OKOLJSKI DEJAVNIKI RAZVOJA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Katarina VALENTINČIČ

OKOLJSKI DEJAVNIKI RAZVOJA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Katarina VALENTINČIČ

OKOLJSKI DEJAVNIKI RAZVOJA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja

ENVIRONMENTAL RISK FACTORS FOR TYPE 1 DIABETES

B. SC. THESIS Academic Study Programmes

.

Ljubljana, 2021

(3)

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, 2021

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.

Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Klemna Dovča, za somentorja pa prof. dr. Polono Jamnik.

Komisija za oceno in predstavitev:

Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Klemen DOVČ

Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Katedra za pediatrijo Član: prof. dr. Polona JAMNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: doc. dr. Iztok PRISLAN

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Datum predstavitve: 9. 7. 2021

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 606: 616.379-008.64:577.27(043.2)

KG avtoimunost, črevesna mikrobiota, epigenetika, imunski sistem, prehrana, preventiva, probiotiki, prebiotiki, sladkorna bolezen tipa 1, živčni sistem

AV VALENTINČIČ, Katarina

SA DOVČ, Klemen (mentor), JAMNIK, Polona (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija

LI 2021

IN OKOLJSKI DEJAVNIKI RAZVOJA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1 TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)

OP VIII, 22 str., 2 sl., 91 vir.

IJ sl JI sl/en

AI V zadnjih petdesetih letih je zelo narasla incidenca sladkorne bolezni tipa 1 (SBT1), ki je zdaj druga najbolj pogosta avtoimunska bolezen pri otrocih. Raziskave so pokazale, da so pri razvoju sladkorne bolezni lahko pomembni tako genetski kot okoljski dejavniki ter zaradi sodobnega sloga življenja spremenjena prehrana. Ta lahko vpliva na epigenetsko regulacijo genoma in tudi na sestavo prebavne mikrobiote, ki lahko imata vlogo v patogenezi razvoja sladkorne bolezni tipa 1. Eden izmed možnih mehanizmov je medsebojno vplivanje živčnega in imunskega sistema ter mikrobiote prek mikrobnih metabolitov, ki tudi spodbudijo izražanje IL-22, enega ključnih citokinov za ohranjanje prebavne homeostaze in preživetje beta celic v trebušni slinavki.

Pri mikrobnih metabolitih je kritično predvsem pomanjkanje kratkoverižnih maščobnih kislin, ki je posledica disbioze in sprememb v prehrani v prvih mesecih življenja.

Obstaja vedno več dokazov, da poleg genetskih dejavnikov tudi okoljski igrajo pomembno vlogo pri sprožitvi avtoimunostnega procesa proti Langerhansovim otočkom. Novo znanje o okoljskih in metabolnih biooznačevalcih lahko po eni strani uporabimo za napovedovanje pojava in napredovanja sladkorne bolezni tipa 1, po drugi strani pa za razvoj novih terapij, ki so osredotočene na spreminjanje razmerja različnih rodov bakterij v prebavilih in ponovno vzpostavitev epigenetskih modifikacij, ki so značilne za zdrave ljudi.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 606: 616.379-008.64:577.27(043.2)

CX autoimmunity, diet, epigenetics, immune system, intestinal microbiota, nervous system, prebiotics, prevention, probiotics, type 1 diabetes

AU VALENTINČIČ, Katarina

AA DOVČ, Klemen (supervisor), JAMNIK, Polona (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology

PY 2021

TI ENVIRONMENTAL RISK FACTORS FOR TYPE 1 DIABETES DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)

NO VIII, 22 p., 2 fig., 91 ref.

LA sl AL sl/en

AB The incidence of type 1 diabetes has much increased in the last fifty years, making it the second most common autoimmune disease among children. Different studies have shown that besides genetic factors environment and changed diet due to modern lifestyle also play an important role in the development of the disease. Diet can potentially influence the epigenetic regulations of the genome and the composition of the intestinal microbiota, which can affect the pathogenesis of diabetes. One of the possible mechanisms could be the crosstalk among the immune and nervous system and microbiota, mediated by microbial metabolites which also promote the expression of IL-22, one of the key cytokines for maintaining intestinal homeostasis and ensuring survival of beta cells in the pancreas. Lack of short-chain fatty acids due to dysbiosis and changes in the diet during the first months of a child’s life is crucial regarding microbial metabolites. There is an increasing amount of evidence that suggests that in addition to genetic predisposition environmental factors also help trigger autoimmunity against beta cells. New knowledge on environmental and metabolic markers can be used for predicting the onset and progression of type 1 diabetes as well as for developing new therapies that alter the ratio of the different genus of bacteria in the intestines and can reverse the epigenetic changes.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

Str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VII

1 UVOD 1

2 STOPNJE V RAZVOJU SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1 1 3 OKOLJSKI DEJAVNIKI RAZVOJA SLADKORNE BOLEZNI

TIPA 1

2

3.1 OKUŽBE 2

3.2 PREHRANA 3

3.2.1 Gluten 3

3.2.2 Vitamin D 4

3.2.3 Dojenje in uživanje kravjega mleka 4

3.3 ČREVESNA MIKROBIOTA POSAMEZNIKOV S SLADKORNO

BOLEZNIJO TIPA 1

5 3.3.1 Primerjava mikrobiote zdravih in posameznikov s sladkorno

boleznijo tipa 1

5 3.3.2 Vpliv črevesne mikrobiote na razvoj sladkorne bolezni tipa 1 5

3.3.2.1 Vpliv mikrobnih metabolitov 6

3.3.2.1.1 Butirat 7

3.3.2.1.2 Polifenoli 8

3.3.2.1.3 Acetat 8

3.3.3 Vpliv prehrane na črevesno mikrobioto 8

4 NOVE TERAPIJE IN PREVENTIVA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1

10

4.1 PROBIOTIKI, PREBIOTIKI IN SINBIOTIKI 11

4.2 EPIZDRAVILA 12

4.3 IMUNOTERAPIJE 12

5 ZAKLJUČEK 14

6 VIRI 15

ZAHVALA

(7)

VI KAZALO SLIK

Str.

Slika 1: Grafična predstavitev vpliva črevesne mikrobiote na izražanje

protimikrobnih peptidov v alfa in beta celicah trebušne slinavke (Sun in sod., 2015)

9 Slika 2: Cikel propada beta celic pri SBT1 in možnosti za intervencijo v različnih

fazah razvoja bolezni (Martens in sod., 2021)

14

(8)

VII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI SBT1 sladkorna bolezen tipa 1

TEDDY The Enviromental Determinants of Diabetes in the Young MIDIA The environmental triggers for type 1 diabetes

GAD dekarboksilaza glutaminske kisline IA2 tirozin fosfatazi podoben protein ZnT8 transporter cinka 8

IGRP za otočke specifičen s katalitično podenoto glukoza-6-fosfataze povezan protein

ICA69 avtoantigen celic Langerhansovih otočkov 69 HbA1c nivo glikiranega hemoglobina

IFN-𝛾 interferon gama IL-17 interlevkin 17

TGF-𝛽 beta transformirajoči rastni faktor

DAISY Diabetes Autoimmunity Study in the Young ACE2 angiotenzin konvertaza 2

NRP1 nevropilin 1

TFRC receptor transferina 1,25 (OH)2D3 1,25-dihidroksivitamin D3

VDR receptor vitamina D

APC antigen predstavitvene celice LPS lipopolisaharidi

PLN bezgavke trebušne slinavke

MLN mezenterične bezgavke

TNF-𝛼 dejavnik tumorske nekroze alfa

IA dvakrat potrjena prisotnost protiteles proti IA2, GAD ali inzulinu PBMC enojedrne celice iz periferne krvi

SCFA kratkoverižne maščobne kisline ILC3 limfoidne celice 3

EGC enterične glialne celice

miRNA mikro RNA

HDAC histon deacetilaze DNMT DNA metiltransferaze

(9)

VIII SAM S-adenozilmetionin

DMHT histon demetiltransferaze MHT histon metiltransferaze

CRAMP s katelicidinom povezan protimikrobni peptid

pSC Schwannove celice, ki so v ovojnici Langerhansovih otočkov GFAP glialni fibrilarni kisli protein

TLR tollu podoben receptor

Pdk1 fosfoinozitid-odvisna kinaza 1 IDO indolamin 2,3-dioksigenaza ITF fruktani inulinskega tipa

MET metformin

SITA sitagliptin

DAC DNA 5-Aza-2'-deoksicitidin

TSA trihostatin A

SCE Stem Cell Educator

CB-SC matične celice iz popkovnične krvi

ATG imunoglobulin proti humanim limfocitom T

(10)

1 1 UVOD

Izraz sladkorna bolezen se nanaša na raznoliko skupino presnovnih motenj, za katere je značilna kronična hiperglikemija. Do povišane koncentracije glukoze v krvi pride zaradi okvar v presnovi ogljikovih hidratov, maščob in proteinov, ki so posledica motenj v izločanju inzulina iz beta celic Langerhansovih otočkov v trebušni slinavki, motenj v njegovem delovanju ali pa obojega. Sladkorna bolezen tipa 1 (SBT1) je oblika bolezni, ki nastopi predvsem zaradi postopnega uničenja beta celic in posledično nezadostnega izločanja inzulina (Gavin in sod., 1997). Pred diagnozo lahko posameznike s SBT1 prepoznamo po značilnih simptomih, kot so žeja, hujšanje, poliurija in zamegljen vid, vendar so lahko ti simptomi tudi zelo mili ali pa celo odsotni. Vendar pa lahko pri SBT1 verjetnost za razvoj bolezni opredelimo že mesece ali celo leta pred kliničnim nastopom bolezni z detekcijo za SBT1 značilnih protiteles proti dekarboksilazi glutaminske kisline (GAD), tirozin fosfatazi podobnemu proteinu (IA2), transporterju cinka 8 (ZnT8) ali inzulinu (Rewers in sod., 1996; Lampasona in Liberati, 2016).

