OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV IZ GRENČICE SEČOVELJSKIH SOLIN

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

DIPLOMSKO DELO

ELINDA LOGAR

PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: Biologija in kemija

OSAMITEV IN IDENTIFIKACIJA GLIV IZ GRENČICE SEČOVELJSKIH SOLIN

DIPLOMSKO DELO

Mentorica: doc. dr. Polona Zalar Kandidatka: Elinda Logar

Ljubljana, september 2016

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija programa Biologija in kemija.

Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Študijska komisija na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete je za mentorico diplomskega dela imenovala doc. dr. Polono Zalar.

Mentorica: doc. dr. Polona Zalar Recenzent: doc. dr. Martina Turk

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: dr. Iztok Tomaţič

Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: doc. dr. Polona Zalar

Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Član: dr. Martina Turk

Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem spletu preko Digitalne knjiţnice Biotehniške fakultete.

Elinda Logar

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK

KG glive / Penicillium / Aspergillus / Cladosporium / Hortaea werneckii / Phaeotheca triangularis / solarne soline / grenčica / ITS rDNA

AV LOGAR, Elinda

SA ZALAR, Polona (mentor)/ PRIIMEK, Ime (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in kemija Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2016

IN OSAMITEV IN IZOLACIJA GLIV IZ GRENČICE IZ SEČOVELJSKIH SOLIN TD diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP XI, 73 str., 14 pregl., 34 sl.,3 pril., 53 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Sečoveljske soline štejemo med solarne soline, za katere je značilno izparevanje morske vode v zaporednih plitkih umetno ustvarjenih bazenih v namen pridobivanja halita (NaCl). Ko se ga večina obori, ostane matična luţina oz. grenčica, ki je bogata z drugimi solmi, kot sta MgCl₂ in MgSO₄. Raziskovalci so v zadnjih 15 letih iz slanice solin osamili in okarakterizirali številne vrste gliv. Malo pa je znanega o njihovem ţivljenju v vodi po evaporaciji halita,v grenčici, kar je bil cilj naše raziskave. Grenčica med drugim vsebuje visoke koncentracije Mg²⁺, ki so toksični za biološke sisteme. Pred našo raziskavo so dokazali, da nekatere vrste gliv tolerirajo visoke koncentracije Mg²⁺ ionov. V naši študiji smo za osamitev gliv iz grenčice uporabili tri različne tehnike: filtracijo, obogatitev v tekočih stresanih, in v nestresanih kulturah. Z vsemi tremi tehnikami smo osamili 120 sevov gliv, ki smo jih na osnovi morfologije in molekularnih označevalcev taksonomsko določili. Med halotolerante smo uvrstili črne kvasovke vrst Hortaea werneckii in Phaeotheca triangularis. Osamili smo tudi halofilno glivoWallemia ichthyophaga, in pa za slanico solin dosedaj še nepoznane naseljevalke, kot je vrsta Verrucocladosporium dirinae.

Med izolati pa so tudi predstavniki nekaterih še ne opisanih vrst rodov Aspergillus in Cladosporium.

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dn

DC

CX fungi / Penicillium / Aspergillus / Cladosporium / Hortaea werneckii / Phaeotheca triangularis / solar salteren / bitterns / ITS rDNA

AU LOGAR, Elinda

AA ZALAR, Polona (supervisor)/PRIIMEK, Ime (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Faculty of education, Biology-chemistry University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2016

TY ISOLATION AND IDENTIFICATION OF FUNGI FROM SEČOVLJE SALTERN BITTERNS

DT Graduation Thesis (University studies) NO XI, 73 p., 14 tab.,34 fig., 3 ann., 53 ref.

LA sl Al sl/en

AB The Sečovlje salterns are solar salterns made by human to obtain halite (NaCl) from sea water. They are characterized by shallow ponds where sea water is sucessivelly evaporating, and different minerals are successively crystalizing, halite being the most important one. After its percipitation, the mother liquor or bittern, rich in salts like MgCl2 and MgSO4 remains. During the last 15 years researchers have isolated and characterized representatives of many fungal species from brine, but very little is known about their life in bittern, which was the aim of our study.

Bittern is characterized by high concentration of Mg²⁺, toxic to biological systems.

Nevertheless, even prior our study, it was prooven, that fungi withstand high amount of Mg salts. To isolate fungi from bittern, we used three diferent isolation techniques: (i) filtration, enrichment in (ii) liquid shake cultures and in (iii) liquid non-shaken coltures. With all three techniques, we isolated 120 fungal strains and identified them using morphological characters, as well as molecular markers. We have identified the halotolerant black yeasts Hortaea werneckii and Phaeotheca triangularis, halophilic Wallemia ichthyophaga, and untill now for salterns yet unknown species Verrucocladosporium dirinae. Among the isolates there were representatives of yet undescribed species from genera Aspergillus and Cladosporium.

