UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ EKOLOGIJE IN BIODIVERZITETE
Domen KOCJAN
UGOTAVLJANJE KOLIČINE JEDRNE DNA IZBRANIH TROPSKIH VRST IZ DRUŽINE
KAČNIKOVK (ARACEAE)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ EKOLOGIJE IN BIODIVERZITETE
Domen KOCJAN
UGOTAVLJANJE KOLIČINE JEDRNE DNA IZBRANIH TROPSKIH VRST IZ DRUŽINE KAČNIKOVK (ARACEAE)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
DETERMINING THE AMOUNT OF NUCLEAR DNA OF SELECTED TROPICAL SPECIES IN THE ARUM FAMILY (ARACEAE)
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Ekologija in biodiverziteta. Delo je bilo opravljeno na Katedri za botaniko in fiziologijo rastlin.
Študijska komisija je za mentorico magistrskega dela imenovala doc. dr. Jasno Dolenc Koce, za recenzentko pa doc. dr. Martino Bačič.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Simona STRGULC KRAJŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Martina BAČIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Jasna DOLENC KOCE
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora:
Domen Kocjan
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 582.532:575(728.6Kostarika)(043.2) KG slikovna citometrija, genom, kačnikovke AV KOCJAN, Domen
SA DOLENC KOCE, Jasna (mentor), BAČIČ, Martina (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij ekologije in biodiverzitete LI 2021
IN UGOTAVLJANJE KOLIČINE JEDRNE DNA IZBRANIH TROPSKIH VRST IZ DRUŽINE KAČNIKOVK (ARACEAE)
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP IX, 56 str., 8 pregl., 13 sl., 115 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V nalogi smo z metodo slikovne citometrije analizirali velikost jedrnega genoma kačnikovk, ki smo jih nabrali v La Gambi (Kostarika). Ugotavljali smo, ali imajo rastline z isto življenjsko obliko podobne velikosti genomov, ali imajo sorodne vrste podobne velikosti genomov in ali velikost genoma kaže, da je v raziskovanih vzorcih prisotna poliploidija.
Izmerili smo velikost genoma 46 vrst iz 12 rodov, pri čemer smo ugotovili velik razpon vrednosti 2C. Pridobili smo prve podatke za 39 vrst in 3 rodove. Potrdili smo, da življenjska oblika raziskovanih vrst ni povezana z velikostjo genoma, obstaja pa povezava med velikostjo genoma in življenjsko dobo. Vrste v ožjem sorodstvu so imele podobne velikosti genomov le pri rodovih Philodendron in Pistia. Poliploidijo smo ovrgli pri taksonu Philodendron sp. (vzorec Etl #9), za vrsto Philodendron cf. sulcatum pa bi potrebovali dodatne raziskave. Prešteli smo število kromosomov nedoločene vrsterodu Adelonema (2n
= 10), kar je prvi podatek za ta rod. Za 5 vrst priporočamo dodatne meritve zaradi metodoloških pomankljivosti, ostale meritve pa so primerne za vnos v spletno bazo vrednosti C (Royal Botanic Gardens, Kew, VB). Naše meritve smo primerjali z znanimi podatki kačnikovk, enokaličnic in kritosemenk na splošno ter ugotovili, da imajo kritosemenke v povprečju manjši genom kot kačnikovke, čeprav so taksonomska nadkategorija, ki vključuje kačnikovke in enokaličnice.
KEY WORDS DOCUMENTATION
ND Du2
DC UDC 582.532:575(728.6Kostarika)(043.2) CX image cytometry, genome size, aroids AU KOCJAN, Domen
AA DOLENC KOCE, Jasna (supervisor), BAČIČ, Martina (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Ecology and Biodiversity
PY 2021
TI DETERMINING THE AMOUNT OF NUCLEAR DNA OF SELECTED TROPICAL SPECIES IN THE ARUM FAMILY (ARACEAE)
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO IX, 56 p., 8 tab., 13 fig., 115 ref.
LA sl AL sl/en
AB We measured nuclear genome size of aroids, collected in La Gamba (Costa Rica), using DNA image cytometry. We aimed to establish whether plants with the same life form have similar genome size, whether closely related species have similar genome sizes and whether polyploidy is present in any of the studied samples. We measured 46 species from 12 genera, in which we found a wide range in 2C-values. 39 species and 3 genera were measured for the first time. We determined that life form is not correlated with genome size, while life cycle is. Closely related species had similar genome sizes only in genera Philodendron and Pistia. Polyploidy was disproved for taxon Philodendron sp. (sample Etl
#9), while additional research is necessary for Philodendron cf. sulcatum. We also counted the chromosome number for an unidentified species of genus Adelonema (2n = 10), which is the first data for this genus. Due to methodological flaws, we recommend additional measurements for 5 species, while other measurements could be included into the online C- value database by Royal Botanic Gardens, Kew (Great Britain). Our measurements were compared with known data of aroids, monocots, and angiosperms in general. We found angiosperms have on average a smaller genome size than aroids, despite being the clade that includes both aroids and monocots.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI IX
1 UVOD 1
1.1 NAMEN DELA 1
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 KAČNIKOVKE 3
2.2 OBMOČJE LA GAMBA V KOSTARIKI 6
2.3 VELIKOST GENOMA IN VREDNOST C 10
2.3.1 Vloga količine jedrne DNA 11
2.3.2 Zbiranje podatkov 11
2.4 SLIKOVNA CITOMETRIJA DNA 12
3 MATERIAL IN METODE 15
3.1 RASTLINSKI MATERIAL 15
3.2 FIKSIRANJE TKIVA 15
3.2.1 Priprava tkiva za fiksiranje 15
3.2.2 Fiksiranje s 4 % formaldehidom in metanol ocetno kislino 16
3.3 BARVANJE DNA PO FEULGENU 17
3.4 PRIPRAVA MEČKANCEV 18
3.5 SLIKOVNA CITOMETRIJA DNA 18
3.6 STATISTIČNA ANALIZA 20
4 REZULTATI IN RAZPRAVA 21
4.1 VELIKOST GENOMA PRI IZBRANIH VRSTAH KAČNIKOVK 21
4.2 METODOLOŠKE POMANJKLJIVOSTI 26
4.3 ODSTOPAJOČE VREDNOSTI ZNOTRAJ RODOV 28
4.4 ŠTEVILO KROMOSOMOV 30
4.5 KOLIČINA JEDRNE DNA GLEDE NA ŽIVLJENJSKO OBLIKO 31
4.6 KOLIČINA JEDRNE DNA GLEDE NA ROD 36
4.7 POLIPLOIDIJA 40
4.7.1 Philodendron cf. sulcatum 40
4.7.2 Philodendron sp. Etl #9 41
4.8 PRIMERJAVA VELIKOSTI GENOMA V ŠIRŠEM TAKSONOMSKEM
KONTEKSTU 42
5 SKLEPI 44
6 POVZETEK 45
7 VIRI 47
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Seznam kačnikovk, ki smo jih nabrali v okolici raziskovalne postaje La
Gamba. 21
Preglednica 2: Količina jedrne DNA pri izbranih kačnikovkah iz La Gambe. 23 Preglednica 3: Seznam vrst s popravljenim imenom glede na aktualno taksonomijo. 25 Preglednica 4: Variabilnost vrednosti 2C znotraj rodov. 29
Preglednica 5: Število kromosomov izbranih kačnikovk. 31
Preglednica 6: Mediane vrednosti 2C za posamezno življenjsko obliko za vzorce iz La
Gambe in vse kačnikovke skupaj. 32
Preglednica 7: Mediane vrednosti 2C posameznih rodov za vzorce iz La Gambe in
RBG Kew skupaj. 36
Preglednica 8: Primerjava izmerjenih vrednosti kačnikovk v širšem taksonomskem
kontekstu. 42
KAZALO SLIK
Slika 1: Betičasto socvetje kačnikovk. 3
Slika 2: Diagram različnih življenjskih oblik kačnikovk. 5
Slika 3: Predstavniki raziskovanih rodov kačnikovk. 7
Slika 4: Pestrost habitatov v okolici tropske postaje La Gamba. 9 Slika 5: Različne vrednosti C v življenjskem ciklu rastline. 10 Slika 6: Frekvenčna porazdelitev jeder v tipičnem histogramu slikovne citometrije. 13
Slika 7: Vzorci različnih rodov kačnikovk. 16
Slika 8: Kromosomi v metafazi pri vrsti Adelonema wendlandii. 30 Slika 9: Količina jedrne DNA kačnikovk iz La Gambe in iz spletne baze (RBG Kew)
glede na življenjske oblike. 33
Slika 10: Razporeditev vrednosti jedrne DNA kačnikovk iz La Gambe in iz spletne
baze (RBG Kew) glede na rod. 37
Slika 11: Filogenetsko drevo družine Araceae in količina jedrne DNA. 39 Slika 12: Histogram integrirane optične gostote (IOG) jeder v vzorcih A7_1a in
C18_2b vrste Philodendron cf. sulcatum. 41
Slika 13: Razporeditev vrednosti 2C različnih taksonomskih skupin rastlin. 43
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
CCD Charge Coupled Device DNA deoksiribonukleinska kislina IOG integrirana optična gostota IPNI International Plant Names Index KV koeficient variacije
MAA metanol ocetna kislina POWO Plants of the World Online RBG Royal Botanic Gardens
WCSP World Checklist of Selected Plant Families
1 UVOD
Količina jedrne DNA je uporaben podatek za mnogo znanstvenih disciplin, od molekularne biologije, taksonomije, evolucijske biologije, filogenije, ekologije ter vse do naravovarstva (Bennett in sod., 2000).