Do pojava simptomov je običajno uničenih že 70–80 % vseh beta celic, zato je za učinkovito preventivo pomembno ukrepati čim bolj zgodaj v razvoju bolezni, da bi pri posameznikih z genetsko predispozicijo preprečili pojav avtoimunosti proti beta celicam. Pri tem ima velik pomen prepoznava značilnih metabolnih biooznačevalcev (Primavera in sod., 2020). Poleg določenih genetskih dejavnikov, ki so močno povezani z razvojem SBT1, pa najverjetneje k razvoju bolezni pripomore tudi več okoljskih dejavnikov, saj sicer težko razložimo 3- do 4- odstotno povečanje incidence v zadnjih treh desetletjih in tudi razlike v številu posameznikov s SBT1 med državami (Norris in sod., 2020). Zaradi številnih nepojasnjenih mehanizmov in vprašanj v povezavi s SBT1 ter velike razširjenosti v populaciji se je veliko raziskav usmerilo v preučevanje ozadja te bolezni. V diplomski nalogi bodo predstavljeni nekateri njihovi rezultati, ki bodo zagotovo pomagali pri naporih za zajezitev širjenja bolezni in razvoju še bolj učinkovitih terapij po njenem nastopu.

2 STOPNJE V RAZVOJU SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1

SBT1 je kronična avtoimunska bolezen, pri kateri celice T uničijo beta celice trebušne slinavke, ki proizvajajo inzulin. Do napada na beta celice pride, ko CD8⁺ celice T prepoznajo avtoantigene, kot so GAD, avtoantigen celic Langerhansovih otočkov 69 (ICA69), IA2, za otočke specifičen s katalitično podenoto glukoza-6-fosfataze povezan protein (IGRP) in proinzulin (Jayasimhan in Mariño, 2019). Nedebele diabetične (NOD) miši z izbitim genom za 𝛽₂-mikroglobulin imajo manjše število CD8⁺ celic T, prav tako pa pri njih ne pride do vnetja Langerhansovih otočkov, kar kaže na ključno vlogo CD8⁺ T celic pri razvoju SBT1, vendar zaradi odsotnosti MHC molekul razreda I na vseh tipih celic, ne zgolj na antigen predstavitvenih celicah (APC), in posledično tudi odsotnosti molekul, ki se z njimi povezujejo, kot sta CD1 in neonatalni FcR, do preprečitve razvoja SBT1 lahko privedejo tudi drugi dejavniki. V gensko spremenjenih miših, ki pa ne izražajo MHC molekul razreda I zgolj na APC, tudi ne pride do razvoja SBT1, iz česar lahko sklepamo, da izražanje MHC molekul razreda I na beta celicah ni zadostno za aktivacijo CD8⁺ T celic (de Jersey in sod., 2006). Pri tem se poraja vprašanje, kaj vodi do začetka razvoja SBT1. Študija z NOD mišmi je pokazala, da so pri SBT1 tarče CD8⁺ celic zgodaj v razvoju bolezni tudi Schwannove celice, ki so v ovojnici otočka (angl. Peri-islet Schwann cells – pSC) in ki izražajo glialni fibrilarni kisli protein (GFAP). Rezultati študije vodijo do hipoteze, da so v zgodnji avtoimunosti pri SBT1 poleg beta celic tarča tudi tkiva živčnega sistema ter da so pSC prvi elementi pankreasnega tkiva, ki so masovno uničeni (Winer

(11)

2

in sod., 2003). Povezava med beta celicami in živčnim sistemom se lahko prekine zaradi sprememb v črevesju, kot je to v primeru disbioze, ki spremeni prepustnost epitelija. Zaradi vnetja in z njim povezanih poškodb tkiva pride do izpostavljanja mnogih avtoantigenov v črevesju in enteričnem živčnem sistemu. Enterične glialne celice (EGC) in enterični nevroni lahko s pomočjo receptorjev, kot so tollu podobni receptorji (TLR), zaznavajo različne antigene iz črevesja, vključno z gostiteljevimi in mikrobnimi (Turco in sod., 2014). EGC med disbiozo s pomočjo svojih zvezdastih izrastkov vzorčijo mikrobne antigene, ki prehajajo črevesno pregrado, in aktivirajo diabetogene celice T. Sproščanje mikrobnih antigenov, kot so lipopolisaharidi (LPS), bi lahko prekinilo toleranco EGC in vodilo do čezmernega izražanja GFAP in S100B. GFAP je povezan z vnetnim odzivom v črevesju, medtem ko je S100B nevrotrofin in vodi do sproščanja dušikovega oksida (von Boyen, 2004; Esposito in sod., 2007).

Prekomerno sproščanje NO lahko povzroči poškodbe tkiva in na ta način posega v integriteto črevesnega epitelija (Nadler in sod., 1999). Glia celice, ki izražajo GFAP, bi tako lahko imele v normalnih pogojih zaščitno vlogo pri vzdrževanju integritete črevesja, v nenadzorovanih vnetnih pogojih pa bi lahko vodile do avtoreaktivnosti. GFAP, ki ga izražajo celice glia, je tudi že bolj prepoznan kot avtoantigen pri SBT1 in protitelesa prot GFAP so bila identificirana pri NOD miših in ljudeh s SBT1, kar kaže na pomembnost povezave med mikrobioto, EGC in SBT1 (Pang in sod., 2017; Jayasimhan in Mariño, 2019). To je zgolj ena od teorij, k nadaljnjemu razvoju bolezni pa zagotovo prispevajo še drugi dejavniki, tako genetski kot okoljski.

3 OKOLJSKI DEJAVNIKI RAZVOJA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1 3.1 OKUŽBE

Na Norveškem so z retrospektivno študijo med letoma 1973 in 1982 opazili največje število novih primerov v oktobru in januarju, torej mrzlih mesecih, ko so okužbe z virusi pogostejše, ter najmanjše število v maju in juliju (Joner in Svik, 1989). Študija TEDDY sledi otrokom z genetsko predispozicijo za razvoj SBT1 v različnih državah, kjer so izpostavljeni različnim potencialnim okoljskim dejavnikom, ki lahko doprinesejo k razvoju bolezni. Osredotočili so se tudi na okužbe z virusi, tako da so na šestih lokacijah TEDDY študije v ZDA, Nemčiji, na Švedskem in na Finskem izvedli metagenomsko sekvenciranje na blatu otrok, ki so ga vzorčili vsak mesec od starosti 3 mesecev pa do diagnoze SBT1. Raziskovali so fekalno izločanje evkariontskih DNA in RNA virusov v povezavi z avtoimunostjo Langerhansovih otočkov in SBT1. Avtorji so prišli do zaključka, da je daljša okužba z Enterovirus B, ne pa tudi krajše okužbe, morda vpletena v avtoimunost otočkov pri nekaterih otrocih, medtem ko niso našli povezave z razvojem SBT1, zaradi česar sta tip in trajanje okužbe verjetno pomembna dejavnika (Vehik in sod., 2019). V drugi raziskavi so z dvema različnima sevoma coxsackievirusa B1 in vitro okužili izolirane človeške Langerhansove otočke. Med okužbo so opazili manjše izražanje gena za inzulin in nespremenjeno izražanje gena za glukagon ter replikacijo virusa zgolj v beta celicah, kar je skladno z večjo dovzetnostjo za okužbo beta celic v primerjavi z alfa celicami in tudi pojasni preferenčno izgubo beta celic pri SBT1 (Anagandula in sod., 2014).

Na Norveškem so v okviru študije MIDIA do četrtega leta spremljali novorojenčke z genotipom z visokim tveganjem za razvoj SBT1 HLA-DR4-DQ8/DR3-DQ2. Do prvega leta starosti so vsake 3 mesece nato pa enkrat letno vzeli vzorce krvi za antigenske teste (za določitev

(12)

3

avtoimunosti – prisotnost protiteles proti vsaj enemu od antigenov: GAD, IA2 ali inzulinu), starši pa so izpolnili vprašalnik, če je imel njihov otrok pljučnico, bronhitis ali pa je bil okužen z respiratornim sincicijskim virusom. Glede na njihove odgovore so okužbe spodnjega dihalnega trakta povezane z večjim tveganjem za avtoimunost Langerhansovih otočkov v zgodnjem otroštvu (Rasmussen in sod., 2011). Mnoge raziskovalne skupine so se osredotočile tudi na povezavo med razvojem SBT1 in okužbo z rotavirusom. Študija na NOD miših je pokazala povečano izražanje vnetnih citokinov v APC v bezgavkah trebušne slinavke (PLN) ter v primeru T in B celic v PLN, mezenteričnih bezgavkah (MLN), vranici in Langerhansovih otočkih ter povečano izražanje MHC molekul razreda I v B celicah in s tem povezano namnoževanje za antigene Langerhansovih otočkov specifičnih CD8⁺ T celic (Pane in sod., 2014). Preučevali so tudi povezavo med razvojem SBT1 in cepljenjem proti rotavirusom.

