UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
MAGISTRSKO DELO
Neža Gaube
2021
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE
BIOKEMIJA
Vpliv antioksidantov in odsotnosti stefina B na oksidativni stres pri primarnih mišjih PyMT rakavih celicah
MAGISTRSKO DELO
Neža Gaube
Mentor: prof. ddr. Boris Turk
2021
IZJAVA O AVTORSTVU
magistrskega dela
Spodaj podpisana Neža Gaube sem avtorica tega magistrskega dela z naslovom
Vpliv antioksidantov in odsotnosti stefina B na oksidativni stres pri primarnih mišjih PyMT rakavih celicah.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je magistrsko delo izključno rezultat mojega lastnega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. ddr. Borisa Turka;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorskih in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. List RS, št. 16/2007));
• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, 22.06.2021 Podpis avtorice
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biokemija.
Delo je bilo opravljeno na Institutu »Jožef Stefan« pod skrbništvom dr. Nežke Kavčič.
Senat UL FKKT je za mentorja imenoval prof. ddr. Borisa Turka.
Recenzentki: prof. dr. Brigita Lenarčič in doc. dr. Vera Župunski
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela:
Predsednica komisije: prof. dr. Brigita Lenarčič
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Članica: doc. dr. Vera Župunski
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Član: prof. ddr. Boris Turk
Institut »Jožef Stefan«, Oddelek za Biokemijo, molekularno in strukturno biologijo
Najprej bi se rada iskreno zahvalila prof. ddr. Borisu Turku za omogočeno izvedbo magistrske naloge in strokovni pregled dela.
Zahvaljujem se predsednici komisije prof. dr. Brigiti Lenarčič in članici komisije doc. dr.
Veri Župunski za hiter in temeljit pregled magistrske naloge.
Hvala dr. Mihi Butinarju za pomoč pri začetkih in uvajanje v delo.
Posebna zahvala gre moji delovni mentorici dr. Nežki Kavčič za vso pomoč, prijaznost, vzpodbude, potrpežljivost, strokovnost in usmerjanje pri izdelavi magistrske naloge.
Nežka, hvala za vse!
Hvala vsem prijateljem, ki ste kakorkoli pripomogli k nastanku magistrske naloge. Zlati ste!
Hvala družini za vso podporo, pomoč, spodbude in razumevanje.
Hvala Leonardu za vse dragocene skupne trenutke, spodbudne besede in neomajno podporo.
Vpliv antioksidantov in odsotnosti stefina B na oksidativni stres pri primarnih mišjih PyMT rakavih celicah
Povzetek
Oksidativni stres je definiran kot porušeno razmerje med reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS) in antioksidanti. V nekaterih študijah so nakazali povezavo med občutljivostjo celic na oksidativni stres in stefinom B, ki je endogeni inhibitor cisteinskih katepsinov. V raziskovalni nalogi smo zato želeli potrditi vpliv stefina B na oksidativni stres sprožen s H2O2 na modelu primarnih tumorskih celic MMTV-PyMT divjega tipa in z izbitim genom za stefin B. Celice z izbitim genom za stefin B so imele po tretmaju s H2O2 signifikantno večji delež mrtvih celic kot celice divjega tipa, vendar pri tem nismo izmerili kaspazne aktivnosti. Pokazali smo, da tretma s H2O2 v celicah z izbitim genom za stefin B hitro dvigne nivo ROS in povzroči oksidacijo kardiolipina. Tretma je vplival tudi na povišanje pH v lizosomih, vendar smo z uporabo inhibitorja cisteinskih proteaz ugotovili, da katepsini najverjetneje nimajo glavne vloge pri celični smrti sproženi s H2O2. Dodatek antioksidanta N-acetyl-cisteina je izboljšal viabilnost celic in omejil nastanek ROS. Dodatek antioksidanta vitamina C pa na nastanek ROS ni vplival, viabilnost celic pa je celo poslabšal. Na podlagi teh rezultatov smo sklepali, da niso vsi antioksidanti enako učinkoviti in da je njihova učinkovitost odvisna od številnih dejavnikov (npr. uporabljene koncentracije antioksidanta in vrste nastalih ROS).
Zaključimo lahko, da v našem celičnem modelu s H2O2 nismo sprožili apoptoze, ampak neko drugo obliko celične smrti. Najverjetneje pride v celicah z odsotnim stefinom B do aktivacije NLRP3 inflamasoma in od ROS-odvisne celične smrti (npr. feroptoza), kar bi lahko potrdili v nadaljevanju raziskovalne naloge.
Ključne besede
:
stefin B, H2O2, ROS, celična smrt, antioksidantInfluence of antioxidants and Stefin B depletion on oxidative stress in mouse mammary PyMT cancer cells.
Abstract
Oxidative stress is defined as an imbalance between reactive oxygen species (ROS) and antioxidants. Some studies have suggested an association between cell sensitivity to oxidative stress and stefin B, an endogenous inhibitor of cysteine cathepsins. In this research, we wanted to confirm the effect of stefin B on oxidative stress induced by H2O2
in a model of wild-type primary tumour cells MMTV-PyMT and in cells with the knocked-out gene for stefin B. Cells with the knocked-out gene for stefin B had a significantly higher proportion of dead cells after treatment with H2O2 as wild-type cells, however, we did not measure caspase activity. We have shown that treatment with H2O2
in cells with the knocked-out gene for stefin B rapidly raises reactive oxygen species and causes cardiolipin oxidation. The treatment also affected raising the pH in lysosomes, but inhibiting cathepsin with a cysteine protease inhibitor showed no effect; therefore, cathepsins most likely do not play an essential role in H2O2-induced cell death. The addition of the antioxidant N-acetyl-cysteine improved cell viability and limited the formation of ROS. The addition of the antioxidant vitamin C did not affect ROS formation and has even lowered cell viability. Based on these results, we concluded that not all antioxidants are equally effective and that their effectiveness depends on many factors (e.g., antioxidant concentrations used and ROS type). We can conclude that we did not trigger apoptosis in our cell model by H2O2 treatment but some other form of cell death.
Activation of NLRP3 inflammasome and ROS-dependent cell death (e.g., ferroptosis) are most likely to occur in cells with absent stefin B, which could be confirmed in continuation the research task.