Čeprav se je v zadnjih desetletjih znanje o vlogi količine jedrne DNA zelo izboljšalo, še vedno manjka veliko informacij o funkcionalni pomembnosti in pomenu raznolikosti v velikosti genoma med vrstami. Eno izmed glavnih razrešenih vprašanj je t.i. »paradoks vrednosti C«, ki je zajemal vprašanja o variabilnosti genomov in zakaj velikost genoma ni povezana s kompleksnostjo organizma. Z odkritjem nekodirajoče DNA v genomih organizmov je bil odgovor na paradoks najden, raziskave pa so se med drugim usmerile v biološko vlogo nekodirajoče DNA, raziskovanje mehanizmov, ki povzročajo variabilnost, in evolucijski pomen razlik v velikosti DNA (Greilhuber in Leitch, 2012). Nerazrešena vprašanja danes imenujemo »uganka vrednosti C« (Gregory, 2001). Glavne teorije, ki razlagajo vlogo količine jedrne DNA, so hipoteza »sebične« DNA, nukleotipska hipoteza in nukleoskeletna hipoteza.
Podatke o količini jedrne DNA rastlinskih vrst se zbira že dolgo časa, od leta 1997 pa je to delo preko mednarodnih delavnic usmerjano tako, da se analizira čim več vrst, rodov, družin, življenjskih oblik in geografskih območij. Največje pomanjkljivosti so na področju tropskih ekosistemov in specializiranih življenjskih oblik, kot so epifiti, halofiti, saprofiti in paraziti (Bennett in Leitch, 2011).
V sklopu študijske ekskurzije v Kostariko smo leta 2018 nabrali vzorce rastlin iz družine kačnikovk (Araceae). Nižinski deževni gozd, kjer smo opravljali terensko delo, je vrstno pestro območje, z velikim številom endemnih vrst, še posebej dreves in epifitov. Kačnikovke so na območju raziskave ena vrstno najbolj pestrih družin.
Z ugotavljanjem količine jedrne DNA nabranih vrst smo želeli izboljšati znanje o tej družini in ugotoviti morebitne povezave z njihovim načinom življenja v tropskem okolju.
1.1 NAMEN DELA
Z metodo slikovne citometrije smo ugotavljali količino jedrne DNA vzorcev rastlin, ki smo jih nabrali na študijski ekskurziji v Kostariki.
S testiranjem delovnih hipotez smo preverili, ali za družino kačnikovk velja, da imajo vrste z enako življenjsko obliko bolj podobne velikosti genoma. Preverili smo tudi, ali imajo vrste v ožjem sorodstvu bolj podobne velikosti genoma. To hipotezo smo preverjali na nivoju rodu. Preverjali smo vrste znotraj rodu in rodove v bližnjem filogenetskem odnosu. Testirali smo tudi hipotezo, da imajo vzorci istih vrst z večkratno razliko v velikosti genoma prisotno endopoliploidijo ali pa so poliploidi.
Izmerili smo 46 vrst iz družine kačnikovk (Araceae), od tega 39 vrst in tri rodove, ki so bili analizirani prvič. S tem smo prispevali k večji pestrosti zbirke velikosti rastlinskih genomov ter k cilju poznavanja čim večje pestrosti različnih rodov in življenjskih oblik. Z nalogo smo prispevali tudi k večjemu poznavanju variabilnosti velikosti genomov v družini kačnikovk.
V sklopu raziskovalne naloge smo si postavili tri delovne hipoteze:
1. Vrste z enako življenjsko obliko imajo bolj podobne velikosti genoma.
2. Vrste v ožjem sorodstvu imajo bolj podobne velikosti genoma.
3. Vrste oz. vzorci z večkratno velikostjo genoma imajo prisotno endopoliploidijo ali pa so poliploidi.
2 PREGLED OBJAV 2.1 KAČNIKOVKE
Kačnikovke (Araceae) so s 140 rodovi in 3645 opisanimi vrstami tretja največja družina enokaličnic (Croat, 2020). So globalno razširjene, vendar več kot 90 % vrst najdemo v tropih (Bogner, 2020). Najpestrejša območja so Srednja in Južna Amerika, jugovzhodna Azija, Malajsko otočje in celinska osrednja Afrika. Večino vrst najdemo v tropih Srednje in Južne Amerike. Ogromno vrst je endemnih, nekatere pa so razširjene po celem svetu (Mayo in sod., 1997). Predstavnice družine se nahajajo v različnih habitatih, od suhih in deževnih tropskih gozdov, preko močvirij in gorskih deževnih gozdov, do gorskih planot in subarktičnih barij (Croat, 1988).
Glavni prepoznavni znak družine je betičasto socvetje z množico majhnih strnjenih cvetov (slika 1). Obdano je z velikim ovršnim listom v obliki tulca ali lijaka, ki ga imenujemo spata (Jogan, 2010). Kadar je socvetje dvospolno, so moški in ženski cvetovi ločeni s sterilno cono. Pestrost vrst pomeni tudi pestrost socvetij, ki se vidi predvsem v vonjavah in barvah betiča in spate.
Slika 1: Betičasto socvetje kačnikovk (povzeto po Mayo in sod., 1997: 25). Leva skica prikazuje enospolno, desna pa dvospolno socvetje.
Barve in vonjave pomagajo pri privabljanju žuželk, saj je večina kačnikovk žužkocvetk.
Veliko kačnikovk v socvetju proizvaja toploto (termogeneza), ki pomaga pri širitvi vonjav in privabljanju opraševalcev (Mayo in sod., 1997).
Semena večinoma raznašajo živali, predvsem ptice. Semena kačnikovk so občutljiva in ne preživijo dolgo, zato ima družina omejen potencial za disperzijo na večje razdalje. To je eden izmed razlogov za velik delež endemnih vrst in razlog, da na osamljenih otokih družine praktično ne najdemo (Mayo in sod., 1997).
Rast je odvisna predvsem od zadostne količine vode in vlage v zraku. Večina vrst v suhih in mrzlih podnebjih slabo uspeva, nekatere vrste pa so prilagojene tudi na kalitev v snegu (Croat, 1988). Vrste zmernih podnebij so praktično vse geofitske ali helofitske, nasploh pa v družini najdemo veliko različnih življenjskih oblik (Mayo in sod., 1997).
Večina kačnikovk je terestričnih in rastejo na tleh, veliko jih je geofitskih z obsežnimi korenikami (Croat, 1988; Mayo in sod., 1997). Poleg teh, ki uspevajo na tleh, so med kačnikovkami tudi plezalke in v življenjskem ciklu potrebujejo podporno rastlino (Sperotto in sod., 2020). V obeh primerih je nujna koreninska povezava s tlemi. Epifitske rastline, ki uspevajo na gostiteljski rastlini, za življenje ne potrebujejo stika s tlemi. Rastline, ki rastejo izključno v epifitski obliki, so obligatni epifiti (Zotz, 2013). Epifiti vsa potrebna hranila in vodo dobijo iz deževnice in rastlinskega opada, ki ju lahko zbirajo zaradi oblike in namestitve svojih listov (Mayo in sod., 1997). Če rastlina zraste v epifitski obliki, nato pa požene korenine, ki dosežejo tla in se zakoreninijo v prsti, ji pravimo hemiepifitska rastlina (Mayo in sod., 1997) (slika 2). Včasih so priznavali še sekundarno hemiepifitske rastline, katerih življenjski cikel je ravno obraten od primarnih hemiepifitov, življenje začnejo kot terestrične rastline, nato pa v višino rastejo po gostiteljski rastlini in sčasoma izgubijo osrednjo koreninsko povezavo s tlemi (postanejo epifiti), lahko pa ostanejo povezane z nadomestnimi koreninami (Mayo in sod., 1997; Moffett, 2000). Ker je izraz »sekundarni hemiepifit« za takšen življenjski cikel zavajajoč, saj imajo te rastline ekološko več skupnega s terestričnimi rastlinami kot s primarnimi hemiepifiti ali epifiti (Moffett, 2000), se za sekundarne hemiepifite uveljavlja izraz nomadske plezalke (Moffett, 2000; Zotz, 2013;
Sperotto in sod., 2020).
