KARIOLOŠKA ANALIZA SKUPINE GOZDNE SPOMINČICE (Myosotis sylvatica agg.)

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA

Predmetno poučevanje, Kemija - biologija

Bernarda Jamnik Zupančič

KARIOLOŠKA ANALIZA SKUPINE GOZDNE SPOMINČICE (Myosotis sylvatica agg.)

Magistrsko delo

Ljubljana, 2016

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA Predmetno poučevanje, Kemija - biologija

Bernarda Jamnik Zupančič

KARIOLOŠKA ANALIZA SKUPINE GOZDNE SPOMINČICE (Myosotis sylvatica agg.)

Magistrsko delo

Mentorica: doc. dr. Simona Strgulc Krajšek Somentorica: doc. dr. Jasna Dolenc Koce

Ljubljana, 2016

(3)

Jamnik Zupančič, B. Kariološka analiza skupine gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.).

Mag. delo. Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Predmetno poučevanje, Kem in bio, 2016

II

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa II. stopnje Predmetno poučevanje (področje Kemija in biologija). Opravljeno je bilo na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Študijska komisija Oddelka za biologijo je potrdila temo in naslov magistrskega dela ter za mentorico imenovala doc. dr. Simono Strgulc Krajšek, za somentorico doc. dr. Jasno Dolenc Koce in za recenzentko doc. dr. Martino Bačič.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: prof. dr. Nejc JOGAN

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Članica: doc. dr. Martina BAČIČ

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Mentorica: doc. dr. Simona STRGULC KRAJŠEK Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Somentorica: doc. dr. Jasna DOLENC KOCE

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta

Datum zagovora: 19. 10. 2016

Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Bernarda Jamnik Zupančič

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK WDK 582.901.1 (043.2)=163.6

KG gozdna spominčica / Myosotis sylvatica agg. / slikovna citometrija DNA / velikost jedrnega genoma / vrednost C / kromosomsko število

AV JAMNIK ZUPANČIČ, Bernarda

SA STRGULC KRAJŠEK, Simona (mentorica) / DOLENC KOCE, Jasna (somentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta

LI 2016

IN KARIOLOŠKA ANALIZA SKUPINE GOZDNE SPOMINČICE (Myosotis sylvatica agg.)

TD Magistrsko delo (Magistrski študij: 2. stopnja Predmetno poučevanje, Kemija - biologija) OP VIII, 52 str., 2 pregl., 14 sl., 3 pril., 66 vir.

IJ sl.

JI sl/en

AI Predhodne morfološke raziskave skupine gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.) na Oddelku za biologijo so pokazale, da je poleg vrst M. sylvatica in M. decumbens na območju Slovenije prisoten še en takson, ki ima pri večini morfoloških znakov nekako vmesno lego med obema vrstama. Omenjeni trije taksoni se najbolj zanesljivo razlikujejo po velikosti pelodnih zrn. Ker je velikost pelodnih zrn odraz stopnje ploidnosti, smo izmerili velikost jedrnega genoma predstavnikov vseh treh taksonov skupine gozdne spominčice z območja Slovenije in bližnje soseščine ter skušali določiti njihova kromosomska števila. V raziskavo smo vključili 50 rastlin z območja Slovenije, Hrvaške, Avstrije in Italije. Velikost jedrnega genoma smo izmerili v celicah koreninskih vršičkov z uporabo slikovne citometrije DNA in je znašala: 2C = 1,21 pg za M. decumbens, 2C = 1,13 pg DNA za novi takson spominčice in 2C = 0,62 pg DNA za M. sylvatica. Kot umeritveni standard smo uporabili vrsto Pisum sativum. Podatke o velikosti jedrne DNA smo primerjali s predhodno opravljenimi meritvami velikosti pelodnih zrn in ugotovili, da sta znaka v pozitivni korelaciji.

Natančnega kromosomskega števila nismo določili. Kljub temu je razvidno, da ima novi takson število kromosomov med vrednostima za gozdno in poleglo spominčico.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Du2

DC WDK 582.901.1 (043.2)=163.6

CX Wood Forget-me-not / Myosotis sylvatica agg. / DNA-image cytometry / nuclear genome size / C-value / chromosome number

AU JAMNIK ZUPANČIČ, Bernarda

AA STRGULC KRAJŠEK, Simona (supervisor) / DOLENC KOCE, Jasna (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotechnical Faculty

PY 2016

TI Karyological analysis of Myosotis sylvatica agg.

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Chemistry – biology) NO VIII, 52 p., 6 tab., 14 fig., 3 ann., 66 ref.

LA sl

AL sl/en

AB Previous morphological research of the Myosotis sylvatica group in the Department of Biology has shown there is another taxon present in Slovenia. The majority of the results of the measurements have placed the new taxon between the M. sylvatica and the M. decumbens. The only reliable trait between taxa is pollen size.

Since pollen grain size indicates genome size we measure nuclear genome size of the representatives from the Myosotis sylvatica group from the territory of Slovenia and the neighbouring areas and count their chromosome numbers. The research includes 50 plants from Slovenia, Croatia, Austria and Italy. DNA image cytometry was used to measure nuclear genome size in the root tips. The following karyotypes were obtained:

2C = 1,21 pg for M. decumbens, 2C = 1,13 pg DNA for the new taxon and 2C = 0,62 pg DNA for M. sylvatica.

Data about nuclear DNA amount was compared to the past measurements of pollen sizes. We found a positive correlation between these traits. Determining the chromosome number was less successful. Despite this, it is apparent that the new taxon has a value of chromosome number between M. sylvatica and M. decumbens.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VII KAZALO PREGLEDNIC ... VIII KAZALO PRILOG ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VIII

1. UVOD ... 1

2 PREGLED OBJAV ... 2

2.1 SISTEMATIKA RODU SPOMINČIC (Myosotis) ... 2

2.2 SKUPINA GOZDNE SPOMINČICE (Myosotis sylvatica agg.)... 5

2.2.1 Gozdna spominčica - Myosotis sylvatica (Ehrh.) Hoffm. ... 6

2.2.2 Polegla spominčica - Myosotis decumbens Host... 8

2.2.3 Novi takson spominčice ... 10

2.3 VELIKOST JEDRNEGA GENOMA ... 10

2.3.1 Variabilnost genoma ... 11

2.4 KROMOSOMSKO ŠTEVILO IN POLIPLOIDIJA ... 14

2.4.1. Kromosomsko število ... 14

2.4.2. Poliploidija ... 15

2.5 CILJI MAGISTRSKE NALOGE ... 17

3 MATERIAL IN METODE ... 18

3.1 RASTLINSKI MATERIAL ... 18

3.2 FIKSIRANJE VZORCEV ... 18

3.3 ANALIZA VELIKOSTI GENOMA ... 19

3.3.1 Umeritveni standard ... 19

3.3.2 Barvanje po Feulgenu ... 19

3.3.3 Priprava mečkancev ... 20

(7)

VI

3.3.4 Merjenje velikosti genoma s slikovno citometrijo DNA ... 21

3.3.5 Statistična analiza podatkov ... 22

3.4 DOLOČANJE ŠTEVILA KROMOSOMOV ... 22

3.7. KORELACIJE MED VELIKOSTJO GENOMA, ŠTEVILOM KROMOSOMOV IN VELIKOSTJO PELODA ... 22

3.8. IZDELAVA ZEMLJEVIDA RAZŠIRJENOSTI ... 23

4 REZULTATI ... 24

4.1 PODATKI O VZORCIH ... 24

4.2.1 Metoda merjenja velikosti genoma ... 26

4.2 KORELACIJA MED VREDNOSTJO 2C IN DOLŽINO PELODA ... 32

4.3 ŠTEVILO KROMOSOMOV ... 33

4.4 GEOGRAFSKA RAZPOREDITEV VZORCEV ... 34

5 RAZPRAVA ... 35

5.1.1 Optimizacija metode za meritev jedrnega genoma pri spominčicah ... 35

5.1.2 Velikost jedrnega genoma v skupini gozdne spominčice ... 36

5.1.3 Variabilnost velikosti jedrnega genoma ... 37

5.2 KORELACIJA MED VREDNOSTJO 2C IN DOLŽINO PELODA ... 37

5.3 KROMOSOMSKO ŠTEVILO ... 38

5.4 ANALIZIRANI VZORCI GOZDNIH SPOMINČIC ... 39

5.4.1 Gozdna spominčica (Myosotis sylvatica) ... 39

5.4.2 Polegla spominčica (Myosotis decumbens) ... 40

5.4.3 Novi takson iz skupine gozdne spominčice ... 40

6. SKLEPI ... 42

7. POVZETEK ... 43

8 VIRI ... 47 ZAHVALA

PRILOGE

(8)

VII

KAZALO SLIK

Slika 1: Kromosomsko število in velikost pelodnih zrn pri različnih skupinah spominčic (Grau, 1964: 601) ... 4

Slika 2: Zemljevid razširjenosti vrst v skupini gozdne spominčice v Sloveniji (Jogan in sod., 2001: 253) ... 6