Rezultati večje kohortne študije v ZDA so zaznali za 33 % manjše tveganje za razvoj SBT1 pri cepljenih otrocih, vendar je druga kohortna študija, ki se je zaključila lansko leto, to ovrgla, saj ni bilo razlik v incidenci med cepljeno in kontrolno skupino (Rogers in sod., 2019; Glanz in sod., 2020). Ker so bili tudi koronavirusi določeni kot dejavnik, ki pripomore k pojavu protiteles proti Langerhansovim otočkom, se je zelo hitro pojavila skrb, da bo epidemija covid-19 močno vplivala na število na novo diagnosticiranih otrok s SBT1 (Lönnrot in sod., 2017). Poleg že znanih mehanizmov, s katerimi lahko virusi vplivajo na razvoj SBT1 – kot so neposredna poškodba beta celic zaradi namnoževanja virusa in posledično sproščanje pankreasnih antigenov ter povečano izražanje citokinov in aktivacija T celic – bi se lahko SARS-CoV-2 tudi vezal na angiotenzin konvertazo 2 (ACE2) v trebušni slinavki in povzročil še dodatne poškodbe.

Liu in sod. (2020) so preverili izražanje in distribucijo ACE2 v trebušni slinavki zdravih ter retrospektivno analizirali bolnike, diagnosticirane s covidom-19. Ugotovili so, da je izražanje ACE2 v trebušni slinavki malo večje kot v pljučih, in sicer tako v eksokrinih žlezah kot tudi v Langerhansovih otočkih. Velik delež bolnikov, sploh tistih s hujšo obliko bolezni, je utrpelo poškodbe trebušne slinavke, zato bi bilo treba pri zdravljenju covida-19 več pozornosti nameniti tudi temu vidiku (Chowdhury in Goswami, 2020). Poleg ACE2 so za beta celice potrdili tudi izražanje nevropilina 1 (NRP1) in receptor transferina (TFRC), ki sta nujno potrebna za vstop virusa. Okužba s SARS-CoV-2 je predvsem v beta celicah vodila do zmanjšanega izločanja inzulina, indukcije z apoptozo povezanih signalnih poti in celične apoptoze (Wu in sod., 2021).

Nekaj študij je poleg tega spremljalo število novih diagnoz SBT1 v povezavi z okužbo s SARS- CoV-2, med drugim v Veliki Britaniji, kjer so zaznali porast v diagnozah, vendar bo za potrditev te povezave potrebno še več raziskav (Unsworth in sod., 2020).

3.2 PREHRANA 3.2.1 Gluten

Največ študij v povezavi s prehrano posameznikov s SBT1 je v povezavi z glutenom, saj lahko najdemo kar nekaj podobnosti med SBT1 in celiakijo, ki sta med drugim obe avtoimunski bolezni, tveganje za razvoj obeh bolezni pa je tudi povezano s (HLA) DQ2 in/ali DQ8 genotipom (Leonard in sod., 2019). Ena od takih je bila 12-mesečna pilotna študija, kjer je 12 otrok, na novo diagnosticiranih s SBT1, zauživalo hrano brez glutena. Po pol leta je bilo trikrat več otrok s prehrano brez glutena še vedno v remisiji v primerjavi s kontrolno skupino, po enem letu pa so imeli 21 % nižji nivo glikiranega hemoglobina (HbA1c). Se je pa že med raziskavo izpostavila težava z vztrajanjem pri taki prehrani, saj je v drugi polovici leta veliko otrok izgubilo motivacijo (Svensson in sod., 2016). Študija (Antvorskov in sod., 2013) je želela

(13)

4

pojasniti povezavo med razvojem SBT1 in glutenom preko sprememb v citokinih, izraženih v FOXP3⁺ regulatornih T celicah in FOXP3^- T celicah, ki so bile izolirane iz črevesnega mukoznega in nemukoznega limfoidnega tkiva v BALB/c miših. Prehrana, ki je vključevala gluten, je tako pri FOXP3^- T celicah kot pri FOXP3⁺ T celicah v vseh analiziranih organih povečala izražanje vnetnih citokinov interferona gama (IFN-𝛾), interlevkina 17 (IL-17) in interlevkina 2 (IL-2). Prehrana brez glutena pa je spremenila vzorec citokinov v prid protivnetnim, s povečanim deležem beta transformirajoči rastni faktor (TGF-𝛽)⁺ FOXP3^- T celic v vsem preiskovanem limfoidnem tkivu ter vplivala na večje število TGF-𝛽⁺ FOXP3⁺ regulatornih T celic v mukozi ter povečano izražanje IL-10 v ne-T celicah vranice. Po drugi strani so v okviru študije DAISY, ki spremlja otroke s povečanim tveganjem za razvoj SBT1, prišli do zaključka, da ni nobene povezave med zaužitjem glutena in avtoimunostjo Langerhansovih otočkov ter napredovanjem do SBT1 (Lund-Blix in sod., 2019). Rezultati različnih študij so tako precej nasprotujoči in ne ponujajo trdnih dokazov o vlogi glutena. Poleg prehrane otroka pa bi lahko na razvoj SBT1 vplivala tudi prehrana matere med nosečnostjo.

Nacionalna kohortna študija na Danskem, pri kateri so nosečnice med letoma 1996 in 2002 izpolnjevale vprašalnike o svoji prehrani, se je osredotočila na povezavo med materinim zaužitjem glutena in pojavom SBT1 pri njenemu otroku. Glede na rezultate je ta povezava močna, saj se tveganje za razvoj SBT1 proporcionalno povečuje z večjo količino zaužitega glutena (Antvorskov in sod., 2018).

3.2.2 Vitamin D

Incidenca SBT1 se spreminja z geografsko širino, podobno pa se od juga proti severu zmanjšuje preskrbljenost prebivalcev z vitaminom D, zato bi bil ta lahko zaščitni dejavnik pri SBT1. Poleg tega se aktivna oblika vitamina D 1,25-dihidroksivitamin D3 (1,25 (OH)2D3) veže na receptor vitamina D (VDR) in lahko vpliva na APC ter preko APC ali pa direktno tudi na celice T.

Gregori in sod. (2002) so pokazali, da analog 1𝛼, 25-dihidroksivitamina D3 Ro 26-2198, ki prepreči dozorevanje dendritičnih celic, pri NOD miših zmanjša od LPS odvisno produkcijo IL-12 in IFN-𝛾, zaustavi infiltracijo Th1 celic, napredovanje vnetja Langerhansovih otočkov ter razvoj SBT1. Poleg tega pripomore k večjemu številu CD4⁺CD25⁺ regulatornih T celic v bezgavkah, ki lahko inhibirajo T-celični odgovor na IA2, ter pomembno upočasni prenos bolezni preko patogenih CD4⁺CD25^-celic. Kljub ugotovljeni vlogi vitamina D pri regulaciji imunskega sistema pri NOD miših pa pri posameznikih s SBT1 niso opazili pomembnega vpliva. V dveh velikih študijah na Danskem so pri novorojencih preučevali vpliv preskrbljenosti s 25-hidroksivitaminom D na tveganje za razvoj SBT1. Študija je vključevala 912 posameznikov s SBT1 in 2866 brez, ki so se rodili med letoma 1981 in 2002 ter so jih spremljali do leta 2012. Nobena od študij ni zaznala povezave med preskrbljenostjo z vitaminom D ob rojstvu in kasnejšim tveganjem za razvoj SBT1 (Jacobsen in sod., 2016).

3.2.3 Dojenje in uživanje kravjega mleka

Večina velikih kohortnih študij ni odkrila nobene povezave med trajanjem dojenja in tveganjem za razvoj avtoimunosti Langerhansovih otočkov ali pa SBT1. Ker so v študije vključene velike populacije otrok, ki jim sledijo več let, lahko v takih študijah ocenijo povezave s precejšnjo statistično zanesljivostjo (Hakola in sod., 2018). Čeprav starost ob prenehanju dojenja očitno ni povezana z razvojem SBT1, pa so zaznali večje tveganje za dvakrat potrjeno prisotnost protiteles proti IA2, GAD ali inzulinu oz. IA pri otrocih sHLA-DR genotipi z nizkim ali s

(14)

5

srednjim tveganjem za razvoj SBT1, kadar so s kravjim mlekom zaužili več mlečnih proteinov in laktoze, ne pa tudi pri otrocih z genotipi z visokim tveganjem za razvoj SBT1. Biološko ozadje tega pojava bi bilo lahko povezano z odzivom črevesja na mlečne proteine. V normalnih razmerah epitelne celice debelega črevesja namreč ne izražajo HLA-DR antigenov. Glede na izsledke raziskave Chunga in sod. (2003) pa mlečni proteini lahko sprožijo večje izražanje HLA-DR in celično posredovano imunost ob vnetju epitelnih celic. Netipičen celično posredovan imunski odziv pa bi lahko vodil do avtoimunosti. Ker so otroci z genotipi HLA-DR z visokim tveganjem za razvoj SBT1 že tako ali tako nagnjeni k nenormalnemu celično posredovanemu imunskemu odzivu, verjetno ob vnetju epitelija pride do IA ne glede na prehrano, medtem ko je pri otrocih z genotipi z manjšim tveganjem morda potrebna kombinacija vnetja in večje izpostavljenosti mlečnim proteinom za razvoj IA (Lamb in sod., 2015).