Slika 2: Diagram različnih življenjskih oblik kačnikovk, s poudarkom na delitvi plezalnih rastlin (povzeto po Sperotto in sod., 2020: 183). Epifiti se delijo še na obligatne in fakultativne epifite, ne glede na sposobnost plezanja.
V določenih razmerah, npr. v gorskem deževnem gozdu (oblačni gozd) je težko razlikovati življenjske pogoje na tleh in na gostiteljskih rastlinah. V takih primerih lahko sicer epifitske rastline uspevajo tudi na tleh. Takšne rastline so fakultativni epifiti (Zotz, 2013). Podobno velja za epifite, ki lahko uspevajo na skalnati podlagi namesto na gostiteljski rastlini. To naj bi bile epilitske rastline, vendar je ta življenjska oblika v juvenilni fazi fakultativna za praktično vse epifite, zato je v naši raziskavi nismo ločevali. Dodatna komplikacija je dejstvo, da reofiti, ki spadajo med vodne rastline, prav tako uspevajo na skalnati podlagi in kot taki ustrezajo definiciji epilitskih rastlin (Croat, 1988).
Kot vodne rastline lahko upoštevamo več različnih življenjskih oblik, ki so odvisne od stalnega stika z vodo. Sem štejemo potopljene in plavajoče vodne rastline, ki uspevajo v vodnih telesih in so lahko prostoplavajoče ali pritrjene v substrat, reofite, ki uspevajo v tekoči vodi in so pritrjeni na skalnato podlago, in helofite, ki so močvirske rastline in uspevajo v prsti, ki je večino časa nasičena z vodo (Mayo in sod., 1997).
V naši raziskavi smo analizirali rastline iz 12 rodov kačnikovk (slika 3), ki jih lahko uvrstimo v štiri poddružine. Za poddružino Pothoideae z rodom Anthurium je značilna preprosta spata, ki ne obdaja socvetja (Mayo in sod., 1997). V rodu Anthurium najdemo vse kopenske življenjske oblike, najpogosteje predstavniki rodu uspevajo na bolj odprtih območjih in v gorskem deževnem gozdu (Croat, 1988). Gre za najštevilčnejši rod kačnikovk (POWO, 2019). Poddružina Monsteroideae z rodovi Spathiphyllum, Monstera in Stenospermation
vsebuje predvsem terestrične vrste in nomadske plezalke z redkimi epifiti. Rod Spathiphyllum je poleg ameriških tropov prisoten tudi na Malajskem otočju. Poddružino Lasioideae z rodom Dracontium prepoznamo po trokrpih deljenih listih z izrazito glavno žilo in razcepljenimi krpami (Mayo in sod., 1997). Večinoma gre za geofitske terestrične rastline (Croat, 1988). Poddružina Aroideae vsebuje preostanek preučevanih rodov:
Dieffenbachia, Philodendron, Adelonema, Xanthosoma, Syngonuim, Alocasia in Pistia.
Povezuje jih enospolno socvetje (Mayo in sod., 1997), medsebojno pa se v veliki meri razlikujejo. Še posebej rod Pistia, ki velja za enega redkih prostoplavajočih vodnih rodov, se od ostalih razlikuje tako po življenjski obliki kot tudi po razširjenosti. Prisoten je namreč v vseh svetovnih tropih (Mayo in sod., 1997), kot invazivna vrsta pa se pojavlja tudi v zmernih podnebjih, tudi v Sloveniji (Šajna in sod., 2007). Je tudi eden redkih rodov, ki se razmnožuje predvsem vegetativno. Ostali rodovi te poddružine so predvsem terestrični geofiti ali nomadske plezalke, le v rodu Philodendron najdemo tudi nekaj vodnih vrst in epifitov, nekatere pa razvijejo celo drevesno obliko (Croat, 1988). Rod Alocasia je sicer avtohton v jugovzhodni Aziji, vzorci, ki smo jih nabrali mi, so bili zasajeni na vrtu raziskovalne postaje La Gamba.
2.2 OBMOČJE LA GAMBA V KOSTARIKI
Terenski del raziskave je bil opravljen v okolici avstrijske tropske raziskovalne postaje La Gamba, ki jo vzdržuje Univerza na Dunaju. Postaja se nahaja na jugovzhodu Kostarike, v kantonu Golfito province Puntarenas. Zaradi geološke zgodovine je območje reliefno zelo pestro, z množico grebenov in pobočij (Weissenhofer in sod., 2008a) ter bogatim prepletom potokov (Tschelaut in sod., 2008). Zaradi vpliva reliefa to območje velja za enega najbolj vlažnih v celotni Srednji Ameriki. Povprečna količina letnih padavin je okoli 5800 mm, deževnih dni je v letu lahko do 300. Povprečna letna temperatura je okoli 28,2 °C, vlažnost zraka pa v gozdu dosega 97,7 % (Weissenhofer in Huber, 2008). Območje zaznamuje tudi visoka pestrost različnih magmatskih in sedimentnih kamnin (Malzer in Fiebig, 2008).
Vsi zgornji dejavniki vplivajo na visoko vrstno pestrost. Območje velja za eno izmed floristično najbolj pestrih območij v Srednji Ameriki. Zaradi pestrosti prsti in reliefa tudi na zelo majhnih razdaljah najdemo različne gozdne združbe z različno vrstno sestavo (Weissenhofer in sod., 2008b). Skupna vsem je predvsem velika pestrost dreves in epifitov.
Tu najdemo več kot četrtino (n = 851) kostariških drevesnih vrst in skoraj 400 rastlin z epifitskim značajem (epifiti, hemiepifiti, nomadske plezalke). Tu najdemo tudi velik delež endemnih vrst. Kačnikovke so ena najbolj pestrih družin na območju. Zaenkrat je bilo tu opisanih 96 vrst iz družine Araceae, kar 50 od teh pa pripada rodovoma Anthurium in Philodendron (Huber in sod., 2008; Hietz, 2008). Za tropske gozdove je značilna višinska porazdelitev rastlin. Polovica vseh vrst uspeva na višini med 2 m in 15 m nad tlemi (Spicer in sod., 2020).
Slika 3: Predstavniki raziskovanih rodov kačnikovk: 1 - Adelonema, 2 – Alocasia, 3 – Pistia, 4 – Dieffenbachia, 5 – Syngonium, 6 – Monstera, 7 – Stenospermation, 8 – Dracontium, 9 – Anthurium, 10 – Xanthosoma, 11 – Spathiphyllum, 12 – Philodendron (prirejeno po Mayo in sod., 1997).
1 2
3
4
5
6
7
8
9
12 10 11
V okolici tropske postaje La Gamba lahko v grobem ločimo tri glavne skupine ekosistemov (slika 4): ekosistemi primarne vegetacije, ekosistemi sekundarne vegetacije in antropogeni ekosistemi. Primarna vegetacija vsebuje predvsem primarne gozdove (pragozdove brez antropogenih motenj), ter obrežne in poplavne gozdove. Sekundarna vegetacija vsebuje območja, kjer je bil primarni gozd vsaj delno posekan. To so mladi in stari sekundarni gozdovi, gozdni rob in pobočja, porasla s praprotjo. Gozdovi La Gambe spadajo med vegetacijski tip nižinskega deževnega gozda. Takšen tip gozdov je zelo ogrožen, območje predstavlja še zadnje ostanke nižinskih deževnih gozdov na pacifiški strani Srednje Amerike.
Žal je to tudi najmanj raziskan tip gozdov. Zadnja skupina ekosistemov so antropogeni ekosistemi, ki vključujejo predvsem pašnike in nasade gozdnogospodarskih dreves, oljne palme in riža (Weissenhofer in sod., 2008b).
Slika 4: Pestrost habitatov v okolici tropske postaje La Gamba.