Slika 3: Uspevanje nekaterih vrst spominčic (Myosotis) na območju Evrazije, med njimi tudi M. sylvatica s podvrstami in M. decumbens (Meusel in sod., 1978: 364) ... 7

Slika 4: Razširjenost skupine gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.) v Sloveniji (Sušnik, 2016: 66) ... 8

Slika 5: Variabilnost velikosti genoma za glavne skupine rastlin (Metcalfe in Casane, 2013). ... 12

Slika 6: Kariograma obravnavanih vrst gozdnih spominčič (Grau, 1964: 603) ... 14

Slika 7: Kromosomi obravnavanih vrst gozdnih spominčic (Grau, 1964: 608) ... 15

Slika 8: Prikaz deleža vrst, vključenih v analizo... 25

Slika 9: Jedra skupine gozdne spominčice in standardne vrste ... 26

Slika 10: Frekvenčna porazdelitev integrirane optične gostote (IOG) v interfaznih jedrih gozdnih spominčic (M. sylvatica, M. decumbens, M. x.) in umeritvenega standarda (Pisum sativum) ... 27

Slika 11: Velikost jedrnega genoma vrst iz skupine gozdne spominčice ... 31

Slika 12: Korelacija med vrednostjo 2C in dolžino peloda ... 32

Slika 13: Kromosomi skupine gozdne spominčice... 33

Slika 14: Zemljevid nahajališč analiziranih vzorcev vrst iz skupine gozdne spominčice (M. sylvatica agg.) ... 34

(9)

VIII

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Rezultati kariološke analize in meritev dolžine peloda po posameznih vzorcih ... 28 Preglednica 2: Rezultati kariološke analize in meritev dolžine peloda po taksonih ... 30

KAZALO PRILOG

Priloga A: Seznam lokalitet

Priloga B: Statistične analiza posameznega vzorca in populacije Priloga C: Statistična obdelava podatkov

Priloga D: Število kromosomov

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

a.e. arbitrarne enote

agg. agregat, skupina

EAA Farmerjev fiksativ

FAA raztopina formalina, ocetne kisline in etanola IOG intergrirana optična gostota

KV koeficient variacije

OTE osnovna taksonomska enota

SN standardna napaka

M. x. novi takson Myosotis

(10)

Mag. delo. Univ. v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Predmetno poučevanje, Kem in Bio, 2016

1

1. UVOD

Rod spominčic (Myosotis) obsega približno 100 vrst, ki so razširjene v zmernih območjih obeh polobel. Za rod je značilna taksonomska kompleksnost, ki izhaja iz široke morfološke in kariološke variabilnosti v kombinaciji s pomanjkanjem zanesljivih razlikovalnih morfoloških znakov, zato je sistematika tega rodu težavna (Winkworth in sod., 2002).

Fenotipske in citološke razlike, ki se pojavljajo znotraj rodu, so odvisne od številnih dejavnikov.

Najpomembnejši dejavniki so: poliploidija, kombinacija spolnih in nespolnih načinov razmnoževanja, hibridizacija in visoka stopnja fenotipske plastičnosti (Štěpánková, 1993a).

Za območje Slovenije sta bili za skupino gozdne spominčice (M. sylvatica agg.) do nedavnega znani dve vrsti (Strgulc Krajšek, 2007): gozdna (M. sylvatica (Ehrh.) Hoffm.) in polegla spominčica (M. decumbens Host). V okviru magistrskega dela Polone Sušnik "Revizija skupine gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.) v Sloveniji", ki je potekala v letih 2013 in 2015, pa je bil odkrit domnevno nov takson, ki morfološko sodi med vrsti M. sylvatica in M. decumbens. Iz nabora morfoloških znakov, ki jih je P. Sušnik opazovala, se je kot najbolj zanesljiv izkazal znak velikost pelodnega zrna, ki se pri novem taksonu giblje okrog 7 μm. Gre za vmesno vrednost med vrednostima 6 μm in 7,5–8 μm, ki sta značilni za slovenske predstavnike M. sylvatica in M.

decumbens (Sušnik in sod., 2015). Drugi morfološki znaki so se izkazali za manj zanesljive in s tem potrdili taksonomsko zahtevnost obravnavane skupine (Sušnik, 2016).

Pri pomanjkanju zanesljivih morfoloških znakov so v rastlinski sistematiki v veliko pomoč kariološki podatki, kot sta število kromosomov in velikost jedrnega genoma (Judd in sod., 2008).

Oba znaka sta namreč vrstno specifična in zato pomembna kazalnika znotrajvrstne in medvrstne pestrosti (Murray, 2005). Znani vrsti skupine gozdne spominčice se dobro razlikujeta po številu kromosomov: M. sylvatica ima 2n = 18, M. decumbens pa 2n = 32. Število kromosomov se pri spominčicah odraža tudi v velikosti pelodnih zrn (Grau, 1964).

V okviru magistrske naloge smo izmerili velikost jedrnega genoma primerkov iz skupine gozdne spominčice, nabranih v Sloveniji in obmejnih območjih sosednjih držav. Na osnovi teh podatkov smo želeli ugotoviti, kako je velikost pelodnih zrn povezana z velikostjo genoma in kromosomskim številom.

Če bodo naši podatki o velikosti genoma in kromosomskih številih potrdili obstoj taksona z vmesnimi vrednostmi med do zdaj znanima vrstama iz skupine gozdne spominčice, bo to pripomoglo k razumevanju težave, ki jo imamo na območju Slovenije pri določanju gozdnih spominčic.

(11)

2

2 PREGLED OBJAV

2.1 SISTEMATIKA RODU SPOMINČIC (Myosotis) Znanstvena klasifikacija:

Kraljestvo: Plantae – rastline

Deblo: Magnoliophyta – kritosemenke Razred: Magnoliopsida – dvokaličnice Red: Lamiales – ustnatičevci

Družina: Boraginaceae – srhkolistovke

Rod: Myosotis – spominčica (Martinčič in sod., 2007)

Spominčice spadajo v družino srhkolistovk (Boraginaceae), ki obsega 100 rodov in kar 2000 vrst.

Gre za razmeroma veliko družino enoletnih in trajnih zelišč, grmov, dreves in ovijalk (Barrett in sod., 1995).

Za družino je značilno, da je steblo večinoma poraslo s togimi laski, ki se pojavljajo tudi na socvetjih in listih. Listi so navadno enostavni in večinoma celorobi, so brez prilistov in premenjalno razvrščeni. Cvetovi so zvezdasti, redko somerni, običajno dvospolni in združeni v cimozno socvetje, pogosto vijaček. Čaša je petštevna in pri dnu zrasla. Pladnjast ali zvonast venec je petkrp, nanj je priraslih pet prašnikov, ki imajo pri dnu pogosto priveske. Na vrhu venčne cevi so lahko prisotne goltne luske. Prašnice imajo po dve pelodni vrečki, pri dnu prašničnih niti so pogosto razvite medovne žleze. Nadrasla plodnica je iz dveh zraslih plodnih listov in je štiripredalasta. Plod razpade na štiri plodiče. Cvetove oprašujejo predvsem žuželke, tedaj so modri, rožnati, beli ali rumeni (Barrett in sod., 1995; Martinčič in sod., 2007).

Družino razdelimo na dve poddružini, Heliotropioideae in Boraginoideae. Pomembna morfološka znaka za delitev sta oblika plodu in vratu pestiča. Poddružino Boraginoideae lahko naprej delimo na štiri tribuse: Cynoglosseae, Lithospermeae, Boragineae in Eritricheae, kamor spada rod Myosotis (Barrett in sod., 1995; Martinčič in sod., 2007).

Za rod spominčic (Myosotis) je značilno, da so vsi deli rastline, z izjemo venca in plodiča, porasli s togimi dlačicami, zaradi česar je rastlina na otip srhkodlakava. Spominčice so enoletnice, dvoletnice ali trajnice. Spiralasto nameščeni listi so lopatičaste, eliptične ali črtalaste oblike brez prilistov. Cvetovi so zvezdasto somerni in v premeru merijo med 3 in 9 mm. Urejeni so v socvetje, ki mu pravimo vijaček. Barva cvetov je po navadi rožnata in nato modra, redko pa zasledimo trajno

(12)

3

rožnato ali celo belo barvo. Plod ob zrelosti razpade na 4 plodiče, ki so večinoma jajčaste oblike (Hegi, 1927; Strgulc Krajšek, 2007).

Znaki, po katerih se spominčice ločijo od drugih sorodnih rodov, so: oblika listov, odsotnost dlačic ali papil na goltnih luskah in odsotnost podpornih listov vsaj pri najvišjih cvetovih v socvetju (Martinčič in sod., 2007).

V rod Myosotis uvrščamo okoli 100 vrst, ki so razširjene pretežno v zmernih območjih severne in južne poloble. V zahodni Evraziji, ki je eden od dveh glavnih centrov raznolikosti, najdemo okoli 60 vrst, na Novi Zelandiji pa so jih do zdaj opisali 44. Izven teh dveh regij je rod slabše zastopan.