Keywords: stefin B, H2O2, ROS, cell death, antioxidant
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Rak ... 1
1.2 Celična smrt ... 2
1.3 Oksidativni stres in antioksidanti ... 3
1.4 Proteaze ... 5
1.4.1 Katepsini ... 5
1.4.2 Cisteinski katepsini ... 5
1.4.3 Cisteinski katepsini pri raku in celični smrti ... 6
1.5 Katepsinski inhibitorji ... 6
1.5.1 Stefin B ... 7
1.5.2 Stefin B in bolezni ... 8
1.5.3 Stefin B in oksidativni stres ... 8
2 Namen dela in hipoteza ... 9
3 Materiali in metode ... 10
3.1 Materiali ... 10
3.1.1 Celična kultura ... 10
3.1.2 Gojišče ... 10
3.1.3 Kemikalije ... 10
3.1.4 Protitelesa ... 11
3.1.5 Laboratorijska oprema ... 11
3.1.6 Pufri ... 13
3.2 Metode ... 14
3.2.1 Odmrzovanje celic ... 14
3.2.2 Gojenje in precepljanje celic ... 14
3.2.3 Štetje celic... 14
3.2.4 Zamrzovanje celic... 14
3.2.5 Potrjevanje genotipa celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B 14 3.2.6 Določanje vpliva H2O2, antioksidantov in inhibitorjev na celice ... 16
3.2.7 Meritve na pretočnem citometru... 16
3.2.8 Priprava celičnih lizatov in analiza proteinov ... 18
3.2.9 Statistična analiza rezultatovna ... 21
4 Rezultati ... 22
4.1 Potrditev genotipa mišjih celic ... 22
4.2 Določanje deleža mrtvih celic ... 23
4.3 Kaspazna aktivnost ... 26
4.4 Določanje deleža celic s poškodovanimi lizosomi ... 27
4.5 Določanje vpliva inhibitorja katepsinov ... 29
4.6 Določanje nastanka ROS ... 30
4.7 Določanje oksidacije kardiolipina ... 31
4.8 Vpliv antioksidantov na celično smrt sproženo s H2O2 ... 33
4.8.1 Določanje deleža mrtvih celic v prisotnosti antioksidantov ... 33
4.8.2 Določanje deleža celic s poškodovanimi lizosomi ob dodatku antioksidantov ... 34
4.8.3 Določanje nastanka ROS ob dodatku antioksidantov... 36
4.8.4 Določanje oksidacije kardiolipina ob dodatku antioksidantov ... 37
5 Razprava ... 38
5.1 Pot celične smrti ... 38
5.2 Vpliv antioksidantov ... 41
6 Zaključek ... 43
7 Literatura ... 44
Seznam kratic
ACD – naključna celična smrt (ang. accidental cell death) AO – akridin oranž
ATP – adenozin trifosfat Baf – bafilomicin
bp – bazni par
BSA – goveji serumski albumin (ang. bovine serum albumin) CAT – katalaza
DAMP – molekularni vzorci povezani s poškodbo (ang. damage associated molecular patterns)
DMEM – Dulbeccov spremenjeni medij Eagle (ang. Dulbecco's Modified Eagle Medium)
DNA – deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxiribonucleic acid)
DPBS – Dulbeccov fosfatni pufer (ang. Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) DT – divji tip primarnih celic iz tumorja mlečne žleze MMTV-PyMT
DTT – ditiotreitol
ECM – zunajcelični matriks (ang. extracellular matrix)
EDTA – Etilendiamintetraocetna kislina (ang. ethylenediaminetetraacetic acid) EPM1 – progresivna mioklonična epilepsija
ER – endoplazemski retikulum
GAPDH – gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza GPX – glutation peroksidaza
MD – menadion
MMTV-PYMT – mišji model raka mlečne žleze MMTV-PyMT (ang. mouse mammary tumor virus-Polyoma virus middle T oncogene)
NAC – N-acetil cistein
NaDS-PAGE – poliakrilamidna gelska elektroforeza z natrijevim dodecil sulfatom NAO – nonil akridin oranž
NF-κB – jederni faktor κB
PCD – programirana celična smrt (ang. programmed cell death) PCR – verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) PI – propidijev jodid
RCD – regulirana celična smrt (ang. regulated cell death)
RIPA – pufer za radioimunoprecipitacijo (ang. radio-imunoprecipitation assay buffer) ROS – reaktivne kisikove spojine (ang. reactive oxygen species)
SOD – superoksid dismutaza
StfB-/- – primarne celice iz tumorja mlečne žleze MMTV-PyMT z izbitim genom za stefin B
STS – staurosporin
TNF – dejavnik tumorske nekroze (ang. tumor necrosis factor) UPR – odziv na nezvite proteine (ang. unfolded protein response) vitC – vitamin C
1
1 Uvod 1.1 Rak
Rak je eden od najpogostejših vzrokov smrti po celem svetu. Z rastjo ter staranjem populacije in načinom življenja (npr. slabša prehrana, kajenje, fizična neaktivnost ...) se bo najverjetneje pojavnost rakavih obolenj še naprej večala. Najpogosteje diagnosticirani vrsti raka sta kolorektalni in pljučni rak, ki predstavlja tudi najvišji odstotek smrtnosti med rakavimi obolenji. Pri moških je zelo pogost še rak prostate, pri ženskah pa rak dojk [1]. S spodbujanjem zdravega življenjskega sloga in z metodami za zgodnjo detekcijo raka, je bil narejen velik napredek na področju preventive in izboljšanja možnosti ozdravitve rakavih bolnikov [2].
Rakavo tkivo sestavlja heterogena populacija celic [3]. Rakave celice nastanejo preko genetskih sprememb in jih lahko opišemo s šestimi glavnimi značilnostmi:
- izognitev programirani celični smrti (apoptozi);
- sposobnost invazije v okoliško tkivo in metastaziranja;
- neomejena zmožnost podvajanja;
- sposobnost angiogeneze (tvorjenja lastnega ožilja);
- neobčutljivost na signale za zaviranje rasti celic;
- samopreskrba rakavih celic z rastnimi faktorji [4].
Neomejena proliferacija vodi v nastanek tumorja ali neoplazmo. Če je ta masa celic omejena na enem mestu, je tumor benigen. Ko pa tumorske celice razvijejo sposobnost invazije v sosednja tkiva, govorimo o malignem tumorju. Maligni tumorji običajno razvijejo metastaze – sekundarne tumorje na drugih mestih v telesu [5]. Rakave celice se dobro prilagodijo na hipoksično okolje. Hipoksija vpliva na transkripcijo nekaterih faktorjev, ki vplivajo na ekspresijo večih genov, vpletenih v angiogenezo [6,7]. Tumorska vaskularna mreža se razlikuje od žil v preostalih tkivih, saj so tumorske žile običajno razširjene, neorganizirane in nepravilnih oblik. Žile v tumorjih so tudi bolj prepustne in imajo torej slabši krvni pretok [8].
Klasične terapije za zdravljenje raka so kemoterapija, kirurška odstranitev in radiacija.
Pojavljati so se začele v sredini 20. stoletja. Kirurška odstranitev in radioterapija sta bili v 60. letih 20. stoletja temelj zdravljenja za trdne tumorje, kar je vodilo v omejeno število ozdravljenih pacientov zaradi mikrometastaz. Pogosto se za zdravljenje uporablja tudi kombinacija različnih terapij. Konvencionalne terapije učinkovito uničujejo rakave celice, vendar vplivajo tudi na zdravo tkivo in celice. V zadnjih dvajsetih letih pa se je znanje o molekularni in tumorski biologiji še povečalo, kar je precej spremenilo načine zdravljenja raka. Pojavile so se različne tarčne terapije (npr. imunoterapija in genska terapija), ki pa imajo za razliko od klasičnih terapij manj stranskih učinkov [7,9,10].
2
1.2 Celična smrt
Razvoj rakavih obolenj temelji na porušenem razmerju med celično proliferacijo in celično smrtjo. Motnje v uravnavanju celične smrti lahko podaljšujejo življenjsko dobo celice in s tem sodelujejo pri nastanku tumorja in razvoju raka [11]. Celice lahko umrejo preko regulirane celične smrti (RCD) ali pa naključne celične smrti (ACD). ACD lahko sprožijo fizikalni (npr. visok pritisk, temperatura …), kemijski (npr. velika sprememba v pH) ali mehanski (strižne sile) dejavniki [12]. Pri ACD ne pride do aktivacije specifične regulirane signalne kaskade, na katero bi lahko vplivali. Lahko pa zaradi hudih zunanjih vplivov pride do povečane količine molekularnih vzorcev povezanih s poškodbo (DAMP). Ti pa lahko vodijo do aktivacije imunskega odziva. Tipična naključna celična smrt je nekroza [13].
Nekroza je definirana kot nekontrolirana oblika celične smrti. Običajno so v njen potek vpleteni številni pro-vnetni proteini (npr. jedrni faktor κB (NF- κB)). Pri nekrotični celični smrti se celica napihne, celična membrana poči in vsebina celice se razlije v okolje celice, kar v organizmu vodi do aktivacije vnetne kaskade. Za potek nekroze za razliko od apoptoze ni potrebna energija [14]. V zadnjih dvajsetih letih so definirali kar nekaj novih oblik celične smrti ter predpostavili, da obstajajo tudi regulirane oblike nekroze [12,15].
Najbolj preučevane regulirane oblike nekroze so nekroptoza, feroptoza in piroptoza. Pri vseh gre za litično obliko celične smrti. Pride do prepustnosti celične membrane, citosolne komponente se sprostijo v okolje celice in lahko pride tudi do vnetja in imunskega odziva [16]. Oblike celične smrti se med seboj razlikujejo po sprožilcu in kaskadi, ki pripelje do celične smrti. Pri nekroptozi zaradi vezave induktorja (npr. TNFα) pride do aktivacije RIPK1, RIPK3 in MLKL. Fosforiliran MLKL pa oligomerizira in poškoduje celično membrano, kar vodi do sprostitve DAMP in vnetnega odziva. Nekroptozo lahko prepreči inhibitor Nec-1[17,18]. Feroptozo pa sproži oksidativni stres znotrajceličnega mikrookolja. Sprožijo jo lahko različni induktorji (npr. erastin in RSL3). Za to obliko celične smrti so značilni povišani ROS in oksidacija lipidov. Znotrajcelični ROS namreč lahko oksidirajo PUFA, kar vodi preko inaktivacije glutation peroksidaze 4 do peroksidacije lipidov in feroptoze. Do povišanja ROS pride zaradi železa, zato lahko feroptozo preprečijo kelatorji železa. Poleg le-teh pa jo lahko preprečijo tudi lipofilni antioksidanti (npr. ferrostatin). [19]. Vloga litičnih smrti pri raku je zapletena, saj le-te lahko spodbudijo močan odziv adaptivnega odziva imunskega sistema, ki se lahko bori proti tumorju. Hkrati pa lahko ravno vnetni odziv stimulira tumorogenezo in nastanek metastaz [20].