3.3 ČREVESNA MIKROBIOTA POSAMEZNIKOV S SLADKORNO BOLEZNIJO TIPA 1

3.3.1 Primerjava mikrobiote zdravih in posameznikov s sladkorno boleznijo tipa 1 Črevesna mikrobiota in njena vloga pri zdravju ljudi je deležna vse več pozornosti tako v znanstvenih kot v laičnih krogih. V človeškem prebavnem traktu je desetkrat več bakterij kot pa gostiteljevih celic, ki imajo skupaj stokrat več genov kot pa gostiteljeve celice (Bull in sod., 2014). Čeprav je že pred 2000 leti Hipokrat spoznal, da se veliko bolezni začne v črevesju, povezava med črevesjem in avtoimunsko SBT1 še ni dobro razumljena (Al Theyab in sod., 2020). Vemo pa, da je raznolikost prebavne mikrobiote močno vpletena v etiologijo te bolezni in številne študije z živalskimi modeli in klinične študije so pokazale, da razlike v sestavi mikrobiote med zdravimi gostitelji in tistimi s sladkorno boleznijo povečajo tveganje za razvoj bolezni. Predvsem so te spremembe odgovorne za napredovanje bolezni pri dojenčkih in posameznikih, ki so še posebej ogroženi, po navadi zaradi genetske predispozicije. Predlagano je bilo, da je izguba raznolikosti morda povezana z avtoimunskim procesom in nam lahko pomaga pri njegovi napovedi. V eni od študij so primerjali vrste bakterij v blatu zdravih in otrok s SBT1. Otroci s SBT1 so imeli manjše število bakterij iz debel Actinobacteria in Firmicutes ter manjše razmerje Firmicutes proti Bacteroidetes. Pri še natančnejšem pregledu, na ravni rodov, so našli povečano število bakterij iz rodov Clostridium, Bacteroides in Veillonella in precejšnje zmanjšanje v številu vrst rodov Lactobacillus, Bifidobacterium, skupine Blautia coccoides/Eubacterium rectale in Prevotella. Številčnost in raznolikost bakterij, ki so potrebne za ohranjanje integritete črevesja, sta bili pri otrocih s SBT1 občutno nižji v primerjavi z zdravimi kontrolami. Poleg tega so ugotovili, da je večje število bakterij rodov Bifidobacterium in Lactobacillus ter večje razmerje Firmicutes proti Bacteroidetes povezano z nižjo vsebnostjo glukoze v plazmi, medtem ko za bakterije iz rodu Clostridium velja ravno nasprotno (Murri in sod., 2013).

3.3.2 Vpliv črevesne mikrobiote na razvoj sladkorne bolezni tipa 1

Zamisel, da črevesna mikrobiota morda sodeluje pri razvoju avtoimunskih bolezni, kot je SBT1, se je pojavila že v osemdesetih letih. Črevesna sluznica pokriva največji del našega telesa, in ker nenehno prihaja v stik z različnimi mikroorganizmi, antigeni iz hrane in toksini, mora črevesni epitelij ločevati med patogenimi in koristnimi mikroorganizmi, ki kot komenzali

(15)

6

naseljujejo naše črevesje, in tudi med antigeni iz hrane. Glede na literaturo, ki je na voljo, bi lahko povezali povečano incidenco SBT1, ki smo ji priča zadnjih 50 let, s tremi primarnimi mehanizmi, povezanimi s črevesjem, ki jih vključuje model »The perfect storm«. Model pravi, da vsak dejavnik ločeno ne privede do razvoja SBT1, medtem ko skupaj v interakciji privedejo do nastanka »The perfect storm« in razvoja SBT1. Ti trije dejavniki so nenormalno delovanje imunskega sistema v prebavnem traktu, povečana prepustnost črevesja in spremenjena črevesna mikrobiota (Vaarala in sod., 2008). Torej bi okvarjen razvoj in/ali spremembe zdrave mikrobiote pri posameznikih z genetsko predispozicijo za razvoj SBT1 lahko privedla do nenormalne imunoregulacije, ki omogoča avtoimunsko uničenje beta celic. To se sklada z izsledki, da je zorenje imunskega sistema, ki je potrebno za ločevanje med lastnim in tujim, v veliki meri izvedeno v prvih letih življenja z razvojem in učenjem imunskega sistema s strani mikrobiote, ki kolonizira prebavni trakt in simbiontsko živi z gostiteljem (Cebra, 1999).

Na vlogo črevesja pri razvoju SBT1 kažejo številne raziskave. Westerholm-Ormio in sod.

(2003) so izvedli biopsijo jejunuma vzorcev otrok s SBT1 ter prišli do zaključka, da tanko črevo kaže znake povečane imunske aktivnosti. Z imunohistokemijo so zaznali povečano izražanje antigenov MHC razreda II in ICAM-1 ter izražanje HLA-DR in -DP tudi v kriptah in na površini vilov, kjer jih običajno ne najdemo. Poleg tega so odkrili povečano število IL-1𝛼 in IL-4 pozitivnih celic. IL-4, ki ga sintetizirajo imunske celice v črevesju, naj bi pripomogel k povečani prepustnosti epitelija, ki je značilna za SBT1 (Carol in sod., 1998). V raziskavi iz leta 2006 so pri posameznikih z avtoimunostjo Langerhansovih otočkov določili povečano prepustnost črevesja za disaharid laktulozo, kar kaže na poškodovano črevesno pregrado, vendar dokaj nespremenjeno prepustnost za monosaharid manitol v primerjavi s kontrolno skupino, kar pa kaže na nepoškodovanost sluznice. Rezultati potrjujejo vpletenost tankega črevesja v razvoj SBT1, saj je mogoče zaznati subklinično enteropatijo še pred kliničnim pojavom SBT1 (Bosi in sod., 2006). Zaradi povečane prepustnosti lokalno prisotne imunske celice naletijo na še več patogenov, mikrobnih produktov in iz hrane izhajajočih antigenov. Imunske celice lahko dostopajo do trebušne slinavke preko PLN in MLN in hiperaktivirajo avtoreaktivne celice B in T (Jaakkola in sod., 2003). Poleg tega lahko mikrobni produkti iz črevesja dosežejo PLN in lokalno modificirajo predstavljanje pankreasnih lastnih antigenov. Enteropatija lahko predstavlja vnetni stimulus, ki aktivira dendritične celice v PLN in na ta način potencira odgovor na pankreasne avtoantigene (Turley in sod., 2005). Druga pot sprožitve razvoja SBT1, ki izvira v črevesni disbiozi, pa bi bila lahko molekularna mimikrija med mikrobnimi antigeni in avtoantigeni Langerhansovih otočkov. Rezultati študije, ki so jo izvedli Rani in sod. (2013), kažejo na navzkrižno reaktivnost proteina Hsp65 iz Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis s protitelesi iz seruma posameznikov s SBT1, ki je verjetno posledica ohranjenih peptidov med mikobakterijskim Hsp65 in človeškima Hsp60 in GAD65.

Pri enojedrnih celicah iz periferne krvi (PBMC), ki so bile izpostavljene rekombinantnemu Hsp65, so detektirali povečano izločanje citokinov IL-1β, IL-8, IL-6, dejavnika tumorske nekroze alfa (TNF-𝛼) in IL-10. To kaže na dvojno vlogo Hsp65: indukcija avtoimunosti in vnetja, kar sta dve ključni značilnosti SBT1.

3.3.2.1 Vpliv mikrobnih metabolitov

Črevesna mikrobiota in njeni gostitelji – ljudje smo se razvijali v procesu koevolucije, ki je vodil po eni strani do stabilnega okolja za preživetje mikroorganizmov, po drugi strani pa te isti mikroorganizmi izvajajo številne funkcije, ki nam koristijo: razgradnja kompleksnih

(16)

7

makromolekul, produkcija vitaminov in hranil, obramba pred patogeni in vzdrževanje imunskega sistema. S produkcijo različnih metabolitov lahko tako doprinesejo k našemu zdravju ali pa pripomorejo k razvoju različnih bolezni. Naša prehrana pa vpliva na sestavo mikrobiote in tudi na tip metabolitov, ki jih mikroorganizmi proizvajajo, zaradi česar slednji predstavljajo povezavo med prehrano in različnimi fiziološkimi stanji. Najpomembnejša skupina bakterijskih metabolitov so kratkoverižne maščobne kisline (SCFA), ki nastanejo z mikrobno fermentacijo prehranskih vlaknin (Koh in sod., 2016). Del SCFA porabijo epitelne celice v črevesju, preostanek pa se najprej metabolizira v jetrih, nato pa vstopi v sistemski krvni obtok ter potuje po celem telesu (Cummings in sod., 1987). SCFA lahko aktivirajo izražanje IL-22 v limfoidnih celicah (ILC), med drugim v limfoidnih celicah 3 (ILC3), ki so v tesni povezavi z EGC. Raziskave podpirajo ključno vlogo EGC kot neke vrste vratarjev, ki ves čas nadzorujejo in se odzivajo na dražljaje iz ekosistema črevesja ter pripomorejo k ohranjanju črevesne homeostaze. Tudi ILC3 so pomembni regulatorji vnetja in okužb na mukozni pregradi, a njihov odziv na signale iz okolja še ni povsem raziskan. V študiji iz leta 2016 so v miših potrdili vlogo ILC3 pri zaznavanju okolja ter nadzoru nad obrambo črevesja kot del glialno- ILC3-epitelne povezave, ki je odvisna od nevrotropnih dejavnikov, saj enterične ILC3 izražajo nevroregulatorne receptorje RET. ILC3 se namreč nahajajo v neposredni bližini EGC, ki izražajo nevrotropne dejavnike in iztegujejo svoje zvezdasto oblikovane izrastke v agregate ILC3. Izražanje nevrotropnih dejavnikov in IL-22 pa je pod nadzorom od MYD88 odvisne poti, in delecija Myd88 v EGCs vodi k zmanjšani produkciji IL-22 v ILC3 ter nagnjenosti k vnetju črevesja in okužbam (Ibiza in sod., 2016). Poleg tega na razvoj EGC vpliva črevesna mikrobiota, saj so v študiji na miših brez črevesnih bakterij (germ free ali GF miši) zaznali zmanjšan pritok EGC v črevesno mukozo. Ker EGC igrajo pomembno vlogo pri preživetju in funkcionalni povezanosti enteričnih nevronov, ti rezultati kažejo na povezavo med okrnjeno gibljivostjo črevesja, ki so jo opazili pri GF in z antibiotiki tretiranih miših, ter napakami v dinamiki EGC (Kabouridis in sod., 2015).