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VIII

1 UVOD... 2

1.1 NAMEN ... 2

1.2 HIPOTEZE ... 2

2 PREGLED OBJAV ... 3

2.1 IZJEMNO SLANA VODNA OKOLJA ... 3

2.1.1 MORJE ... 4

2.1.2 SOLINE ... 4

2.1.2.1 SOLARNE SOLINE... 5

2.1.3 SLANA JEZERA ... 5

2.1.3.1 VELIKO SLANO JEZERO (GREAT SALT LAKE.UTAH) ... 6

2.1.3.2 MRTVO MORJE (DEAD SEA,IZRAEL) ... 6

2.2 GLIVE V SLANIH OKOLJIH ... 7

2.2.1 GLIVE V MORJU ... 7

2.2.2 GLIVE V SOLARNIH SOLINAH ... 8

2.2.3 GLIVE V SLANIH JEZERIH ... 9

2.2.3.1 GLIVE V VELIKEM SLANEM JEZERU,UTAH (GREAT SALT LAKE,UTAH) ... 9

2.2.3.2 GLIVE V MRTVEM MORJU,IZRAEL (DEAD SEA,IZRAEL) ... 9

3 MATERIAL IN METODE ... 11

3.1 GOJIŠČA,RAZTOPINE,ZMESIINREAGENTI ... 11

3.1.1 GOJIŠČA ... 11

3.1.2 RAZTOPINE, ZMESI IN REAGENT ... 13

3.2 LABORATORIJSKEAPARATUREINKEMIKALIJE ... 15

3.2.1 LABORATORIJSKE APARATURE... 15

3.2.2 KEMIKALIJE ... 16

3.2.3 REAGENTI ... 17

3.3 METODE ... 18

3.3.1 IZOLACIJA GLIV ... 18

3.3.1.1 FILTRACIJA... 18

3.3.1.2 OBOGATITEV V TEKOČIH STRESANIH KULTURAH ... 18

3.3.1.3 OBOGATITEV V TEKOČIH STACIONARNIH KULTURAH ... 18

3.3.2 IZOLACIJA ČISTIH KULTUR ... 19

3.3.2.1 KVASOVKE ... 19

3.3.2.2 FILAMENTOZNE IN SPORULIRAJOČE GLIVE ... 19

3.3.3 FENOTIPSKA KARAKTERIZACIJA ... 19

3.3.3.1 MORFOLOGIJA ... 19

3.3.3.1.1 MAKROMORFOLOGIJA ... 19

3.3.3.1.2 MIKROMORFOLOGIJA ... 20

3.3.4 GENOTIPSKA KARAKTERIZACIJA GLIV ... 20

3.3.4.1 IZOLACIJA GENOMSKE DNA ... 20

3.3.4.1.1 KVASOVKE ... 20

3.3.4.1.2 FILAMENTOZNE IN SPORULIRAJOČE GLIVE ... 20

3.3.4.2 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR) ... 21

3.3.4.3 GELSKA ELEKTROFOREZA ... 23

3.3.4.4 DOLOČANJE IN OBDELAVA NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA ... 24

3.3.5 SHRANJEVANJE IZOLIRANIH GLIV ... 24

4 REZULTATI ... 25

4.1 REZULTATI ANALIZE SLANICE - MATIČNE LUŽINEOZ. GRENČICE ... 25

4.2 OPIS IZOLACIJE KULTUR ... 25

4.2.1 FILTRACIJA ... 25

4.2.2 IZOLACIJA GLIV PO OBOGATITVI V TEKOČIH STRESANIH KULTURAH ... 28

4.2.3 IZOLACIJA GLIV PO OBOGATITVI V TEKOČIH NESTRESANIH KULTURAH ... 30

4.3 IDENTIFIKACIJAIZOLATOV ... 38

4.3.1 ROD CLADOSPORIUM ... 38

4.3.2 ROD HORTAEA ... 40

4.3.3 ROD ASPERGILLUS ... 42

4.3.4 ROD PENICILLIUM ... 45

4.3.5 ROD VERRUCOCLADOSPORIUM ... 47

4.3.6 ROD PHAEOTHECA ... 49

4.3.7 DRUGE GLIVE ... 51

5 RAZPRAVA IN SKLEPI ... 55

5.1 RAZPRAVA ... 55

5.1.1 IZOLACIJA GLIV ... 55

5.1.2 FILAMENTOZNE GLIVE V GRENČICI SEČOVELJSKIH SOLIN ... 59

5.1.2.1 ROD ASPERGILLUS ... 59

5.1.2.2 ROD CLADOSPORIUM ... 60

5.1.2.3 ROD PENICILLIUM ... 60

5.1.2.4 ROD WALLEMIA ... 61

5.1.2.5 ROD VERRUCOCLADOSPORIUM ... 61

5.1.3 ČRNE KVASOVKE V GRENČICI SEČOVELJSKIH SOLIN ... 62

5.1.3.1 HORTAEA WERNECKII ... 62

5.1.3.2 PHAEOTHECA TRIANGULARIS ... 62

5.1.4 DRUGE GLIVE ... 63

5.2 SKLEPI ... 63

6 POVZETEK ... 65

7 VIRI ... 67

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Seznam uporabljenih naprav in njihov proizvajalec. ... 15

Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij in njihov proizvajalec. ... 16

Preglednica 3: Seznam uporabljenih reagentov in njihov proizvajalec. ... 17

Preglednica 4: Seznam uporabljenih oligonukleotidnih začetnikov in njihovih zaporedij. ... 22

Preglednica 5: Priprava PCR mešanice za pomnoţitev 1 vzorca ... 22

Preglednica 6: Program za podaljševanje verige. ... 23

Preglednica 7: Primerjava zastopanosti posameznih rodov dobljenih z različnimi tehnikami na različnih gojiščih. ... 36

Preglednica 8: Izolati gliv rodu Cladosporium in odstotek ujemanja z ITS zaporedjem, z zaporedjem genov, ki kodirata elongacijski faktor (EF-1α) in aktin (ACT) najsorodnejšega tipskega seva. ... 38

Preglednica 9: Izolati gliv rodu Hortaea in odstotek ujemanja z ITS zaporedjem najsorodnejšega tipskega seva. ... 41

Preglednica 10: Izolati gliv rodu Aspergillus in odstotek ujemanja z ITS zaporedjem, z zaporedjem genov, ki kodira beta tubulin (BenA) najsorodnejšega tipskega seva. ... 43

Preglednica 11: Izolati gliv rodu Penicillium in odstotek ujemanja z ITS zaporedjem, z zaporedjem genov, ki kodira beta tubulin (BenA) najsorodnejšega tipskega seva. ... 45

Preglednica 12: Izolati gliv rodu Hortaea in odstotek ujemanja z ITS zaporedjem najsorodnejšega tipskega seva. ... 48

Preglednica 13: Izolati gliv rodu Phaeotheca in molekularna identifikacija na osnovi ITS. ... 50

Preglednica 14: Izolati ostalih gliv in molekularna identifikacija na osnovi ITS. ... 51

KAZALO SLIK

Slika 1: Osnovne izolacijske plošče po filtraciji. ... 27

Slika 2: Osnovne izolacijske plošče nacepljene po obogatitvi v tekočih stresanih kulturah v gojišču YNB. .. 28

Slika 3: Osnovne izolacijske plošče nacepljene po obogatitvi v tekočih stresanih kulturah v gojišču CSL. ... 29

Slika 4: Osnovne izolacijske plošče, pridobljene z nanosom tekočega gojišča ME s pH7 pridobljenega z obogatitvijo v tekočih stresanih kulturah, po 1 tednu inkubacije. ... 29

Slika 5: Osnovne izolacijske plošče, pridobljene z nanosom tekočega gojišča ME s pH3.5 pridobljenega z obogatitvijo v tekočih stresanih kulturah, po 1 tednu inkubacije. ... 30

Slika 6: Mikrotiterska plošča z YNB + Ch v pufru pH 7.4 obarvano z resazurinom ... 31

Slika 7: Mikrotiterska ploščica z YNB + Ch. ... 32

Slika 8:Izolacijske plošče po nacepitvi iz mikrotiterske ploščice z YNB gojiščem po 1 tednu inkubacije. .... 32

Slika 9: Mikrotiterska ploščica z ME + Ch, pH7. ... 33

Slika 10: Izolacijske plošče po nacepitvi iz mikrotiterske ploščice z ME pH 7 gojiščem po 1 tednu inkubacije. ... 33

Slika 11: Mikrotiterska ploščica z ME + Ch, pH 3.5 + Ch. ... 34

Slika 12: Izolacijske plošče po nacepitvi iz mikrotiterske plošče z ME pH 3.5 ojiščem po 1 tednu inkubacije. ... 34

Slika 13: Mikrotiterska ploščica s CSL + Ch. ... 35

Slika 14:Izolacijske plošče po nacepitvi iz mikrotiterske ploščice z ME pH 3.5gojiščem po 1 tednu inkubacije. ... 35

Slika 15: Zastopanost vrst rodu Cladosporium pridobljenih z različnimi tehnikami. ... 39

Slika 16: Zastopanost vrst rodu Cladosporium izoliranih z različnih gojišč. ... 40

Slika 17: Mikromorfologija Cladosporium sp. EXF-10920 (C. sp. aff. dominicanum). Konidiofori in konidiji raznolikih oblik in velikosti. ... 40

Slika 18: Zastopanost vrste Hortaea werneckii izolirane z različnimi tehnikami. ... 41

Slika 19: Zastopanost vrste Hortaea werneckii dobljene izoliranena iz različnih gojišč. ... 42

Slika 20: Zastopanost vrst rodu Aspergillus izoliranih z različnimi tehnikami. ... 43

Slika 21: Zastopanost vrst rodu Aspergillus izoliranih iz različnih gojišč. ... 44

Slika 22: Mikromorfologija seva rodu Aspergillus. ... 44

Slika 23: Zastopanost vrst rodu Penicilliums izoliranih z različnimi tehnikami. ... 46

Slika 24: Zastopanost vrst rodu Penicillium izoliranih iz različnih gojišč. ... 46

Slika 25: Mikromorfologija seva rodu Penicillium. ... 47

Slika 26: Zastopanost vrste Verrucocladosporium dirinae izolirane z različnimi tehnikami. ... 48

Slika 27: Zastopanost vrste Verrucocladosporium dirinae izolirane iz različnih gojišč. ... 49

Slika 28: Mikromorfologija seva Verrucocladosporium EXF-10948 (V. dirinae). ... 49

Slika 29: Zastopanost vrste Phaeotheca triangularis izolirane z različnimi tehnikami. ... 50

Slika 30: Zastopanost vrste Phaeotheca triangularis izoliranine iz različnih gojišč. ... 50

Slika 31: Mikromorfologija seva EXF-10948 (P. triangularis). ... 51

Slika 32: Zastopanost vrst ostalih osamljenih gliv izoliranih z različnimi tehnikami. ... 52

Slika 33: Zastopanost vrst ostalih osamljenih gliv izoliranih iz različnih gojiščih. ... 53

Slika 34: Mikromorfološka reven identifikacije drugih gliv ... 54

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

µ mikroliter (10^-6 litra)

°C stopinje celzija

% odstotek

‰ promil

ACT aktin

Aff. soroden, po latinsko: »affinis«

BLAST osnovno iskalno orodje lokalne poravnave (»Basic Local Alignment Search Tool«)

CBS mikrobiološka zbirka gliv »Centraalbureau voon Schimmelcultures«, Utrecht Ch antibiotik kloramfenikol

CSL gojišče s pšeničnimi otrobi in koruzno namakalno tekočino (»Corn Steep Liquor«)

CSM mešanica esencialnih dodatkov (»Complete Supplement Mixture«) CTAB cetil trimetil amonijev bromid

DG-18 agar z dikloranom in glicerolom DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP deoksinukleotid trifosfat EDTA etidiaminotetrocetna kislina

EXF oznaka za glive v mikrobiološki zbirki ekstremofilnih gliv Ex na Katedri za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov, Oddelek za biologijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani

g gram

ITS notranji distančniki, ki ločujejo rDNA posameznih ribosomskih podenot.

