BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Petra KERN
UVAJANJE FUNKCIJSKIH TESTOV DELOVANJA CAR-T IN VITRO
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Petra KERN
UVAJANJE FUNKCIJSKIH TESTOV DELOVANJA CAR-T IN VITRO
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
INTRODUCTION OF FUNCTIONAL CAR-T ACTIVITY TESTS IN VITRO
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Biotehnologija. Delo je bilo opravljeno na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala doc. dr. Uroša Rajčevića.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Polona JAMNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: doc. dr. Uroš RAJČEVIĆ
Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino
Član: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum zagovora: 15. 7. 2021
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 606:616-006.6:602.68:602.621(043.2)
KG celična terapija, CAR-T, limfociti, elektroporacija, ELISA, citokini AV KERN, Petra
SA RAJČEVIĆ, Uroš (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN UVAJANJE FUNKCIJSKIH TESTOV DELOVANJA CAR-T IN VITRO TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja)
OP XI, 50 str., 11 pregl., 24 sl., 51 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Celična terapija s CAR-T se je v preteklih letih izkazala za eno najobetavnejših novih terapij za zdravljenje malignih obolenj. Zaradi uporabe bolniku lastnih (avtolognih) celic, ki predstavljajo spremenljiv dejavnik, se pojavlja potreba po in vitro testiranju aktivnosti celic CAR-T pred vnosom v pacienta. V magistrski nalogi smo s pomočjo elektroporacije v celično linijo humanih limfocitov T CD4+ vnesli receptor CAR anti-CD19 in reporterski protein GFP, nato smo dvojno pozitivne celice ločili s pomočjo FACS in tako dobili homogeno celično kulturo. Celice CAR-T smo izpostavili antigenu CD19. Gojili smo jih v kokulturi s celično linijo humanih limfocitov B, ki izražajo ta antigen. Po 48 urah kokultivacije smo v supernatantu celične kokulture s pomočjo posrednega testa ELISA določali koncentracijo citokinov IL-2, TNF-alfa in IFN-gama. Citokini v supernatanu kokulture so pokazatelj aktivacije celic CAR-T z antigenom CD-19. Celice smo prešteli s pomočjo Bürker – Türkove števne komore pod fluorescentnim in pod svetlobnim mikroskopom, da bi ugotovili, kako se je spremenilo število celic in razmerje med efektorskimi (celice CAR-T, ki zeleno fluorescirajo) in tarčnimi celicami (limfociti B, ki ne fluorescirajo). Z optimalnimi pogoji elektroporacije smo dosegli, da je 22,1 % živih celic izražalo CAR in GFP. V 48 urah kokultivacije se razmerje med efektorskimi in tarčnimi celicami ni spremenilo, prav tako se ni spremenila končna skupna koncentracija celic. Statistično značilno razliko v izločanju citokinov IL-2 in TNF-alfa smo opazili pri razmerju efektorskih in tarčnih celic 1:1. Izločanja IFN-gama z našim testom nismo zaznali. Pokazali smo, da je kokultivacija celic CAR-T skupaj s specifičnim antigenom povzročila izločanje citokinov, ki jih lahko kvantitativno določimo z indirektnim testom ELISA in s tem posredno ovrednotimo pričakovano učinkovitost terapije.
KEY WORDS DOCUMENTATION
ND Du2
DC UDC 606:616-006.6:602.68:602.621(043.2)
CX cell therapy, CAR-T, lymphocytes, electroporation, ELISA, cytokines AU KERN, Petra
AA RAJČEVIĆ, Uroš (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI INTRODUCTION OF FUNCTIONAL CAR-T ACTIVITY TESTS IN VITRO DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes)
NO XI, 50 p., 11 tab., 24 fig., 51 ref.
LA sl AL sl/en
AB CAR-T cell therapy is one of the most promising new therapies for treatment of malignancies. Because of the use of autologous cells, which are a variable factor, there is a need for in vitro testing of CAR-T cell activity prior to aplication to patient. In the thesis, electroporation was used to insert anti-CD19 CAR receptor and reporter protein GFP into CD4+ human lymphocyte cell line. Next, double positive cells were sorted using fluorescence-assisted cell sorting to acquire a homogenous cell culture. CAR-T cells were then exposed to the antigen CD19 present on human B-cell line. We cocultured both cell lines for 48 hours. Using an indirect ELISA test, we then determined the concentration of cytokines IL-2, TNF- alpha, and IFN-gamma in the cell culture supernatant. Cytokines in the coculture supernatant indicate that activation of CAR-T cells via CD-19 antigen was successful. Cells were counted using Bürker – Türk counting chamber to determine how the number of cells in the culture and the ratio between effector (fluorescent CAR-T cells) and target cells (B-cells) has changed. With optimised electroporation parameters we accomplished expression of CAR and GFP proteins in 22,1 % of live cells. In the 48 hours of cocultivation the ratio between effector and target cells did not change. The density of cell culture did not differ between test and control.