Do RCD pa pride zaradi aktivacije regulirane signalne kaskade. Kadar pride do RCD v fizioloških pogojih, govorimo o programirani celični smrti (PCD). Najbolj raziskana programirana celična smrt je apoptoza [15].
Apoptoza je programirana celična smrt, ki so jo definirali že 1972 [21]. Zanjo je značilno, da se zaradi določenega apoptotskega signala celica preneha deliti in rasti ter vstopi v
3
proces celične smrti. Pri apoptozi za razliko od nekrotičnih oblik celične smrti, celična membrana ohrani svojo integriteto. Apoptoza se lahko sproži po intrinzični poti zaradi motenj metabolizma ali celičnega cikla (npr. ROS). Lahko pa se sproži po ekstrinzični poti, kjer pride do interakcije s transmembranskim receptorjem iz družine receptorjev dejavnikov tumorske nekroze (TNF). Obe poti apoptoze v večceličnih organizmih zagotavljata odstranjevanje celic [14]. Apoptozo lahko od nekroze ločimo že pod svetlobnim mikroskopom, saj se v zgodnji apoptozi celice vidno skrčijo in nastanejo apoptotska telesca. Na molekularnem nivoju pa aktivacija efektorskih kaspaz 3 in 7 vodi v DNA fragmentacijo, degradacijo jedrnih in citoskeletnih proteinov in zamreženja proteinov. Opisali so že različne proapoptotske in antiapoptotske proteine. Pri porušenem razmerju le-teh lahko pripomorejo k zmanjšanju apoptoze v malignih celicah in s tem k hitrejšemu razvoju raka. Npr. povišano izražanje antiapoptotskih proteinov iz družine BCL-2 je pogosto povezano s slabšo prognozo, odpornostjo na terapijo in večjo možnostjo za ponovljivost raka [22]. Po drugi strani je pa zmanjšana raven kaspaz povezana z manj apoptoze in kancerogeneze pri različnih rakavih obolenjih. Npr.
pokazali so, da je pri raku na jajčnikih, na dojkah in materničnem vratu pogosto znižana raven kaspaze 3. Ob zvišanju ravni le-te pa pride do povečane apoptoze in boljšega odziva na zdravljenje [23].
1.3 Oksidativni stres in antioksidanti
Reaktivne kisikove spojine (ROS) in tudi reaktivne dušikove spojine (RNS) so lahko koristne ali pa škodljive v bioloških sistemih. Imajo namreč fiziološko vlogo v številnih celičnih odzivih in signalnih poteh (npr. mitohondrijski ROS aktivirajo HIF1a). V primeru porušenega razmerja med nastankom ROS in njihovo nevtralizacijo z antioksidanti pride do nastanka oksidativnega stresa. Porušeno razmerje vodi do poškodb različnih celičnih makromolekul, kot so lipidi, proteini in nukleinske kisline, kar vpliva na delovanje celice in celotnega organizma [24]. Med ROS spadajo vodikov peroksid (H2O2), superoksidni anion (O2-) in hidroksilni radikal (·OH), ki so zelo reaktivni [25]. V živalskih celicah so glavni viri nastanka ROS mitohondrij, endoplazemski retikulum (ER), peroksisom in citokrom P450 v citosolu [26]. Večina ROS nastane v mitohondrijih v hipoksičnih signalnih poteh pri nepopolni redukciji kisika [24].
Oksidativni stres ima pomembno vlogo pri razvoju različnih bolezni. Ena izmed njih je tudi rak. Pri raku je vloga ROS odvisna od njihove koncentracije. Pri nizkih do zmernih ravneh ROS delujejo kot mutageni dejavnik za genomsko DNA in signalne molekule.
Kot slednje lahko delujejo pri proliferaciji, diferenciaciji in aktivaciji odziva na stresno okolje. ROS lahko namreč stimulirajo fosforilacijo različnih kinaz (npr. z mitogenom aktivirano protein kinaza in z zunajceličnim signalom regulirano kinaza ), ki so povezane z rastjo in preživetjem tumorskih celic. Prav tako lahko inaktivirajo tumor-supresorske molekule (npr. fosfataza) in aktivirajo antioksidantni obrambni mehanizem, ki je povezan z razvojem tumorskih celic, ki so odporne na nekatere terapevtike. Visoke koncentracije ROS običajno sprožijo celično smrt tako v rakavih kot v nerakavih celicah zaradi poškodb
4
celičnih komponent. V nekaterih primerih pa visoka koncentracija ROS lahko deluje kot dodaten selekcijski dejavnik. Tumorske celice, ki imajo boljši antioksidativni obrambni sistem, preživijo in lahko metastazirajo. Poznavanje nastanka ROS in delovanje antioksidacijskega sistema v tumorskih celicah je zato izrednega pomena za uvajanje ustrezne terapije in predvidevanje učinka zdravljenja [24,27].
Visoke koncentracije ROS povezujejo z različnimi oblikami celične smrti. Pri notranji poti apoptoze lahko ROS delujejo kot sprožilci, saj poškodujejo mitohondrijsko DNA, oksidirajo proteine in vplivajo na aktivnost citokroma C. Citokrom C pa oksidira kardiolipin, ki se veže na zunanjo mitohondrijsko membrano in posledično pride do vezave proapoptotskih proteinov Bax in Bak. Pri zunanji poti apoptoze pa lahko ROS delujejo kot ojačevalec signala. Npr. pri TNF sproženi celični smrti pride do aktivacije ASK1 preko Daxx. ASK1 fosforilira JNK, ki inhibira antiapoptostki Bcl2. Posledično poteče celična smrt preko mitohondrijske notranje poti, kjer spet igrajo pomembno vlogo proteini Bax, Bad in Bid [22,28]. Pri nekroptozi sproženi s TNF pa pride do aktivacije RIPK1/3 in fosforilacije MLKL, kar vodi do nastanka ROS. ROS so ključni za aktivacijo NF-κB signalne poti. Pokazali so, da dodan H2O2 vpliva na fosforilacijo IκBα na tirozinskem ostanku, čemur sledi razgradnja IκBα in aktivacija NF-κB signalne poti [18,29].
Da do poškodb znotraj celice ne pride, antioksidanti uravnavajo količino ROS v celicah [24,30]. Antioksidante delimo na endogene in eksogene. Endogeni antioksidanti v celicah se delijo na encimske in neencimske antioksidante. Glavni encimski antioksidantni, ki so direktno vpleteni v nevtralizacijo ROS, so superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT) in glutation peroksidaza (GPX). SOD katalizira redukcijo O2- do H2O2. CAT pretvori H2O2 do H2O in O2. Pretvorba H2O2 z GPX do H2O pa poteče preko glutationa [31].
Posamezen ROS nevtralizira en encimski antioksidant. Za nekatere ROS pa ne obstaja ustrezen encimski antioksdantni sistem, ampak njihovo raven uravnavajo tudi neencimski antioksidanti. Tak ROS je recimo zelo reaktiven ·OH, ki pa ga lahko nevtralizirajo flavonoidi [32]. Metabolni antioksidanti nastanejo v organizmu (glutation, koencim Q10), vendar nimajo encimske aktivnosti. Eksogene antioksidante, ki jih vnesemo s prehrano (vitamin C, N-acetil cistein in vitamin E), prav tako prištevamo med neencimske antioksidante [31,33].
Vitamin C (vitC) je donor elektronov in zato lahko reducira spojine z neparnimi elektroni, kot sta recimo O2- in ·OH. Antioksidacijske učinke vitC so pokazali le in vitro [34,35].
Učinek vitamina C je odvisen od njegove koncentracije. Pri nizkih koncentracijah deluje kot antioksidant, pri visokih koncentracijah pa ima oksidativni učinek, saj vodi do nastanka H2O2, ki lahko poškoduje celice [36].
Antioksidant N-acetil cistein (NAC) pa je sintetičen prekurzor glutationa, ki je eden pomembnejših antioksidantov. NAC je aminokislina s tiolno skupino, ki lahko prosto prehaja skozi celično membrano. NAC lovi proste radikale z direktno interakcijo z ROS
5
preko redoks potenciala tiolne skupine ali pa indirektno z višanjem ravni glutationa v celici. V klinični uporabi je že več kot 30 let za zdravljenje različnih patoloških stanj [37].
Povezali so ga že z izboljšanjem preživetja celic pri raziskavah celične smrti [38].
Raziskovali so ga tudi pri raku in ugotovili, da je preprečil tudi in vivo kancerogenezo, invazijo in metastaze epitelijskih celic ter angiogenezo [39].