(»internal transcribed spacer«)

L liter

M molarna koncentracija

MEA agar s sladnim ekstraktom (»Malt Extract Agar«)

NCBI internetna baza podatkov (»National Center for Biotechnology Information«) Npr. na primer

PCR polimerazna veriţna reakcija (»Polymerase Chain Reaction«) PDA krompirjev agar z glukozo

rRNA ribosomska ribonukleinska kislina sp. Vrsta (»species«)

SSS raztopina za pripravo suspenzije spor (»spore suspension solution«)

TE Tris EDTA

YNB definirano gojišče z univerzalnim virom dušika, brez vira ogljika (»Yeast Nitrogen Base«)

ZDA Zdruţene drţave Amerike

1 UVOD

Izjemno slani habitati, kot so vode spreminjajočih se slanosti v solinah, predstavljajo ekstremno ekološko nišo, iz katere so izolirali številne glive (Gunde-Cimerman s sod., 2000, 2004), med njimi tudi za znanost nove vrste (Zalar s sod. 1999a,b; 2005, 2007).

Preučevali so predvsem slanico različnih slanosti od 3% do kristalizacije (32%), ki nastane z evaporacijo morske vode v petih evaporacijskih stopnjah. Po pobiranju kuhinjske soli pa ostane voda, t.i. grenčica (oz. matična luţina = aqua madre), ki je bogata z MgCl2 in MgSO₄. Slednja sol daje vodi grenak okus, zato vodo po kristalizaciji halita imenujemo grenčica. Predvsem MgCl2 je za ţivljenje omejujoča sol, saj drastično zniţa vodno aktivnost in deluje kaotropično, ker vpliva na znotrajmolekulske sile med vodnimi molekulami, in s tem omogoča topnost proteinov in drugih makromolekul. Do leta 2014 je veljalo, da so arheje najbolj tolerantne med mikrobi, saj so nekatere sposobne tolerirati 1,26 M MgCl₂ v odsotnosti kozmotropov. Le-ti prispevajo k stabilnosti in strukturi interakcij vode v makromolekulah, npr. proteinih. Zajc in sodelavci (2014) so ugotovili, da so nekatere iz solin osamljene glive še bolj tolerantne na MgCl₂, saj tolerirajo kar 2 M MgCl2.

1.1 NAMEN

Namen diplomske naloge je osamitev in pridobitev podrobnejšega vpogleda v pestrost halotolerantnih in halofilnih gliv, ki se nahajajo v grenčici Sečoveljskih solin.

Identifikacija glivnih izolatov bo potekala na osnovi morfoloških in molekularnogenetskih lastnosti (določevanje in obdelava nukleotidnih zaporedij ITS rDNA ter pomnoţevanje predela gena, ki kodira aktin, elongacijski faktor in beta tubulin). Vse pridobljene izolate pa bomo deponirali v mikrobiološko zbirko Ex.

1.2 HIPOTEZE

Z uporabo različnih izolacijskih tehnik bomo osamili različne vrste gliv, na primer z obogatitveno metodo v tekočem gojišču pričakujemo izolacijo predvsem kvasovk.

Na podlagi ţe opravljenih raziskav gliv iz Sečoveljskih solin predvidevamo, da se v grenčici nahajajo podobne glive kot v slanici, ki jih označujemo kot poliekstremotolerantne. Menimo, da bodo dobljeni izolati v večini halotolerantni in ne halofilni.

2 PREGLED OBJAV

2.1 IZJEMNO SLANA VODNA OKOLJA

Glavna sestavina Zemeljskega površja je slana voda, saj oceani, morja, podzemna slana jezera in površinska slana jezera predstavljajo kar 99% vse vode na Zemlji. Pribliţno ena četrtina Zemljine skorje pa vsebuje tudi več 100 metrov debele slane depozite. Soli imajo glavno vlogo v biosferi, saj določajo dostopnost biološke vode in z različnimi aktivnostmi (ionski, kozmotropni in kaotropni efekti) vplivajo na biološke sisteme. NaCl je najpogostejša sol v izjemno slanih okoljih. Slanice in depoziti pa so bogati tudi z drugimi solmi, kot je na primer MgCl2 (Hallsworth, 2007).

Izjemno slana okolja imajo višjo koncentracijo soli kot morska voda. Raztopine soli s koncentracijo nad 3,5% NaCl najdemo tako v naravnih kot umetnih sistemih. Med naravne prištevamo globokomorske izjemno slane bazene, slana močvirja, slana in alkalna jezera, medtem ko med umetna izjemnoslana okolja prištevamo soline in s soljo konzervirana ţivila (Galinski in Trüper, 1994).

Glede na izvor nastanka, delimo izjemno slane vode na talasohaline in atalasohaline.

Talasohaline vode imajo enako sestavo soli kot morska voda, saj so njihov derivat, prevladujejo natrijevi in kloridni ioni (Oren, 2002). Primeri talasohaline vode so pomorski ribniki, slana močvirja in solarne soline, nastajajo pa z evaporacijo morske vode, vsaj v prvi fazi evaporacije, ko evaporacija poteka do mejne topnosti CaSO4, ko se ionska sestava drastično spremeni (skupna koncentracija soli nad 100-120 g/liter) (Oren, 2006). V posameznih fazah evaporacije prihaja do precipitacije in kristalizacije halita (NaCl), kalcita (CaCO3), silvita (KCl) in nekaterih drugih mineralov, ostane slanica, ki je bogata z Mg²⁺ in Cl^-, ki je nekoliko bolj bazična kot morska voda (7-8 pH). Vode bogate z NaCl (talasohaline) podpirajo bogato biotsko raznovrstnost. S hranili bogata slanica je posebna ekološaka niša znotraj solin, kjer ţivijo le organizmi, ki tolerirajo tudi ekstremno visoke koncentracije Mg²⁺ (Zajc, 2014)

Ionska sestava atalasohalinih voda se razlikuje od morske vode (Oren, 2006) in je odvisna od geološke podlage nastalih jezer ali morja, zato zanje niso značilne visoke vsebnosti kloridnih in natrijevih ionov (Galinski in Trüper, 1994). Primer atalasohaline vode je

Mrtvo morje, ki je nastalo na obseţnih depozitih magnezijevih mineralov, zato Mg²⁺

prevladuje nad Na⁺ in Cl^- (Grant, 2004).

2.1.1 Morje

Večina, pribliţno 71% zemeljske površine, je prekrita z morjem. Morska voda je zapletena raztopina in vsebuje večino znanih elementov. Nekateri elementi so bolj zastopani kot drugi, med njimi so kloridni (55%), sulfatni (30.6%), magnezijevi (3.7%) in kalijevi ioni (1.1%). Pomembna lastnost morske vode je, da medtem ko se celotna koncentracija soli spreminja od kraja do kraja, koncentracija bolj zastopanih komponent ostaja skoraj nespremenjena. Skupno količino raztopljenega materiala v morski vodi imenujemo slanost in je definirana kot »celotna vsota trdnih snovi v gramih, ki jo vsebuje 1 kilogram morske vode, ko je bil ves karbonat pretvorjen v oksid, ko klor nadomesti brom in jod, ter ko je ves organski material popolnoma oksidiral«. Povprečna slanost oceanskega morja je pribliţno 35 gramov na kilogram morske vode (g/kg, S=35‰, S=35ppt). 75% oceanske vode ima 34-35‰ soli, 50% oceanske vode pa ima 34.6-34.8‰ soli. Z opazovanjem postane jasno, da je površinska slanost določena z obratnim učinkom in sicer se evaporacija poveča, precipitacija pa se zmanjša. Evaporacija je največja v predelih, kjer sta konstanten veter in visoke temperature. Obseg vrednosti površinske slanosti odprtih morij je od 33-37‰. Višje vrednosti pa so doseţene na območjih, kjer je višja evaporacija, kot sta Sredozemsko morje in Rdeče morje (Pikard in Emery, 1990).

2.1.2 Soline

Glavna značilnost solin je evaporacija vode v slanostnem območju med 3% do nasičene raztopine NaCl (35%), nizka koncentracija kisika, visoke intenzitete svetlobe, velika razpoloţljivost hranil in nevtralni pH. Med evaporacijo se kemijska sestava morske vode spreminja s kompleksnimi postopki raztapljanja in precipitacije. Glavna sestavina obarjanja v zadnji fazi predelave soli pri končni koncentraciji nad 30% je NaCl (halit) (Gunde-Cimerman in sod., 2000). Povečane koncentracije soli najdemo v umetno zgrajenih evaporacijskih in kristalizacijskih bazenih ob tropskih in subtropskih obalah po vsem svetu (Oren, 2006).