Statistically significant difference in cytokine IL-2 and TNF-alpha secretion was observed in effector and target cell ratio of 1:1. Secretion of IFN-gamma cytokine was not detected. We showed that cocultivating CAR-T cells with their specific antigen causes activation of the cells and secretion of cytokines which can be quantitatively measured using indirect ELISA test. The results can be used to indirectly predict the efficacy of cell therapy.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA IIII
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA 1
1.2 CILJI NALOGE 1
1.3 DELOVNE HIPOTEZE 1
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 ENOJEDRNE CELICE PERIFERNE KRVI 3
2.1.1 Limfociti T 3
2.1.2 Limfociti B 4
2.2 CAR-T IMUNOTERAPIJA 4
2.2.1 Struktura in delovanje konstrukta CAR 5
2.2.2 Metode vnosa genskega konstrukta CAR 6
2.2.2.1 Virusne metode 7
2.2.2.2 Nevirusne metode 8
2.2.2.3 Prehodno in stalno izražanje 10
3 MATERIALI IN METODE 11
3.1 MATERIALI 11
3.1.1 Aparature in pripomočki 11
3.1.2 Kemikalije 12
3.2 METODE 12
3.2.1 Priprava kulture enojedrnih celic periferne krvi iz levkocitnega
pripravka 12
3.2.2 Štetje in določanje viabilnosti PBMC 14
3.2.3 Gojenje celičnih kultur 15
3.2.4 Zamrzovanje celičnih kultur 15
3.2.5 Odmrzovanje celičnih kultur 16
3.2.6 Namnoževanje in izolacija plazmidov 16
3.2.7 Kontrola kvalitete 16
3.2.8 Elektroporacija 17
3.2.9 Analiza s pretočnim citometrom 20
3.2.10 In vitro funkcijski test aktivnosti celic 23
3.2.10.1 Kokultivacija 23
3.2.10.2 Test ELISA za določanje koncentracij IL-2, TNF-alfa in IFN-gama 24 3.2.10.3 Štetje celic in določanje razmerij po kokultivaciji 24
3.2.11 Statistična obdelava podatkov 25
4 REZULTATI 26
4.1 KONTROLA KVALITETE DNA 26
4.1.1 Koncentracija in čistost DNA 26
4.1.2 Gelska elektroforeza 26
4.2 VIABILNOST PBMC PO IZOLACIJI 27
4.3 ELEKTROPORACIJA 28
4.3.1 Elektroporacija Jurkat s transpozonom EF1α GFP p007G PB 28 4.3.2 Elektroporacija celic HEK 293T/17 s transpozonom P007G EF1α
scFvCD19_4-1BB_CD3ζ_p2A_GFP 28
4.3.3 Elektroporacija celic Jurkat s transpozonom P007G EF1α scFvCD19_4-
1BB_CD3ζ_p2A_GFP 29
4.3.4 Elektroporacija PBMC s transpozonom P007G EF1α scFvCD19_4-
1BB_CD3ζ_p2A_GFP 30
4.4 ANALIZA S PRETOČNIM CITOMETROM 31
4.5 TEST AKTIVNOSTI 33
4.5.1 Koncentracije celic in razmerja po kokultivaciji 33
4.5.2 Testa ELISA 33
4.5.2.1 Analiza izločanja IL-2 34
4.5.2.2 Analiza izločanja TNF-alfa 35
4.5.2.3 Analiza izločanja IFN-gama 36
5 RAZPRAVA 37
6 SKLEPI 43
7 POVZETEK 44
8 VIRI 46
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Uporabljene kemikalije s pripadajočimi proizvajalci. 12
Preglednica 2: Sestava pufra PBS (pH=7,2). 13
Preglednica 3: Optimizacija pogojev elektroporacije celične linije HEK293T/17. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v
nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5
µg DNA transpozaze. 18
Preglednica 4: Optimizacija pogojev elektroporacije celične linije Jurkat. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5 µg DNA
transpozaze. 19
Preglednica 5: Pogoji elektroporacije HEK 293T/17 z anti-CD19 CAR/GFP plazmidom.
Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5
µg DNA transpozaze. 19
Preglednica 6: Pogoji elektroporacije Jurkat z anti-CD19 CAR/GFP plazmidom. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v
nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5
µg DNA transpozaze. 19
Preglednica 7: Pogoji elektroporacije PBMC z anti-CD19 CAR/GFP plazmidom. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5
µg DNA transpozaze. 20
Preglednica 8: Postavitev poskusa kokultivacije. 23
Preglednica 9: Postavitev testa ELISA na mikrotiterski plošči. 25 Preglednica 10: Koncentracija plazmidne DNA in razmerja absorbanc izmerjena
spektrofotometrično. 26
Preglednica 11: Povprečne koncentracije celičnih kultur in kokultur po 48 urah gojenja. 33
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Glavni koraki pri izdelavi celic CAR-T s primeri tehnologij in naprav (Wang in
Riviere, 2016: 2). 5
Slika 2: Strukturne domene receptorjev in njihovo poimenovanje (Chang in Chen, 2017:
431). 6
Slika 3: Ločen transgen in virusni proteini za vnos transgena v genom gostiteljske celice
(Anson, 2004). 7
Slika 4: Povečanje permeabilnosti lipidnega dvosloja zaradi vpliva električnega polja (Kotnik in sod., 2019). (a) Nastanek metastabilne hidrofilne pore. (b) Kemijske spremembe membranskih lipidov povečajo prehodnost membrane za vodo, ione in male molekule. (c) Električno polje spremeni delovanje membranskih proteinov (na sliki kanalček odvisen od naboja). Dolžina rdečih puščic na sliki ponazarja jakost električnega polja. 8 Slika 5: Mehanizem delovanja PiggyBac transpozona (Poseida Therapeutics, 2020).