1.4 Proteaze
Proteaze (peptidaze, proteinaze) so proteolitični encimi, ki cepijo peptidno vez med dvema aminokislinama. Običajno so dobro regulirane. Pri določenih boleznih, kot so rak, kardiovaskularne bolezni, vnetne bolezni, osteoporoza in nevrološke motnje, pa lahko pride do nepravilne regulacije proteaz, zato bi bile lahko proteaze ključne pri tarčnem zdravljenju [40]. Proteaze predstavljajo kar 10 % vseh encimov v človeku [41].
1.4.1 Katepsini
Katepsini spadajo med proteaze in jih glede na aminokislinski ostanek, ki deluje kot nukleofil, delimo na serinske, cisteinske in aspartilske proteaze. Ključni so pri različnih procesih v človeškem telesu (prebava, koagulacija, imunski odziv …). Njihova aktivnost je natančno regulirana z različnimi endogenimi in eksogenimi inhibitorji. Z disregulacijo katepsinov so povezali že različne bolezni (artritis, Alzheimerjeva bolezen, rak …) [42].
1.4.2 Cisteinski katepsini
Cisteinski katepsini so cisteinske proteaze, ki so aktivne v rahlo kislem okolju. Večinoma jih najdemo v lizosomih. Kot vse cisteinske proteaze imajo tudi cisteinski katepsini v aktivnem mestu cisteinski aminokislinski preostanek, ki deluje kot nukleofil, in histidinski aminokislinski preostanek za prenos protonov [43,44]. Trenutno je znanih 11 človeških katepsinov: B, H, L, S, C, K, O, F, V, X/Z in W. Najbolj stabilni in aktivni so pri kislem pH; izjema je katepsin S, ki je stabilen tudi pri pH 7 [43,45]. Katepsini B, C, F, H, L, O in X se izražajo v vseh človeških tkivih in celicah, drugi pa imajo tudi bolj specifično mesto izražanja (npr. katepsin K se izraža v osteoklastih in sinovialnih fibriblastih; katepsin S v imunskih celicah; itd.) [46–48].
Večina lizosomskih katepsinov je monomerov, velikih okoli 30 kDa. Izjema je katepsin C, ki je tetramer z 200 kDa. Večina je endopeptidaz. Eksopeptidaze pa so katepsin C (aminodipeptidaza), katepsin X (karboksimonopeptidaza), katepsin B (karboksidipeptidaza) in katepsin H (aminopeptidaza). Katepsina B in H imata poleg eksopeptidazne tudi endopeptidazno aktivnost [49–51].
Cisteinski katepsini cepijo različne znotrajcelične in zunajcelične substrate. Glavna funkcija je razgradnja proteinov, vključeni so v metabolizem lipidov in proteinov, pomembno vlogo pa imajo pri avtofagiji, antigenski predstavitvi, recikliranju
6
zunajcelicnih receptrojev, celični signalizaciji in nenazadnje pri celični smrti. V normalnih fizioloških pogojih so pomembni pri vzdrževanju homeostaze [47,52,53].
1.4.3 Cisteinski katepsini pri raku in celični smrti
Spremembe v ekspresiji, lokalizaciji in aktivnosti katepsinov so povezane z različnimi patološkimi stanji, tudi z rakom [53]. Pri različnih vrstah raka imajo katepsini različno vlogo pri njegovem napredovanju. Prisotnost nekaterih katepsinov pri nekaterih vrstah raka nima vpliva na napredovanje tumorja ali pa celo zmanjša tumorsko breme [50].
Večinoma pa so cisteinski katepsini povezani s hitrejšim napredovanjem raka in/ali slabšo prognozo. Povečana ekspresija katepsinov in prisotnost katepsinov v tumorskem mikrookolju, kamor jih izločajo s tumorji povezani makrofagi, sta povezani s slabo prognozo pri raku pljuč, dojk, glave in vratu, melanomu, kolorektalnem raku ter mnogih drugih. Zunajcelični katepisni razgradijo ECM, cepijo proteine, ki tvorijo medcelične stike, receptorje ter adhezijske molekule in aktivirajo citokine ter rastne faktorje. Vse to pripomore k napredovanju raka in nastanku metastaz [50,52]. Na in vivo modelih so pokazali, da pomankanje nekaterih katepsinov upočasni hitrost rasti tumorja in njegovo napredovanje pri različnih vrstah raka [46]. Zato so nekatere raziskave usmerjene k temu, da bi katepsine B, L in X uporabljali kot tumorske biomarkerje [51,54–56].
Cisteinski katepsini so povezani tudi s celično smrtjo. Lahko bi namreč po sprostitvi iz lizosomov sodelovali pri intrinzični mitohondrijski poti apoptoze z aktivacijo kaspaz 3 in 7 in s tem pripomogli k celični smrti. Katepsini lahko namreč cepijo proapoptotični protein Bid v tBid, zato lahko sprostitev katepsinov iz lizosomov v citosol vodi do celične smrti [46,57].
1.5 Katepsinski inhibitorji
Cistatini, tiropini in serpini so endogeni inhibitorji katepsinov in preprečujejo vezavo katepsinskih substratov [45]. Cistatini so superdružina homolognih proteinov, ki so na podlagi podobnosti v aminokislinskem zaporedju in tridimenzionalne molekulske strukture razdeljeni v tri glavne družine: stefini, cistatini in kininogeni [58]. Njihove glavne značilnosti so predstavljene v preglednici 1 [58–60].
7 Preglednica 1: Glavne značilnosti cistatinov
stefini cistatini kininogeni
vrste stefin A in B cistatin C, D, E/M, F, S, SA in SN
kininogen H, L in T
velikost 11 kDa 13-15 kDa 60-120 kDa
signalni peptid ne da ne
lokacija večinoma
intracelularni ekstracelularni intravaskularni
glikoziliranost ne ne da
disulfidne vezi ne da da
inhibicija katepsinov B, H, S in L
katepsinov B, C, F, L, H, F, S, V
papaina, katepsinov L in S
Glavna vloga cistatinov je zaščita organizma pred endogenimi proteazami sproščenih iz lizosomov in pa zaščita pred invazijo mikroorganizmov in parazitov, ki vstopajo v telo preko cisteinskih proteaz [43,61]. Cistatini lahko sodelujejo tudi pri nastanku in razvoju različnih bolezni, kot so nevrološka obolenja. Poleg tega so pokazali tudi vlogo cistatinov pri raku, kjer pride do porušenja razmerja koncentracij katepsinov in njihovih inhibitorjev [62,63]. Katepsini pomembno vplivajo na rast tumorja. Pokazali so namreč, da lahko inhibitor širokega spektra cisteinskih katepsinov JPM-565 pomembno zmanjša rast tumorja. To kaže, da katepsini, ki so v tumorski stromi, predstavljajo potencialno tarčo pri zdravljenju raka [46,64].
1.5.1 Stefin B
Stefin B je neglikoziliran enoverižni protein, ki je sestavljen iz 98 aminokislinskih preostankov. Njegova molekulska masa je 11 kDa [65]. Izraža se v različnih človeških celicah in tkivih. V celici ga najdemo v citosolu, mitohondriju in jedru. Njegova glavna naloga je zaščita celic pred izlitimi lizosomalnimi katepsini [66,67]. Stefin B je reverzibilni in kompetitivni inhibitor, ki inhibira papainu podobne cisteinske proteaze.
Katepsine S, H in L inhibira s pM konstanto inhibicije, katepsin B pa z nM konstanto inhibicije [46].
8 1.5.2 Stefin B in bolezni
Poleg svoje inhibitorne vloge v celicah je znano, da stefin B igra pomembno vlogo tudi pri progresivni mioklonični epilepsiji (EPM1) ali Unverricht_Lundborgovi bolezni [68,69]. Gre za avtosomno recesivno bolezen, ki se najverjetneje razvije zaradi mutacij v genu za stefin B. Najpogostejša mutacija je dodekamerna ponovitev v promotorski regiji, ki povzroči zmanjšano količino mRNA in posledično tudi manj proteina stefina B ali celo njegovo odsotnost. To mutacijo najdemo pri 90 % bolnikov z EPM1. Pokazali so, da izbitje gena za stefin B iz genoma miši vodi do nevrološke bolezni, s podobnimi simptomi kot pri človeku [69,70]. Epilepsije so povezane tudi z oksidativnim stresom, ki je lahko povezan tako z nastankom bolezni ali pa je le posledica njenega razvoja [71]. Pokazali so tudi, da izbitje gena za stefin B poveča občutljivost cerebralnih granulnih nevronov na celično smrt sproženo z oksidativnim stresom. Možno je, da je povečana občutljivost na oksidativni stres v nevronih pri pomanjkanju stefina B, ker ta ne inhibira katepsina B.