2.1.2.1 Solarne soline

Solarne soline so antropogeni sistemi plitkih bazenov in so namenjene pridobivanju halita (NaCl) iz morske vode (Javor, 1989). Najbolj poznana skrajno slana okolja so poleg eksorheičnih slanih jezer, kjer je zaloga vode večja, glede na volumen bazena tudi endorheična (notranje izsušujoča se) jezera. Za njih so značilni veliki vodni bazeni z majhnim dotokom vode in brez odtoka. Voda se odstrani le z evaporacijo, kar pa povzroča kopičenje soli (Moss, 1986). Solarne soline so pol umetni sistemi za pridobivanje NaCl iz morske vode in omogočajo zelo uporaben sistem za preučevanje mikrobne raznolikosti (Casamayor in sod., 2002).

Ko priteče morska voda v začetne bazene (1. faza), voda prične izhlapevati in se zgosti, nato gre slanica v bazene druge evaporacijske stopnje, kjer voda doseţe gostoto od 70 do 140 g/l, izloča se kalcijev karbonat (CaCO₃).Voda, nadaljuje pot v bazen tretje evaporacijske stopnje, kjer je gostota vode od 140 do 220 g/l, izloča pa se kalcijev karbonat in nekaj sadre (CaSO₄ × 2H₂O). V predkristalizacijskih bazenih pa je gostota vode ţe od 220 do290 g/l, izloča se sadra. V zadnjih kristalizacijskih bazenih z gostoto vode nad 290 g/l pa poteka izločanje halita (Javor, 1989; Poţar, 1990). Ko se večina halita obori, ostanejo v slanici Mg^2+, K⁺, Cl^- in SO₄^- ioni. Preostalo vodo v Sečoveljskih solinah imenujejo matična luţina (aqua madre) ali grenčica (Javor, 1989). Proces izpadanja soli označuje tudi intenzivna rdeča barva vodne površine, ki jo obarvajo fototrofne halofilne bakterije (Schneider, 1995). Proces izparevanja slanice ustavijo pri določeni slanosti, ker bi sicer prišlo do prevelike primesi grenke soli MgSO4, ki se začne obilneje obarjati pri slanosti 33% (Poţar, 1990). Grenčica je grenka, reducirana raztopina in navadno predstavlja odpadek. Uporabljajo jo v talasoterapiji in v nekaterih industrijskih obratih, kjer iz nje pridobivajo magnezij, brom in kalijeve soli (Poţar, 1990). Skozi celotni postopek kopičenja NaCl pa se biodiverziteta niţa (Benlloch, 2002).

2.1.3 Slana jezera

Večina jezer je dobro pretočnih, s čimer je zagotovljena stalna kemijska sestava vode podobna pitni vodi. Zgodi se, da je voda obremenjena s topljenci in takrat jezero postane slano. Slana jezera nastajajo, če (1) je omejen odtok vode, kot je pri hidrološko zaprtih bazenih, (2) evaporacija presega dotok sveţe vode in (3) je zadosten dotok vode, da

vzdrţuje obstoj jezera (Eugster in Hardie, 1978). Slana jezera (˃5000 ppm =5‰

raztopljenih soli), so dokaj pogosta na sušnih območjih sveta (Hardy in sod., 1978). Vode slanih jezer lahko doseţejo koncentracije soli tudi do 400.000 ppm (400‰) skupne raztopljene raztopine, ki lahko kristalizirajo kot alkalne (Na-CO3, Mg-Na-SO4), grenke (MgSO₄ × 7H₂O, Na₂SO₄ × MgSO₄ × 4H₂O, Na-SO₄-Cl) ali kot halit (NaCl) (Eugster in Hardie, 1978).

2.1.3.1 Veliko slano jezero (Great Salt Lake. Utah)

Veliko slano jezero je locirano v severnem območju Utah, ki je na zahodu omejen s pokrajino Sierra Nevada, na vzhodu pa z gorovjem Rocky Mountains (Post, 1977) in je danes četrto največje terminalno jezero na Svetu (Stephens, 1990). Veliko slano jezero sta dejansko dva jezera (severni rokav in juţni rokav), ki ju ločujejo polprepustne kamnine umetne bariere (Post, 1977). Jezero je ostanek glacialnega sladkovodnega jezera Lake Bonneville.

Pred gradnjo pregrade preko celotnega jezera je jezero imelo slanost pribliţno

20%. Po končani gradnji pregrade leta 1959 (Javor, 1989), pa je juţni rokav v katerega se steka 67% letnega pritoka vode iz okoljskih gora, reke Bear, Weber in Jordan, (Stephens, 1990) , imel slanost okrog 12%, medtem pa je severni rokav postal izjemno slan, saj se mu je slanost povečala na 33% (Javor, 1989). Dva največja tokova, ki napajata jezero, sta močno mineralizirana z Na2SO4 in NaCl, zato je vsebnost soli Velikega slanega jezera prav tako NaCl in Na2SO4. Pozimi, ko se temperatura vode severnega rokava spusti pod 3°C, se Na2SO4 spontano prične obarjati in oblikuje 15 do 20 cm debelo odejo hidratiranih sulfatov na dnu jezera. Valovi to odejo potisnejo na obalo, kjer se tvorijo velike bele »palice« 98%

čistega Na2SO4.

2.1.3.2 Mrtvo morje (Dead Sea, Izrael)

V Pleistocenu, pribliţno 70,000 to 15,000 pred našim štetjem, je obstajalo jezero Lake Lisan, ki je bil predhodnik današnjega Mrtvega morja.. Nahajal se je v tektonski depresiji vzdolţ bazena Mrtvega morja in doline reke Jordan (Bartov, 2000). Današnje Mrtvo Morje je eden od številnih internacionalnih, terminalnih jezer v sistemu vzhodno Afriško- Sirijskem grebenu (Niemi, 1997) in je locirano na meji med Izraelom in Jordanijo

(Buchalo, 1998), obdajajo ga strmi robovi na vzhodu in zahodu, na severni in juţni strani pa je omejen s poloţnimi pobočji (Bartov, 2000) in leţi na najniţji zemeljski točki (-410 metrov) (Buchalo, 1998).

Ekstremno nizka nadmorska višina v kombinaciji s tektonsko dvignjenimi gorami, ki obdajajo Mrtvo Morje, povzročajo zelo izsušena območja. Voda, ki doteka v to jezero nima odtoka. Vsi ti pogoji kontrolirajo njegove fizikalne, kemijske in biološke lastnosti (Niemi, 1997). Trenutno je eden najbolj slanih jezer na Zemlji (slanost 34%). To jezero se od ostalih izjemno slanih jezer razlikuje po unikatni ionski sestavi njegove vode. Vsebuje visoke koncentracije divalentnih kationov (Mg, 40.7 g/l; Ca, 17 g/l), ki presegajo koncentracije monovalentnih kationov (Na, 39.2 g/l; K 7 g/l). Glavni anioni, ki so zastopani pa so Cl (212 g/l) in Br (5 g/l) (Buchalo, 1998). Lahko rečemo, da je Mrtvo Morje v principu jezero MgCl (Post, 1977).

2.2 GLIVE V SLANIH OKOLJIH

Relativno slabo raziskana področja so oceani in morski rokavi, še leta 1991 pa so poročali o skoraj popolnoma neraziskanih naravnih slanih jezerih in solarnih solinah (Hawkswort, 1991). Prve informacije o glivnih naseljevalkah solinskih vod pa datirajo šele v letu 2000, (Gunde-Cimerman).

V skrajno slanih okoljih so prisotne specifične zdruţbe, ki so zaradi povišanega osmotskega tlaka in toksičnih koncentracij ionov popolnoma prilagojene na ta ekstremna okolja. Najštevilčnejši predstavniki so halofilne bakterije, arheje, glive in alge rodu Dunaliella. Z naraščanjem slanosti se biotska raznovrstnost zmanjšuje (Faezel in sod., 2008).

2.2.1 Glive v morju

Morske glive nastopajo kot paraziti na rastlinah in ţivalih, kot simbionti alg v obliki lišajev in kot saprobionti na razpadajočem organskem materialu, kot so les in keratin) (Blomberg in Adler, 1993).