Transgen znotraj regij ITR se izreže iz plazmida s pomočjo transpozaze PiggyBac, ki ga
nato vstavi na naključno TTAA mesto v genomski DNA. 9
Slika 6: Pred centrifugiranjem: zgornja rdeča plast - razredčen levkocitni pripravek,
spodnja bistra plast - gostotni gradient Histopaque. 13
Slika 7: Po centrifugiranju: zgornja plast - plazma, plast "Buffy Coat"- PBMC, plast
Histopaque, posedli eritrociti in preostanek drugih celic. 14 Slika 8: Transfekcijski sistem Neon, 1 Transfekcijska naprava, 2 pipetna postaja, 3
elektroporacijska kiveta, 4 pipeta, 5 pufri, 6 nastavki (Thermofisher.com, 2021). 17 Slika 9: Princip delovanja pretočnega citometra in celičnega ločevalca (Ibrahim in van den Engh, 2007). Celice v tankem curku potujejo mimo laserja v koloni. Senzorji zaznajo odboje svetlobe in fluorescenco vsake celice (vrh skice). V nadaljevanju poti se celice v električnem polju ločujejo tako, da posamezne populacije ločimo od tistih, ki niso zaželene
in gredo v odpad. 21
Slika 10: Postopek določanja lastnosti celic v suspenziji. Označena skupina celic na prvem grafu prikazuje celice ustrezne velikosti in granuliranosti. Tako smo izbrali homogeno skupino celic. Označene celice na drugem grafu so le posamezne celice izbrane homogene skupine. Iz te skupine smo izločili skupke celic. Tretji graf prikazuje homogeno populacijo živih celic. Žive so tiste celice, v katerih ne zaznamo barvila 7-AAD. 22 Slika 11: Princip posrednega ELISA testa za določanje specifičnih proteinov v vzorcu
(MBL Life Science, 2021). 24
Slika 12: Plazmidi po gelski elektroforezi na agaroznem gelu, 1.stolpec: standard, 2. in 3.
stolpec: PiggyBac plazmid, 4. in 5. stolpec: CAR GFP plazmid, 6. stolpec: standard. 27
Slika 13: Viabilnost PBMC v dnevih po izolaciji. Graf prikazuje viabilnost PBMC od časa
po izolaciji. 27
Slika 14: Celična linija Jurkat elektroporirana s plazmidom EF1α GFP p007G PB. Slika posneta 4 dni po elektroporaciji (400 – kratna povečava). 28 Slika 15: Celična linija HEK 293 T/17 elektroporirana s plazmidom P007G EF1α
scFvCD19_4-1BB_CD3ζ_p2A_GFP. Slika posneta 3 dni po elektroporaciji (400 – kratna
povečava). 29
Slika 16: Celična linija Jurkat elektroporirana s plazmidom P007G EF1α scFvCD19_4- 1BB_CD3ζ_p2A_GFP. Slika posneta en dan po elektroporaciji (400 – kratna povečava). 30 Slika 17: Levo: PBMC 24 ur po elektroporaciji s plazmidom anti-CD19 CAR/GFP, pri pogojih 2500 V, 15 ms, 1 pulz. Desno: PBMC 24 ur po elektroporaciji s plazmidom anti- CD19 CAR/GFP, pri pogojih 2450 V, 15 ms, 1 pulz (100 – kratna povečava). 30 Slika 18: Graf določanja dvojno pozitivnih celic. V kvadratu desno zgoraj so označene
celice, ki izražajo receptor CAR in GFP. 31
Slika 19: Postopek izbire dvojno pozitivnih celic iz celotne populacije. Dvojno pozitivnih celic je 16,7 % vseh celic, oziroma 22,1 % živih celic. 31 Slika 20: Celice Jurkat, ki izražajo konstrukt CAR in GFP pod fluorescentnim
mikroskopom pred ločevanjem. Opazimo lahko, da fluorescira le del celic (400 – kratna
povečava). 32
Slika 21: Celice Jurkat, ki izražajo konstrukt CAR in GFP pod fluorescentnim
mikroskopom po ločevanju. Fotografija posneta nekaj dni po ločevanju. Opazimo, da po ločevanju fluorescirajo skoraj vse celice. Fluorescirajo skupki celic, kar nakazuje na dejstvo, da je izražanje transgenov stalno in prisotno tudi po ločevanju (400 – kratna
povečava). 32
Slika 22: Primer umeritvenih krivulj za izračun koncentracij IL-2 v vzorcih. 34 Slika 23: Graf prikazuje povprečne koncentracije IL-2 v vzorcih s pripadajočimi
standardnimi odkloni. Koncentracija IL-2 v supernatantu celične kulture po 48 urah
gojenja. 35
Slika 24: Graf prikazuje povprečne koncentracije TNF-alfa v vzorcih s pripadajočimi standardnimi odkloni. Koncentracija TNF-alfa v supernatantu celične kulture po 48 urah
gojenja. 36
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI 4-1BB kostimulatorni receptor značilen za limfocite T 7-AAD 7-aminoaktinomicin D
5-AzaC 5-azacitidin
BCR B-celični receptor (ang. B cell receptor) B-ALL B-celična akutna limfoblastna levkemija
CAR himerni receptor za antigen (ang. chimeric antigen receptor)
CD celični površinski označevalci, označevalci diferenciacije (ang. Clusters of differentiation)
CD3 T-celični koreceptor, značilen za limfocite T
CD4 glikoproteinski koreceptor, značilen za celice pomagalke CD8 glikoproteinski koreceptor, značilen za celice ubijalke CD19 membranski glikoprotein, značilen za limfocite B
CD28 membranski glikoprotein, značilen za diferencirane limfocite T CD4 in CD8 CRISPR gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (ang.