Simbiontske povezave med združbami komenzalnih bakterij in gostiteljem pa vključujejo tudi spremembe v izražanju genov, ne pa direktnega spreminjanja DNA sekvenc oz. epigenetiko.

Najpomembnejši epigenetski mehanizmi vključujejo DNA metilacijo, kovalentne posttranslacijske modifikacije histonov in z mikro RNA (miRNA) posredovano utišanje genov (Vaissiere in sod., 2008). Vse te epigenetske modifikacije so povezane z izločanjem inzulina in procesi, ki se odvijajo med razvojem SBT1. Butirat, acetat in polifenoli, ki izhajajo iz črevesja ali iz mikrobov, pa vsi igrajo pomembno vlogo pri epigenetski regulaciji SBT1 in na njihovo vsebnost pomembno vpliva disbioza črevesja (Al Theyab in sod., 2020).

3.3.2.1.1 Butirat

Podatki, pridobljeni iz 16s rRNA blata zdravih in posameznikov s SBT1, kažejo večje število bakterij, ki proizvajajo butirat, in bakterij, ki razgrajujejo mucin, pri kontrolah v primerjavi s primeri, medtem ko so pri zadnjih zaznali večje število bakterij, ki proizvajajo druge SCFA.

Bakterije, ki proizvajajo butirat, bi bile zato lahko v zdravem črevesju odgovorne za zadostno sintezo mucina in s tem ohranjanje integritete črevesja. Po drugi strani bakterije, ki ne proizvajajo butirata ter porabljajo laktat, preprečujejo zadostno sintezo mucina (Brown in sod., 2011). Zaradi nedavnih dokazov, da obstaja povezava med SBT1 in histon deacetilazami (HDAC), saj inhibitorji HDAC spodbujajo delitev, razvoj in delovanje beta celic ter izboljšajo homeostazo glukoze, so Khan in sod. (2014) preučevali dodatek natrijevega butirata pri miših

(17)

8

s SBT1. Tretiranje z natrijevim butiratom je zmanjšalo vsebnost glukoze v plazmi, HbA1c, apoptozo beta celic ter preko inhbicije HDAC ter acetilacije histonov izboljšalo raven inzulina in homeostazo glukoze. Pred tretiranjem niso v Langerhansovih otočkih diabetičnih miši zaznali skoraj nobenih endokrinih celic, po njem pa se je stanje izboljšalo, kar povezujejo z zaščitno vlogo butirata tako na molekulski kot tudi na tkivni ravni. Dalje so preučevali vpliv butirata na transkripcijske faktorje, kot je FOXO1, ki so vključeni v homeostazo glukoze.

FOXO1 aktivira transkripcijo genov za glukoza-6-fosfatazo, fruktoza-1,6-bifosfatazo in druge encime, ki so vključeni v glukoneogenezo in glikogenolizo ter tako posredno poveča sintezo glukoze v jetrih. Kasnejše raziskave so pokazale, da butirat z mehanizmi, ki vključujejo fosforilacijo, zmanjša izražanje FOXO1, kar izboljša homeostazo glukoze.

3.3.2.1.2 Polifenoli

Polifenoli so navadno v zelenjavi in sadju, prav tako pa nastajajo med mikrobnim metabolizmom hrane v prebavnem traktu, kjer se pretvorijo v različne aromatične SCFA (Kondakova in sod., 2009). Razvoj in delovanje Treg celic, ki so ključne za ohranjanje imunske tolerance in preprečitev avtoimunosti, sta odvisna od transkripcijskega faktorja FOXP3.

Izražanje FOXP3 pa je epigenetsko regulirano preko DNA metilacije in inhibitorji DNA metiltransferaz (DNMT) lahko inducirajo izražanje FOXP3 v naivnih CD4⁺ T celicah. Eden takih inhibitorjev je EGCG, polifenol zelenega čaja, ki poleg izražanja FOXP3 inducira tudi izražanje IL-10 v CD4⁺T celicah. Poleg tega so v študiji pokazali povečano število Treg celic v vranici in bezgavkah miši, ki so prejemale EGCG, ter inhibiran T celični imunski odziv (Wong in sod., 2011). Kljub pozitivnim izsledkom obsežnih študij, bo treba vložiti še več napora, da se bo določil točen mehanizem delovanja različnih polifenolov.

3.3.2.1.3 Acetat

Acetat je pomemben pri ohranjanju homeostaze v črevesju sesalcev, saj zmanjšuje izražanje vnetnih citokinov ter spodbuja izražanje protivnetnih citokinov (Soliman in sod., 2012). V študiji, kjer so s ciklofosfamidom potenciranim nedebelim (CY-NOD) mišim dajali imunomodulatorni peptid Glatiramer acetat (GA), se je zmanjšal delež miši s sladkorno boleznijo ter ublažilo vnetje Langerhansovih otočkov. To je sovpadalo tako in vivo kot in vitro s povečanim izražanjem transkripcijskega faktorja FOXP3, ki sodeluje pri regulaciji razmnoževanja in diferenciacije Treg celic ter vodi k povečani produkciji protivnetnega citokina IL-4. Raziskovalci menijo, da bi zaradi indukcije Treg celic (še posebej CD4⁺CD25⁺) ter njihovega izboljšanega delovanja zaradi večje količine IL-4 lahko potencialno uporabili GA ali prehranski acetat v terapiji za SBT1 (Cui in sod., 2009).

3.3.3 Vpliv prehrane na črevesno mikrobioto

Prehrana je eden od glavnih dejavnikov, ki odločajo o sestavi črevesne mikrobiote. Bakterijske združbe, ki naseljujejo različne dele prebavnega trakta, so povezane s stikom gostitelja z določenimi metaboliti, ki izhajajo iz fermentacije zaužite hrane. K zaščiti pred SBT1 naj bi pripomogla predvsem prehrana, ki zagotavlja velike količine z bakterijsko fermentacijo nastalega acetata in butirata. Ko so NOD miši hranili s tako prilagojeno prehrano (acetiliran ali butiliran škrob), so bile te popolnoma zaščitene pred SBT1. Učinki acetata in butirata se prekrivajo zgolj v manjši meri, zato verjetno delujeta na različen način, vendar oba vodita do

(18)

9

spremenjene sestave črevesne mikrobiote, izboljšanja integritete črevesja, manjše vsebnosti vnetnih citokinov, kot je IL-21, in avtoreaktivnih efektorskih T celic – vse lastnosti, ki so sicer povezane z razvojem SBT1. Acetat in v manjši meri tudi butirat sta spremenila fenotip B celic v smislu manjšega izražanje MHC molekul razreda I, kar je sovpadalo z manjšim številom IGRP⁺CD8⁺ T celic in z manjšo ekspanzijo populacije avtoreaktivnih NOD8.3 T celic in vivo (Mariño in sod., 2017). B celice namreč v bezgavkah delujejo kot APC za na antigene Langerhansovih otočkov reaktivne T celice. Pri NOD miših brez celic B z MHC molekulami razreda I ni prišlo do razvoja SBT1, prav tako pa je bila manjša ekspanzija avtoreaktivnih CD8⁺ T celic, torej z navzkrižnim predstavljanjem avtoantigenov avtoreaktivnim CD8+ T celicam B celice morda vodijo prehod od vnetja Langerhansovih otočkov do SBT1. Druga možnost je, da visoke koncentracije acetata posredno ali pa neposredno spodbujajo apoptozo T celic (Mariño in sod., 2012; Mariño in sod., 2017). SCFA tudi vplivajo na produkcijo s katelicidinom povezanega protimikrobnega peptida (CRAMP), vrste protimikrobnih peptidov, ki jih sicer izražajo epitelne in imunske celice za obrambo pred patogenimi mikroorganizmi. Raziskava je pokazala, da je produkcija CRAMP okvarjena pri NOD miših, zato so želeli preučiti vpliv peritonealnega vnosa CRAMP na incidenco SBT1. CRAMP deluje imunoregulatorno na pankreasne makrofage in dendritične celice (Slika 1), saj zmanjšuje vnetno delovanje makrofagov in ohranja imunsko homeostazo s spodbujanjem diferenciacije Treg celic.

Katelicidini imajo dve nasprotujoči si vlogi v različnih fazah razvoja SBT1: citruliran katelicidin, ki ga sintetizirajo NETotični nevtrofilci v mladih NOD miših, lahko z aktivacijo plazmacitoidnih dendritičnih celic inducira začetek razvoja bolezni, medtem ko nemodificirani katelicidin, ki ga sintetizirajo endokrine celice v odraslih miših, regulira infiltracijo imunskih celic in prepreči razvoj SBT1. Produkcija CRAMP je od SCFA odvisna preko receptorjev endokrinih celic GPR41 in GPR43, ki pa jih izražajo tudi beta celice (Bahar Halpern in sod., 2012; Sun in sod., 2015).