2.3 VELIKOST GENOMA IN VREDNOST C
Velikost genoma je izraz, ki je v literaturi splošno uporabljen, vendar ima glede na avtorja lahko različno definicijo (Greilhuber in sod., 2005). V naši nalogi ga uporabljamo kot izraz, ki povzema količino DNA v jedru rastlinske celice in je sopomenka za količino jedrne DNA.
Količino jedrne DNA lahko izražamo kot število baznih parov (bp = ang. base pair) ali pa kot maso DNA, izraženo v pikogramih (1 pg = 10-12 g). Ker je število baznih parov lahko zelo veliko, je bolj uporabna enota pikogram, 1 pg namreč ustreza 109 baznim parom (Sessions, 2013).
Količina jedrne DNA je najpogosteje izražena kot t.i. vrednost C, kjer C pomeni konstantno vrednost (C = ang. constant) (Swift, 1950). Vrednost 1C pomeni količino nepodvojenega haploidnega genoma, ne glede na število kromosomov in nivo poliploidije v osebku. Takšen genom najdemo v nepodvojenem jedru haploidne spolne celice. Vrednost 2C pomeni količino jedrne DNA v podvojenem jedru spolne celice in v nepodvojenem jedru diploidne somatske celice, medtem kot 4C ustreza količini jedrne DNA v podvojenem diploidnem jedru, pred potekom mitoze ali mejoze (slika 5).
Slika 5: Različne vrednosti C v življenjskem ciklu rastline (prirejeno po Leitch in Leitch, 2012: 308).
Poznamo tudi višje vrednosti C, ki so posledica pojava endopoliploidije v rastlinskih celicah (Barow in Jovtchev, 2007). Najvišja poznana vrednost C je 24 576C, izmerjena v endospermu vrste Arum maculatum (Erbrich, 1965).
Vrednost C je med različnimi vrstami zelo variabilna. V kritosemenkah tako niha od 1C = 0,06 pg vse do 1C = 150 pg. Korelacija med kompleksnostjo organizma in velikostjo njegovega genoma ne obstaja, kar so pred odkritjem nekodirajočih delov DNA imenovali
»paradoks vrednosti C« (Thomas, 1971; Greilhuber in Leitch, 2012).
2.3.1 Vloga količine jedrne DNA
Čeprav se je znanje o vlogi količine jedrne DNA v zadnjih desetletjih zelo izboljšalo, sta izvor raznolikosti in funkcionalna pomembnost velikosti genoma večinoma nerazrešena. Ta vprašanja skupaj imenujemo »uganka vrednosti C« (Gregory, 2001). Trenutno obstajajo tri glavne hipoteze, ki se trudijo razložiti pomembnost raznolikosti v količinah jedrne DNA med organizmi.
Prva hipoteza pravi, da je raznolikost naključna posledica mutacij, ki v DNA podvojujejo in nalagajo t.i. nekodirajočo ali »sebično« DNA (Orgel in sod., 1980). Vrste z velikimi genomi naj bi bile tiste, ki lahko tolerirajo nalaganje »sebične« DNA, velikost genoma in posledična večja celična velikost pa naj ne bi imela biološke vloge (Greilhuber in Leitch, 2012).
Druga hipoteza je t.i. nukleotipska hipoteza. Izraz nukleotip kot nasprotje genotipa izraža vpliv jedrne DNA na fenotip, odvisen od strukture in velikosti DNA, ne le od genov, ki jih DNA kodira (Bennett, 1971). Glede na to hipotezo velikost genoma igra aktivno biološko vlogo v organizmu.
Zadnja hipoteza, t.i. nukleoskeletna hipoteza, pravi, da aktivno biološko vlogo igra velikost celice, velikost genoma pa je pasivna posledica rasti celice. DNA naj bi imela podporno vlogo jedrnega skeleta, ki pomaga zagotavljati ustrezno razmerje med velikostjo jedra in celice, s tem pa optimizira delovanje celičnih procesov (Cavalier-Smith, 1978, 2005).
2.3.2 Zbiranje podatkov
Količina jedrne DNA je uporaben podatek za mnogo znanstvenih disciplin, od molekularne biologije, taksonomije, evolucijske biologije, filogenije, ekologije ter vse do naravovarstva (Bennett in sod., 2000). Podatki o vrednostih C se zbirajo v spletni bazi, ki jo vzdržuje Royal Botanic Gardens, Kew (Velika Britanija). Baza trenutno vsebuje 12 273 vpisov vrednosti C različnih rastlinskih skupin, od tega je 10 770 kritosemenk in med njimi 149 kačnikovk (Leitch in sod., 2019).
Kljub ogromni količini podatkov, obstajajo pomanjkljivosti. Lughadha in sod. (2016) navajajo 369 434 priznanih vrst kritosemenk, kar pomeni, da je velikost genoma poznana le za 2,9 % kritosemenk. Glede na 4 150 vrst kačnikovk (Bogner, 2020), je delež zanje malo boljši, 3,5 %. Poleg taksonomskih obstajajo tudi geografske pomanjkljivosti v poznavanju velikosti genoma. Bennett in sod. (2011) so pokazali, da je leta 2011 58,2 % vseh izmerjenih genomov pripadalo evropskim vrstam, le 4,5 % pa vrstam iz Južne in Srednje Amerike. Prav tako manjka znanje o nekaterih življenjskih oblikah, kot so npr. epifiti, treba pa bi bilo vključiti več različnih rodov.
2.4 SLIKOVNA CITOMETRIJA DNA
Za merjenje vzorcev kačnikovk smo uporabili metodo slikovne citometrije, ki je primerljiva z bolj razširjeno pretočno citometrijo (Vilhar in sod., 2001; Greilhuber, 2005; Praça-Fontes in sod., 2011). V primerjavi z njo je slikovna citometrija finančno dostopnejša, ne zahteva veliko predznanja (Greilhuber, 2008), omogoča uporabo fiksiranih vzorcev in dolgotrajno hranjenje pripravljenih mikroskopskih preparatov (Praça-Fontes in sod., 2011). Po drugi strani pa je manj natančna kot pretočna citometrija, zato z njo slabše zaznamo manjše razlike med vzorci.
Prvi korak metode, ki smo jo uporabili v naši raziskavi, je fiksiranje tkiva s 4 % formaldehidnim fiksativom v kombinaciji z metanol ocetno kislino. Formaldehid polimerizira morebitne prisotne tanine ter tako prepreči njihov vpliv na intenziteto barvanja po Feulgenu (Greilhuber, 1986, 1988). Potrebno je paziti tudi na enako temperaturo pri fiksiranju, saj 5 °C razlike v temperaturi obarvanost spremeni za 1,7 % (Greilhuber in Temsch, 2001). Po fiksiranju se vzorce do barvanja hrani v etanolu.
Fiksiranju sledi barvanje po Feulgenu (Feulgen in Rosenbeck, 1924). Sprva s hidrolizo denaturiramo DNA in z nje odstranimo purinske baze (adenin in gvanin). To omogoči, da se Schiffov reagent veže na depurinirano DNA in jo obarva vijolično (Mello in Vidal, 2017), zaradi česar jo lahko opazujemo s svetlobnim mikroskopom. Hidroliza je najbolj kritičen del postopka, saj je od nje odvisna intenziteta barvanja, zato je pomembno zagotoviti pravo temperaturo in čas trajanja hidrolize (Greilhuber in Temsch, 2001). Na intenziteto barvanja lahko vplivata tudi neenaka depurinacija DNA zaradi različnih DNA-proteinskih kompleksov v jedru in vezava barvila na citoplazemske aldehide, kar vodi v lažno barvanje.
Zaenkrat so bili ti pojavi opaženi le v živalskem tkivu (Mello in Vidal, 2017).
Preparate za opazovanje pripravimo iz obarvanega tkiva tako, da pripravimo mečkanec s tkivom, ki ga zamrznemo na objektno steklo. Pripravljeni preparat nato lahko uporabimo za meritve obarvanosti jeder s slikovno citometrijo. Metoda nam omogoča neposreden vpogled v posamezna jedra na preparatu, preko CCD kamere na svetlobnem mikroskopu pa sliko zajamemo in obdelamo z računalniškim programom. Pred uporabo slikovnega sistema je potrebno opraviti kontrolo kakovosti nastavitev, da se prepričamo, da ne prihaja do sistemskih napak pri merjenju (Vilhar in Dermastia, 2002). Pred vsakim laboratorijskim delom je nujno opraviti tudi kalibracijo sistema, ki zagotovi enakomerne nastavitve pri vsaki meritvi. Če teh postopkov ne opravimo, rezultati niso zanesljivi, saj je sistem vsakokrat nastavljen drugače. Nepravilna nastavitev sistema se kaže kot neenakomerna osvetlitev, nihanje intenzitete svetlobe, elektronski šum, nelinearnost zaznavanja svetlobe v CCD kameri ter kot neželene sence in sijaji v vidnem polju (Puech in Giroud, 1999; Vilhar in Dermastia, 2002).