clustered regularly interspaced short palindromic repeats) DH5α kompetentne celice Escherichia coli
DLBCL velikocelični difuzni limfom (ang. diffuse large B-cell lymphoma) DMSO dimetilsulfoksid
DPBS Dulbeccov fostatni pufer s soljo (ang. Dulbecco's phosphate – buffered saline)
dsDNA dvoverižna deoksiribonukleinska kislina (ang. double stranded deoxyribonucleic acid).
EDTA etilendiamintetraocetna kislina
ELISA encimskoimunski test (ang. enzyme-linked immunosorbent assay)
FACS fluorescenčno aktivirano celično ločevanje (ang. fluorescence-activated cell sorting)
FBS fetalni goveji serum (ang. fetal bovine serum)
FDA Ameriška vladni urad za hrano in zdravila (ang. US Food and Drug Administration)
FITC fluorescein izotiocianat (ang. fluorescein isothiocyanate) GFP zeleni fluorescentni protein (ang. green fluorescent protein) IFN-gama interferon gama
IgA protitelesa razreda A (ang. immunoglobulins A)
IgD protitelesa razreda D (ang. immunoglobulins D) IgE protitelesa razreda E (ang. immunoglobulins E) IgG protitelesa razreda G (ang. immunoglobulins G) IgM protitelesa razreda M (ang. immunoglobulins M) IL-2 interlevkin-2
IL-4 interlevkin-4 IL-15 interlevkin-15
ITAM imuno-tirozinski aktivacijski motivi (ang. immuno-tyrosine activation motifs)
ITR obrnjena ponavljajoče se zaporedja ( ang. inverted terminal repeats) LB medij za gojenje bakterij Luria-Bertani
LTR dolga ponavljajoča se zaporedja (ang. long terminal repeats)
MHC poglavitni histokompatibilnostni kompleks (ang. major histocompatibility complex)
mRNA informacijska ribonukleinska kislina (ang. messenger ribonucleic acid) PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction)
PBMC enojedrne celice periferne krvi (ang. peripheral blood mononuclear cells) PBS fosfatni pufer s soljo (ang. phosphate – buffered saline)
PB transpozaza »PiggyBac«
q-PCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo (ang. quantitative polymerase chain reaction)
scFv enoverižni fragment variabilne domene protitelesa (ang. single-chain variable fragment)
T25 gojitvena posodica s površino 25 cm2 T75 gojitvena posodica s površino 75 cm2 TBE pufer Tris/Borat/EDTA
Th1 celice T pomagalke tipa 1 (ang. T helper type 1) Th2 celice T pomagalke tipa 2 (ang. T helper type 2) TLR T-celični receptor (ang. T cell receptor)
TMB tetrametil bendizin
TNF-alfa faktor tumorske nekroze alfa (ang. tumor necrosis factor alpha) TSA trihostatin A
ZTM Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino
1 UVOD
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Terapije s specifičnimi imunskimi celicami (ang. adoptive cell therapy) so nov biotehnološki pristop k zdravljenju predvsem malignih bolezni. Ena takih terapij je tudi zdravljenje s spremenjenimi limfociti T, ki izražajo himerni receptor za tumorske antigene (ang. Chimeric Antigen Receptor T-cell, CAR-T). Za najobetavnejše se je izkazalo zdravljenje hematoloških malignosti s spremenjenimi limfociti T, ki izražajo konstrukt CAR, ki prepoznava antigen CD-19 (Rohaan in sod., 2019).