Pokazali so namreč tudi, da je povečana ekspresija katepsina B povečala občutljivost nevronov na celično smrt sproženo s H2O2. Nasprotno pa je izbitje katepsina B zaščitilo nevrone pred oksidativnim stresom [72].
Poleg povezave z EPM1 pa raziskujejo tudi povezavo med stefinom B in rakom. Zaenkrat v literaturi ni veliko študij o vlogi stefina B pri različnih rakavih obolenjih. Pokazali pa so, da znižane koncentracije stefina B v tumorjih in povišane serumske koncentracije korelirajo s slabo prognozo pacientov pri različnih malignih obolenjih [56].
1.5.3 Stefin B in oksidativni stres
Vlogo stefina B pri razvoju raka so preučevali tudi z uporabo mišjega modela raka mlečne žleze (MMTV-PyMT) z izbitim genom za stefin B. Ugotovili so, da izbitje gena ni vplivalo na invazijo tumorja in metastaziranje tumorja, ampak je bil razvoj tumorjev upočasnjen. Pokazali so tudi povišan delež mrtvih celic, kar bi lahko bilo povezano s povečano preobčutljivostjo tumorskih celic na oksidativni stres v odsotnosti stefina B [74]. Oksidativni stres pa lahko v celicah sproži imunski odgovor. Pokazali so, da je po dodatku H2O2 v celicah mikroglije prišlo do povečane aktivnosti katepsina B in aktivacije NLRP3 inflamasoma [75]. Nekatere raziskave pa nakazujejo, da bi stefin B lahko imel mitohondrijsko zaščitno funkcijo. Miši z odsotnim stefinom B so bile namreč bolj občutljive na sepso povzročeno z lipopolisaharidom, kjer je prišlo do aktivacije NLRP inflamasoma in povišanja mitohondrijskih ROS [66].
9
2 Namen dela in hipoteza
Stefin B je endogeni inhibitor cisteinskih katepsinov B, S, H in L, ki po sprostitvi iz lizosomov lahko sodelujejo pri apoptotični celični smrti. Do celične smrti lahko pride tudi zaradi oksidativnega stresa, kjer je porušeno razmerje med oksidanti in antioksidanti.
Butinar in sodelavci so pokazali, da bi stefin B lahko imel pomemben vpliv na občutljivost MMTV-PyMT celic na oksidativni stres [74].
Namen magistrskega dela je bil določiti vpliv odsotnosti stefina B na celično smrt sproženo s H2O2 na primarnih MMTV-PyMT rakavih celicah. Želeli smo preveriti vpliv tretiranja celic s H2O2 na posamezne celične komponente in opredeliti vrsto sprožene celične smrti. Preveriti smo želeli tudi vpliv antioksidantov na potek sprožene celične smrti. V ta namen smo uporabili dva antioksidanta, NAC in vitC, ki imata terapevtski potencial [76,77].
Delovne hipoteze:
• Celice z izbitim genom za stefin B so bolj občutljive na tretiranje s H2O2 kot celice divjega tipa.
• H2O2 sproži apoptozo v izbranem celičnem modelu.
• H2O2 povzroči poškodbe celičnih komponent.
• Antioksidanta NAC in vitC preprečita celično smrt in omejita poškodbe sprožene s H2O2.
• NAC bo bolj učinkovito zmanjšal vpliv H2O2 kot vitC.
10
3 Materiali in metode 3.1 Materiali
3.1.1 Celična kultura
V raziskavi smo uporabili divji tip primarnih celic iz tumorja mlečne žleze MMTV-PyMT (DT) in primarne celice iz tumorja mlečne žleze MMTV-PyMT z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Primarne MMTV-PyMT tumorske celice so pripravili iz transgenih miši na Institutu »Jožef Stefan« na odseku za Biokemijo, molekularno in strukturno biologijo po metodi opisani v [78].
3.1.2 Gojišče
Uporabili smo obogateno gojišče DMEM z dodanim 1 % penicilin/streptamicinom (v/v), 1 % glutaminom (v/v) in 10 % FBS (v/v).
3.1.3 Kemikalije
• Ac-DEVD-AFC (Bachem)
• Akridin oranž (AO) (Sigma)
• akrilamid (Serva)
• amonijev persulfat (APS) (Serva)
• Borova kislina (Sigma)
• Goveji serumski albumin (BSA) (Sigma)
• CHAPS (Sigma)
• CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific)
• deoksiholna kislina (Sigma)
• dH2O
• dimetil sulfoksid (DMSO) (Sigma)
• Dulbeccov fosfatni pufer (DPBS) (Lonza)
• ditiotreitol (DTT) (Sigma)
• aloksistatin (E64d) (Peptide Research Institute)
• etilendiamintetraocetna kislina (EDTA) (Serva)
• etanol (Carlo Erba)
• fetalni goveji serum (FBS) (Gibco)
• glicerol (Serva)
• Dulbeccov spremenjeni medij Eagle (DMEM) (Gibco)
• H2O2 (LabExpert)
• Hepes (Sigma)
• L-glutamin (Sigma)
• metanol (Merck)
• N-acetil cistein (NAC) (Sigma)
• NaCl (Merck)
• natrijev dodecil sulfat (NaDS) (Sigma)
• Na2HPO4 x 2H2O (Acros organics)
11
• NaH2PO4 x 2H2O (Sigma)
• NAO (Thermo Scientific)
• NaOH (Merck)
• nitrocelulozna membrana NC45 (Serva)
• NP-40 (Roche diagnostics)
• označevalec velikosti O'GeneRuler Express DNA Ladder (Thermo Scientific)
• označevalec velikosti proteinov PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Fermentas)
• penicilin/streptamicin (Sigma)
• Phire Tissue Direct PCR Master Mix (Thermo Scientific)
• propidijev jodid (PI) (Sigma)
• posneto mleko v prahu (Pomurske mlekarne)
• pufer za Trans Blot Turbo (Biorad)
• reagent Bradford (BioRad)
• reagent ECL za kemiluminiscenco (GE Healthcare Amersham)
• saharoza (Merck)
• set reagentov za razvijanje slik prenosa western ECL (Sigma)
• SYBR™ Safe barvilo za DNA na gelu (Thermo Scientific)
• Tetramethylethylenediamine (TEMED) (Merck)
• tripsin (Gibco)
• TRIS (Serva)
• Tween 20 (Serva)
• Vitamin C (Sigma)
• začetni oligonukleotidi (Sigma)
3.1.4 Protitelesa
• primarna kunčja monoklonska protitelesa proti GAPDH (Cell Signaling Technology)
• primarna kunčja monoklonska protitelesa proti stefinu B (Abcam)
• sekundarna kozja anti-kunčja protitelesa, konjugirana s hrenovo preoksidazo (Jackson ImmunoResearch)
3.1.5 Laboratorijska oprema
3.1.5.1 Aparature
• aparatura za PCR 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems)
• bralnik mikrotitrskih plošč TECAN Infinite M1000in Saphire (Tecan)
• centrifugi 5810R (Eppendorf) in Centric200R (Tehtnica)
• inkubator s kontrolirano atmosfero: 37 °C in 5 % CO2 (Binder)
12
• kadička za NaDS PAGE (BioRad)
• kadička za agarozno elektroforezo (Owl Separation system)
• laminar M18 (Iskra PIO)
• ledomat AF200 (Scotsman)
• naprava za NaDS PAGE (Amersham Pharmacia Biotech)
• naprava za razvijanje filmov Gbox (Syngene)
• pretočni citometer FACSCalibur (Becton Dickinson)
• stresalnik Vibromix 314 EVT (Tehtnica)
• tehtnica Mettler PC 2000 (Lotrič)
• termomešalnik Thermomixer compact (Eppendorf)
• trans-blot turbo prenosni sistem za western prenos (BioRad)
• ultrazvočni razbijalec W-405D (Branson)
• vibracijski mešalnik Vibromix 10 (Tehtnica)
3.1.5.2 Plastični material
• mikrocentrifugirke (Eppendorf)
• centrifugirke za pretočni citometer (Falcon)
• sterilne pipete (Greiner)
• nastavki za pipete (Eppendorf)
• centrifugirke (Falcon)
• avtomatske pipete (Eppendorf)
• mikrotitrska ploščica s 96 vdolbinami, črna (Greiner)
• mikrotitrska ploščica s 96 vdolbinami, prozorna (Greiner)
• plošče za gojenje celic s premerom 10 cm (Greiner)
• plošče za gojenje celic z dvanajstimi vdolbinami(TPP)
• strgalo za celice (TPP)
3.1.5.3 Stekleni material
• steklenice 1 L
• krovno steklo (Blaubrand)
• Neubaeurjeva komora (Blaubrand)
• Pasteurjeve pipete (Brand)
13 3.1.6 Pufri
Preglednica 2: Uporabljeni pufri in njihova sestava.