Morska mikologija je doţivela razcvet v 80-ih letih 20-ga stoletja, ko so opisali od 800 do 1000 novih vrst gliv. Večino opisanih vrst so uvrstili v skupino Ascomycota (Brock in sod., 1994), med Deuteromycota in med kvasovke (Buchalo in sod, 1998). Manj kot 500 vrst gliv je bilo izoliranih iz oceanov in morskih rokavov (209 višjih nitastih gliv, 177 vrst kvasovk, 100 niţjih gliv) (Blomberg in Adler, 1993). Manj kot 1% celotnega števila opisanih glivnih vrst torej predstavljajo prave morske glive, ki preţivijo celoten ţivljenjski cikel v morju (Edwards, 1998). Za morske glive je značilno, da ne rastejo pri koncentracijah soli, ki so niţje ali višje od koncentracije soli v morski vodi (Brock in sod., 1994)

2.2.2 Glive v solarnih solinah

Iz slane vode solarnih solin s slanostjo 10 – 12% so izolirali vrsti kvasovk Metchnikowia kamienskii in M. bicuspidata (obligatno halofilna), obe pa parazitirata solinskega rakca Artemia salina (Torzilli, 1997).

Pri študiji biotske raznolikosti gliv v Sečoveljskih solinah so iz talnih in vodnih vzorcev izoliranih 123 vrst mikrogliv. Največja biotska raznolikost gliv je bila ugotovljena v površinskem talnem vzorcu pod vodo, v tako imenovani petoli in v izjemno slani vodi kristalizacijskega bazena, slanosti od 15 do 32% NaCl (Cerovac, 1997).

Leta 1997 so iz skrajno slanih vod solarnih solin Sečovlje izolirali številne vrste gliv, ki so jih razdelili v dve skupini. Prvo obsegajo kserofilne glive (Wallemia sebi, vrste iz rodov Aspergillus in Penicillium s teleomorfi, rodovi Epicoccum, Paecilomyces, Alternaria, Acremonium, Cladosporium, itd), drugo pa halotolerantne ter halofilne glive, skoraj izključno črne kvasovke, ki so jih identificirali kot Aureobasidium pullulanis, Hortaea werneckii, Phaeotheca triangularis, glivo vrste Trimmatostroma salinum pa so opisali kot novo (Zalar, 1999a).

Glive vrst Hortea werneckii, Phaeotheca triangularis in Trimmatostroma salinum skoraj niso poznane zunaj solinskega okolja, očitno je skrajno slana voda njihova naravna ekološka niša (Gunde-Cimerman in sod., 2000).

2.2.3 Glive v slanih jezerih

Raziskave na področju gliv v slanih jezerih so redke. Primeri izoliranih gliv so iz rodu Cladosporium (potopljen les; Great Salt Lake, Utah; 29 – 36% soli), glive iz skupine Chytridiomycota (alkalno jezero Mono Lake, Sierra Nevada, 9% soli), Dendryphiella salina (sediment dna jezera Bonney, Antarktika; 11 – 20% soli, -3 do -5 °C), vrste rodov Penicillium in Aspergillus (sediment dna jezera Vanda, Antarktika; 10% soli) (Javor, 1989).

2.2.3.1 Glive v Velikem slanem jezeru, Utah (Great Salt Lake, Utah)

Edini znani zapis izolacije halofilnih filamentoznih gliv iz jezera Great Salt Lake, je zapis o vrsti Cladosporium sp. (Hyphomycetes, anamorf Mycosphaerellaccae), ki je bila izolirana iz potopljenega borovega lesa. V tem jezeru pa so našli tudi glivo iz rodu Thraustochytrium (Buchalo in sod., 1998) in askomicetno kvasovko Metschnikowia bicuspidata, ki je bila sicer znana kot parazit solinskega raka, tu pa je bila izolirana kot prosto ţiveča oblika (Butinar in sod., 2005).

2.2.3.2 Glive v Mrtvem morju, Izrael (Dead Sea, Izrael)

Včasih so mislili, da v Mrtvem morju skoraj ni ţivljenja, po čimer je tudi dobilo ime. Od leta 1936, ko je B. Wilkansky odkril ţivljenje v tem jezeru, je znano, da je naseljeno z večjim številom vrst mikroorganizmov.

V prvem nam znanem zapisu o pojavu filamentoznih gliv v izjemno slanem Mrtvem morju so bile predstavljene 3 vrste izolirane iz vzorca površinske vode: Gymnascella marismortui (Ascomycota) opisana kot nova vrsta, Ulocladium chlamydosporum in Penicillium westlingii (Deuteromycota) (povzeto po Butinar in sod., 2005). Voda Mrtvega morja trenutno vsebuje pribliţno 348g/l soli (2 M Mg²⁺, 0.5 M Ca²⁺, 1.5 M Na⁺, 0.2 M K⁺, 6.5 M Cl^-, 0.1 M Br^-) in pH 6. Po deţevnih zimah površina vode postane razredčena, kar sproţi razvoj mikrobnih alg. Med leti 1980 in 1992 sta v rasti prevladovali enocelična zelena alga Dunaliella in rdeča alga Archaea. Blizu obale, iz vode in celo iz globokih predelov tega jezera je bilo osamljenih vsaj 70 vrst, od tega 26 rodov iz Oomycota (Chromista), Mucoromycotina, Ascomycota in Basidiomycota. Največkrat osamljena sta bila rodova

Aspergillus in Euratium. Vrste Aspergillus terreus, A. sydowii, A. versicolor, Eurotium herbariorum, Penicillium westlingii, Cladosporium cladosporioides, C. sphaerospermum, C. ramnotellum, in C. halotolerans najverjetneje tvorijo stabilno jedro skupnosti. Vrsta Gymnascella marismortui pa naj bi bila endemična. Veliko izolatov kaţe zelo visoko toleranco do magnezijevih soli, kar pa ni neposredni pokazatelj, da glive prispevajo k heterotrofični aktivnost v Mrtvem morju, lahko pa soprisotne vsaj lokalno in začasno (Oren in sod., 2012).

3 MATERIAL IN METODE

3.1 GOJIŠČA, RAZTOPINE, ZMESI IN REAGENTI 3.1.1 Gojišča

MEA (agarno gojišče s sladkim ekstraktom -»Malt Extract Agar«) (Samson in sod., 2004) (po Blakeslee- ju):

MEA s kloramfenikololom sladni ekstrakt……… 20 g

pepton……… 1 g

glukoza………... 20 g agar………. 20 g

destilirana voda……. do 1000 ml kloramfenikol……… 0,05 g pH………... 5,0 – 5,5

MEA + Ch (agarno gojišče s sladnim ekstraktom in dodatkom kloramfenikola):

sladni ekstrakt……... 20 g pepton……….... 1 g glukoza……….. 20 g agar……….... 20 g

destilirana voda……. do 1000 ml kloramfenikol……… 0,05 g pH……… 7

MEA + 3M NaCl + Ch (17,5 % NaCl) (agarno gojišče s sladnim ekstraktom in soljo) (Andrewsin Pitt, 1987):

sladni ekstrat……….. 20 g

pepton……… 1 g

glukoza……….…….. 20 g

agar……… 20 g

NaCl……… 175,4 g destilirana voda…….. do 1000ml kloramfenikol……… 0,05 g pH………... 5,0 - 5,5 sladni ekstrat……... 20 g

pepton………....…... 1 g glukoza……….. 20 g agar…….…………... 20 g

destilirana voda……. do 1000 ml pH……….. 5,0 – 5,5

MEA + 1,5M MgCl₂ + Ch (agarno gojišče s sladnim ekstraktom in soljo):

sladni ekstrakt……… 20 g

pepton……… 1 g

glukoza……….. 20 g

agar……… 20 g

MgCl2×6H2O……….. 152 g destilirana voda……. do 1000ml kloramfenikol……… 0,05 g pH……….. 5,0 – 5,5

MEA + 1M CaCl2 + Ch (agarno gojišče s sladnim ekstraktom in soljo):

sladni ekstrakt……… 20 g

pepton……… 1 g

glukoza……….. 20 g

agar……… 20 g

CaCl2……….. 100 g destilirana voda……. do 1000 ml koramfenikol……….. 50 mg pH………... 5,0 – 5,5

DG-18 gojišče z dikloranom in 18 % glicerola (»18 % Dichloran Glycerol«) (Hocking in Pitt, 1980), (Biolife, industrisko pripravljena mešanica):

pepton……… 5 g

glukoza………... 10 g KH₂PO₄……….. 1 g MgSO4……….... 0,5 g dikloran………. 0,002 g

agar……… 15 g

destilirana voda……. do 1000 ml kloramfenikol……… 0,05 g pH……….. 5,0 – 5,5

YNB + Ch (definirano gojišče z univerzalnim virom dušika, brez vira ogljika) (»yeast Nitrogen Base«):

YMB……….…... 0,85 g CSM……….…… 0,4 g (NH₄)₂SO₄…….….…. 2,5 g glukoza………….….. 10 g destilirana voda……... do 500 ml pH……… 7

YNB + Ch v 1 × PBS pufer (definirano gojišče z univerzalnim virom dušika, brez vira ogljika z dodatkom kloramfenikola in PBS pufra)