Z manj kot 10 vrstami je prisoten v Severni Ameriki, Južni Ameriki, Afriki, Novi Gvineji in Avstraliji. Še vedno pa ostaja veliko vrst neodkritih in neopisanih (Winkworth in sod., 2002;

Prebble in sod., 2015).

Spominčice naseljujejo najrazličnejše habitate, npr. morske obale, gorske tropske gozdove, gozdove zmernih pasov, melišča, bregove gorskih jezer, travnike ... Zasledimo jih tudi na vrtovih, saj so priljubljene kot okrasne rastline (Barrett in sod., 1995; Lehnebach, 2012).

S pomočjo molekularnih analiz je Winkworth s sod. (2002) potrdil izvor rodu na severni polobli in indentificiral 5 ločenih linij rodu, ki se med seboj dobro genetsko razlikujejo. Težave pri razlikovanju so se pojavile med vrstami znotraj posameznih linij.

Rod je morfološko dobro opredeljen, vendar sta zaradi pomanjkanja zanesljivih morfoloških lastnosti taksonomija in filogenija še vedno nedorečeni. Fenotipske razlike so odvisne od številnih dejavnikov: poliploidije, kombinacije spolnih in nespolnih načinov razmnoževanja, hibridizacije in visoke stopnje fenotipske plastičnosti (Štěpánková, 1993a). Prav zaradi fenotipske plastičnosti so nekateri avtorji Grau (1964) in Blaiste (1972, cit. po Wisskirchen in Haeupler, 1998) poudarjali pomen kromosomskega števila in posledično velikosti pelodnih zrn za pomoč pri razlikovanju med taksoni (slika 1). Velik problem pri določevanju na osnovi teh značilnosti je majhnost kromosomov in pelodnih zrn (Wisskirchen in Haeupler, 1998).

Še dodaten izziv pri identifikaciji taksonov predstavljajo redke ali neznane vrste (Lehnebach, 2012).

(13)

4

Slika 1: Kromosomsko število in velikost pelodnih zrn pri različnih skupinah spominčic (Grau, 1964: 601)

Četrta izdaja Male flore Slovenije navaja 10 vrst spominčic (Strgulc Krajšek, 2007). Sorodne in morfološko podobne vrste spominčic združujemo v agregate, neformalne skupine vrst, ki se med seboj običajno malo razlikujejo po makroskopskih morfoloških znakih. Po letu 2007 sta bili v Sloveniji odkriti še dve novi vrsti, ki še nista vključeni v Malo floro Slovenije.

V Sloveniji tako uspevajo naslednje vrste spominčic:

 M. alpestris agg.:

M. alpestris F. W. Schmidt [M. sylvatica (Ehrh.) Hoffm. subsp. alpestris (Schmidt) Gams]

– planinska spominčica

 M. sylvatica agg.:

M. sylvatica (Ehrh.) Hoffm. – gozdna spominčica M. decumbens Host – polegla spominčica

 M. arvensis agg.:

M. arvensis (L.) Hill. – njivska spominčica

M. ramosissima Roch. in Schul. [M. hispida Schlecht.] – razrasla spominčica

(14)

5

M. stricta Link. [M. micrantha auct. Non Pall.] – toga spominčica

 M. scorpioides agg.:

M. scorpioides L. [M. palustris (L.) Hill] – močvirska spominčica M. nemorosa Besser – podlesna spominčica

M. laxa Lehm (Király in sod., 2007)

 druge vrste, ki ne sodijo v zgoraj naštete agregate : M. sparsiflora Pohl. – redkocvetna spominčica

M. discolor Pers. [M. versicolor (Pers.) Sm.] – pisana spominčica M. refracta Boiss (Strgulc Krajšek in sod., 2016)

Pravilnik o uvrstitvi ogroženih rastlinskih in živalskih vrst v rdeči seznam (Uradni list RS, št. 82/02 in 42/10) uvršča poleglo in pisano spominčico na Rdeči seznam Republike Slovenije, in sicer poleglo spominčico kot premalo znano vrsto (kategorija K), za katero je na razpolago premalo podatkov za opredelitev ogroženosti, ter pisano spominčico kot prizadeto vrsto (kategorija E, v katero se uvrstijo vrste, katerih obstanek na območju Slovenije ni verjeten, če bodo dejavniki ogroženja delovali še naprej).

2.2 SKUPINA GOZDNE SPOMINČICE (Myosotis sylvatica agg.)

V Sloveniji v skupino gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.) uvrščamo dve vrsti: M.

sylvatica (Ehrh.) Hoffm. in M. decumbens Host (Strgulc Krajšek, 2007). V raziskavi, ki je potekala leta 2013–15 (Sušnik in sod., 2015), je bilo ugotovljeno, da na območju Slovenije najverjetneje uspeva še en takson iz skupine gozdne spominčice, ki je po velikosti pelodnih zrn in morfoloških znakih vmes med zgoraj navedenima vrstama. Takson še ni opisan, prisoten pa je v zahodni Sloveniji, za razliko od M. sylvatica, ki uspeva predvsem v vzhodnem delu Slovenije (Sušnik in sod., 2015).

Nekateri avtorji (Fischer in sod., 2008; Hegi, 1927) v skupino gozdne spominčice uvrščajo še vrsto M. alpestris. Winkworth in sod. (2002) pa poleg M. sylvatica in M. decumbens v to skupino uvrščajo še vrsti M. vestergrenii in M. arvensis. V naši raziskavi smo upoštevali razdelitev, ki sta jo uporabila Grau in Merxmüller (1972) v delu Flora Europaea.

Predstavniki skupine gozdne spominčice uspevajo po vsej Sloveniji, razen na Primorskem, v severovzhodnem delu Slovenije pa le raztreseno (slika 2).

(15)

6

Slika 2: Zemljevid razširjenosti vrst v skupini gozdne spominčice v Sloveniji (Jogan in sod., 2001: 253)

2.2.1 Gozdna spominčica - Myosotis sylvatica (Ehrh.) Hoffm.

Gozdna spominčica (Myosotis sylvatica (Ehrh.) Hoffm.) je zelnata trajnica ali dvoletnica in je visoka od 20 do 50 cm. Njeno steblo je pogosto zelo razvejeno, olistano in dlakavo. Listi so široko do ozko ovalne ali eliptične oblike in niso izrazito pecljati. Cvetni peclji so usmerjeni navzgor in dolgi 7–15 mm. Zeleno obarvana čaša je dolga 5 mm in poraščena z laski. Kavljasto ukrivljeni laski na čaši so štrleči in dolgi do 0,2 mm. Čašni rob je sestavljen iz trikotnih čašnih zobcev. Venec je svetlo modre barve, zgrajen iz venčne cevi in pladnjastega dela venca, ki v premeru meri do 8 mm. Venčna cev je tako dolga ali nekoliko krajša od čaše. Štiridelna plodnica je nadrasla in iz nje se razvijejo 4 plodiči, ki so jajčaste oblike in merijo 1,2 × 1,7 mm (Grau, 1964; Pignatti, 1982;

Tutin in sod., 1972). Pelod je dolg 6,5 µm (Grau, 1964), nekateri viri pa navajajo 6 µm (Štĕpánková, 1993b), kar je potrdila tudi P. Sušnik v svojem magistrskem delu (Sušnik, 2016).

Kromosomsko število gozdne spominčice je 2n = 18 (Grau, 1964).

Gozdna spominčica v Sloveniji cveti od maja do septembra na senčnih, zmerno vlažnih rastiščih (Strgulc Krajšek, 2007).

V Evropi navajajo prisotnost več podvrst gozdne spominčice (Grau in Merxmüller, 1972): M.

sylvatica subsp. sylvatica, M. sylvatica subsp. subarvensis Grau, M. sylvatica subsp. cyanea (Boiss. & Heldr) Vestergren, M. sylvatica subsp. elongata (Strobl) Grau. Greuter in sod. (1984) omenjajo še podvrsto M. sylvatica subsp. rivularis Vestergren in Ark., ki uspeva v Turčiji. Mala flora Slovenije podvrste gozdne spominčice ne navaja (Strgulc Krajšek, 2007).

(16)

7

Gozdna spominčica uspeva na severni polobli na območju Evrazije (Meusel in sod., 1978; slika 3). Prisotna je v večjem delu Evrope, razen jugozahoda in skrajnega severa (Grau in Merxmüller, 1972).

Slika 3: Uspevanje nekaterih vrst spominčic (Myosotis) na območju Evrazije, med njimi tudi M. sylvatica s podvrstami in M. decumbens (Meusel in sod., 1978: 364)

Gozdna spominčica je prisotna v vseh sosednjih državah Slovenije. Vrsto najdemo po vsej Italiji z izjemo Sardinije. Uspeva na travnikih, v gozdovih in na grmovnatih pobočjih na nadmorski višini od 500 do 1800 m, redko 2000 do 2200 m (Pignatti, 1982). Pogosta in splošno razširjena je v Avstriji, najdemo jo od submontanskega do montanskega pasu (Fisher in sod., 2008). Uspeva tudi na Madžarskem v bukovo-gabrovih gozdovih. Precej pogosta je v severnem madžarskem hribovju (Dénes in Gergely, 2015; Tibor, 2002). Na Hrvaškem je vrsta prisotna v hribovitih območjih s tremi podvrstami: M. sylvatica subsp. cyanea, M. sylvatica subsp. subarvensis, M. sylvatica subsp.

sylvatica (Domac, 1990; Nikolić, 2000).