Pufer Sestava
10-kratni elektroforezni pufer z borovo kislino
200 mM NaOH
z borovo kislino umerimo na pH 8
kaspazni pufer 100 mM HEPES
200 mM NaCl 0,2 % (w/v) CHAPS 20 % (w/v) saharoze 2 mM EDTA
pH 7 pufer za radioimunoprecipitacijo
(RIPA pufer)
50 mM TRIS/HCl 100 mM NaCl 0,1 % (w/v) NaDS 1 % (w/v) NP-40
0,25 % (w/v) deoksiholne kisline 1 mM EDTA
pH 8
10-kratni PBS pufer 145 mM NaCl
2,5 mM Na2HPO4
7,5 mM NaH2PO4
pH 7,4 1-kratni PBS pufer z dodanim Tween 20
(PBST)
10 % (v/v) 10-kratnega PBS 0,05 % (v/v) Tween 20 4-kratni koncentracijski pufer 6,1 % (w/v) TRIS/HCl
pH 6,8 10-kratni elektroforezni pufer za NaDS-
PAGE
3 % (w/v) TRIS 14,4 % (w/v) glicerol 1 % (w/v) NaDS
dH2O do končnega volumna 6-kratni nanašalni pufer za NaDS PAGE 30 % (w/v) glicerol
10 % (w/v) NaDS
0,012 % (w/v) bromfenol modro
4-kratni koncentracijski pufer do 10 mL 1 mM DTT
4-kratni ločevalni pufer 18,2 % (w/v) TRIS/HCl pH 8,8
14
3.2 Metode
3.2.1 Odmrzovanje celic
Vialo z zamrznjenimi celicami, ki so bile shranjene pri – 80 °C, smo hitro odmrznili pri 37 °C. Nato smo jih centrifugirali 4 minute pri 1300 rpm in jim odstranili supernatant.
Usedlino smo resuspendirali v 1 mL obogatenega gojišča DMEM in suspenzijo celic prenesli v 10-centimetrsko petrijevko z 9 mL obogatenega gojišča DMEM. Naslednji dan smo celicam zamenjali gojišče.
3.2.2 Gojenje in precepljanje celic
Celice smo gojili v inkubatorju s kontrolirano atmosfero pri temperaturi 37 °C in 5 % deležem CO2 v obogatenem gojišču DMEM. Ko so prerastle 90 % površine, smo gojišče odstranili in jih sprali s 5 mL PBS. Dodali smo jim 3 mL tripsina in inkubirali 5 minut pri 37 °C. Ko so se vse celice odlepile od podlage, smo jim dodali 3 mL DMEM, da smo ustavili tripsinizacijo. Celice smo ustrezno redčili z obogatenim gojiščem DMEM in jih prenesli na željeno število plošč.
3.2.3 Štetje celic
Na Neubarjevo komoro za štetje celic smo nanesli 10 μL suspenzije celic. Prešteli smo jih z uporabo fazno kontrastnega svetlobnega mikroskopa (Olympus CK 40-RPSL) pod 100-kratno povečavo. Po navodilih proizvajalca smo preračunali končno število celic v 1 mL suspenzije. Za poskuse smo celice gojili v koncentraciji 5 x 105 celic/mL v ustreznih ploščah.
3.2.4 Zamrzovanje celic
Pripravili smo zamrzovalno gojišče (10 % DMSO v FBS). Konfluentnim ploščam celic smo odstranili gojišče in jih sprali s 5 mL PBS. Dodali smo 3 mL tripsina in inkubirali 5 minut pri 37 °C. Ko so se vse celice odlepile od podlage, smo jim dodali 3 mL DMEM, da smo ustavili tripsinizacijo. Celice smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Medij smo odsesali, usedlino pa resuspendirali v zamrzovalnem gojišču. Po 1 mL resuspendiranih celic smo prenesli v prej označene krioviale in jih do nadaljnje uporabe hranili pri – 80 °C.
3.2.5 Potrjevanje genotipa celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B Celice smo sprali s 5 mL PBS in jim dodali 3 mL tripsina. Ko so se odlepile od podlage, smo jim dodali 3 mL DMEM, da smo ustavili tripsinizacijo. Pripravili smo suspenzijo celic z 10 000 celicami, ki smo jo shranili pri – 20 °C do analize.
Za verižno reakcijo s polimerazo (PCR) smo uporabili Thermo Scientific Phire Tissue Direct PCR Master Mix po navodilih proizvajalca. V vzorce smo dodali 20 µL pufra in 1 µL raztopine za sprostitev DNA. Vzorce smo kratko centrifugirali in inkubirali na sobni temperaturi 5 minut. Sledila je 2-minutna inkubacija vzorcev pri 98 °C in kratko
15
centrifugiranje. Pripravili smo reakcijsko mešanico za PCR s končnim volumnom 20 µL (preglednica 3).
Preglednica 3: Sestava reakcijske mešanice za izvedbo PCR.
Komponenta Volumen [µL]
dH2O 7
2-kratni Tissue Mix 10
smerni začetni oligonukleotid 1 protismerni začetni oligonukleotid 1
DNA 1
končni volumen 20
Temperatura prileganja oligonukleotidnih začetnikov je bila določena s strani proizvajalca (Sigma). Začetni oligonukleotidi so bili narejeni tako, da pomnožujejo 114 baznih parov (bp) velik fragment gena za stefin B z naslednjimi nukleotidnimi zaporedji:
- smerni začetni oligonukleotid (210F1)
5'-TGTCTTCAGCTTCTCCGTGCTAC-3' - protismernimerni začetni oligonukleotid (int1R1)
5'-CCTCACCTGGTCGGCGACCT-3' Potek PCR je naveden v preglednici 4.
Preglednica 4: Temperaturni program za izvedbo PCR.
Proces Temperatura
[°C]
Čas [s] Število ciklov začetna
denaturacija
98 30 1
denaturacija 98 5
45
prileganje 67,1 5
podaljševanje 72 10
končno
podaljševanje 72 60 1
Po končani reakciji smo vzorce nanesli na 1,2 % elektroforezni gel s SYBR™ Safe barvilom. Elektroforeza je potekala 40 minut pri konstantni napetosti 130 V v 1-kratnem
16
pufru z borovo kislino. Uporabili smo označevalec velikosti O'GeneRuler Express DNA Ladder. Po končani elektroforezi smo za zaznavanje lis uporabili napravo Gbox.
3.2.6 Določanje vpliva H2O2, antioksidantov in inhibitorjev na celice
En dan pred tretiranjem smo nacepili 5 x 105 celic/mL na ustrezne plošče glede na predviden poskus. Na dan tretmaja pa smo zamenjali gojišče in dodali različne spojine v končnih koncentracijah navedenih v preglednici 5. Antioksidanta in inhibitor smo dodali dve uri pred dodatkom H2O2. Kontrolnim vzorcem smo dodali le novo sveže gojišče. Po zaključku inkubacije smo vzorce ustrezno pripravili za želeno analizo.
Preglednica 5: Uporabljene spojine za določanje vpliva H2O2, vitC, NAC in E64d na celice s končnimi koncentracijami v mediju.
Spojina Končna koncentracija Vloga spojine
H2O2 1, 3 ali 5 mM ROS
vitC 100 µM
antioksidant
NAC 1 mM
E64d 10 µM inhibitor cisteinskih proteaz
3.2.7 Meritve na pretočnem citometru
Za meritve na pretočnem citometru smo celice barvali z različnimi barvili (preglednica 6).
Preglednica 6: Pregled uporabljenih barvil za meritve na pretočnem citometru.
Barvilo Opazovanje
aneksin V-FITC in PI celična smrt
AO sprememba pH lizosomov
CM-H2DCFDA nastanek ROS
NAO oksidacija kardiolipina
3.2.7.1 Določanje deleža mrtvih celic
Ko je bila inkubacija končana, smo najprej prenesli gojišče v ustrezno označene centrifugirke. Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v centrifugirke. Celice
17
smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in celotno suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, posamezni usedlini pa dodali 50 µL barvila aneksin V-FITC, ustrezno redčenega v 1 x vezavnem pufru, in inkubirali 15 minut.
Po inkubaciji smo dodali še ustrezno redčeno barvilo PI do celokupnega volumna 200 µL.
Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco PI smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL3, fluorescenco aneksina V-FITC pa na kanalu FL1. Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
Pri apoptozi se zgodaj v signalni kaskadi fosfatidilserin prestavi iz notranje na zunanjo stran celične membrane. Barvilo aneksin V-FITC se veže specifično nanj, zato ga uporabljamo za detekcijo apoptoze [79]. PI pa je majhna fluorescentna molekula, ki se veže na DNA. Ker ne more pasivno prehajati skozi nepoškodovano celično membrano, ga uporabljamo za detekcijo celic s poškodovano membrano [80].