Neznane vzorce vedno merimo sočasno s standardno rastlinsko vrsto, ki ima znano količino DNA. Preko standardne vrste lahko izmerjeno integrirano optično gostoto (IOG) neznanih vzorcev preračunamo v količino DNA, ki jo izrazimo v pikogramih (Dolenc Koce, 2001). V
naši raziskavi smo za standardno rastlinsko vrsto izbrali navadni grah Pisum sativum. Tega sta kot standardno vrsto priporočila že Bennett in Smith (1976), saj izpolnjuje kriterije, potrebne za dober standard. Ti so: preprosta kalitev semen in celoletna razpoložljivost koreninskih vršičkov, znana in dobro preučena sorta/kultivar (Bennett in Smith, 1976), nizek koeficient variabilnosti (Johnston in sod., 1999), diploidnost, dostopnost iz več virov in uporabnost s pretočno kot Feulgenovo citometrijo (Bennett in sod., 2000). Uporabnost graha in stabilnost velikosti njegovega genoma sta dobro dokumentirana (Greilhuber in Ebert, 1994; Baranyi in Greilhuber, 1995, 1996; Doležel in sod., 1998; Praca-Fontes in sod., 2011).
Čeprav Praca-Fontes in sod. (2011) za Pisum sativum priporočajo vrednost 2C = 9,16 pg, kot povprečje različnih raziskav, smo pri naši raziskavi uporabili vrednost 2C = 8,84 pg, povzeto po Greilhuber in Ebert (1994). Ta je bila namreč izmerjena s Feulgenovo citometrijo, medtem ko je večina ostalih študij za metodo uporabila pretočno citometrijo.
Vršički korenin graha ne vsebujejo taninov in podobnih inhibitorjev barvanja, zato je to tkivo za standard najboljše. Zaradi možnih odstopanj je priporočljivo, da se standard in meritveni vzorec fiksirata, barvata in merita sočasno, da se zagotovi enake pogoje fiksiranja,intenzitete barvanja in kalibracije merilnega sistema (Greilhuber, 2005).
Opravljene meritve lahko prikažemo s histogramom, kjer je vidna porazdelitev izmerjenih jeder v različnih fazah celičnega cikla (slika 6).
Slika 6: Frekvenčna porazdelitev jeder v tipičnem histogramu slikovne citometrije. Obarvanim jedrom v koreninskem vršičku graha je izmerjena integrirana optična gostota (IOG). Jedra v fazi G1 celičnega cikla imajo velikost genoma v vrednosti 2C, v fazi G2 vrednosti 4C in med podvojevanjem (S) v vrednostih med 2C in 4C.
Okrajšava: a.e. – arbitrarna enota.
0 10 20 30 40 50
0 400 800 1200
Število jeder
IOG [a.e.]
Pisum sativum
2C - 4C (faza S)
4C (faza G2)
2C (faza G1)
Faza G1 je začetna faza interfaze, ki nastopi takoj po zaključku mitoze. V celici se takrat obnovi metabolna dejavnost in količina celičnih organelov (Alberts in sod., 2010). V tej fazi količina jedrne DNA ustreza vrednosti 2C. Nato nastopi faza S, v kateri se celica začne pripravljati na ponovno mitozo, zato začne podvojevati DNA. Količina jedrne DNA v fazi S ustreza vrednostim med 2C in 4C. Zadnja faza pred mitozo je še faza G2, kjer celica pred delitvijo raste (Alberts in sod., 2010). V tej fazi količina jedrne DNA ustreza 4C, saj se je v fazi S podvojila.
3 MATERIAL IN METODE 3.1 RASTLINSKI MATERIAL
Primerke rastlinskih vrst iz družine kačnikovk smo nabrali januarja 2018 na študijski ekskurziji v Kostariki. Nabrali smo jih v okolici raziskovalne postaje La Gamba. Vzorce smo nabirali predvsem v primarnem in sekundarnem nižinskem deževnem gozdu, ob pohodniških poteh in obrežjih gozdnih potokov. Nekatere vzorce smo nabrali ob gozdnem robu in čistinah ob cesti, nekatere pa v vrtu raziskovalne postaje. Nabirali smo celotne rastline, skupaj s koreniko, rastline odrezane tik nad tlemi brez korenike, ali le liste in socvetje, če je bila rastlina prevelika.
Življenjske oblike smo razdelili na šest kategorij: terestrično, obligatno in fakultativno epifitsko, hemiepifitsko, nomadsko plezalsko in vodno. Delitev na življenjske oblike nima ostrih meja, saj se zaradi pestrosti tropskih življenjskih pogojev pojavljajo vrste, ki lahko uspevajo v več različnih oblikah.
Terensko delo je opravljala večja skupina študentov biologije, laboratorijsko delo pa manjša skupina študentov, ki so bili prisotni na ekskurziji.
Vrste je določil Florian Etl (Katedra za strukturno in funkcionalno botaniko, Univerza na Dunaju, Avstrija), po ključih Hammell in sod. (2003), Croat (1983, 1986, 1997), Grayum (1996). Skupno smo nabrali 142 osebkov 47 različnih vrst. Nabrane rastline smo fotografirali na črni podlagi (slika 7), 131 osebkov pa tudi herbarizirali. Ti so shranjeni v herbariju WU (Inštitut za botaniko, Univerza na Dunaju, Avstrija).
Kot standardno umeritveno vrsto za slikovno citometrijo smo uporabili navadni grah (Pisum sativum cv. Kleine Rheinländerin; Austrosaat AG, Avstrija), ki smo ga nakalili v kalilnikih v laboratoriju Katedre za botaniko in fiziologijo rastlin.
3.2 FIKSIRANJE TKIVA
3.2.1 Priprava tkiva za fiksiranje
Za fiksiranje vzorcev kačnikovk smo iz svežih rastlin vzeli različna tkiva. Osredotočili smo se na meristemsko tkivo, da bi dobili čim več delečih se celic. S skalpelom smo odrezali koreninski vršiček, vršiček poganjka, zalistni brst, socvetje ali semenske zasnove. Kadar pri rastlini teh tkiv nismo našli, smo fiksirali koščke stebla, korenine in lista.
Za fiksiranje standardne vrste smo odrezali 1–2 cm dolgo korenino graha s koreninskim vršičkom.
3.2.2 Fiksiranje s 4 % formaldehidom in metanol ocetno kislino
Tkiva preučevanih vrst in standarda smo fiksirali v formaldehidnem fiksativu. Postopek fiksiranja smo povzeli po Dolenc Koce (2001). Vse fiksative smo pripravili sveže tik pred uporabo na terenu in jih hranili v hladilniku.
Slika 7: Vzorci različnih rodov kačnikovk, ki smo jih nabrali v okolici tropske raziskovalne postaje La Gamba.
Izbrana tkiva smo fiksirali v fiolah v 4 % formaldehidu v Sørensenovem pufru (pH 6,8) 90 min pri ambientalni temperaturi. Nato smo vzorce fiksirali še v mešanici absolutnega metanola in ocetne kisline (MAA) 3:1 (v:v). Najprej smo v MAA fiksirali trikrat po 10 min, v četrti mešanici smo tkiva fiksirali čez noč v hladilniku pri temperaturi 4 °C. Po najmanj 24 urah smo tkiva prenesli v 96 % etanol za dolgotrajno shranjevanje pri temperaturi -20 °C.
Postopek za pripravo Sørensenovega pufra:
- V merilno bučo dodamo 4,54 g KH2PO4 in 12,1 g Na2HPO4∙12 H2O.
- Dodamo destilirano vodo do 1000 mL.
- Pufer se lahko pri 4 °C hrani nekaj tednov, če v njem ni precipitata ali okužbe.
Na enak način smo fiksirali korenine graha v laboratoriju Katedre za botaniko in fiziologijo rastlin, kjer smo izvedli tudi vse ostale postopke in meritve količine jedrne DNA.
3.3 BARVANJE DNA PO FEULGENU
Uporabljeno metodo barvanja sta prvič opisala Feulgen in Rosenbeck (1924). Postopek, ki smo ga uporabili mi, je opisala Dolenc Koce (2001), in je bil prirejen po Greilhuber in Ebert (1994).