(17)

8

Mala Flora Slovenije navaja, da je gozdna spominčica razširjena po vsem slovenskem ozemlju, manjka samo na submediteranskem območju. Raste na travnikih, v vlažnih gozdovih in na grmovnatih pobočjih od nižine do subalpinskega pasu (Strgulc Krajšek, 2007; Jogan in sod., 2001).

Nedavna raziskava (Sušnik in sod., 2015) je pokazala, da večina podatkov iz zahodne Slovenije, ki so na zemljevidu razširjenosti na sliki 2 (Jogan in sod., 2001) prikazani kot podatki M. sylvatica agg., pripada novemu taksonu (slika 4). Podatki iz vzhodne Slovenije so večinoma primerki M.

sylvatica, kot jih je določila P. Sušnik (2016).

Slika 4: Razširjenost skupine gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.) v Sloveniji (Sušnik, 2016: 66)

2.2.2 Polegla spominčica - Myosotis decumbens Host.

Klasično nahajališče polegle spominčice je v Ljubljani (Host, 1827). Polegla spominčica (Myosotis decumbens Host.) je zelnata trajnica, ki zraste od 20 do 40 cm. Gre za rastlino s plazečimi korenikami, zato rastline ne rastejo posamič, ampak v strnjenih skupinah. Pritlični listi so dolgopecljati in gosto dlakavi. Zeleno obarvana čaša je dolga do 6 mm in poraščena s številnimi laski. Kavljasto ukrivljeni laski so dolgi od 0,4 do 0,6 mm. Čašni rob je sestavljen iz trikotnih čašnih zobcev. Svetlo modro obarvan cevastopladnjast venec ima premer 6 do 8 mm. Venčna cev rahlo presega dolžino čaše. Štiridelna plodnica je nadrasla in iz nje se razvijejo 4 plodiči, ki so jajčaste oblike in dolgi okoli 2 mm. Pelod je dolg približno 8 µm (Grau, 1964; Pignatti, 1982).

V Sloveniji cveti od junija do avgusta, raste na vlažnih in senčnih mestih (Strgulc Krajšek, 2007).

V Evropi so opisali več podvrst polegle spominčice (Grau in Merxmüller, 1972): M. decumbens subsp. decumbens, M. decumbens subsp. teresiana (Sennen) Grau, M. decumbens subsp. variabilis

(18)

9

(M. Angelis) Grau, M. decumbens subsp. kerneri (Dalla Torre & Sarnth.) Grau, M. decumbens subsp. florentina Grau. V Romuniji je bila opisana M. decumbens subsp. transsylvanica Porc.

Greuter s sodelavci omenja še M. decumbens subsp. rifana (Maire) Greuter in Burdet (Greuter in sod., 1984).

Vrsta je v Sloveniji zastopana z dvema podvrstama (Strgulc Krajšek, 2007; Grau, 1964; Tutin in sod., 1972):

 M. decumbens subsp. decumbens, pri kateri je dolžina venčne cevi za 1/3 ali ¼ daljša od čaše. Pestič je krajši od venčne cevi. Število kromosomov: 2n = 32.

 M. decumbens subsp. variabilis (Angelis) Grau [M. sylvatica (Ehrh.) Hoffm. subsp.

variabilis (Angelis) Nym., M. decumbens Angelis], pri kateri je dolžina venčne cevi dvakrat daljša od čaše. Dolžina pestiča je daljša od venčne cevi. Opazimo lahko, da prašnice štrlijo iz venčne cevi. Število kromosomov: 2n = 32.

Poleglo spominčico v Evropi najdemo predvsem v gorskih predelih na območju Alp, Balkanskega, Apeninskega in Pirenejskega polotoka, ter v Skandinaviji (Meusel in sod., 1978; slika 3). Prek Skandinavije se širi naprej v Rusijo (Grau, 1964; Grau in Merxmüller, 1972).

Vrsta je prisotna v vseh sosednjih državah Slovenije, razen na Madžarskem (Dénes in Gergely, 2015; Tibor, 2002). V Italiji uspeva le na severnem delu, v vlažnih gozdovih. Zasledimo jo tudi na bregovih potokov, na višini 800 do 2000 m. V Italiji uspevajo tri podvrste: M. decumbens subsp.

decumbens, M. decumbens subsp. florentina, M. decumbens subsp. kerneri (Pignatti, 1982). V Avstriji vrsta uspeva od montanskega do subalpinskega pasu, zastopane so tri podvrste: M.

decumbens subsp. decumbens, M. decumbens subsp. variabilis, M. decumbens subsp. kerneri (Fisher in sod., 2008). Na Hrvaškem uspevata dve podvrsti polegle spominčice: M. decumbens subsp. decumbens in M. decumbens subsp. variabilis (Nikolić, 2000). V bazi podatkov Flora Croatica (Nikolić, 2015) pa je zabeležen le en podatek M. decumbens, z območja južnega Velebita.

Kljub temu da je klasično nahajališče polegle spominčice v Ljubljani (Host, 1827), tipska podvrsta v 1. izdaji Male flore Slovenije ni omenjena (Martinčič, 1969). V tem delu je omenjena le podvrsta M. decumbens subsp. variabilis, ki pa je obravnavana na vrstnem nivoju kot M. variabilis Angelis.

V drugi izdaji Male flore Slovenije (Martinčič, 1984) sta v določevalni ključ vključeni tako M.

variabilis kot M. decumbens, a je M. variabilis pri opisih vrst (verjetno pomotoma) izpuščena. V tretji izdaji Male flore Slovenije (Martinčič in sod., 1999) tipska podvrsta M. decumbens ponovno manjka.

(19)

10

Četrta izdaja Male flore Slovenije (Strgulc Krajšek, 2007) navaja dve podvrsti polegle spominčice:

M. decumbens subsp. decumbens in M. decumbens subsp. variabilis. Za M. decumbens subsp.

decumbens navaja, da je slika razširjenosti, zaradi pogostih zamenjav z vrsto M. sylvatica, zelo nejasna. P. Sušnik (2016) je v reviziji herbarijskega materiala iz Herbarija Univerze v Ljubljani potrdila le 5 nahajališč te vrste, in sicer v Ljubljani, Škofji Loki, Senčurju, Kranju in Kobaridu. M.

decumbens subsp. variabilis (Angelis) Grau (spremenljiva spominčica) naseljuje vlažne trate v subalpinskem pasu. Podatki so z Vajneža in Belščice v Karavankah (Strgulc Krajšek, 2007).

Prisotnost te podvrste v Karavankah je potrdila tudi P. Sušnik (2016).

2.2.3 Novi takson spominčice

Morfološki opis novega taksona povzamem po magistrskem delu Polone Sušnik: "Revizija skupine gozdne spominčice (Myosotis sylvatica agg.) v Sloveniji" (2016).

Rastlina zraste od 20 do 60 cm. Pritlični listi so pecljati, stebelni pa sedeči in jajčaste oblike.

Najdaljši kavljasto ukrivljeni laski na dnu čaše merijo od 0,4 do 0,6 mm. Svetlomodro obarvan venec ima premer do 8 mm. Dolžina venčne cevi je od 1 do 2,5 mm. Vrh plodiča je koničasto oblikovan in brez vzdolžnega grebena. Dolžina pelodnega zrna je okoli 7 µm. Takson uspeva do 1000 metrov nadmorske višine, predvsem v zahodnem delu Slovenije, prisotnost je bila potrjena tudi v severni Italiji in v Avstriji na Koroškem (Sušnik, 2016).

2.3 VELIKOST JEDRNEGA GENOMA

Zanimanje za velikost genoma seže že v leto 1940, ko so raziskovalci začeli z merjenjem in primerjavo količine DNA. Zgodnje študije so pokazale, da je velikost jedrnega genoma znotraj vrste konstantna in od takrat naprej ima velik pomen v bioloških in evolucijskih študijah, že desetletja prej pa so se ukvarjali s povezavo števila kromosomov in taksonomije (Garcia in sod., 2014).

Velikost genoma izražamo kot vrednost C, ki pomeni konstantno vrednost (ang. 'constant').

Vrednost 1C je definirana kot nepodvojen haploidni genom, ki ga imajo jedra po mejozi (Bennett in Leitch, 1995).

Med celičnim ciklom se količina jedrne DNA spreminja. V somatskih celicah sporofitov kritosemenk, ki se mitotsko delijo, jedra vsebujejo količino DNA od vrednosti 2C (telofaza mitoze, faza G1 interfaze) do 4C (faza G2 interfaze, profaza mitoze). V fazi S interfaze je količina jedrne DNA med vrednostjo 2C in 4C (Dolenc Koce, 2001). Količino DNA izrazimo kot maso v

(20)

11

pikogramih (1 pg = 10^-12 g) ali kot število nukleotidnih parov (1 pg = 978 Mb) (Garcia in sod., 2014).