3.2.7.2 Določanje deleža celic s poškodovanimi lizosomi
15 minut pred iztekom inkubacije s H2O2 smocelicam dodali barvilo akridin oranž (AO) v končni koncentraciji 1 μg/mL. Gojišče smo nato prenesli v ustrezno označene centrifugirke. Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v centrifugirke. Celice smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, usedlinam pa dodali 200 μL PBS. Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL3.
Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
Barvilo AO je šibka baza in se kopiči v kislih veziklih. Ob povišanju pH v le-teh (npr. ob spremenjeni prepustnosti lizosomalne membrane), intenziteta rdeče fluorescence pade [81].
3.2.7.3 Določanje nastanka reaktivnih kisikovih spojin
Po končani inkubaciji smo najprej prenesli gojišče v ustrezno označene centrifugirke.
Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v ustrezne centrifugirke. Celice smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in celotno suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, posamezni usedlini pa dodali barvilo CM- H2DCFDA, pripravljeno po navodilih proizvajalca, in inkubirali 30 minut. Po inkubaciji smo vzorce centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo ponovno odstranili, usedlini pa dodali 200 µL PBS. Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL1. Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
18
Barvilo CM-H2DCFDA se uporablja za merjenje znotrajceličnih ROS. Celična esteraza barvilu odstrani acetatno skupino. Spojina potem reagira z intracelularnimi ROS. Sledi spontana oksidacija znotraj celice in barvilo začne fluorescirati [82].
3.2.7.4 Določanje oksidacije kardiolipina
30 minut pred iztekom inkubacije s H2O2 smocelicam dodali barvilo nonil akridin oranž (NAO) v končni koncentraciji 50 µM. Gojišče smo nato prenesli v ustrezno označene centrifugirke. Nato smo celice sprali s PBS in ga prav tako prenesli v centrifugirke. Celice smo inkubirali s tripsinom, dokler se niso odlepile od podlage. Tripsinizacijo smo ustavili z DMEM in suspenzijo prenesli v centrifugirke. Vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm. Supernatant smo odstranili, usedlinam pa dodali 200 μL PBS. Vzorce smo do meritve hranili v temi. Fluorescenco smo izmerili s pretočnim citometrom na kanalu FL1.
Podatke smo analizirali s programom FlowJo.
Barvilo NAO se veže na kardiolipin, ki je na membrani mitohondrija. Če pride do oksidacije kardiolipina, NAO ne more biti več vezan na kardiolipin in intenziteta fluorescence pade [83].
3.2.8 Priprava celičnih lizatov in analiza proteinov
Po končani inkubaciji s H2O2, smo najprej prenesli gojišče z mrtvimi celicami v centrifugirko. Pritrjene celice pa smo sprali s 5 mL PBS in ga prenesli v isto centrifugirko.
Na pritrjene celice smo dodali 300 µL RIPA pufra. Celice smo postrgali s plošče s strgalom in jih prenesli v označeno mikrocentrifugirko, ki smo jo takoj dali na led.
Centrifugirke s suspenzijo mrtvih celic smo centrifugirali 5 minut pri 1000 rpm.
Supernatant smo previdno odstranili, usedlino pa resuspendirali v 20 µL RIPA pufra in ga prenesli v ustrezno mikrocentrifugirko. Do nadaljnje uporabe smo vzorce shranili pri – 20 °C.
Lizate smo odtajali na ledu in jih skozi celoten postopek priprave hranili na ledu. Odtajane vzorce smo sonificirali dvakrat po 10 sekund oziroma dokler se niso zbistrili. Nato smo jih 10 minut centrifugirali pri 4 °C in 13200 rpm. Supernatant smo prenesli v novo označeno mikrocentrifugirko, usedlino pa smo zavrgli.
3.2.8.1 Določanje koncentracije celokupnih proteinov v celičnih lizatih z Bradfordovo metodo
Za določitev koncentracije celokupnih proteinov v celičnih lizatih smo najprej pripravili umeritveno krivuljo z različnimi koncentracijami BSA. Volumne, ki so prikazani v preglednici 7, smo nanesli na mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami.
19
Preglednica 7: Volumni komponent za pripravo umeritvene krivulje za določanje koncentracije proteinov z Bradfordovo metodo.
koncentracija BSA [µg/mL]
volumen BSA s koncentracijo 100
µg/mL [µL]
volumen dH2O [µL]
volumen Bradford reagenta [µL]
0 0 160 40
2 4 156 40
6 12 148 40
10 20 140 40
14 28 132 40
16 32 128 40
20 40 120 40
25 50 110 40
Absorbance vzorcev smo izmerili na TECAN spektrometru pri valovni dolžini 595 nm.
Iz dobljenih rezultatov smo izrisali umeritveno krivuljo, s katero smo določili koncentracijo celokupnih proteinov v celičnih lizatih.
Vzorce lizatov smo redčili z dH2O v razmerju 1:400 ali 1:600. V mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami smo odpipetirali v vsako vdolbino 40 µL Bradford reagenta, potem pa še 160 µL redčenega vzorca. Absorbanco smo izmerili na TECAN spektrometru pri valovni dolžini 595 nm. Koncentracijo smo izračunali s pomočjo spodnje enačbe.
𝑐 = ( 𝐴 − 𝑛
𝑘 ) ∗ 𝑅
c …… koncentracija celokupnih proteinov A ……izmerjena absorbance redčenega lizata k, n ….koeficienta iz umeritvene krivulje R …… redčitev vzorca
3.2.8.2 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS- PAGE)
NaDS-PAGE smo uporabili za ločevanje proteinov. Najprej smo pripravili 12,5 % gel (sestava v preglednici 7). Komponente smo zmešali po navedenem vrstnem redu.
20
TEMED in APS smo dodali tik preden smo gel vlili med stekelca. Ko se je gel strdil, smo ga shranili pri 4 °C do naslednjega dne ali pa ga uporabili takoj.
Volumnu celičnih lizatov, ki je vseboval 50 µg proteinov, smo dodali 6 x nanašalni pufer z DTT. Vzorce smo segreli (5 minut pri 95 °C), jih centrifugirali in nato nanesli na 12,5 % gel (sestava v preglednici 8). Nanesli smo tudi označevalec velikosti proteinov PageRulerTM Prestained Protein Ladder. Elektroforeza je potekala 60 minut pri konstantnem toku 30 mA/gel.
Preglednica 8: Komponente za 12,5 % nanašalni in ločevalni poliakrilamidni gel.
nanašalni gel 12,5 % ločevalni gel
0,625 µL akrilamida 3,13 mL akrilamida
1,25 mL Tris pH 6.8 2,50 mL Tris pH 8.8
3,075 mL dH2O 4,27 mL dH2O
0,05 mL 10 %NaDS 0,10 mL 10 % NaDS
10 µL TEMED 20 µL TEMED
20 µL 10 % APS 40 µL 10 % APS
3.2.8.3 Detekcija proteinov s prenosom western
Ločene proteine iz NaDS-PAGE gela smo prenesli na nitrocelulozno membrano s hitrim prenosom western (Trans-Blot turbo). Prenos je potekal 7 minut pri toku 2,5 A in napetosti 25 V v pufru pripravljenem po navodilih proizvajalca. Po končanem prenosu smo membrane inkubirali 45 minut na sobni temperaturi v blokirnem pufru (5 % mleko v prahu v PBST). Membrane smo po blokadi inkubirali s primarnimi protitelesi proti GAPDH (redčena 1:3000 v PBST) in stefinu B (redčena 1:2000 v PBST) preko noči pri 4 °C na stresalniku. Po inkubaciji smo membrane spirali 3 x 15 minut s PBST in nato inkubirali 45 minut z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (redčena 1:10000 v PBST).
Membrane smo ponovno spirali 3 x 15 minut s PBST. Po dodatku reagenta ECL, ki smo ga pripravili po navodilih proizvajalca, smo proteinske lise detektirali z napravo Gbox.
3.2.8.4 Merjenje kaspazne aktivnosti
Uporabili smo črno mikrotitrsko ploščico s 96 vdolbinami. Najprej smo v vsako vdolbino dodali 50 µL kaspaznega pufra z 20 µM DTT. Nato smo dodali dH2O in volumne lizatov s 50 µg proteinov (skupaj 40 µL). Mikrotitrsko ploščo smo inkubirali 10 minut pri 37 °C.