Pri CAR-T terapiji gre za personalizirano zdravljenje, saj za pripravo spremenjenih limfocitov T uporabimo pacientu lastne (avtologne) celice, ki jim nato vnesemo genski konstrukt za receptor CAR. Z uporabo pacientu lastnih celic omejimo možnost imunskega odziva na prejeto terapijo, hkrati s tem pa moramo upoštevati, da so med posameznimi pacienti razlike (starost, genetske predispozicije, tip rakavega obolenja idr.), ki lahko vplivajo na učinkovitost terapije. Zato potrebujemo teste, s katerimi bi lahko v in vitro pogojih testirali učinkovitost terapevtskih celic preden le-te vnesemo v pacienta. Da je terapija uspešna, morajo avtologne celice CAR-T v telesu prepoznati antigen in se nanj odzvati z izvajanjem svoje efektorske funkcije, t.j. izločanjem citokinov, citolitični učinek.
1.2 CILJI NALOGE
Cilj magistrske naloge je bil uvesti in vitro funkcijski test za določanje učinkovitosti aktivacije limfocitov T s konstruktom CAR, ob izpostavitvi specifičnemu antigenu. Za začetek smo želeli s pomočjo elektrogenskega transferja vnesti konstrukt CAR v limfocite T, ki smo jih izolirali iz krvi pacientov, in celično linijo Jurkat, ki je imortalizirana celična linija humanih limfocitov T CD4+. V nadaljevanju smo želeli preveriti izražanje konstrukta CAR s pretočnim citometrom. Na koncu smo želeli s pomočjo kokultivacije CAR-T in limfocitov B preveriti aktivacijo celic CAR-T s specifičnim antigenom na limfocitih B – CD19. S pomočjo testa ELISA smo želeli kvantificirati količino citokinov interlevkina 2 (IL-2), tumorskega faktorja nekroze alfa (TNF-alfa) in interferona gama (IFN-gama), ki se sprostijo ob aktivaciji limfocitov T CD4+.
1.3 DELOVNE HIPOTEZE
• S pomočjo elektrogenskega transferja lahko vnesemo konstrukt CAR v humane celice PBMC in celično linijo Jurkat,
• Z vnosom transpozaze in konstrukta CAR v transpozonski obliki lahko dosežemo stabilno izražanje,
• S kokultivacijo limfocitov T s konstruktom CAR proti antigenu CD19 in limfocitov B, ki izražajo CD19, lahko dosežemo specifično aktivacijo limfocitov CAR-T,
• S pomočjo testa ELISA lahko zaznamo in kvantificiramo pri aktivaciji izločene citokine.
2 PREGLED OBJAV
2.1 ENOJEDRNE CELICE PERIFERNE KRVI
Enojedrne celice periferne krvi (ang. Periferal Blood Mononuclear Cell, PBMC) so pomemben del imunskega sistema. Okarakteriziramo jih kot vse celice, ki se nahajajo v krvi in imajo okroglo jedro. Mednje sodijo limfociti T, limfociti B, makrofagi, dendritične celice, celice naravne ubijalke, monociti in matične celice. Ker je njihovo pridobivanje preprosto in so na voljo v velikem številu pri darovalcih krvi, se pogosto uporabljajo za raziskave imunskega odziva (Pourahmad in Salimi, 2015).
Večino PBMC predstavljajo limfociti (70-90 %), CD3+ celice oz. limfociti T predstavljajo 45-70 % PBMC, od tega je 25-60 % CD4+ limfocitov T in 5-30 % CD8+ limfocitov T.
Limfociti B predstavljajo 5-15 %, celice naravne ubijalke 5-10 %, dendritične celice 1-2 % in matične celice 0,1-0,2 % celic PBMC (Stemexpress.com, 2020).
2.1.1 Limfociti T
Limfociti T izvirajo iz hematopoetskih matičnih celic, iz katerih se preko limfoidne linije razvijejo v zrele limfocite. Med procesom zorenja migrirajo v timus, kjer dozorijo, se selekcionirajo in eksportirajo v periferijo. Periferne limfocite T predstavljajo različni podtipi celic kot so naivne, spominske in regulatorne celice T (Kumar in sod., 2018).
Limfociti T so glavni del specifične celično posredovane imunosti. Njihova vloga pri imunskem odzivu se začne tako, da s svojimi T-celičnimi receptorji (ang. T-cell receptor, TCR) prepoznavajo peptidne antigene, predstavljene v kompleksih MHC (ang. Major Histocompatibility Complex)(Restifo in sod., 2012). Ko se naivna celica sreča s svojim antigenom in s kostimulatornimi molekulami, izraženimi na antigen predstavitvenih celicah, začne izločati interlevkin 2 (IL-2), proliferira in se diferencira v efektorske celice, ki migrirajo po telesu (Kumar in sod., 2018).
Limfocite T v grobem delimo na CD4+ (pomagalke) in CD8+ (ubijalke) limfocite T.
Skupini se razlikujeta po kostimulatorni domeni, ki se veže na kompleks MHC.