Fiksirano rastlinsko tkivo smo najprej najmanj 5 minut spirali v destilirani vodi, da smo odstranili presežek fiksativa. Naslednji korak je bila t.i. »hladna hidroliza«, ki jo je uveljavil Fox (1969). Tkivo smo v 5 M HCl raztopini hidrolizirali 90 minut pri temperaturi 20 °C v termostabilni vodni kopeli. Hidrolizo smo po 90 minutah ustavili z ledeno mrzlo destilirano vodo, v katero smo za cca. 5 min potopili rastlinski material. Hidrolizi je sledilo barvanje rastlinskega tkiva s Schiffovim reagentom 120 minut pri 20 °C v termostabilni vodni kopeli ali čez noč v hladilniku.
Po barvanju smo presežek barvila odstranili s spiranjem v SO2-vodi. Spirali smo trikrat po 2 minuti, dvakrat po 10 minut in enkrat po 20 minut v vodni kopeli pri 20 °C. Nato smo obarvano rastlinsko tkivo shranili v destilirani vodi v hladilniku, do priprave mikroskopskih preparatov isti dan.
Postopek za pripravo Schiffovega reagenta:
- 4 g pararosanilin klorida (Pararosaniline chloride, BDH, VB) raztopimo v 800 mL vrele destilirane vode, premešamo in pustimo ohladiti na 50 °C.
- Raztopino vakuumsko prefiltriramo preko filtra iz steklenih vlaken (Microfibre filters, Whatman GF/C).
- Raztopini dodamo 120 mL 1 M HCl in 12 g kalijevega metabisulfata K2S2O5 (Fisons, VB).
- Raztopino čez noč pustimo v temi na sobni temperaturi.
- Raztopini dodamo 2 do 4 g aktivnega oglja za razbarvanje (decolourising charcoal, BDH, VB) in premešamo.
- Raztopino vakuumsko prefiltriramo preko filtra iz steklenih vlaken v suho steklenico (barvilo mora biti prozorno).
- Raztopino hranimo v hladilniku pri 4 °C do 1 leto (v barvilu ne sme biti precipitata).
Postopek za pripravo SO2-vode:
- V 475 mL destilirane vode dodamo 25 mL 1 M HCl.
- Raztopini dodamo 2,5 g kalijevega metabisulfita K2S2O5 (Fisons, VB).
- SO2-vodo pripravimo svežo, ali jo hranimo v dobro zaprti steklenici največ nekaj dni, dokler ne izgubi ostrega vonja.
3.4 PRIPRAVA MEČKANCEV
Obarvano rastlinsko tkivo smo uporabili za izdelavo mečkancev. S tem postopkom smo na objektnih steklih pripravili eno plast celic, v katerih smo lahko opazovali jedra z mikroskopom.
Sprva smo rastlinsko tkivo 5–15 minut pri sobni temperaturi zmehčali v 45 % ocetni kislini.
Ta korak ne sme trajati dlje, saj lahko vodi do izgube barve (Greilhuber, 2005). Na objektno steklo smo v kapljico 45 % ocetne kisline položili obarvano rastlinsko tkivo in s preparirno iglo ter pinceto izpreparirali najbolj obarvani meristemski del. Čez tkivo smo položili krovno steklo in ga razprostrli s pritiskanjem na steklo s preparirno iglo. Nato smo krovno steklo prekrili s filtrirnim papirjem in ga stisnili še s palcem. Tako smo dobili eno plast celic. Na istem objektnem steklu smo pripravili mečkance dveh vzorcev kačnikovke in enega graha.
Preparat smo zamrznili na suhem ledu (CO2) in s pomočjo britvice odstranili krovna stekla.
Mečkance smo nato za 3–5 minut dehidrirali v 96 % etanolu, posušili pa v stojalih za stekelca, v temi. Mečkance smo hranili v zaprtih škatlah, da se ne bi razbarvali.
Vsak preparat smo na obrušenem delu objektnega stekla označili s šifro vzorca, datumom priprave in kratico preparatorja.
3.5 SLIKOVNA CITOMETRIJA DNA
Količino jedrne DNA smo izmerili z metodo slikovne citometrije. Pri temu smo uporabili sistem z naslednjimi inštrumenti:
- Svetlobni mikroskop Axioscope 2 MOT (Zeiss, Nemčija).
- CCD kamera DXC-950P (Sony, Japonska).
- Zajemalnik slike Matrox Meteor.
- Osebni računalnik.
- Programska oprema za analizo slike KS400 v. 3.0 (Zeiss, Nemčija).
Pred začetkom meritev smo sistem umerili po navodilih v Vilhar in Dermastia (2002). Za umeritev smo v programski opremi KS400 uporabljali makro podprograme, ki so bili predhodno razviti v laboratoriju (Vilhar in sod., 2001).
CCD kamero smo prižgali 90 minut pred vsako meritvijo, da se je zadostno ogrela in stabilizirala (Pirard in sod., 1999; Vilhar in Dermastia, 2002). S tem smo se izognili fluktuacijam v zaznavanju intenzitete svetlobe.
Sprva smo kot vir svetlobe uporabljali halogensko žarnico in v svetlobno pot mikroskopa vstavili zeleni filter z valovno dolžino 540 nm, saj se v tem območju nahaja absorpcijski maksimum (565 nm) za Feulgenov reagent (Bedi in Goldstein, 1976; Chieco in sod., 1994).
Za približno dve tretjini meritev pa smo uporabili novo, zeleno LED žarnico in nismo več uporabljali dodatnega zelenega filtra.
Za meritve količine DNA smo uporabljali imerzijski objektiv s povečavo 63x (Plan- Neofluar, Carl Zeiss, 63x/1,25 Oil). Enakomerno osvetljenost vidnega polja smo zagotovili z nastavitvijo Köhlerjeve osvetlitve (Köhler, 1893; Evennett, 1983). Umeritveno krivuljo smo naravnali z nizom nevtralno sivih filtrov (ND 79, 70, 63, 50, 20, 5), postavljenih v vidno polje (Vilhar in Dermastia 2002; Puech in Giroud, 1999). Sliko smo zajeli s črno-belo CCD kamero in jo analizirali z makro podprogramom. Obarvanost posameznega jedra smo računalniško izmerili kot integrirano optično gostoto (IOG, podan v arbitrarnih enotah). IOG smo izmerili za nekaj sto interfaznih jeder (Dolenc Koce, 2001). Izbirali smo jedra brez deformacij in motenj v ozadju. Meritev smo zaključili, ko je bilo v vrhu 2C več kot 30 jeder, kar smo spremljali preko histograma v računalniškem programu.
Za vsako izmerjeno jedro smo dobili podatek o IOG in njegovi površini (Vilhar in Dermastia, 2002). Vse podatke smo obdelali v programu Microsoft Excel in preko grafa kumulativne frekvence ocenili vrednost 2C in 4C za posamezen vzorec.
Vzorec smo označili kot primeren za nadaljnjo analizo, če je ustrezal določenim kriterijem kakovosti. Za umeritveni standard smo upoštevali le tiste vzorce, katerih vrh 2C je imel koeficient variacije (KV) manjši od 6 % (Böcking in sod., 1995) in Pearsonov korelacijski koeficient med IOG in površino jedra manjši od 0,4 (Haroske in sod., 2001). Ti kriteriji se že dolgo uporabljajo kot medicinski standard, vendar so v odsotnosti standardizirane botanične metode lahko uporabljeni tudi v raziskavah rastlinskega tkiva (Vilhar in sod., 2001; Praça-Fontes in sod., 2011)
Za vzorce kačnikovk smo upoštevali tiste, ki so imeli izrazit 2C vrh, četudi niso ustrezali zgoraj opisanim medicinskih kriterijem. Če je bil histogram nažagan z več vrhovi, vzorca nismo upoštevali.
Iz IOG vrednosti za vrh 2C smo izračunali absolutno vrednost 2C, ki smo jo izrazili s pikogrami (pg). Za vrednost 2C standarda smo uporabili vrednost 2C = 8,84 pg DNA (Greilhuber in Ebert, 1994). Za posamezno rastlinsko vrsto smo izračunali povprečno vrednost 2C.
Naše rezultate smo v sklopu postavljenih hipotez primerjali s podatki, ki smo jih pridobili v spletni bazi Royal Botanic Gardens, Kew (Leitch in sod., 2019).
3.6 STATISTIČNA ANALIZA
Za vsako vrsto smo izračunali povprečno vrednost 2C in standardno napako. Za statistično obdelavo podatkov in oblikovanje grafov smo uporabljali računalniška programa Microsoft Excel v. 16.0 (Office 365, Microsoft Inc.) in GraphPad Prism v. 8.4.3 (GraphPad Software Inc).