Slika 1: Grafična predstavitev vpliva črevesne mikrobiote na izražanje protimikrobnih peptidov v alfa in beta celicah trebušne slinavke. SCFA: kratkoverižna maščobna kislina, CRAMP: s katelicidinom povezan protimikrobni peptid, M𝜙: makrofag, cDC: dendritična celica, RA: retinojska kislina, TGF-β: beta transformirajoči rastni faktor, TNF-α: dejavnik tumorske nekroze alfa, IL12: interlevkin 12, EGFR: receptor za epidermalni rastni faktor (povzeto po Sun in sod., 2015).

(19)

10

Prehrana in/ali pomanjkanje prehranskih SCFA prav tako lahko uravnava gibljivost in preživetje črevesnih nevronov preko molekul miRNA, ki so vpletene v energijsko homeostazo, metabolizem lipidov in širjenje ter razvoj gladkih mišic v prebavnem traktu. Študija na miših je pokazala, da prehrana z visoko vsebnostjo maščob upočasni prehod skozi prebavni trakt. Do tega pride deloma zaradi indukcije apoptoze črevesnih nevronov, ki je posledica okvar mitohondrijev in stresa endoplazmatskega retikuluma, pomembna pa je tudi vloga Mir375, ki je odgovoren za zmanjšano translacijo fosfoinozitid-odvisne kinaze 1 (Pdk1), proteina, ki je pomemben za preživetje celice (Nezami in sod., 2014). Vlogo miRNA pri preživetju beta celic so preučevali Lovis in sod. (2008), ki so analizirali izražanje miRNA v celični liniji endokrinih celic Langerhansovih otočkov in v celicah Langerhansovih otočkov iz db/db miši, ki so bile za 3 dni izpostavljene palmitatu. Podaljšana izpostavljenost palmitatu je vodila do od časa in koncentracije palmitata odvisnega povečanega izražanja miR34a in miR146. Večja prisotnost miR34a pa je povezana z aktivacijo p53 in posledično večjo občutljivostjo na apoptozo in okvarjeno od hranil inducirano sekrecijo. MiR34a je tako povezana z večjo stopnjo apoptoze, ne vpliva pa na sposobnost izločanja inzulina. Po drugi strani pa prehrana bogata z omega-3 polinenasičenimi maščobnimi kislinami inducira spremembe v sestavi mikrobiote v smeri manjšega števila Faecalibacterium in večjega števila bakterij, ki producirajo butirat (Noriega in sod., 2016).

Predhodne študije so pokazale, da tudi proteini lahko spreminjajo sestavo črevesne mikrobiote pri ljudeh in živalih ter na ta način vplivajo na razvoj SBT1. V eni od študij so prašiče hranili s prehrano z naraščajočo vsebnostjo proteinov. Raziskovalci so prišli do zaključka, da prehrana z deloma omejeno vsebnostjo proteinov (prehrana s 13 % proteinov) ugodno vpliva na sestavo bakterijskih združb in nastale metabolite ter izboljša delovanje črevesne pregrade. Čezmerno omejevanje vnosa proteinov pa vodi k pomanjkanju vira aminokislin in zmanjšanju raznolikosti črevesne mikrobiote (Fan in sod., 2017). Med mikrohranili so preučevali vpliv pomanjkanja vitamina A pri miših na sestavo mikrobiote. Miši s pomanjkanjem so imele manjše število vrst iz debla Bacteroidetes in posledično višje razmerje Firmicutes proti Bacteroidetes v primerjavi z mišmi brez pomanjkanja. Poleg tega so pri miših z dovolj vitamina A določili več bakterij, ki proizvajajo butirat.Verjetno vpliv vitamina A na mikrobioto ni neposreden, temveč deluje preko imunskega sistema, saj so študije pokazale, da retinojska kislina in agonisti receptorja retinojske kisline alfa inhibirajo nastajanje Th17 vnetnih T celic in spodbujajo razvoj FOXP3⁺ protivnentih celic; to pa sta dve populaciji celic, ki pomembno določata ravnotežje med obrambo gostitelja in avtoimunostjo. Miši s pomanjkanjem so bile tudi hiperglikemične in so se počasneje odzivale na injiciran inzulin, vendar zaenkrat še ni nobenih dokazov, da bi bilo pomanjkanje vitamina A povezano z razvojem SBT1 pri ljudeh (Elias in sod., 2008; Tian in sod., 2018).

4 NOVE TERAPIJE IN PREVENTIVA SLADKORNE BOLEZNI TIPA 1

Teoretično bi lahko poleg upoštevanja splošnih nasvetov za ohranjanje zdravja preprečili razvoj SBT1 tudi s spreminjanjem epigenetskih vzorcev, ki so povezani s pojavom SBT1, ali pa z inhibicijo imunskih aktivnosti, ki vodijo do bolezni (Esposito in sod., 2019). Po drugi strani pa se za odpravo disbioze in s tem povezanimi pozitivni učinki preučuje tudi uporaba probiotikov in prebiotikov ter celo njihovih kombinacij oz. sinbiotikov (Slika 2).

(20)

11 4.1 PROBIOTIKI, PREBIOTIKI IN SINBIOTIKI

Probiotiki so definirani kot živi mikroorganizmi, ki lahko v primernih odmerkih izboljšajo zdravje ljudi. Njihova uporaba postaja vse pomembnejša in številne raziskave osvetljujejo njihovo vlogo pri imunoloških, prebavnih in respiratornih procesih. Večinoma se kot probiotiki uporabljajo vrste rodov Lactobacillus in Bifidobacterium, v manjši meri pa tudi nekatere druge (Probiotics …, 2006). Dolpady in sod. (2016) so v svoji študiji uporabili z Lactobacillaceae obogaten probiotik VSL#3 samostojno ali v kombinaciji z retinojsko kislino, ki je zaščitil NOD miši pred SBT1 z vplivanjem na inflamosom v črevesju. VSL#3 inhibira izražanje vnetnega interlevkina IL-1𝛽 ter spodbuja izločanje pro-tolerogenih komponent inflamosoma.

Spremembe v črevesni imunosti NOD miši, ki so prejemale VSL#3, vključujejo izboljšano diferenciacijo tolerogenih CD103⁺ dendritičnih celic in zaviranje diferenciacije ter ekspanzije Th1 in Th17 celic v črevesni mukozi in v PLN. Poleg tega vpliva tudi na spremenjeno sestavo črevesne mikrobiote s povečanjem števila vrst debla Bacteroidetes, ki zagotavljajo zaščito pred vnetjem in avtoimunostjo. Ena od mednarodnih kohortnih študij TEDDY je preiskovala povezavo med prejemanjem probiotikov (različne kombinacije vrst rodov Lactobacillus in Bifidobacterium) v prvem letu življenja in avtoimunostjo otočkov pri otrocih s povečanim genetskim tveganjem za razvoj SBT1. V primerjavi z otroki, ki so prvič prejeli probiotik po 27 dneh ali pa ga sploh niso prejeli, so tisti, ki so ga prejeli pri starosti 27 dni ali še prej, imeli za 60 % znižano tveganje za razvoj SBT1, vendar zgolj otroci z DR3/4 genotipom (Uusitalo in sod., 2016). Rezultate lahko morda pojasni zmožnost probiotikov, da modificirajo črevesno mikrobioto zgolj pred predstavitvijo trdne hrane, ki ima dominanten vpliv na sestavo črevesne mikrobiote (Fallani in sod., 2011). Ker Lactobacillus johnsonii N6.2 zmanjša pojavnost SBT1 pri podganah, nagnjenih k diabetesu, so v pilotni študiji na 42 zdravih odraslih preizkusili varnost njegove uporabe in imunski odziv. Probiotik je vplival na povišano raven triptofana v serumu in posledično manjše razmerje kinurenina proti triptofanu, ki je sicer pri posameznikih s SBT1 povečano. Pretvorbo triptofana v kinurenin katalizira indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO), ki pa jo aktivirajo vnetni citokini. Kinurenin in nekateri metaboliti, ki izhajajo iz njega, so bili namreč povezani z okvarjeno sintezo, izločanjem in aktivnostjo inzulina. Po dobi izpiranja se je tudi preko IDO poti povečalo število monocitov in naravnih celic ubijalk (Oxenkrug, 2013; Marcial in sod., 2017).

Na črevesno mikrobioto pa lahko vplivamo tudi s skupino hranil, ki jih bakterije v črevesju razgrajujejo, in jih imenujemo prebiotiki. V glavnem se v ta namen uporabljajo fruktani in galaktani, ki obogatijo črevesno mikrobioto z Lactobacillus spp. ali/in Bifidobacterium spp.