Podatki o velikosti genoma so pomembni za številne raziskave. Uporabljajo se pri reševanju evolucijskih vprašanj, v ekologiji, celični in molekularni biologiji, fiziologiji, razvojni biologiji, paleontologiji in sistematiki (Bennett in Leitch, 1995).

Znotrajvrstna variabilnost velikosti genoma je uporaben pokazatelj taksonomske heterogenosti in speciacije v teku. V sistematiki bi lahko s pomočjo vrednosti C razrešili taksonomske težave, ki se pojavljajo pri nekaterih rodovih (Murray, 2005).

Baza Plant DNA C- values vsebuje podatke o velikosti jedrnega genoma za vse glavne skupine kopenskih rastlin (Bennett in Leitch, 2012). Do zdaj je zbranih že 8510 podatkov za posamezne vrste. Za rod Myosotis so podatki zelo skopi. V zbirki lahko zasledimo dva podatka o velikosti jedrnega genoma za vrsto Myosotis scorpiodes (Myosotis palustris): 1C = 1,40 pg DNA in 1C = 2,68 pg DNA. Kot metoda je bila uporabljena mikrodenzitometrija, jedra so bila barvana s Feulgenovo reakcijo. Število kromosomov: 2n = 64 (Bennett in Leitch, 2012). Drugi viri navajajo še 2n = 66 (Štěpánková, 1993a).

Najbolj razširjena metoda za merjenje količine jedrne DNA je pretočna citometrija, ki temelji na fluorometriji (Bennett in Leitch, 2011). Količina DNA je ocenjena iz količine oddajne svetlobe, merjenje z mikroskopskim fotometrom ali s pretočnim citometrom.

V botaniki se je v preteklosti, za določanje količine jedrne DNA, najbolj uporabljala mikrodenzitometrija s fotocitometrom (fotometrična citometrija). Študija iz leta 2001 je dokazala, da je moderna izvedba denzitometrije, imenovana slikovna citometrija, tudi primerna za določanje količine jedrne DNA v rastlinah (Vilhar in sod., 2001).

2.3.1 Variabilnost genoma

Pričakovali bi, da imajo preprosti organizmi majhne genome in višje razviti organizmi velike genome. Tako imenovani paradoks vrednosti C pa se nanaša na opažanja, da količina DNA v različnih organizmih ni v korelaciji z zapletenostjo organizmov. Poleg tega vrednosti C za posamezne razrede evkariontov ne naraščajo z njihovo evolucijsko kompleksnostjo (Lee in Kim, 2014; Taft in sod., 2007).

Velikost genoma je med organizmi izjemno variabilna. Največjo variabilnost zasledimo prav pri rastlinah. Med kopenskimi rastlinami kritosemenke obsegajo celoten spekter vrednosti C in varirajo za okoli 2400-krat, od 0,0648 pg DNA pri vrsti Genlisea margaretae (družina Lentibulariaceae) do 152,23 pg DNA pri vrsti Paris japonica (družina Melanthiaceae) (Bai in

(21)

12

sod., 2012; Bennett in Leitch, 2011). Povprečna velikost jedrnega genoma pri kritosemenkah znaša 1C = 6,51 pg DNA, in kot je razvidno na sliki 5, ima večina rastlin majhen genom, saj se pojavlja le nekaj skupin z ekstremno velikim genomom (Lee in Kim, 2014).

Bistveno manjše razlike v velikosti genoma opazimo pri drugih skupinah. Pri praprotih se vrednosti C razlikujejo za okoli 95-krat, pri golosemenkah za približno 14-krat in pri mahovih le za okoli 12-krat (Gregory, 2005).

Slika 5: Variabilnost velikosti genoma za glavne skupine rastlin (Metcalfe in Casane, 2013). Vodoravni stolpci kažejo najmanjšo do največjo velikost genoma (v Gb) za določeno skupino, krogec v njih prikazuje povprečno velikost genoma. Številke na desni strani pomenijo število vključenih vrst za to skupino, številka v oklepaju odstotek vrst v skupini, ki imajo velikost genoma večjo od 20 Gb. Modro senčenje prikazuje genome večje od 20 Gb (Metcalfe in Casane, 2013).

Molekularne raziskave organiziranosti jedrne DNA so pokazale, da razlike v velikosti genoma niso odvisne od števila genov ali velikosti genov, ampak so povezane predvsem s količino in deležem ponavljajočih se nekodirajočih zaporedij v jedrnem genomu, ki jih enačimo s pojmom transpozicijski elementi (TE) (Bennetzen in sod., 2005). Znana je linearna povezanost med velikostjo genoma in delom genoma, ki ga sestavljajo TE. Pri kritosemenkah z večjo vrednostjo C predstavljajo TE do 85 % jedrnega genoma. Veliki genomi so torej lahko skoraj v celoti sestavljeni iz njih. Največji prispevek k velikosti genoma naj bi imeli retroelementi, predvsem dolgi terminalni ponavljajoči se retrotranspozoni (LTR) (Bennett in Leitch, 1995; Lee in Kim, 2014).

Medvrstna in znotrajvrstna variabilnost vrednosti C je povezana s fenotipskimi lastnostmi na ravni kromosomov, jeder, celic, tkiv in s hitrostjo mitotskega, mejotskega in generacijskega cikla.

(22)

13

Odraža se v ekološki in geografski razširjenosti rastlin, njihovih fenoloških lastnostih in optimalnih rastnih razmerah (Bennett in Leitch, 1995).

Znotraj populacije iste vrste prihaja do variabilnosti genoma zaradi kromosomskih sprememb, kot so poliploidija, anevploidija, prisotnost B-kromosomov in spolnih kromosomov. Razlike lahko nastanejo tudi zaradi mutacijskih procesov na molekularnem nivoju, in sicer zaradi delovanja transpozicijskih elementov, polimorfizma, delecije in ektopične rekombinacije. Medtem ko kromosomske mutacije nastanejo med mitozo in mejozo ter povzročijo nenadne in velike spremembe v genomu, se lahko mutacije na molekularni ravni pojavijo na različnih stopnjah razvoja in povzročijo postopno povečanje variacije (Gregory, 2005; Šmarda in Bureš, 2010).

Razlike v velikosti genoma znotraj vrste lahko nastanejo tudi kot prilagoditve na različne ekološke razmere. Znano je, da rastline z manjšimi genomi najdemo na višjih zemljepisnih širinah in nadmorskih višinah (Šmarda in Bureš, 2010). Prav tako imajo praviloma manjše genome rastline, ki rastejo v stresnem in časovno omejenih rastnih razmerah (Ohri, 1998). Količino DNA so primerjali tudi z rastno dobo rastlin, kjer naj bi veljalo pravilo, da imajo kratkotrajnice in enoletnice majhne genome (Gregory, 2005). Vse raziskave pa niso potrdile teh korelacij (Ohri, 1998).

Ker so organizmi sestavljeni iz celic, obstaja možnost, da sprememba v genomu povzroči spremembo v velikosti telesa. Vendar velikost genoma ne vpliva na splošno telesno velikost, lahko pa vpliva na velikost posameznih organov, kot so npr. listi, cvetovi, semena (Gregory, 2005).

Raziskave so pokazale, da lahko velikost listov pozitivno ali negativno korelira z velikostjo genoma, odvisno od taksonomske skupine (Knight in sod., 2010). V splošnem tudi velja negativna korelacija med vrednostjo C in velikostjo cvetov (Gregory, 2005). Prav tako se je pokazalo, da so majhni genomi lahko povezani z majhnimi ali velikimi semeni, velikih genomov pa ne najdemo v majhnih semenih (Knight in Ackerly, 2002).

Raziskani so tudi odnosi med velikostjo genoma in trajanjem celičnega cikla, velikostjo in maso semen, velikostjo pelodnega zrna, stopnjo fotosinteze in velikostjo listnih rež (Bennett in Leitch, 2011; Knight in sod., 2010). Primerjalnih študij za rod spominčic ali družino srholistovk ni mogoče zaslediti.

(23)

14

2.4 KROMOSOMSKO ŠTEVILO IN POLIPLOIDIJA 2.4.1. Kromosomsko število

Vsaka vrsta ima v jedru značilno število kromosomov. Splošno veljavno je, da je kromosomsko število pri določeni vrsti konstantno (Stace, 1989). Zato je kromosomsko število uporaben taksonomski znak.

Vrsti v obravnavani skupini gozdne spominčice se na kromosomskem nivoju dobro razlikujeta:

 M. sylvatica ima 2n = 18 (Hegi, 1927; Grau, 1964). V literaturi lahko zasledimo, da so odkrili tudi populacijo gozdne spominčice s kromosomskim številom 2n = 20 (Grau, 1964).