Filogenetsko drevo kačnikovk (slika 11) smo pridobili na spletni strani TimeTree (Kumar in sod., 2017; podatki po Nauheimer in sod., 2012), drevo smo uredili v programu MEGA X 10.2.4 (Kumar in sod., 2018), oblikovali pa v programu CorelDRAW 2019.
Za statistične analize smo uporabljali D'Agostino-Pearsonov in Shapiro-Wilkov test normalnosti, ki služita za preverjanje normalne porazdelitve vzorcev. D'Agostino-Pearsonov test je bolj primeren za velike vzorce, Shapiro-Wilkov pa za majhne (n < 20). Z Grubbsovim testom odstopanja smo preverjali, če katera izmed vrst odstopa od ostalih vrst znotraj posameznega rodu. Za analize hipotez smo uporabili neparametrični Mann-Whitney U-test za primerjavo dveh vzorcev, za primerjavo več vzorcev hkrati pa smo uporabili neparametrični Kruskal-Wallis ANOVA test in Dunnov test, ki primerja še vsak vzorec z vsakim. Stopnjo zaupanja smo določili kot α = 0,05 oz. statistično značilno razliko pri p <
0,05.
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 VELIKOST GENOMA PRI IZBRANIH VRSTAH KAČNIKOVK
Velikost genoma ali količino jedrne DNA smo določili pri 46 različnih vstah iz 12 rodov (preglednica 1). Večina vzorcev je bila določena do vrste (n = 33), medtem ko smo 13 rastlin lahko določili le do rodu (oznaka sp.) oz. je bila določitev provizorična oz. potrebna nadaljnjega potrjevanja (oznaka cf.).
Preglednica 1: Seznam kačnikovk, ki smo jih nabrali v okolici raziskovalne postaje La Gamba, in podatki o njihovi življenjski obliki ter tkivo, fiksirano za merjenje količine jedrne DNA. Izrazi v oklepaju navajajo specifičen del izbranega tkiva, kadar je ta znan.
Rod Vrsta Življenjska oblika Fiksirano tkivo
Adelonema A. erythropus terestrična list; neznano
A. wendlandii terestrična meristemsko tkivo; neznano; socvetje;
steblo (vršiček)
A. sp. terestrična neznano
Alocasia A. cf. princeps terestrična list; steblo
A. sp. fakultativno epifitska mladi listi; socvetje, socvetje (semenska zasnova)
Anthurium A. brownii obligatno epifitska steblo
A. clavigerum obligatno epifitska neznano; steblo A. hacumense obligatno epifitska korenine; socvetje A. hoffmanii fakultativno epifitska neznano
A. obtusum obligatno epifitska neznano; socvetje; socvetje (semenska zasnova)
A. ochranthum. terestrična korenine; list; steblo; steblo (vršiček) A. ochrantum ssp.
pluricostatum terestrična list; socvetje; socvetje (seme. zasnova) A. pentaphyllum obligatno epifitska list; steblo
A. sp. obligatno epifitska neznano
Dieffenbachia D. aurantiaca terestrična neznano; socvetje (semenska zasnova);
steblo
D. concinna terestrična steblo (zalistni brst)
D. oerstedii terestrična list; neznano; steblo (zalistni brst)
Dracontium D. pittieri terestrična neznano
Monstera M. adansonii nomadska plezalka steblo; steblo (zalistni brst) M. cf. adansonii nomadska plezalka list (listna zasnova)
M. pinnatipartita nomadska plezalka list; neznano; steblo (vršiček) Philodendron P. auriculatum fakultativno epifitska neznano; socvetje; steblo
P. fragrantissimum nomadska plezalka list; steblo
P. grandipes terestrična socvetje; socvetje (semenska zasnova);
steblo P. microstictum nomadska plezalka socvetje
se nadaljuje
nadaljevanje preglednice 1: Seznam kačnikovk, ki smo jih nabrali v okolici raziskovalne postaje La Gamba.
Rod Vrsta Življenjska oblika Fiksirano tkivo
Philodendron P. platypetiolatum nomadska plezalka list; steblo P. popenoei terestrična neznano; steblo
P. pterotum nomadska plezalka neznano; steblo (vršiček, zalistni brst) P. sagittifolium nomadska plezalka list (listna zasnova); steblo; steblo
(vršiček) P. sp. #13 fakultativno epifitska list; korenina
P. sp. 1 terestrična steblo
P. sp. 2 nomadska plezalka list; socvetje (semenska zasnova)
P. sp. 4 terestrična korenina
P. sp. Etl #9 nomadska plezalka list; neznano P. cf. sulcatum obligatno epifitska korenina; list; steblo P. tripartitum nomadska plezalka list; steblo
Pistia P. stratiotes vodna list; steblo; steblo (vršiček) Spathiphyllum S. cf. laeve terestrična list
S. phrynifolium terestrična korenina (vršiček); socvetje S. silvicola terestrična list; socvetje
S. wendlandii terestrična list; steblo (kolence)
Stenospermation S. angustifolium obligatno epifitska neznano; socvetje; socvetje (semenska zasnova); steblo
S. cf. maranthifolium obligatno epifitska socvetje; steblo
Syngonium S. hastiferum nomadska plezalka korenine; list; neznano; steblo S. podophyllum nomadska plezalka korenine; list; steblo (vršiček) Xanthosoma X. sagittifolium terestrična list; steblo
Največ nabranih vrst je pripadalo rodovoma Anthurium in Philodendron, ki sta tudi najbolj pogosta rodova na območju La Gambe. Več kot polovico vseh znanih kačnikovk namreč pripada tema rodovoma (Huber in sod., 2008). Največ nabranih vrst je bilo terestričnih (n = 18) in nomadskih plezalk (n = 13). Nabrali smo še obligatne epifite (n = 9), fakultativne epifite (n = 4) in eno vodno vrsto (n = 1). Na območju La Gambe je največ terestričnih rastlin, kar je skladno s številom nabranih vrst, sledi pa epifitska oblika (obligatna in fakultativna) (Hietz, 2008). Zaradi višinske razporejenosti je epifite težje nabirati, saj večinoma živijo na nedosegljivih višinah. Lažje je nabirati nomadske plezalke, ki so pritrjene v tla, kar je razlog, da smo tudi mi nabrali več le-teh.
Za določanje velikosti genoma smo najpogosteje fiksirali dele stebla (vršiček glavnega poganjka, zalistni brst) (n = 30) in liste (n = 24) (preglednica 1). Redkeje smo fiksirali socvetja in semenske zasnove (n = 19), saj smo našli omejeno število cvetočih osebkov, najredkeje pa korenine (n = 7) pri vrstah, kjer so bile razvite nadomestne korenine. To so bile predvsem nomadske plezalke in epifiti.
Izmed nabranih kačnikovk je bila količina jedrne DNA predhodno že znana za sedem vrst (Anthurium clavigerum, Anthurium hoffmanii, Anthurium obtusum, Anthurium ochrantum, Pistia stratiotes, Syngonium podophyllum, Xanthosoma sagittifolium) (Leitch in sod., 2019), za 39 vrst pa so naše meritve prvi podatki. Prvič je bila izmerjena količina jedrne DNA tudi za 3 rodove (Adelonema, Dracontium, Stenospermation) in osebke divje rastočih vrst rodu Spathiphyllum, v katerem so bili doslej izmerjeni le hortikulturni kultivarji z neznanim izvorom (Bharathan in sod., 1994; Zonneveld in sod., 2005).
Povprečne vrednosti 2C so imele razpon od 0,83 pg pri vrstah Pistia stratiotes do 62,48 pg pri Adelonema sp. (preglednica 2). Variabilnost večine meritev je bila za posamezno vrsto največ 10 %, dve vrsti difenbahije (Dieffenbachia aurantiaca, D. oerstedii) in trije filodendroni (Philodendron cf. sulcatum, Philodendron sp. 1 in Etl #9) pa so imeli velik razpon izmerjenih vrednosti 2C, kar je vidno tudi v relativno visokem koeficientu variacije, ki je presegal 13 %. Pri D. aurantiaca je bil razpon vrednosti 2C med 22,23 pg in 34,41 pg, pri D. oerstedii med 21,05 pg in 36,45 pg, pri P. sp. Etl #9 pa med 2,95 pg in 4,69 pg. Pri vrsti P. cf. sulcatum je bil razpon vrednosti 2C med 2,26 pg in 4,52 pg. To je dvakratna razlika med najmanjšo in najvišjo izmerjeno vrednostjo, kar bi lahko kazalo na prisotnost endopoliploidije v izbranem fiksiranem tkivu ali poliploidije te vrste. Razlog bi bil lahko tudi metodološki, če so bila v prvem primeru izmerjena le 2C-jedra, v drugem pa le 4C- jedra. O variabilnosti teh meritev razpravljamo v poglavju o metodoloških pomanjkljivostih in poliploidiji.