Kostimulatorna domena CD4 se veže na MHC II, kostimulatorna domena CD8 pa se veže na MHC I antigen-predstavitvenih celic. Sočasna vezava kostimulatorne domene CD4 ali CD8 in TCR na MHC kompleks potencira izločanje IL-2 (Miceli in Parnes, 1991). Prav tako se podskupini razlikujeta v svoji funkciji. Naivne celice CD4+ se po aktivaciji diferencirajo v celice T pomagalke 1 (Th1), ki izločajo IFN-gama, in celice T pomagalke 2 (Th2), ki izločajo IL-4. Th1 so ključne pri obrambi pred vrsto intracelularnih infekcij, Th2 pa nas ščitijo pred nekaterimi ekstracelularnimi infekcijami. Zrele celice CD8+ pa svoje efektorske funkcije izvajajo preko produkcije citokinov (npr. TNF-alfa in IFN-gama) in s citolitičnimi mehanizmi (Seder in Ahmed, 2003).
2.1.2 Limfociti B
Limfociti B in protitelesa, ki jih ti izločajo so eden glavnih delov pridobljene imunosti.
Limfociti B se prav tako kot limfociti T razvijejo preko limfoidne linije iz hematopoetskih matičnih celic. Tekom zorenja se razvije specifika imunoglobulinov in izrazijo se določeni površinski antigeni. Specifika posamezne celice B je določena s protitelesi, ki jih ta izraža.
Protitelesa, specifična za različne antigene, nastanejo v celicah B z rekombinacijo segmentov V, (D) in J težkih in lahkih verig imunoglobulinov (Kurosaki, 2010). Pri rekombinaciji segmentov sodelujeta proteina RAG-1 in RAG2 (Recombination Activating Gene 1 in 2), ki podobno rekombinacijo verig opravljata tudi pri določanju specifike TCR (Akamatsu in Oettinger, 1998). Pri nadaljnjem zorenju limfocitov B, ko se ti že srečajo z antigenom, pride do preklopa težkih verig imunoglobulinov. Pri zamenjavi konstante regije IgM ali IgD z IgG, IgA ali IgE konstantno regijo, protitelesa pridobijo nove efektorske funkcije, vezane na konstantno regijo in s tem povečajo učinkovitost imunskega odgovora pri odstranjevanju patogena (Cerutti in sod., 2005).
Med razvojem limfocitov B se na njihovi površini pojavi marker CD19 (ang. Cluster of differentiation 19). CD19 je transmembranski glikoprotein, ki spada v družino imunoglobulinov. CD19 deluje kot del multimolekularnega kompleksa na površini celic, ki regulira prevajanje signalov v notranjost celice. Predstavlja tudi biomarker za normalne in neoplastične celice B, saj se začne izražati med procesom reorganizacije fragmentov imunoglobulinskih genov in se izraža do končne diferenciacije v plazmatke (Wang in sod., 2012). CD19 predstavlja zelo dobro antigensko tarčo pri zdravljenju B-celičnih malignosti, ker se izraža skoraj izključno na limfocitih B, skozi skoraj vse stopnje razvoja in ne glede na malignost celic (Mohty in sod., 2019).
2.2 CAR-T IMUNOTERAPIJA
Imunoterapija s CAR-T je eden od modernih pristopov za zdravljenje malignih bolezni, ki temeljijo na prilagojenih celicah. V principu terapija poteka tako, da pacientu preko procesa levkofereze (odvzema levkocitne frakcije krvnih celic) odvzamemo del limfocitov T, ki jih nato lahko dodatno selekcioniramo, če želimo uporabiti določene podtipe. Celice nato in vitro aktiviramo s pomočjo umetnih antigen predstavitvenih celic, kroglic, prevlečenih s protitelesi ali posebnimi reagenti. Sledi vnos genskega zapisa za konstrukt CAR in kultivacija spremenjenih celic do zadostne količine, ki je potrebna za terapevtski učinek. Nato spremenjene limfocite T preko transfuzije vrnemo pacientu, kjer opremljene z receptorjem za prepoznavo rakavih celic opravijo svojo funkcijo (Wang in Riviere, 2016) (Slika 1). Celice CAR-T ob vrnitvi v pacienta prepoznajo antigen na površini tumorskih celic, se aktivirajo in pri tem izločajo citokine, ki sprožijo imunski odgovor pri drugih imunskih celicah in hkrati delujejo direktno na tumor.
Slika 1: Glavni koraki pri izdelavi celic CAR-T s primeri tehnologij in naprav (Wang in Riviere, 2016: 2).
Terapija se je izkazala za zelo uspešno, predvsem pri zdravljenju krvnih rakov.
Najuspešnejše so celice CAR-T z receptorjem za antigen CD19, ki se jih uporablja za zdravljenje B-celične akutne limfoblastične levkemije (B-ALL)(Frey, 2017). CAR-T celična terapija druge generacije je pokazala več kot 85 % uspešnost pri več kliničnih študijah za zdravljenje B-ALL (Chang in Chen, 2017).