(Gibson in sod., 2017). V raziskavi iz leta 2017 so primerjali učinek različnih vrst fruktanov inulinskega tipa (ITF), ki so naravne topne prehranske vlaknine iz cikorije z različno stopnjo fermentabilnosti, na razvoj SBT1 pri NOD miših. Prišli so do zaključka, da dolgoverižni ITF ne pa tudi kratkoverižni ITF upočasnijo razvoj SBT1, saj so pri miših, hranjenih z dolgoverižnimi ITF, opazili zaščito pred vnetjem Langerhansovih otočkov in odsotnost infiltracije imunskih celic. Dolgoverižni ITF vplivajo na razmerje Treg/Th17 celic v prid prvih in spodbujajo produkcijo modulatornih citokinov. Izboljšajo tudi črevesno imunsko homeostazo in integriteto črevesne pregrade s selektivno regulacijo proteinov tesnih stikov in antimikrobnega peptida β-defenzina-1. Poleg tega so pri miših, hranjenih z dolgoverižnimi ITF, zaznali povečano produkcijo SCFA ter bolj raznoliko in uravnoteženo črevesno mikrobioto (Chen in sod., 2017). Probiotiki in prebiotiki torej lahko ločeno pripomorejo k metabolizmu glukoze, da pa se njihova terapevtska učinkovitost še poveča, jih lahko uporabimo skupaj, kot

(21)

12

sinbiotike. Stenman in sod. (2015) so na samcih C57BI/6J miši preizkusili, ali probiotiki in prebiotiki v kombinaciji z zdravili vplivajo na glikemični nadzor in občutljivost na inzulin. Miši so prejele metformin (MET) ali sitagliptin (SITA), ki ju sicer uporabljajo posamezniki s sladkorno boleznijo tipa 2, brez dodatkov, s probiotikom Bifidobacterium animalis ssp. lactis 420, s prebiotikom polidekstrozo ali pa skupaj s prebiotikom in probiotikom. Dodatek probiotika je znatno zmanjšal glikemični odziv in koncentracijo glukoze v plazmi, polidekstroza pa je skupaj s SITA učinkoviteje zmanjšala glikemijo pri oralnem glukozno tolerančnem testu v primerjavi s samim SITA, kar bi lahko bila posledica zmožnosti polidekstroze, da poveča koncentracijo inkretina GLP-1 v portalni veni. Kombinacija probiotika in prebiotika pa je še bolj znižala koncentracijo glukoze na tešče.

4.2 EPIZDRAVILA

Zaradi spoznanj, da so epigenetske modifikacije morda povezane s SBT1, so se mnogi raziskovalci usmerili v razvoj t.i. epizdravil, ki lahko odpravijo epigenetske spremembe (Esposito in sod., 2019). Zheng in sod. (2009) so preizkusili vplive sredstva za demetilacijo DNA 5-Aza-2'-deoksicitidin (DAC). Majhne doze DAC, ki so jih miši prejemale krajše časovno obdobje, so inducirale demetilacijo gena FOXP3, ki je pomemben transkripcijski faktor za razvoj in delovanje Treg celic ter povečale njegovo izražanje v CD4⁺CD25^-FOXP3^- celicah.

Vse to je doprineslo k izboljšanju kliničnega poteka sladkorne bolezni pri CY-NOD miših.

Jayaraman in sod. (2013) pa so se usmerili na področje inhibitorjev histon acetilaz in z uporabo dobro karakteriziranega trihostatina A (TSA) učinkovito zmanjšali incidenco SBT1 pri samicah NOD miši. Poleg tega so izvedli še transkriptomsko analizo splenocitov miši, kjer so z uporabo TSA preprečili razvoj SBT1 pri nediabetičnih ter diabetičnih miših. Analiza je razkrila skupino 17 vnetnih genov, ki so imeli povečano izražanje pri diabetičnih miših, tretiranje miši s TSA pa je inhibiralo njihove izražanje. Ti geni nosijo zapis za različne lipaze in peptidaze, medtem ko remodeliranje kromatina ni imelo vpliva na izražanje genov, na katere najprej pomislimo pri genetski predispoziciji za SBT1, kot so geni za MHC molekule razreda I in II.

4.3 IMUNOTERAPIJE

Večina imunoterapij za preprečevanje pojava simptomatske faze bolezni oz. preventiva, za ohranjanje sposobnosti sinteze C-peptida po diagnozi in za dosego drugih pomembnih izboljšav v poteku SBT1 (npr. izboljšan HbA1c, preprečitev hipoglikemij, neodvisnost od terarpije z inzulinom) pri ljudeh z nedavno diagnozo, je bila usmerjena v prekinitev avtoimunskega procesa (Atkinson in sod., 2019). Quattrin in sod. (2020) so se osredotočili na golimumab, človeško monoklonsko protitelo proti TNF-𝛼, ki je bilo predhodno že potrjeno za zdravljenje drugih avtoimunskih bolezni. TNF-α je vnetni citokin, ki je vpleten v razvoj številnih bolezni, vključno z avtoimunskimi in je neposredno toksičen za beta celice (NCBI, 2020). V 2. fazi kliničnih študij so otroci in mladi odrasli z nedavno diagnozo SBT1 52 tednov subkutano prejemali golimumab ali pa placebo. Skupina, ki je prejemala golimumab, je imela večjo endogeno produkcijo inzulina in je potrebovala manjše doze eksogenega inzulina v primerjavi s skupino, ki je prejemala placebo, niso pa opazili nobenih razlik v HbA1c. Druga raziskovalna skupina pa je želela preizkusiti, ali jemanje inzulina pred pojavom SBT1 vpliva na potek bolezni. V študijo so bili vključeni sorodniki posameznikov s SBT1 v prvem in drugem kolenu, ki so dvakrat na dan subkutano prejemali majhne doze inzulina ter enkrat na leto štiridnevno kontinuirano intravenozno infuzijo inzulina. Na žalost taka obravnava ni upočasnila ali

(22)

13

preprečila razvoja SBT1, za kar bi bila lahko kriva prepozna intervencija glede na potek bolezni.

Poleg tega bi oralni vnos inzulina lahko imel večji imunološki vpliv, vendar je tudi klinična študija DPT-1, ki je potekala od 1994 do 2003, prišla do podobnih zaključkov pri oralni uporabi inzulina (Skyler in sod. 2002). Poleg inzulina je bil nedavno preizkušen vpliv še enega za SBT1 značilnega avtoantigena GAD, ki so ga sodelujoči v raziskavi prejeli v obliki treh intralimfatičnih injekcij v kombinaciji z oralnim vnosom vitamina D. V klinični študiji je sodelovalo več kot 100 mladih, na novo diagnosticiranih s SBT1 in s povišano vsebnostjo protiteles proti GAD69 v serumu. Žal vnos GAD-aluma ni vplival na produkcijo inzulina, je pa pozitivno vplival na podskupino z DR3-DQ2 varianto HLA genov, saj je pripomogel k ohranitvi C-peptida (Ludvigsson in sod., 2021). Glede na meta analizo iz lanskega leta sta za preprečitev propada beta celic najbolj učinkovita imunoglobulin proti humanim limfocitom T (ATG) in teplizumab (protitelo proti CD3) (Jacobsen in sod., 2020). ATG je imunomodulator, ki se sicer uporablja pri transplantacijah organov, vendar v večjih dozah kot za upočasnitev uničenja beta celic in preprečitev pojava SBT1. Pretočna citometrija je pokazala zmanjšano razmerje CD4:CD8 in povečano razmerje regulatornih T celic proti konvencionalnim T celicam v skupini, ki je prejemala ATG, ter nižji HbA1c (Haller in sod., 2019). Teplizumab je kazal velik potencial, vendar ni prešel klinične raziskave faze III. Avtorji menijo, da bi bili uspešnejši pri preprečitvi upada delovanja beta celice in zagotovitvi glikemične kontrole ter zmanjšanju potrebnih doz inzulina, če bi se osredotočili na novo diagnosticirane posameznike in otroke (Sherry in sod., 2011). Za uspešnost kliničnih raziskav je tako ključna tarčna populacija in določitev cilja (»end point«) raziskave.

Novejši pristop k imunoterapiji pa je terapija Stem Cell Educator (SCE), pri kateri se uporabijo pacientove lastne imunske celice, ki »se učijo« od matičnih celic iz popkovnične krvi in vplivajo na imunski sistem lokalno in tudi sistemsko. Pri tej terapiji spustijo pacientovo kri skozi separator krvnih celic, za kratek čas in vitro kokultivirajo njegove imunske celice z adherentnimi matičnimi celicami iz popkovnične krvi (CB-SC) ter »naučene« avtologne imunske celice vrnejo v krvni obtok pacienta. Klinična študija v 2. in 3. fazi, ki naj bi se zaključila letos decembra, ima velik potencial, saj je terapija SCE dosegla dolgotrajen preobrat avtoimunosti pri posameznikih s SBT1, vključno z višjo ravnjo C-peptida, znižanimi vrednostmi HbA1c in manjšo srednjo vrednostjo dnevne porabe inzulina. Študija potrjuje vlogo CB-SC pri učenju T celic in/ali T-reg celic v smislu trajno spremenjenega izražanja kostimulatornih molekul, povečanja populacij Treg celic in obnovitve ravnotežja Th1/Th2/Th3 citokinov, kar vse verjetno pripomore k izboljšanemu nadzoru nad avtoimunostjo pri SBT1 (Zhao in sod., 2009; Zhao in sod., 2012). Tudi slovenski zdravniki in raziskovalci sodelujejo v številnih študijah preprečevanja in zdravljenja SBT1, vključno z evropsko klinično in osnovno raziskovalno mrežo za preučevanje SBT1 – INNODIO. INNODIA je globalno partnerstvo 31 akademskih ustanov, šestih panožnih partnerjev, majhnega podjetja in dveh združenj oseb s sladkorno boleznijo. V okviru trenutno aktivnih raziskav določajo najvarnejši odmerek ATG, ki ga proizvaja Sanofi, in učinkovitost Novartisovega iscalimaba za ustavitev napredovanja bolezni pri otrocih, na novo diagnosticiranih s SBT1. VER-A-T1D pa v primerjavi s prej omenjenima študijama vključuje odrasle, nedavno diagnosticirane s SBT1, ki bodo prejemali verapamil, sicer zdravilo za povišan krvni tlak, ter preverjali njegov vpliv na napredovanje bolezni (Innodia, 2021).