Po končani inkubaciji smo dodali še 10 µL substrata Ac-DEVD-AFC v končni koncentraciji 10 µM. Razgradnjo substrata v odvisnosti od časa smo spremljali fluorimetrično pri vzbujevalni valovni dolžini 400 nm in emisijski valovni dolžini 505 nm. Iz dobljenih rezultatov smo izrisali graf fluorescence v odvisnosti od časa ter iz naklona krivulje izračunali povprečno aktivnost kaspaz.
21 3.2.9 Statistična analiza rezultatov
Za izvedbo poskusov smo imeli različne biološke ponovitve. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Vsak poskus, kjer ni drugače zavedeno, smo opravili v dveh neodvisnih eksperimentih z dvema tehničnima ponovitvama. Iz dobljenih rezultatov smo izračunali povprečje in standardni odklon meritev. Rezultate smo analizirali s programom Microsoft Excel 2016. Za ugotavljanje statističnih razlik smo uporabili Student t test v programu GraphPad Prism 8.4.3. Za statistično značilno razliko smo upoštevali, če je bila vrednost p < 0,05 (*).
22
4 Rezultati
4.1 Potrditev genotipa mišjih celic
Tekom raziskave smo opazovali razliko med primarnimi MMTV-PyMT tumorskimi celicami divjega tipa (DT) in primarnimi MMTV-PyMT tumorskimi celicami z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Primarne MMTV-PyMT tumorske celice so izolirali iz transgenih miši na Institutu »Jožef Stefan« na odseku za Biokemijo, molekularno in strukturno biologijo po predhodno opisani metodi [78]. Celične kulture so izolirali iz različnih miši, da smo dobili boljši vzorec in imeli tudi več ponovitev.
Najprej smo naredili genotipizacijo s PCR in tako potrdili, da so celice, ki smo jih uporabili v poskusih, bodisi celice divjega tipa bodisi celice z izbitim genom za stefin B.
Na sliki 1 je agarozni gel s produkti PCR. Pri vzorcih DT1, DT2 in DT3 so vidne lise različnih intenzitet v velikosti 114 bp pomnoženega fragmenta gena za stefin B, pri vzorcih StfB-/- 1 in StfB-/- 2 pa ne.
Slika 1: Produkti PCR za potrditev celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B.
Na sliki so prikazani vzorci v naslednjem vrstnem redu: označevalec velikosti (ST), DT1, DT2, DT3, StfB-/-1 in StfB-/- 2.
Za preverjanje izražanja stefina B v celicah smo naredili imunodetekcijo s prenosom western na popolnih celičnih lizatih. Na poliakrilamidni gel smo nanesli po 25 µg proteina posameznega vzorca. Za kontrolo količine nanesenega proteina smo uporabili gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH). Na sliki 2 je membrana po prenosu western in inkubaciji z ustreznimi protitelesi. Vidne so lise v velikosti stefina B pri celicah divjega tipa, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa so odsotne. Pri celicah divjega tipa sta vidni dve lisi podobne velikosti. Možno je, da je prišlo do fragmentacije stefina B, saj so lise prisotne le pri celicah divjega tipa. Tako z genotipizacijo kot s prenosom Western smo potrdili, da je pri celicah divjega tipa stefin B prisoten, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa odsoten.
23
Slika 2: Izražanje stefina B v primarni celični kulturi. Na sliki so prikazani vzorci v naslednjem vrstnem redu: označevalec velikosti (ST), DT1, DT2, DT3, StfB-/-1, StfB-/-2.
4.2 Določanje deleža mrtvih celic
V naslednjem koraku smo preverili občutljivost celic na tretiranje s H2O2. Butinar in sodelavci so namreč pokazali, da so celice divjega tipa MMTV-PyMT in z izbitim genom za stefin B različno odzivajo na tretiranje s H2O2 [74].
Celice smo 24 ur tretirali z različnimi koncentracijami H2O2 (0-5 mM). Po končani inkubaciji, smo celice najprej pogledali pod svetlobnim mikroskopom pod 40 x povečavo.
Že na prvi pogled je bilo vidno, da je pri celicah z izbitim genom za stefin B precej več mrtvih (odlepljenih) kot pri celicah divjega tipa tretiranih z enako koncentracijo H2O2. Ostalih morfoloških sprememb (npr. krčenje celic) nismo opazili.
Celice smo nato pobarvali v skladu s protokolom za aneksin V-FITC in PI. Pri apoptozi se namreč zgodaj v signalni kaskadi fosfatidilserin prestavi iz notranje na zunanjo stran celične membrane. Barvilo aneksin V-FITC se veže specifično nanj, zato ga uporabljamo za detekcijo apoptoze [79]. PI pa je majhna fluorescentna molekula, ki se veže na DNA.
Ker ne more pasivno prehajati skozi nepoškodovano celično membrano, ga uporabljamo za detekcijo celic s poškodovano membrano [80].
Po barvanju, smo vzorce pomerili na pretočnem citometru in rezultate analizirali s programom FlowJo. Rezultati so bili zbrani v točkovnih diagramih, ki na osi X prikazujejo intenziteto fluorescence za aneksin V-FITC, na osi y pa intenziteto fluorescence za PI. Kot mrtve celice smo pri izračunu upoštevali vse aneksin V-FITC in/ali PI pozitivne dogodke, ki so prikazani v kvadrantih Q1, Q2 in Q3.
Iz slike 3 je razvidno, da 1 mM H2O2 sproži celično smrt pri celicah z izbitim genom za stefin B v 70 %, pri celicah divjega tipa tretiranih z 1 mM pa ni velike razlike v primerjavi z netretiranimi (0 mM). Z višanjem koncentracije H2O2 pa se začne poviševati odstotek mrtvih celic tudi pri celicah divjega tipa (npr. pri 3 mM H2O2 je 45 % mrtvih celic), vendar je pri celicah z izbitim genom za stefin B odstotek mrtvih celic še višji (90 %). Iz slike 3 je tudi razvidno, da za podoben učinek na celice potrebujemo 5 mM H2O2 za celice divjega tipa, za celice z izbitim genom za stefin B pa je potreben zgolj 1 mM H2O2. Na podlagi teh rezultatov smo se odločili, da bomo za nadaljnje poskuse uporabljali 3 mM H2O2.
24 (A)
(B)
Slika 3: Določanje deleža mrtvih celic po tretiranju s H2O2. (A) Stolpični diagram prikazuje naraščanje deleža mrtvih celic v odvisnosti od koncentracije H2O2 po 24 h pri celicah divjega tipa (DT) in celicah z izbitim genom za stefin B (StfB-/-). Kot odstotek mrtvih celic so predstavljene aneksin V-FITC in/ali PI pozitivne celice. Pri celicah divjega tipa smo uporabili celične kulture iz treh različnih miši, pri celicah z izbitim genom za stefin B pa iz dveh. Opravili smo dva neodvisna eksperimenta z dvema tehničnima ponovitvama. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardno napako teh meritev. Statistika je bila narejena s Student t testom (*; p < 0,05). (B) Prikaz reprezentativnih točkovnih diagramov za posamezno meritev na pretočnem citometru. V
0 20 40 60 80 100 120
0 1 3 5
Delež mrtvih celic [%]
Koncentracija H2O2[mM]
DT StfB-/-
*
* *
25
vsakem kvadrantu je zapisan pripadajoči delež celic. Leva dva histograma predstavljata kontrolno skupino, desna dva pa predstavljata 24-urno inkubacijo celic v prisotnosti 3 mM H2O2. Mrtve celice predstavljajo oba zgornja kvadranta ter spodnji desni kvadrant (PI in/ali aneksin V-FITC pozitivne celice).
V okviru raziskovalne naloge smo želeli določiti, kakšno obliko smrti sprožimo v celicah divjega tipa in celicah z izbitim genom za stefin B. Zato smo naredili poskus, v katerem smo merili porast deleža mrtvih celic v odvisnosti od časa tretiranja s 3 mM H2O2. Iz grafa na sliki 4 je razvidno, da v izbranem časovnem okvirju ne pride do porasta deleža mrtvih celic divjega tipa v prisotnosti H2O2. V nasprotju s tem, pa se delež mrtvih celic z izbitim genom za stefin B s časom povečuje. Po 30 minutah se delež celične smrti pri le- teh dvigne na skoraj 30 %, po 240 minutah pa je mrtvih več kot 70 % celic. Razlika med smrtnostjo celic divjega tipa in celic z izbitim genom za stefin B je v vseh časovnih točkah statistično značilna.
(B)
0 20 40 60 80 100 120
0 30 60 120 240
Delež mrtvih celic [%]
Čas inkubacije [min]
DT StfB-/-
(A)
*
*
* *