2.2.1 Struktura in delovanje konstrukta CAR
Konstrukt CAR je himerni protein sestavljen iz različnih delov, ki imajo vsak svojo funkcijo. Za specifičnost receptorja je najpomembnejša ekstracelularna vezavna domena, ki se specifično veže na antigen. Navadno se uporablja scFv (ang. Single Chain Variable Fragment), ki ga sestavljata variabilni regiji težke in lahke verige protitelesa povezani s povezovalno peptidno sekvenco. ScFv je nato preko povezovalne domene povezana s transmembransko domeno, katere funkcija je sidranje receptorja v membrano. Kot povezovalno oz. transmembransko domeno se navadno uporabljajo ekstracelularni oz.
transmembranski fragmenti CD4, CD8 ali CD28. Na znotrajceličnem delu receptorja sta dodani ena ali dve kostimulatorni domeni. Najpogosteje se uporabljata kostimulatorni domeni 4-1BB in CD28. Pomemben del receptorja je tudi aktivacijska domena z motivom ITAM (ang. Immunoreceptor Tyrosin-Based Activation Motif), ki je nujen za iniciacijo prenosa aktivacijskega signala v celico (Chang in Chen, 2017; Slika 2).
Raziskovalci so doslej razvili več generacij receptorjev CAR. Receptorji prve generacije so sestavljeni iz scFv, povezovalne domene, transmembranske domene in aktivacijske domene, ne vsebujejo pa kosimulatorne domene, ključne za popolno aktivacijo limfocitov.
Tako imenovani receptorji druge generacije vsebujejo eno kostimulatorno domeno, 4-1BB ali CD28, receptorji tretje generacije pa vsebujejo obe kostimulatorni domeni (Harris in Kranz, 2016; Slika 2).
Pri svojem delovanju se celice CAR-T zanašajo na prepoznavanje antigenov, ki so prisotni na tumorskih celicah, kot ga opravljajo limfociti B in na efektorsko funkcijo, kot jo opravljajo limfociti T. Receptorji CAR imajo visoko afiniteto vezave na antigen, ne da je ta predstavljen v kompleksu MHC, torej sami prepoznajo antigen podobno kot BCR (Chang in Chen, 2017). Aktivacija celice preko receptorja CAR poteka preko fosforilacije motiva ITAM, ki sproži izločanje citokinov in citolitično funkcijo limfocitov T. Izločanje široke palete citokinov je glavna efektorska funkcija limfocitov T CD4+, ki preko citokinov aktivirajo druge celice imunskega sistema, npr. makrofage, limfocite B (Golubovskaya in Wu, 2016).
Slika 2: Strukturne domene receptorjev in njihovo poimenovanje (Chang in Chen, 2017: 431).
2.2.2 Metode vnosa genskega konstrukta CAR
Za vnos genskega konstrukta CAR uporabljamo različne metode vnosa. Metode vnosa genskega materiala v splošnem delimo na biološke (virusne) in nebiološke. Po trajanju izražanja konstrukta pa metode delimo na metode s prehodnimo in stalnim izražanjem.
Najpogosteje se pri CAR-T uporabljajo lentivirusni vektorji, gama retrovirusni vektorji, sistem transpozon/transpozaza in vnos mRNA.
2.2.2.1 Virusne metode
Virusni sistemi, ki se najpogosteje uporabljajo pri vnosu konstrukta CAR so retrovirusni vektorji, natančneje lentivirusni in gama retrovirusni vektorji. Prednost virusnih sistemov je prenos velikih konstruktov in stabilna integracija le-teh v genom tarčnih celic ter trajno izražanje zapisa. Za retroviruse je značilen reverzni prepis iz RNA v dsDNA. Virusni sistemi imajo odstranjene virusne gene (gag, env, pol) na njihovo mesto med obe regiji LTR pa lahko vnesemo transgen. S tem onemogočimo podvojevanje virusa in njegovo sposobnost integracije genskega materiala v genom gostiteljske celice, zato moramo v kulturo dodati še drugi, pomožni vektor s temi geni. Pri procesu integracije pa pride le do integracije transgena, saj je le transgen vstavljen med regiji LTR (Anson, 2004; Slika 3).
Preden se virusni sistemi lahko uporabijo v kliniki, je potrebno dokazati, da je virus nesposoben samopodvojevnja in ni genotoksičen ali imunogen (Morgan in Boyerinas, 2016).
Slika 3: Ločen transgen in virusni proteini za vnos transgena v genom gostiteljske celice (Anson, 2004).
Gama retrovirusni vektorji so zelo učinkoviti prenašalci genskega materiala, saj lahko skoraj celoten genom virusa zamenjamo z insertom, ki se po transdukciji integrira v genom gostiteljske celice. Prav iz tega razloga so bili gama retrovirusni vektorji prvi uporabljeni kot napredni sistemi za pakiranje in prenos genskega materiala (Morgan in Boyerinas, 2016).