Kromosomsko število podvrst gozdne spominčice: M. sylvatica subsp. sylvatica 2n = 18 (20), M. sylvatica subsp. subarvensis 2n = 18, M. sylvatica subsp. cyanea 2n = 18, 20, M.

sylvatica subsp. elongata 2n = 22 (Grau, 1964).

 M. decumbens ima 2n = 32 (Hegi, 1927; Grau, 1964).

Kromosomsko število podvrst polegle spominčice: M. decumbens subsp. decumbens 2n = 32, M. decumbens subsp. teresiana 2n = 32 (34), M. decumbens subsp. variabilis 2n = 32, M. decumbens subsp. kerneri 2n = 32 (Grau, 1964).

Slika 6: Kariograma obravnavanih vrst gozdnih spominčič (Grau, 1964: 603)

(24)

15

Slika 7: Kromosomi obravnavanih vrst gozdnih spominčic (Grau, 1964: 608)

Velikost kromosomov, položaj centromer in druge diferenciacije kromosomov so v pomoč v rastlinski sistematiki (Judd in sod., 2008). S kariološko raziskavo skupine gozdne spominčice se je ukvarjal Grau (1964). Kot najbolj primerni za kariološke raziskave so se izkazali meristemi iz somatskih območij. Dolžina največjega metafaznega kromosoma pri vrsti M. sylvatica je približno 3 μm, dolžina najmanjšega pa 0,75 μm. Bolj očitne razlike so bile v profazi, kjer je bila dolžina največjega kromosoma 10 μm in najmanjšega 2 μm. Po mnenju avtorja je indentifikacija kromosomov na podlagi njihove velikosti možna, vendar je treba opraviti še druge raziskave morfoloških diferenciacij kromosomov (Grau, 1964).

2.4.2. Poliploidija

Med ozko sorodnimi vrstami lahko pride do precejšnih razlik v kromosomskem številu. Do njih najpogosteje pride zaradi pojava poliploidije (Stace, 1989). Poliploidija je hiter in dramatičen mehanizem, ki lahko podvoji gensko vsebino in velikost genoma v eni sami generaciji. Večina semenk je ali poliploidnih ali imajo poliploidni izvor (Bennetzen in sod., 2005). Poliploidija povzroči fenotipske in morfološke spremembe, kot tudi spremembe v rastlinski fiziologiji, kot je npr. povečana odpornost proti mrazu. Povezana je tudi s povečanjem heterozigotnosti osebka, višjo stopnjo samooploditve in višjo stopnjo nespolnega načina razmnoževanja (Storme in Mason, 2014). Pri kritosemenkah ocena deleža poliploidnih vrst variira med 30 do 80 % (Stace, 1989).

Poliploidni organizem vsebuje več kot dve garnituri kromosomov. Izraz »ploidnost« ali »ploidni nivo« se nanaša na število kopij kromosomov, ki jih označujemo s črko x. Običajno so organizmi diploidni, kar pomeni, da imajo dve garnituri kromosomov (2x). Če imajo tri garniture kromosomov, gre za triploide (3x), in tako naprej za tetraploide (4x), pentaploide (5x), heksaploide (6x) ...

(25)

16

Pomembno je tudi, da opredelimo, ali se število nanaša na znižano (gametofitsko) kromosomsko število pri mejozi, kjer imajo haploidne celice eno garnituro kromosomov (označimo z »n«) ali se nanaša na nereducirana (sporofitska) tkiva (označimo z »2n«). Tako bodo na primer tetraploidne breze predstavljene kot 2n = 4x = 56 (Ranney, 2006).

V naravi pride do poliploidije na več načinov. V nekaterih primerih pride do somatskih mutacij, kjer je zaradi motenj v mitozi rezultat kromosomska podvojitev v meristemskih celicah in povod za nastanek poliploidnega poganjka. Poliploidijo izzovejo tudi združitve nereduciranih gamet, ki so še vedno v diploidnem (2n) stanju.

Potomci, na katere se nanašata ta dva načina, ki izhajajo iz dveh tesno povezanih diploidnih posameznikov, se imenujejo avtopoliploidi. Avtotetraploid (ali polisomski tetraploid) bo tako imel štiri homologne različice vsakega kromosoma.

Potomci, ki nastanejo s križanjem dveh različnih vrst in nato podvojijo število kromosomov, se imenujejo alopoliploidi. Gre za poliploide z dvema ali več različnih kromosomskih garnitur (Ranney, 2006).

Zgoraj opisana poliploidija se imenuje evploidija. V naravi zasledimo tudi anevploidijo, kjer pride do povečanja ali zmanjšanja števila samo nekaterih kromosomov (Storme in Mason, 2014).

Kromosomsko število se tako razlikuje od mnogokratnega osnovnega kromosomskega števila (Stace, 1989).

Do spremembe števila kromosomov lahko pride tudi zaradi preureditve DNA in posameznih delov kromosoma. Pri takšni poliploidiji uporabimo izraz disploidija (Storme in Mason, 2014).

Geitler (1936, cit. po Grau, 1964) je bil prvi, ki je pridobil točne kariološke rezultate (n = 9 in n

=16) za obravnavani vrsti skupine M. sylvatica agg. Ker morfoloških razlik med vrstama ni zasledil, so ga citološke razlike pripeljale na idejo, da je osnovno število vrste x = 8. Iz te osnovne oblike je nastala diploidna oblika z dodatnim kromosomom v haploidni celici in tetraploidna oblika 2n = 32 v procesu poliploidije. Našel ni nobene povezanosti med sicer bližnje sorodno skupino M. alpestris, v kateri imajo vse vrste x = 12 (Grau, 1964).

Grau (1964) pa je upošteval pri svoji razlagi bližnje sorodstvene odnose s skupino M. alpestris.

Evolucijsko naj bi M. sylvatica nastala v procesu disploidije. Vrsta M. decumbens pa naj bi nastala s pomočjo zapletenih dogodkov poliploidije in disploidije, katerih sledovi so skoraj popolnoma zabrisani.

(26)

17

2.4.2.1 Korelacija med velikostjo jedrnega genoma in dolžino peloda

Različne študije so pokazale močan pozitivni odnos med velikostjo genoma in velikostjo celic, kar je puščalo odprto možnost povezave med velikostjo jedrnega genoma in dolžino pelodnih zrn.

Pelod ni metabolno aktiven in je precej drugačen od drugih tipov celic. Prav tako nanj deluje močan selekcijski pritisk, ki daje prednost majhnim celicam. Kljub temu so pri različnih raziskavah vrst ali rodov ugotovili povezavo med velikostjo pelodnih zrn in stopnjo ploidnosti (Knight in sod., 2010). Že leta 1972 je Bennett na primeru šestnajstih vrst trav ugotovil pozitivno korelacijo med obsegom peloda in vrednostjo C (Murray, 2005).

V raziskavi On the Relationship between Pollen Size and Genome Size leta 2010 so testirali 464 filogenetsko neodvisnih vrst in prišli do ugotovitev, da na mikroevolucijski ravni (znotraj ozko sorodnih skupin vrst) lahko potrdijo trend naraščajoče velikosti peloda s povečanjem velikosti genoma, vendar pa to ne drži, če med seboj primerjamo manj sorodne skupine vrst (Knight in sod., 2010).

2.5

CILJI MAGISTRSKE NALOGE

V okviru magistrske naloge smo si zastavili dva cilja:

1

. Izmeriti velikost jedrnega genoma in določiti kromosomska števila pri predstavnikih skupine gozdne spominčice z območja Slovenije in obmejnih območij sosednjih držav.

2. Ugotoviti, v kakšni korelaciji sta velikost peloda in velikost jedrnega genoma pri slovenskih predstavnikih skupine gozdne spominčice.

Postavili smo dve hipotezi:

1. Novi takson ima velikost jedrnega genoma in število kromosomov, ki je po vrednostih vmes med vrstama M. sylvatica in M. decumbens.

2. Velikost peloda v izmerjenih primerkih iz skupine gozdne spominčice je v pozitivni korelaciji z velikostjo jedrnega genoma ter številom kromosomov.

(27)

18

3 MATERIAL IN METODE

3.1 RASTLINSKI MATERIAL

Za analize velikosti genoma in štetje kromosomov potrebujemo sveže koreninske vršičke. Te smo pridobili iz dveh virov:

1. Iz Herbarija Univerze v Ljubljani (Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani) smo izbrali herbarijske pole, ki niso bile starejše od 1 leta in so vsebovale zrela semena. Ta semena smo kalili in uporabili koreninske vršičke kalic.

2. Sveže vzorce smo nabirali spomladi leta 2015 v času cvetenja. Nabirali smo na območju Slovenije, Hrvaške, Italije in Avstrije. Pri vzorčenju smo želeli čim bolje pokriti geografska območja v Sloveniji in soseščini, kjer uspevajo proučevani taksoni, ter nabrati material vseh treh taksonov iz skupine gozdne spominčice. Podatki o uporabljenem rastlinskem materialu so v prilogi A.