NaCl………... 2 g KCl………. 0,05 g Na₂HPO₄…………... 0,36 g KH2PO4……….. 0,06 g PBS pufer………….. 18705 ml

pH……….. 7,4

PDA (krompirjevo agarno gojišče z glukozo – »Potato Dextrose Agar«) (Biolife, Milan, Italija):

CSL + Ch (definirano gojišče s pšeničnimi otrobi in koruzno namakalno tekočino):

koruzna namakalna tekočina……….. 20 g NaNO₃……….…….. 3 g K₂HPO₄………. 1 g KCl………. 0,5 g MgSO4×7H2O……… 0,5 g FeSO₄×7H₂O……….. 0,01 g NaCl………... 50 g destilirana voda……. do 500 ml

pH……….. 7

3.1.2 Raztopine, zmesi in reagent

1× PBS pufer:

NaCl………... 4 g KCl………. 0,1 g Na₂HPO₄……… 0,72 g KH2PO4………. 0,12 g destilirana voda…….. do 500 ml pH (uravnavamo z 1

M HCl)………... 7,4

CTAB pufer:

Tris………. 2,42 g NaCl………... 8,2 g Na-EDTA…………... 0,74 g CTAB………. 2 g

ultra čista voda…….. do 100 ml pH (uravnavamo z 1

M HCl)……… 7,5

potato dextrose agar... 42 g agar……….… 10 g

destilirana voda……. do 1000 ml

TE pufer:

Tris………. 0,12 g Na-EDTA…………... 0,04 g ultra čista voda…….. do 100 ml pH (uravnavamo z 1

M HCl)…………...… 8

Pufer 1× TAE:

Tris baza………….. 242 g Ocetna kislina…….. 57,1 ml 0,5M EDTA (pH 8).. 100 ml destilirana voda…… do 1000 ml

5× nanašalni pufer:

bromtimol modro….. 0,25 g ksilen cianol………... 0,25 g glicerol………... 30 ml destilirana voda……. do 100 ml

Nanašalni gel:

agaroza….………….. 0,8 SYBER safe………... 2 µl pufer TAE………….. 80 ml

SSS (raztopina za pripravo suspenzije spor – »Spore Suspension Solution«) (CBS katalog, 2001):

Tween 80……… 0,5 g agar……….… 0,5 g destilirana voda……. do 1000 ml

2 mM resazurin (Rampersad, S.N., 2012):

resazurin……… 0,00251 g PBS pufer………….. 5 ml rečimo s pufrom PBS (rečimo 10×: 5 ml v

45 ml)………. do 200 µM

3.2 LABORATORIJSKE APARATURE IN KEMIKALIJE 3.2.1 Laboratorijske aparature

V preglednici so navedene uporabljene laboratorijske aparature.

Preglednica 1: Seznam uporabljenih naprav in njihov proizvajalec.

NAPRAVA PROIZVAJALEC

Avtoklav A-63C Kambič, Slovenija

Avtomatske pipete Biohit, Finska; Eppendorf Nemčija

Bunsenov gorilnik TLOS, Zagreb, Hrvaška

Centrifuga Eppendorf, Hamburg, Nemčija

Digestorij Variolab Molibien W90 Waldner, Wangen, Nemčija

Digitalna kamera DP12 Olympus, Tokio, Japonska

Električni transformator za elektroforezo Consort E143 Sigma-Aldrich, St, Luis, MO, ZDA

Elektroforezna banijica E33 Hoefer, San Francisco, CA, ZDA

Filtri Millex s premerom por 0,45 µm Millipore Corporate Headquarters, ZDA

Laminarij IBK 1V2 Iskra, Slovenija

Magnetno mešalo Rotamix 550MMH Tehtnica, Ţelezniki, Sloveniija

Mikroskop Olympus BX51 Olympus, Tokio, Japonska

Mikrovalovna pečica Gorenje, Slovenija

PCR sistem Ependorf, Hamburg, Nemčija

pH meter Metrom 713 Ţelezniki, Slovenija

Stereomikroskop Steri SV11 z virom svetlobe KL1500 LCD Zeiss, Oberkoshen, Nemčija

Tehtnica ET-1111 Tehtnica, Ţelezniki, Slovenija

Transiluminator °SYNGENE, a division of synoptics Limited

Vakumska črpalka ASF Thomas, Nemčija

Vodna kopel Pharmacia Biotech, Uppsala, Švedska

Vrtinčasto mešalo (vortex) Ţelezniki, Slovenija

3.2.2 Kemikalije

V preglednici so navedene uporabljene kemikalije.

Preglednica 2: Seznam uporabljenih kemikalij in njihov proizvajalec.

KEMIKALIJA PROIZVAJALEC

dNTP Applied Biosystem, Callifornia, ZDA

YNB Beton, Dickinson and Company, Sparks, MD

DG-18

Biolife, Milan, Italija Potato dextrose agar

Sladni skstrakt Tween 80

Agaroza Carl Roth Gmbh+Co

Etanol 96%

Chemo d.d., Ljubljana, Slovenija Glicerol

Maltoza Difco laboratories, Detroit, Michigan, ZDA

10× PCR pufer brez MgCl2

Fermanta Life Sciences, Litva Lestvica: ʺ100bp DNA Ladder Plusʺ

RNA-ze

Taq polimeraza (5U/µl) Glukoza

Kemika, Zagreb, Hrvaška HCl

KH₂PO₄ Kloroform MgCl₂ × 6 H₂O Na-EDTA Agar agar

Merck, Darmstadt, Nemčija K₂HPO₄

NaH₂PO₄ NaNO₃ Ocetna kislina KCl

MgSO₄ × 7 H₂O

Merck, Darmastadt, Nemčija NaCl

Pepton Silikagel

Bromtimol modro

Sigma Chemical C., Luis, Mo., ZDA CTAB

Kloramfenikol Ksilen cianol Tris baza CSM

Formedium, Anglija CSL

(NH₄)₂SO₄ J. T. Baker, Nizozemska

Syber safe Invitrogen

CaCl₂ Gram d.o.o., Zagreb, Hrvaška

FeSO4 × 7 H2O Panreac quimica S.L.U, Barcelona, Španija

3.2.3 Reagenti

Preglednica 3: Seznam uporabljenih reagentov in njihov proizvajalec.

REAGENT PROIZVAJALEC

ITS4: mesto vezave na 3` koncu 28S rDNA:

nukleotidno zaporedje (5` proti 3`):

TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

Jena Bioscience GmbH, Jena, Nemčija ITS5: mest vezave na 5` koncu 18S rDNA

nukleotidno zaporedje (5` proti 3`):

GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G

3.3 METODE

ANALIZA SLANICE-MATIČNE VODE (GRENČICE)

Analize so bile opravljene med 18.8 in 20.8.2015 na območju Sečoveljskih solin.

(Slovenija). Kemijske analize grenčice so opravili v tehnološkem laboratoriju podjetja Soline d.o.o. (Rezultati v poglavju 4.1)

3.3.1 Izolacija gliv 3.3.1.1 Filtracija

Grenčico smo filtrirali v volumnih po 20 ml preko Millipore membranskih filtrov (premer pore 0,45 µm) s filtrirnim sistemom. Te filtre smo s sterilno pinceto prenesli v 5.

paralelkah na gojišča (DG-18 + Ch, MEA + Ch) ter na 3 različna selekcijska gojišča (MEA + 3 M NaCl + Ch, MEA + 1.5 M MgCl2 + Ch in MEA + 1 M CaCl2 + Ch), in jih inkubirali 3 tedne pri 25°C.

3.3.1.2 Obogatitev v tekočih stresanih kulturah

V steklenice po Erlenmayerju s po 50 ml tekočega gojišča (ME + Ch – pH 7, ME + Ch – pH 3.5, ter YNB + Ch, CSL + Ch) smo dodali po 50 ml grenčice. Uporabili smo po 5 paralelk vsakega gojišča. Gojišča, smo inkubirali 7 dni pri 25°C v inkubatorju s stresanjem (do 180 obratov/min.). Po 7. dneh smo iz vseh paralelk gojišč naključno izbrali po 2 Erlenmayerjevi steklenici vsakega gojišča in iz njih odpipetirali in s sterilno spatulo razmazali po 100 µl brozge na celotno površino selekcijska gojišča (DG-18 + Ch, MEA + 1.5 M MgCl2 + Ch, MEA + 3 M NaCl + Ch), in sicer po 3 paralelke. Gojišča smo inkubirali 4 tedne.