(23)

14

Slika 2: Cikel propada beta celic pri SBT1 in možnosti za intervencijo v različnih fazah razvoja bolezni. ER:

endoplazmatski retikulum, GAD: dekarboksilaza glutaminske kisline, IAA: protitelesa proti inzulinu, GADA:

protitelesa proti GAD, IA2: tirozin fosfatazi podoben protein (povzeto po Martens in sod., 2021).

5 ZAKLJUČEK

Kljub temu da je sladkorna bolezen tipa 1 predmet raziskav že vrsto let, ključni vzrok za njen razvoj še ni pojasnjen. Za nekonsistentne rezultate je verjetno krivo tudi to, da je zaradi razlik v patologiji med posamezniki s SBT1 težko zagotoviti enake pogoje pri vseh študijah. Za zanesljivost rezultatov bi bilo treba študije izvesti na velikem številu otrok, ki bi jih morali spremljati od rojstva in skozi vse faze razvoja bolezni, kar pa je povezano s številnimi logističnimi omejitvami. K razumevanju veliko pripomorejo tudi študije na živalskih modelih, sploh NOD miših, vendar zaradi razlik v poteku bolezni izsledkov ne moremo neposredno prevesti na človeka. Poleg tega se strinjam z mnenjem številnih znanstvenikov, da v ozadju bolezni ni en sam dejavnik, temveč gre za povezavo več različnih dejavnikov. Tudi ti se lahko razlikujejo od posameznika do posameznika in v določeni kombinaciji sprožijo razvoj zgolj pri eni osebi z določeno genetsko predispozicijo, ne pa tudi pri drugi, zato je skoraj nemogoče opredeliti en sam razlog. Na splošno se zadnja leta v medicini preusmerjajo v vse bolj individualiziran pristop do pacientov, kar je verjetno povezano ravno s spoznanjem, da je za številne bolezni značilna velika raznolikost in da je pri terapiji treba upoštevati posameznikov genotip, okolje in slog življenja. Zagotovo pa igra pri številnih boleznih, sploh avtoimunskih, pomembno vlogo črevesna mikrobiota, saj je tesno povezana s črevesno imunostjo in številnimi drugimi fiziološkimi procesi. Za boljše razumevanje te povezave na molekularni ravni ima velik pomen razvoj standardiziranih in ponovljivih metod za odvzem, hranjenje in procesiranje vzorcev. Z rezultati odkrivajo vedno nova tarčna mesta, kjer bi z intervencijo lahko odložili razvoj SBT1 ali ga celo preprečili, ter razvijajo nove terapij, ki bodo še dodatno olajšale življenje »sladkorčkov«.

(24)

15 6 VIRI

Al Theyab A., Almutairi T., Al-Suwaidi A. M., Bendriss G., McVeigh C., Chaari A. 2020.

Epigenetic effects of gut metabolites: exploring the path of dietary prevention of type 1 diabetes. Frontiers in Nutrition, 7, 563605, doi: 10.3389/fnut.2020.563605: 22 str.

Anagandula M., Richardson S. J., Oberste M. S., Sioofy-Khojine A.-B., Hyöty H., Morgan N.

G., Korsgren O., Frisk G. 2014. Infection of human islets of langerhans with two strains of coxsackie B virus serotype 1: Assessment of virus replication, degree of cell death and induction of genes involved in the innate immunity pathway: Enterovirus Infection of Human Islets of Langerhans. Journal of Medical Virology, 86, 8: 1402–1411

Antvorskov J. C., Halldorsson T. I., Josefsen K., Svensson J., Granström C., Roep B. O., Olesen T. H., Hrolfsdottir L., Buschard K., Olsen S. F. 2018. Association between maternal gluten intake and type 1 diabetes in offspring: national prospective cohort study in Denmark. The BMJ, k3547, doi: 10.1136/bmj.k3547: 9 str.

Antvorskov J. C., Fundova P., Buschard K., Funda D. P. 2013. Dietary gluten alters the balance of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in T cells of BALB/c mice.

Immunology, 138, 1: 23–33

Atkinson M. A., Roep B. O., Posgai A., Wheeler D. C. S., Peakman M. 2019. The challenge of modulating β-cell autoimmunity in type 1 diabetes. The Lancet Diabetes &

Endocrinology, 7, 1: 52–64

Bahar Halpern K., Veprik A., Rubins N., Naaman O., Walker M. D. 2012. GPR41 gene expression is mediated by internal ribosome entry site (IRES)-dependent translation of bicistronic mRNA encoding GPR40 and GPR41 proteins. Journal of Biological Chemistry, 287, 24: 20154–20163

Bosi E., Molteni L., Radaelli M. G., Folini L., Fermo I., Bazzigaluppi E., Piemonti L., Pastore M. R., Paroni R. 2006. Increased intestinal permeability precedes clinical onset of type 1 diabetes. Diabetologia, 49, 12: 2824–2827

Brown C. T., Davis-Richardson A. G., Giongo A., Gano K. A., Crabb D. B., Mukherjee N., Casella G., Drew J. C., Ilonen J., Knip M., Hyöty H., Veijola R., Simell T., Simell O., Neu J., Wasserfall C. H., Schatz D., Atkinson M. A., Triplett E. W. 2011. Gut microbiome metagenomics analysis suggests a functional model for the development of autoimmunity for type 1 diabetes. PLoS ONE, 6, 10: e25792, doi: 10.1371/journal.pone.0025792: 9 str.

Bull M. J., Plummer N. T. 2014. Part 1: The human gut microbiome in health and disease.

Integrative Medicine, 13, 6: 17-22

Carol M., Lambrechts A., Gossum A. V., Libin M., Goldman M., Mascart-Lemone F. 1998.

Spontaneous secretion of interferon and interleukin 4 by human intraepithelial and lamina propria gut lymphocytes, 42: 643-649

Cebra J. J. 1999. Influences of microbiota on intestinal immune system development. The American Journal of Clinical Nutrition, 69, 5: 1046s–1051s

Chen K., Chen H., Faas M. M., de Haan B. J., Li J., Xiao P., Zhang H., Diana J., de Vos P., Sun J. 2017. Specific inulin-type fructan fibers protect against autoimmune diabetes by

(25)

16

modulating gut immunity, barrier function, and microbiota homeostasis. Molecular Nutrition & Food Research, 61, 8: 1601006, doi: 10.1002/mnfr.201601006: 11 str.

Chowdhury S., Goswami S. 2020. COVID-19 and type 1 diabetes: dealing with the difficult duo. International Journal of Diabetes in Developing Countries, 40, 3: 315–320

Chung H. L., Lee J. J., Kim S. G. 2003. Cow’s milk protein induced changes in the expression of HLA-DR antigens on colonic epithelial cells. Annals of Allergy, Asthma &

Immunology, 90, 3: 348–350

Cui G., Zhang Y., Gong Z., Zhang J. Z., Zang Y. Q. 2009. Induction of CD4+CD25+Foxp3+

regulatory T cell response by glatiramer acetate in type 1 diabetes. Cell Research, 19, 5:

574–583

Cummings J. H., Pomare E. W., Branch W. J., Naylor C. P., Macfarlane G. T. 1987. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut, 28, 10:

1221–1227

Dolpady J., Sorini C., Di Pietro C., Cosorich I., Ferrarese R., Saita D., Clementi M., Canducci F., Falcone M. 2016. Oral probiotic VSL#3 prevents autoimmune diabetes by modulating microbiota and promoting indoleamine 2,3-dioxygenase-enriched tolerogenic intestinal Environment. Journal of Diabetes Research, 2016, doi: 10.1155/2016/7569431: 12 str.

Elias K. M., Laurence A., Davidson T. S., Stephens G., Kanno Y., Shevach E. M., O’Shea J.

J. 2008. Retinoic acid inhibits Th17 polarization and enhances FoxP3 expression through a Stat-3/Stat-5 independent signaling pathway. Blood, 111, 3: 1013–1020

Esposito G., Cirillo C., Sarnelli G., De Filippis D., D’Armiento F. P., Rocco A., Nardone G., Petruzzelli R., Grosso M., Izzo P., Iuvone T., Cuomo R. 2007. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology, 133, 3: 918–

925

Esposito S., Toni G., Tascini G., Santi E., Berioli M. G., Principi N. 2019. Environmental factors associated with type 1 diabetes. Frontiers in Endocrinology, 10, 592, doi:

10.3389/fendo.2019.00592: 12 str.

de Jersey J., Snelgrove S. L., Palmer S. E., Teteris S. A., Mullbacher A. 2006. β Cells cannot directly prime diabetogenic. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104, 4, 1295-1300

Fallani M., Amarri S., Uusijarvi A., Adam R., Khanna S., Aguilera M., Gil A., Vieites J. M., Norin E., Young D., Scott J. A., Doré J., Edwards C. A., the INFABIO team. 2011.

Determinants of the human infant intestinal microbiota after the introduction of first complementary foods in infant samples from five European centres. Microbiology, 157, 5:

1385–1392

Fan P., Liu P., Song P., Chen X., Ma X. 2017. Moderate dietary protein restriction alters the composition of gut microbiota and improves ileal barrier function in adult pig model.

Scientific Reports, 7, 1: 43412, doi: 10.1038/srep43412: 12 str.

Gavin J.R., Alberti K.G.M.M., Mayer M.D., Davidson B., DeFronzo R.A., Drash A., Gabbe S.G., Genuth S., Harris M.I., Kahn R., Keen H., Knowler W.C., Lebovitz H., Maclaren N.K., Palmer J.P., Raskin P., Rizza R.A., Stern M.P. 1997. Report of the Expert committee on the diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care, 20, 7: 1183–1197