Za pridobivanje koreninskih vršičkov iz kalic smo uporabili od 7 do 15 semen (v plodičih) za vsak vzorec herbariziranih rastlin. Semena so kalila na vlažnem filtrirnem papirju v plastičnih petrijevkah pri sobni temperaturi in dnevni svetlobi. Filtrirni papir smo po potrebi vlažili z destilirano vodo. Semena so vzklila po 6–16 dneh. Ko so korenine dosegle dolžino najmanj 1 cm, so bile primerne za postopek fiksiranja. Dokazni rastlinski material smo herbarizirali in shranili v Herbariju Univerze v Ljubljani.

Na terenu nabrane rastline smo posadili v cvetlične lončke s prstjo. Ko so zrasle stranske korenine, smo jih odrezali in fiksirali. Pri posameznih primerkih, kjer stranske korenine niso zrasle (predvidevamo, da je bila zemlja preveč zbita ali vlažna), smo uporabili semena. Le-ta smo pred kalitvijo vsaj 5 dni hranili v hladilniku pri 4 °C, nadaljnji postopek pa je bil enak kot za herbarizirana semena. Ta semena so slabše kalila, nekatera od njih so vzkalila po 9–15 dneh.

3.2 FIKSIRANJE VZORCEV

Odrezali smo po 1 cm dolge korenine poganjkov in jih fiksirali v raztopini formalina, ocetne kisline in etanola (FAA; 4 % formalin, 5 % led ocetna kislina, 48 % etanol), ki se uporablja za fiksiranje tkiv s tanini. Vloga fiksativa je, da zamreži tanine, da ne motijo obarvanosti DNA s Schiffovim reagentom. Po pregledu vzorcev smo se zaradi obarvane citoplazme odločili zamenjati fiksativ.

Nadaljnje fiksiranje je potekalo s Farmerjevim fiksativom (EAA; mešanica absolutnega etanola in led ocetne kisline v volumenskem razmerju 3 : 1). Vedno smo pripravili svež fiksativ tik pred

(28)

19

uporabo. Rastlinske vzorce smo fiksirali vsaj 24 ur v hladilniku pri 4 °C. Za dolgotrajnejše shranjevanje smo vzorce prenesli v 96 % etanol in jih hranili v zmrzovalniku pri -20 °C (Dolenc Koce, 2001).

3.3 ANALIZA VELIKOSTI GENOMA 3.3.1 Umeritveni standard

Izbira ustrezne umeritvene vrste je ključnega pomena za pravilno oceno velikosti rastlinskega genoma, saj z njo ocenimo neznano količino DNA preiskovanega vzorca in jo izrazimo v pikogramih. V raziskavah se uporabljajo različne standardne vrste: Raphanus sativus, Zea mays, Pisum sativum, Vicia faba, Allium cepa. Trenutno se kaže kot najbolj primerna vrsta Pisum sativum, ki ima naslednje lastnosti: srednja velikost genoma, konstantnost genoma, odsotnost motečih metabolitov v listnih tkivih, stalna dostopnost in enostavna rast (Doležel in Greilhuber, 2010).

Semena graha (Pisum sativum L. cv. Kleine Rheinlaenderin), ki so bila predhodno shranjena v hladilniku pri 4 °C, smo kalili skupaj s semeni spominčic in za vse uporabili iste postopke fiksiranja, barvanja in meritev.

3.3.2 Barvanje po Feulgenu

Fiksirane korenine smo v steklenih fiolah pobarvali po Feulgnu, po postopku, prirejenem po Greilhuber in Ebert (1994).

Fiksirane korenine rastlin smo spirali v destilirani vodi najmanj 5 minut pri sobni temperaturi, da smo odstranili fiksativ. Temu je sledila hidroliza v 5 M HCl v termostabilni vodni kopeli pri temperaturi 20 °C (60 minutna hidroliza za vzorce, fiksirane z EAA oz. 90 minutna hidroliza za vzorce, fiksirane s FAA). Po hidrolizi smo vzorce prenesli v ledeno mrzlo destilirano vodo za 5 do 10 minut, s čimer smo zaustavili hidrolizo. Korenine smo nato barvali s Shiffovim reagentom 120 minut pri 20 °C v vodni kopeli ali čez noč v hladilniku pri 4 °C. Prebitek barvila smo odstranili s spiranjem v SO2-vodi, in sicer trikrat po 2 minuti, dvakrat po 10 minut in enkrat 20 minut, pri 20 °C. Obarvane korenine smo prenesli v destilirano vodo. Tik pred pripravo preparatov mečkancev smo jih za 5 do 15 minut prenesli v 45 % ocetno kislino, ki tkivo zmehča. Sledila je priprava mečkancev.

(29)

20

Pri pripravi reagentov smo sledili protokolom v delu Dolenc Koce (2001).

Priprava Schiffovega reagenta:

1. 4 g pararosanilin klorida (pararosaniline klorid, BDH, VB) raztopi v 800 mL vrele destilirane vode.

2. Raztopino premešaj in pusti, da se ohladi na 50 °C.

3. Raztopino vakumsko prefiltriraj preko enega ali dveh filtrov iz steklenih vlaken (Microfibre filters, Whatman GF/C).

4. Raztopini dodaj 120 mL 1 M HCl in 12 g kalijevega metabisulfita K2S2O5 (Fisons, VB).

5. Raztopino pusti preko noči v temi na sobni temperaturi.

6. Raztopini dodaj 2 g aktivnega oglja za razbarvanje (decolourising charcoal, BDH, VB) in premešaj.

7. Raztopino vakumsko prefiltriraj preko filtra iz steklenih vlaken v suho steklenico (če raztopina ni prozorna, dodaj oglje in ponovno filtriraj).

8. Raztopino shrani v temi v hladilniku pri 4 °C do 4 mesece.

Priprava SO2-vode:

1. V 475 mL destilirane vode dodaj 25 mL 1M HCl.

2. Raztopini dodaj 2,5 g kalijevega metabisulfita K2S2O5 (Fisons, VB).

3.3.3 Priprava mečkancev

Objektna stekelca smo očistili s 45 % ocetno kislino in jih primerno označili. V kapljico 45 % ocetne kisline smo položili korenino in z britvico odrezali koreninski vršiček. Vzorec smo prekrili s krovnim stekelcem in s preparirno iglo pritisnili nanj, da smo ločili jedra med seboj. Pri spominčici z majhnimi in nežnimi koreninami smo pritisnili rahlo, pri grahu z večjimi bolj kompaktnimi koreninami smo s preparirno iglo pritiskali močneje od sredine navzven. S pomočjo mikroskopa smo preverili kakovost preparata. Čez krovno stekelce smo položili košček filtrirnega papirja in s palcem navpično pritisnili nanj, da smo dobili eno plast celic oz. jeder. Na suhem ledu (CO2 v trdnem stanju) smo zamrznili mečkance in z britvico odstranili krovno stekelce. Nato smo preparate dehidrirali 3 do 5 minut v 96 % etanolu. Preparate smo posušili čez noč v temi, da smo preprečili razbarvanje jeder na svetlobi. Pripravljeni preparati so trajni in na voljo za več meritev.

(30)

21

3.3.4 Merjenje velikosti genoma s slikovno citometrijo DNA

Za merjenje količine jedrne DNA v meristemskih celicah koreninskega vršička smo uporabili slikovno citometrijo.

Slikovna citometrija je statistična kvantitativna analitična metoda, ki omogoča merjenje številnih lastnosti celic na objektnem stekelcu. S pomočjo te metode lahko analiziramo količino DNA ter strukturo in razporeditev jedrne DNA v posamični celici. Za optimalno analizo potrebujemo celične vzorce, v katerih so celice nanešene v enem sloju in med seboj dovolj razmaknjene (Strojan Fležar in Us-Krašovec, 2002). Pri slikovni citometriji računalniški sistem za analizo slike zajame izvorno mikroskopsko sliko preko digitalne kamere. Za vsako točko v jedru sistem izmeri sivo vrednost ter izračuna transmisijo in optično gostoto. Prednost te metode pred metodo pretočne citometrije je večja uporabnost fiksiranega materiala, kar je še posebej pomembno pri rastlinah, pri katerih svež material ni vedno na voljo. Preparati so trajni in na voljo za več meritev. Poleg tega omogoča, da na istem preparatu, ob uporabi enakih postopkov barvanja, določimo stopnjo ploidnosti, količino DNA in število kromosomov (Dolenc Koce, 2001).

Sistem za analizo slike sestavljajo svetlobni mikroskop (Axioskop MOT, Carl Zeiss), črnobela CCD kamera (Sony DXC-950P), osebni računalnik, zajemalnik slike (Matrox Meteor ) in programski paket za analizo slike KS 400 različica 3.0 (Carl Zeiss Vision) (Dolenc Koce, 2001).

Pred začetkom vseh meritev smo 90 minut imeli prižgano lučko na mikroskopu in CCD kamero, da se je sistem segrel in stabiliziral.