Preglednica 2: Količina jedrne DNA pri izbranih kačnikovkah iz La Gambe.
Oznake: Nosebkov - število izmerjenih osebkov, Nmeritev - število meritev za posamezno vrsto, 2Cmin - najnižja izmerjena vrednost 2C, 2Cmax – najvišja vrednost 2C, 2Cpovp - povprečna vrednost 2C ± standardna napaka, KV - koeficient variacije vrednosti 2C.
Vrsta Nosebkov Nmeritev 2Cmin [pg] 2Cmax [pg] 2Cpovpr. [pg] KV [%]
Adelonema erythropus 3 9 2,94 4,08 3,50 ± 0,12 10,7
Adelonema sp. 1 2 59,81 65,16 62,48 ± 2,70 6,1
Adelonema wendlandii 3 12 3,14 3,93 3,51 ± 0,08 7,8
Alocasia cf. princeps 2 3 26,34 28,76 27,50 ± 0,70 4,4
Alocasia sp. 2 7 10,07 12,05 11,02 ± 0,30 6,7
Anthurium brownii 2 8 7,90 8,89 8,45 ± 0,10 4,3
Anthurium clavigerum 5 16 12,28 14,76 13,23 ± 0,15 4,7
Anthurium hacumense 3 11 6,68 8,71 8,09 ± 0,20 8,2 Anthurium hoffmanii 2 9 7,22 8,64 7,83 ± 0,20 7,1
Anthurium obtusum 4 9 4,90 6,06 5,54 ± 0,10 7,7
Anthurium ochranthum 3 6 11,86 13,66 12,48 ± 0,30 5,3
Anthurium ochrantum ssp.
pluricostatum 4 14 11,66 14,87 12,98 ± 0,23 6,7
se nadaljuje
nadaljevanje preglednice 2: Količina jedrne DNA pri izbranih kačnikovkah iz La Gambe.
Vrsta Nosebkov Nmeritev 2Cmin [pg] 2Cmax [pg] 2Cpovpr. [pg] KV [%]
Anthurium pentaphyllum 2 7 13,45 16,18 15,00 ± 0,40 6,8
Anthurium sp. 1 4 8,29 9,00 8,63 ± 0,20 3,5
Dieffenbachia aurantiaca 5 11 22,23 34,41 28,92 ± 1,18 13,5 Dieffenbachia concinna 1 3 32,46 33,49 33,13 ± 0,30 1,7 Dieffenbachia oerstedii 6 15 21,05 36,45 29,70 ± 1,19 15,5
Dracontium pittieri 1 2 10,05 10,30 10,17 ± 0,10 1,7
Monstera adansonii 2 6 8,94 11,59 9,87 ± 0,40 9,8
Monstera cf. adansonii 1 4 2,44 2,65 2,54 ± 0,00 3,3 Monstera pinnatipartita 3 8 11,01 13,41 12,04 ± 0,30 6,6 Philodendron auriculatum 3 10 2,85 3,68 3,23 ± 0,10 8,4 Philodendron
fragrantissimum 3 10 4,21 5,39 4,86 ± 0,10 7,7
Philodendron grandipes 2 6 3,99 4,56 4,30 ± 0,10 4,8 Philodendron
microstictum 2 8 3,37 3,77 3,56 ± 0,00 3,4
Philodendron
platypetiolatum 3 9 3,19 3,79 3,55 ± 0,10 6,4
Philodendron popenoei 2 6 2,78 3,00 2,90 ± 0,00 2,7 Philodendron pterotum 3 7 4,71 5,68 5,12 ± 0,10 6,7 Philodendron sagittifolium 3 9 3,42 3,88 3,60 ± 0,00 3,5 Philodendron sp. #13 2 3 3,00 3,50 3,28 ± 0,10 7,8
Philodendron sp. 1 1 3 2,15 2,87 2,52 ± 0,20 14,3
Philodendron sp. 2 2 7 2,87 3,27 3,07 ± 0,10 4,3
Philodendron sp. 4 1 3 2,40 2,50 2,47 ± 0,00 2,3
Philodendron sp. Etl #9 2 9 2,95 4,69 3,65 ± 0,20 15,1 Philodendron cf. sulcatum 4 11 2,26 4,52 3,09 ± 0,27 28,9 Philodendron tripartitum 2 7 3,50 4,12 3,78 ± 0,10 5,5
Pistia stratiotes 3 15 0,69 0,92 0,83 ± 0,00 8,7
Spathiphyllum cf. laeve 1 5 21,38 22,97 22,12 ± 0,30 2,6 Spathiphyllum
phryniifolium 3 11 15,24 18,91 17,08 ± 0,40 8,4
Spathiphyllum silvicola 3 6 17,01 20,22 18,29 ± 0,50 6,7 Spathiphyllum wendlandii 2 6 18,79 21,93 20,07 ± 0,40 5,1 Stenospermation
angustifolium 3 9 6,99 8,48 7,49 ± 0,20 6,5
Stenospermation cf.
marantifolium 3 9 5,88 7,96 7,24 ± 0,20 9,1
Syngonium hastiferum 6 19 6,00 8,03 7,16 ± 0,20 9,2 Syngonium podophyllum 3 10 5,00 5,88 5,48 ± 0,10 5,5 Xanthosoma sagittifolium 2 8 4,36 5,14 4,81 ± 0,10 6,1
Za primerjavo lastnih rezultatov z že obstoječimi vrednostmi 2C smo uporabili spletno bazo Royal Botanic Gardens, Kew (Leitch in sod., 2019). Ob urejanju vrednosti iz baze smo ugotovili, da prihaja do odstopanj med taksonomskimi imeni v bazi in aktualno taksonomijo (POWO, 2019; IPNI, 2021; WCSP, 2021). V ta namen smo za svoje potrebe pripravili seznam vrst iz spletne baze z novo taksonomijo. Poenotili smo 18 sinonimov (preglednica 3). Večina vrst je dobila le novejši sinonim vrstnega imena, nekaj pa jih je bilo prestavljenih v drug rod. S tem smo s seznama izključili rod Landoltia, dodali pa rod Thaumatophyllum.
S posodobitvijo imen je prišlo do nekaj podvojenih vrednosti, saj so nekatere vrste pod novim sinonimom že bile vključene v bazo. Vrednosti, ki so bile podvojene in jih je meril isti avtor, smo izbrisali. Če sta različna avtorja izmerila isto vrsto pod različnim sinonimom, smo vključili obe vrednosti.
Preglednica 3: Seznam vrst s popravljenim imenom glede na aktualno taksonomijo.
Na levi strani so predstavljena stara taksonomska imena, na desni strani pa aktualna taksonomska imena.
Upoštevali smo aktualno taksonomsko razvrstitev (POWO, 2019; IPNI, 2021; WCSP, 2021).
Ime v spletni bazi RBG Kew Sinonim po aktualni taksonomiji
Alocasia hilobeauty Caladium praetermissum
Alocasia lowii var. grandis Alocasia longiloba var. grandis
Alocasia x amazonica Alocasia sanderiana
Amorphophallus dubius Amorphophallus paeoniifolius Amorphophallus laxiflorus Amorphophallus gallaensis
Amorphophallus rivieri Amorphophallus konjac
Amorphophallus sutepensis Amorphophallus krausei
Arum elongatum Arum orientale
Colocasia antiquorum Colocasia esculenta
Dieffenbachia picta Dieffenbachia seguine
Landoltia punctata Spirodela punctata
Philodendron andreanum Philodendron melanochrysum
Philodendron selloum Thaumatophyllum bipinnatifidum
Scindapsus aureus Epipremnum aureum
Spathicarpa sagittifolia Spathicarpa hastifolia
Syngonium albo-lineatum Syngonium angustatum
Typhonium cuspidatum Typhonium flagelliforme
Xanthosoma violaceum Xanthosoma sagittifolium
Poleg spremembe imena pri vrsti Amorphophallus konjac smo za potrebe analiz upoštevali vrednost 2C, kot so jo izmerili Zhao in sod. (2020), ki meri 2C = 12.95 ± 0.73 pg. Vrednost iz baze po Zhang in sod. (2013) meri 2C = 0,39 pg in je nismo upoštevali.