3.3.1.3 Obogatitev v tekočih stacionarnih kulturah

Metodo imeovano redčenje oz. gojenje do ekstinkcije (»dilution to extinction« or

»extintion culturing«) smo priredili za vodne organizme in uporabili različna gojišča. V 5 mikrotiterskih ploščic s po 96 vdolbinicami po 1 ml smo odpipetirali 0,75 ml gojišča ( YNB + Ch – pH 7, YNB + Ch + pufer – pH 7.4, ME + Ch – pH 7, ME + Ch – pH 3.5) in 0,25 ml grenčice. Mikrotiterske ploščice smo ovili v polivinilne vrečke ter jih inkubirali pri 25 °C. Po 6. tednih inkubacije smo vsebine navidezno spremenjenih vsebin luknjic nacepili

na gojišče MEA + 10% NaCl (poglavje 3.1.1). Edino pri gojišču YNB + Ch + pufer (pH 7.4) smo po 21 dneh za vizualizacijo metabolne aktivnosti dodali 0,5 ml 200 µM raztopine barvila resazurin.

3.3.2 Izolacija čistih kultur

Vse izolacijske plošče (poglavje 3.3.1.) smo pregledovali po 7. dnevnih intervalih. Iz osnovnih izolacijskih plošč smo glive osamili na gojišče MEA + 10% NaCl. Način izolacije kultur je bil odvisno od njihove strukture (poglavje 3.3.2.1 in 3.3.2.2). Po končani izolaciji smo na novo pridobljene plošče zalepili s parafilmom in jih inkubirali pri temperaturi 25 °C.

3.3.2.1 Kvasovke

Kvasovke smo izolirali tako, da smo se s sterilno cepilno zanko dotaknili ţeljene kolonije, ter jo do posameznih kolonij v treh potezah nanesli na sveţe gojišče. Če kultura po 7 - 14 dneh ni bila čista smo postopek ponovili.

3.3.2.2 Filamentozne in sporulirajoče glive

Za izolacijo teh vrst gliv smo uporabili metodo prenosa spor s pomočjo agarne igle. Iz roba sveţega gojišča MEA + 10% NaCl smo odvzeli majhen košček (agarna igla) Z njim smo se previdno dotaknili sporulirajoče kolonije in jo nanesli po sredini sveţega gojišča. Tudi tu smo postopek ponovili, če kultura ni bila čista.

3.3.3 Fenotipska karakterizacija 3.3.3.1 Morfologija

3.3.3.1.1 Makromorfologija

Makromorfologijo izoliranih gliv smo opazovali pri 10 izbranih sevih: Aspergillus conicus (EXF-10868), Aspergillus jensenii (EXF-10891), Cladosporium sp. (aff. dominicanum) (EXF-10920), Hortaea werneckii (EXF-10942), Meyerozyma guilliermondii (EXF-11016), Penicillium bialowiezense (EXF-10871), Penicillium polonicum (EXF-10873), Phaeotheca triangularis (EXF-10945), Verrucocladosporium dirinae (EXF-10948) in Strobilurus esculentus (EXF-10973). Filamentozne in sporulirajoče kulture smo nacepili tritočkovno

na gojišče MEA s pripravljeno suspenzijo spor z raztopino SSS (poglavje 3.1.1), kvasovke pa s cepljenjem v treh potezah do posameznih kolonij. Gojišča smo inkubirali 14 dni pri 25

°C, nakar smo kulture pregledali in fotografirali.

3.3.3.1.2 Mikromorfologija

Poleg opazovanja makromorfologije izbranih sevov smo opazovali tudi mikromorfologijo, izbranih kultur, zato smo v ta namen pripravili poltrajne mikroskopske preparate v 60%

mlečni kislini. Mikroskopske preparate smo pregledali s svetlobnim mikroskopom z interferenčnim kontrastom in jih fotografirali z digitalno kamero.

3.3.4 Genotipska karakterizacija gliv 3.3.4.1 Izolacija genomske DNA

3.3.4.1.1 Kvasovke

Za izolacijo DNA kvasovk smo v sterilno 2 ml mikrocentrifugirko odpipetirali 40 µl kita za izolacijo DNA Prepman Ultra, vanj smo s sterilno cepilno zanko dodali majhno količino kvasnih celic. Mikrocentrifugirke smo v vodni kopeli inkubirali 10 minut pri 100°C. Po 10 minutah smo vzorce 5 minut centrifugirali pri 14000 obratov na minuto (16 873 g) in nato odpipetirali 40 µl supernatanta v sveţo 1.5 ml mikrocentrifugirko. Izolirano genomsko DNA smo shranili pri - 20 °C.

3.3.4.1.2 Filamentozne in sporulirajoče glive

Do izolacije DNA smo prišli s pomočjo mehanske lize s CTAB pufrom. V sterilno 20 ml mikrocentrifugirko smo dodali silikagelno mešanico (silikagel in sterilno kovinsko kroglico) in odpipetirali 500 µl CATB pufra (poglavje 3.1.2), ter s sterilno spatulo prenesli delček (1 cm²) glivnega micelija. Celice smo strli z uporabo homogenizatorja.

Homogenizirali smo 1 min pri 30 tresljajev na sekundo. Pridobljeni homogenat smo nato inkubirali v vodni kopeli 30 minut pri 65 °C. Po opravljeni inkubaciji smo v mikrocentrifugirko s homogenatom v digestoriju dodali 500 µl kloroforma in premešali na mešalu za 1-2 sekundi, ter mešanico centrifugirali 5 min pri 14 000 obratov na minuto.

Odpipetirali smo le zgornjo fazo (supernatant) v novo sterilno 1,5 ml mikrocentrifugirko in dodali 500 µl kloroforma, ter ponovno stresali na mešalu 1-2 sekundi in centrifugirali pri

enakih pogojih. Supernatant smo zopet odpipetirali v sveţo 1,5 ml mikrocentrifugirko in mu dodali dvakratni volumen ledenega 96 % etanola. Mikrocentrifugirko smo pazljivo ročno premešali in inkubirali pri temperaturi -20°C, ter jo pustili čez noč, da je prišlo do precipitacije DNA. Naslednji dan smo vzorec centrifugirali 5 minut pri 14000 obratih na minuto. Po centrifugiranju smo odpipetirali supernatant, pelet pa sprali s 500 µl ledenega 70 % etanolom in ponovno centrifugirali za 5 minut pri 14000 obratih na minuto. Zopet smo previdno odstranili celotni supernatant, pelet pa posušili v topli sobi do suhega, 45 minut, nato pa ga resuspendirali z 50 µl TE pufra (poglavje 3.1.2) in inkubirali 5-30 minut v vodni kopeli pri temperaturi 37 °C.

3.3.4.2 Veriţna reakcija s polimerazo (PCR)

V namen identifikacije smo pomnoţili odsek regije notranjih distančnikov 1 in 2 (ITS 1 in ITS 2) vključno s 5.8S rDNA (ITS rDNA). Uporabili smo nukleotidna začetnika ITS4 in ITS5 (White in sod., 1990). Za nekatere zelo pogosto pojavljajoče se rodove askomicetnih gliv (Aspergillus, Cladosporium, Penicillium) je ITS regia premalo variabilna, saj imajo različne vrste popolnoma enaka zaporedja (Zalar, 2015). V ta namen smo za identifikacijo osamljenih gliv do vrst poleg ITS regije pomnoţevali še druge predele genoma. V primeru identifikacije rodu Aspergillu in Penicillium smo z oligonukleotidnima začetkoma Ben2F (Hubka in Kolarik, 2012) in Bt2b (Glass in Donaldson, 1995) pomnoţevali beta tubulinsko regijo (BenA), pri rodu Cladosporium pa smo pomnoţili predel gena, ki kodira aktin regio (ACT), s primerjem ACT-512F in ACT-738R (Carbone in Kohn, 1999) in del zaporedja, ki kodira transkripcijski elongacijski faktor (EF-1α) z začetnikoma EF1-728F in EF1-986R (Carbone in Kohn, 1999). Zaporedja uporabljenih oligonukleotidnih začetnikov so navedena v preglednici 4.

Preglednica 4: Seznam uporabljenih oligonukleotidnih začetnikov in njihovih zaporedij.