Pri meritvah smo uporabili imerzijski objektiv s 63 × povečavo (Plan-Neofluar, Carl Zeiss, 63 × /1,25 Oil) ob Köhlerjevi osvetlitvi in uporabi zelenega filtra (540 nm).

S pomočjo makro podprogramov (IOD_1 LED, IOD_2, IOD_3) v programskem paketu KS 400 smo izvedli tri korake umeritve. Pri prvem koraku smo nastavili osvetlitev, sledila je denziometrična umeritev z nizom sedmih nevtralnih filtrov s transmisijo: 79, 70, 63, 50, 20 in 5

%. Računalnik je izrisal umeritveno krivuljo, ki nam je služila za vzpostavitve linearnosti denziometrične meritve. V tretjem koraku smo zajeli sivo sliko z zajemalnikom slike Matrox Meteor (velikost slike 760 × 560 pikslov). Na zajeti sliki je program za analizo slike na osnovi sivih vrednosti izvedel segmentacijo slike in izračunal intergrirano optično gostoto (IOG) za posamezna izbrana jedra. Izbirali smo le interfazna jedra.

Na vsakem preparatu smo izmerili vsaj 100 interfaznih jeder, ki so bila razporejena v eni sami plasti brez motenj v ozadju. Rezultate meritev smo prikazali kot frekvenčno porazdelitev IOG.

IOG smo merili v arbitrarnih enotah. Vrh na grafičnem prikazu je predstavljal vrednost 2C.

(31)

22

Ločeno smo izmerili obarvanost jeder za gozdne spominčice in za umeritveni standard.

Za preverjanje kakovosti in zanesljivosti meritev količine DNA trenutno uporabljamo naslednje standarde (Vilhar in sod., 2001):

 širina vrha 2C (KVv), izražena kot koeficient variacije vrha, ne sme presegati 6 %,

 odklon razmerja med vrednostjo 4C in 2C ne sme za več kot 5 % odstopati od 2,0,

 korelacijski koeficient med površino jeder v vrhu in vrednostjo C ne sme presegati 0,4.

Pri pregledu smo se osredotočili predvsem na širino vrha 2C, ki predstavlja jedra v fazi G1 celičnega cikla.

3.3.5 Statistična analiza podatkov

V računalniškem programu Microsoft Excel smo podatke, izmerjene IOG, rangirali po velikosti in izračunali kumulativno frekvenco IOG. Vrednost 2C smo ocenili z vrhom grafa kumulativne frekvence. Dobljena vrednost je izražala relativno količino DNA v arbitrarnih enotah.

Pri preračunavanju relativne količine DNA v absolutne smo uporabili umeritveno standardno vrsto Pisum sativum z vrednostjo 2C = 8,84 pg DNA (Greilhuber in Ebert, 1994).

Za posamezen vzorec smo izračunali povprečne vrednosti 2C (pg DNA) in koeficient variacije KV (%). Pri statistični obdelavi podatkov smo uporabili test ANOVA test (Microsoft Excel, z dodatkom Daniel's XL Toolbox).

3.4 DOLOČANJE ŠTEVILA KROMOSOMOV

Na preparatih, ki so vsebovali metafazne kromosome, smo sproti s svetlobnim mikroskopom z imerzijskim objektivom (634 × ali 100 × povečava) določali število kromosomov. Na preparatu smo opravili od 1 do 6 štetij.

3.7. KORELACIJE MED VELIKOSTJO GENOMA, ŠTEVILOM KROMOSOMOV IN VELIKOSTJO PELODA

Rezultate meritev velikosti genoma in štetja kromosomov smo primerjali s podatki o velikosti pelodnih zrn (meritve opravila S. Strgulc Krajšek). Uporabili smo Spearmanov korelacijski koeficient (Microsoft Excel, z dodatkom Daniel's XL Toolbox).

(32)

23 3.8. IZDELAVA ZEMLJEVIDA RAZŠIRJENOSTI

Zemljevide razširjenosti obravnavanih taksonov na območju Slovenije in neposredne soseščine smo izdelali s pomočjo klišejev KARARAS 3.0 (Jogan, 2001). Uporabili smo rastrski prikaz razširjenosti taksonov. Za kartiranje flore v Srednji Evropi se uporabljajo t.i. 'MTB kvadranti' (MTB = Messtischblatt), s stopenjsko mrežo določena polja. Posamezni kvadrant meri 3' zemljepisne širine × 5' zemljepisne dolžine, kar na območju Slovenije znaša okoli 35 km²(Jogan, 2002 ).

(33)

24

4 REZULTATI

4.1 PODATKI O VZORCIH

V raziskavo smo vključili 50 vzorcev spominčic z območja Slovenije, Hrvaške, Avstrije in Italije.

Vzorce smo označili z delovno številko, imenovano operativna taksonomska enota (OTE), ki jo navadno uporabljamo v taksonomskih raziskavah. Nekateri primerki, ki smo jih vključili v raziskavo, so bili že prej vključeni v druge študije (npr. Sušnik, 2016). V tem primeru so primerki obdržali oznako OTE iz prejšnjih raziskav. Pri številčenju smo pazili, da so oznake ostale enoznačne.

10 primerkov, ki smo jih analizirali, smo pridobili iz herbarijskih pol iz Herbarija Univerze v Ljubljani.

Preostalih 40 primerkov smo nabrali na terenu in jih posadili v lončke s prstjo. Podatki so zbrani v prilogi A.

Iz raziskave smo pred kariološkimi raziskavami izločili 6 vzorcev, ker:

- niso zrasle stranske korenine ali niso kalila semena, da bi iz njih pridobili koreninske vršičke (OTU: 250, 263, 264),

- so bili preparati mečkanci tako slabi, da ni bilo mogoče zanesljivo izmeriti velikosti genoma ali prešteti kromosomov (OTU: 271, 278, 283).

Kariološke raziskave smo opravili na 44 vzorcih. 10 vzorcev smo morali izločiti naknadno, ker:

- so se izgubili herbarijski primerki, zato nismo mogli izmeriti velikosti pelodnih zrn in preveriti morfoloških znakov za določitev vrste (OTU: 265, 279, 280, 281, 919, 920),

- se je izkazalo, da gre za križanca med M. alpestris in eno izmed vrst iz skupine M.

sylvatica, najverjetneje z novoodkritim taksonom spominčice (OTU: 78),

- so bile meritve velikosti genoma preveč variabilne (OTU: 268, 292, 836).

Na podlagi opravljenih meritev in pregledanih rezultatov smo ugotovili, da je za nadaljno analizo primernih 34 vzorcev. 26 vzorcev je bilo nabranih v Sloveniji, 6 v italijanskih Alpah, 3 na

(34)

25

avstrijskem Koroškem in 2 na Hrvaškem, na območju Žumberak. Izmed teh vzorcev jih je 13 pripadalo vrsti M. sylvatica, 2 vrsti M. decumbens in 22 novemu taksonu spominčice (slika 8).

Slika 8: Prikaz deleža vrst, vključenih v analizo. M. x. je oznaka za novi takson spominčice.

(35)

26 4.2 VELIKOST JEDRNEGA GENOMA 4.2.1 Metoda merjenja velikosti genoma

Prve vzorce spominčic smo fiksirali s fiksativom FAA (OTE: 78, 84, 85, 95, 137, 136). Izkazalo se je, da se je pri tej metodi pri nekaterih preparatih močno obarvala citoplazma in šibko obarvala jedrna DNA, zato je bila segmentacija težavna in pri mnogih preparatih celo nemogoča. Nove vzorce smo zato fiksirali v Farmerjevem fiksativu EAA, vendar je bila segmentacija tudi tu težavna zaradi majhne količine jedrne DNA in posledično nizke intenzitete obarvanosti jeder. Kljub temu smo uspeli izmeriti velikost genoma za večino OTE.

Pri nekaterih OTE smo zaradi slabih preparatov iz analize izločili posamične preparate in vrednost C izračunali le iz tistih, ki so ustrezali standardu. Pri OTE 268, 292, 836 so bili vsi preparati slabi, zato zanje nismo uspeli določiti velikosti genoma.

Vrste skupine gozdne spominčice imajo manjša in šibkeje obarvana jedra z majhnim genomom kot standardna vrsta z večjim genomom (slika 9).

M. syl. M. dec. M. x. Ps

Slika 9: Jedra skupine gozdne spominčice in standardne vrste. Prikazana so jedra, pobarvana po Feulgnu pri vrstah M.

sylvatica (M. syl.), M. decumbens (M. dec.), novi takson (M. x.) in Pisum sativum (Ps). Merilce predstavlja 10 µm.

(36)

27

Primere frekvenčne porazdelitve integrirane optične gostote (IOG) interfaznih jeder pri vseh obravnavanih vrstah in umeritvenega standarda prikazuje slika 10. IOG je sorazmerna količini DNA in je izražena v arbitratnih enotah (a.e.).

Slika 10: Frekvenčna porazdelitev integrirane optične gostote (IOG) v interfaznih jedrih gozdnih spominčic (M.

sylvatica, M. decumbens, M. x.) in umeritvenega standarda (Pisum sativum)