Oligonukleotidni začetnik Zaporedje (5` - 3`)

ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC

ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G

Ben2F TCC AGA CTG GTC AGT GTG TAA

Bt2b ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC

ACT-512F ATG TGC AAG GCC GGT TTC GC

ACT-783R TAC GAG TCC TTC TGG CCC AT

EF1-728F CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG

EF1-986R TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC

Veriţno reakcijo s polimerazo (PCR) smo izvedli v 0.2 ml mikrocentrifugirkah. Na ledu smo pripravili mešanico reagentov (preglednica 5) potrebno za PCR in dodali 1 µl vzorčne DNA. Za negativno kontrolo smo odpipetirali sterilno bidestilirano vodo. Predel gena, ki kodira aktin, smo pomnoţevali z Fermentas mešanico Mastermix po navodilih proizvajalca. Nukleotidni začetniki, ki smo jih uporabili za pomnoţevanje razlličnih odsekov DNA, so navedeni v preglednici 4.

Preglednica 5: Priprava PCR mešanice za pomnoţitev 1 vzorca

MEŠANICA ZA POMNOŢEVANJE [µl]

REAGENT ITS EF1-α, BenA

Dd H2O 26,82 21,46

10× Taq pufer 3,5 3,5

Raztopina betaina 0 5,36

dNTP (AB) (10mM) 0,7 0,7

Primer 1(10pmol/µl) 1,4 1,4

Primer 2(10pmol/µl) 1,4 1,4

Dream Taq (5U/µl) 0,18 0,18

DNA 1 1

SUM 35 35

MEŠANICA ZA POMNOŢEVANJE [µl]

REAGENT Act; 9.8.16

Mastermix 17,5

voda 13,7

ACT-512F(10pmol/µl) 1,4

ACT-738R(10pmol/µl) 1,4

DNA 1

Sum 35

Preglednica 6: Program za podaljševanje verige.

TEMPERATURA (ITS, EF, BENA, ACT)

ČAS TRAJANJA POSAMEZNEGA

CIKLA

ŠTEVILO CIKLOV

95 °C (začetna denaturacija) 2 min

95 °C(denaturacija)

54/54/57/52 °C (vezava začetnih oligonukleotidov)

72 °C (podaljševanje verige)

45 s 30 s

2 min

30

72 °C(končno podaljševanje verige) 4 min

3.3.4.3 Gelska elektroforeza

Prisotnost in dolţino fragmentov pomnoţenih s PCR smo preverili z gelsko elektroforezo.

Za pripravo gela smo uporabili 0,8 g agaroze, 80 ml TAE pufra z barvilom SYBER safe.

Elektroforeza je potekala v 1 × TAE pufru. V rob gela, smo nanesli po 2 µl DNA lestvice, v ostale, pa po 4 µl vzorca pomnoţka, zmešanega z 2 µl nanašalnega pufra. V zadnjo luknjico pa smo odpipetirali negativno kontrolo. Celotna elektroforeza je potekala prib 20 min pod napetostjo 100-120 V. Po končanem postopku smo gel fotografirali in fotografijo obdelali na transiluminatorju z računalniškim programom UVI.

3.3.4.4 Določanje in obdelava nukleotidnega zaporedja

Nukleotidna zaporedja pomnoţenega dela DNA so določili v podjetju Microsynth (Avstrija) z DNA sekvenatorjem 3730xl, ki temelji na Sangerjevi metodi in kapilarni elektroforezi.

Nukleotidna zaporedja smo obdelali in poravnali s pomočjo računalniškega programa Clustal X (Larkin in sod., 2007) v programu Mega 5.2.2.(Tamura s sod., 2011) in našim nukleotidnim zaporedjem poiskali najsorodnejša zaporedja, iz baze podatkov GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) s spletnim programom BLAST (Basic Local Aligment Search Tool).

3.3.5 Shranjevanje izoliranih gliv

Vse seve, ki smo jih osamili iz grenčice Sečoveljskih solin, smo deponirali v mikrobiološko zbirko Ex-, ki je del Mreţe infrastrukturnih centrov Univerze v Ljubljani (MRICUL) in deluje v okvirju IC Mycosmo na Katedri za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov, na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani.

Seve kvasovk smo shranili v zamrzovalni skrinji pri - 80 °C v sistemu za shranjevanje mikroorganizmov »Mikrobank«, seve filamentoznih gliv pa na poševna PDA gojišča, ki so shranjena pri 4°C.

4 REZULTATI

Raziskovalno delo razen vzorčenja grenčice je bilo opravljeno v laboratorijih Katedre za molekularno genetiko in biologijo mikroorganizmov na Biotehniški fakulteti, Univerze v Ljubljani. Vzorčenje grenčice pa je potekalo v Sečoveljskih solinah, v tehnološkem laboratoriju podjetja Soline d.o.o..

4.1 REZULTATI ANALIZE SLANICE - MATIČNE LUŢINE OZ. GRENČICE k. št. 110100005081411

gostota (20°C) .……….…....1,2256 g/ml Cl^- .………...186,6 g/l Mg²⁺ ………...17,8 g/l Ca²⁺ ……….…...0,5 g/l SO42-

………...25,5 g/l pH (24.2°C) ………...7

elektroprevodnost (24.2°C) 207 mS/cm

4.2 OPIS IZOLACIJE KULTUR

Vzorčenje je potekalo z namenom, da bi iz grenčice (Sečoveljske soline, Slovenija) osamili čim večje število različnih vrst, kar nam bi dalo boljši vpogled v ekološko pestrost tega ekstremno slanega okolja. V ta namen smo uporabili 3 različne osamitvene tehnike, ki so potekale na različnih gojiščih. Celotno število sevov, ki smo jih osamili je bilo 120, rodov pa 15.

4.2.1 Filtracija

Metoda filtracije grenčice na različna gojišča (postopek v poglavju 3.3.1.1), se je izkazala za dokaj uspešno, saj smo jih od skupnega števila osamljenih sevov (120), s filtracijo osamili kar 63. Natančnejši vpogled na zastopanost vrst posameznih rodov dobljenih s filtracijo je v poglavju 4.3 (identifikacija izolatov).

Na gojišču DG-18 z dodatkom kloramfenikola nam je uspelo osamiti 15 kultur, od tega 7 različnih rodov (preglednica 7) in 9 vrst. Primeri osnovnih izolacijskih plošč tega gojišča

pridobljenih s filtracijo in rast kultur po 1., 2., in 3. tednu izolacije, so predstavljeni na sliki 1 (vrstica A).

Na osnovnem MEA gojišču z dodatkom kloramfenikola smo osamili le 4 kulture, od tega 3 različne rodove ( preglednica 7) in 3 različne vrste. Primeri osnovnih izolacijskih plošč tega gojišča pridobljenih s filtracijo in rast kultur po 1., 2., in 3. tednu izolacije, so predstavljeni na sliki 1 (vrstica B)

Ostalim MEA gojiščem smo dodali različne koncentracije različnih soli in v primeru gojišča MEA + 1.5 M MgCl2 + Ch, nam je uspelo osamiti 18 kultur, od tega 8 različnih rodov (preglednica 7) in 12 vrst. Primeri osnovnih izolacijskih plošč tega gojišča pridobljenih s filtracijo in rast kultur po 1., 2., in 3. tednu izolacije, so predstavljeni na sliki 1 (vrstica C).

Dodatek 3 M NaCl soli osnovnemu MEA gojišču, je prispeval k osamitvi 14 kultur, od teh 5 rodov (preglednica 7) in 9 vrst. Na sliki 1(vrstica D) je prikaz osnovnih izolacijskih plošč gojišča MEA + 3 M NaCl + Ch dobljenih s filtracijo in rast kultur po 1., 2., in 3. tednu izolacije.

Zadnje selekcijsko gojišče, ki smo ga uporabili pri filtraciji je bilo osnovno MEA gojišče z dodanim 1 M CaCl₂ in kloramfenikolom. Tudi na tem gojišču smo osamili kulture, ki jih je bilo 10, od tega 5 rodov (preglednica 7) in 8 vrst. Na sliki 1 (vrstica E) pa so prikazane osnovne izolacijske plošče gojišča MEA + 1 M CaCl2 + Ch, dobljenih s filtracijo in rast koltur po 1. tednu izolacije.

Slika 1: Osnovne izolacijske plošče po filtraciji.

A-1, A-2, A-3: gojišče DG-18 po 1.,2., in 3. tedenu po izolaciji B-1, B-2, B-3: gojišče MEA + Ch po 1.,2., in 3. tedenu po izolaciji

C-1, C-2, C-3: gojišče MEA + 1.5 M MgCl₂ + Ch po 1.,2., in 3. tedenu po izolaciji D-1, D-2, D-3: gojišče MEA + 3 M NaCl + Ch po 1.,2., in 3. tedenu po izolaciji E-1: gojišče MEA + 1M CaCl₂ + Ch po 1. tedenu po izolaciji

A-2

A-1 A-3

B-3 B-2

B-1

C-1 C-2 C-3

D-1 D-2 D-3

E-1