Drugi virusni sistem, ki se široko uporablja so lentivirusni vektorji. Za razliko od gama retrovirusov lahko lentivirusi okužijo tudi celice, ki se ne delijo. Prav tako zagotavljajo visoko učinkovitost prenosa genov in stabilno izražanje insertov (Wang in Riviere, 2016).
2.2.2.2 Nevirusne metode
Pri nevirusnih metodah vnosa genskega materiala v celice, gre najprej za vnos golih nukleinskih kislin v celico z integracijo materiala v genom ali brez nje. Za vnos nukleinskih kislin v celice oz. njihova jedra uporabljamo različne fizikalne metode, kot so elektroporacija, sonoporacija, biolistika, mikroinjeciranje idr. Nukleinske kisline lahko zapakiramo v nevirusne vektorje kot so npr. lipidi ali polimeri, ki zaščitijo nukleinske kisline pred razgradnjo izven celice in omogočajo lažji prehod v celico (Bono in sod., 2020). Za integracijo genskega materiala v genom pa uporabljamo sistem transpozon/transpozaza ali metode preurejanja genoma, npr. CRISPR/Cas9.
Elektroporacija je najbolj razširjen način vnosa nukleinskih kislin (RNA, DNA, plazmidov) v bakterije, rastlinske in živalske celice. Elektroporacija je proces, pri katerem kratki električni pulzi prehodno ustvarijo pore v celični membrani, preko katerih lahko nukleinske kisline vstopajo v citoplazmo in v celično jedro (Kumar, 2019). Celice vzdržujejo razliko v električnem potencialu med zunanjo in notranjo stranjo svoje celične membrane. Temu potencialu rečemo mirovni membranski potencial, ki pri evkariontskih celicah znaša od -40 do -70 mV. Če celice izpostavimo zunanjemu električnemu polju, to spremeni membranski potencial in poveča permeabilnost membrane. Permeabilnost se spremeni preko več različnih mehanizmov (Kotnik in sod., 2019; Slika 4).
Slika 4: Povečanje permeabilnosti lipidnega dvosloja zaradi vpliva električnega polja (Kotnik in sod., 2019).
(a) Nastanek metastabilne hidrofilne pore. (b) Kemijske spremembe membranskih lipidov povečajo prehodnost membrane za vodo, ione in male molekule. (c) Električno polje spremeni delovanje membranskih proteinov (na sliki kanalček odvisen od naboja). Dolžina rdečih puščic na sliki ponazarja jakost električnega polja.
Ob vplivu zunanjega električnega polja se permeabilnost membrane poveča na tri načine (Slika 4). (a) Vodne molekule predrejo lipidni dvosloj in povzročijo nastanek nestabilne hidrofilne pore (sredina), nato pa se lipidi ob pori reorientirajo s polarnimi glavami proti notranjosti pore in tako ustvarijo metastabilno hidrofilno poro (spodaj). (b) Električno polje
lahko preko kemijskih sprememb membranskih lipidov, kot je na primer peroksidacija, povečajo prehodnost membrane za vodo, ione in male molekule. (c) Električno polje spremeni delovanje membranskih proteinov (na sliki kanalček odvisen od naboja). Dolžina rdečih puščic na sliki ponazarja jakost električnega polja (Kotnik in sod., 2019). Za vnos nukleinskih kislin v celice s pomočjo elektroporacije moramo z električnim poljem zagotoviti nastanek hidrofilnih por, ki omogočajo prehod velike polarne molekule preko lipidnega dvosloja.
Za nevirusno integracijo genov ali genskih konstruktov v genom se pogosto uporablja sistem transpozon/transpozaza. Transpozoni so elementi genomov naravno prisotni pri vretenčarjih, ki jih lahko uspešno uporabimo pri biotehnologiji nevirusne integracije genskih konstruktov v genom. Najpogosteje uporabljeni transpozazi sta PiggyBac in Sleeping Beauty (Zhao in sod., 2016).
DNA konstruktu, ki ga želimo vnesti v genom, vstavimo v PiggyBac transpozon, med obe za transpozone značilni terminalni obrnjeni regiji (ang. Inverted Terminal Repeats, ITR). Ti regiji nato prepozna transpozaza PiggyBac, ki na teh mestih reže insert in ga vstavi na naključno TTAA mesto v genomu (Zhao in sod., 2016; Slika 5). Proces transpozicije lahko nadzorujemo tako, da ločimo transpozonski element in transpozazo in tako ustvarimo neavtonomni transpozon. Neavtonomni transpozon se lahko premika le z dodajanjem transpozaze (Grabundzija in sod., 2010).
Slika 5: Mehanizem delovanja PiggyBac transpozona (Poseida Therapeutics, 2020). Transgen znotraj regij ITR se izreže iz plazmida s pomočjo transpozaze PiggyBac, ki ga nato vstavi na naključno TTAA mesto v genomski DNA.
Z uporabo sistema transpozon/transpozaza dosežemo stabilno izražanje genskega konstrukta, tvegamo pa genotoksičnost, ki je lahko posledica integracije inserta v bližino
ali znotraj proto-onkogenov. Genotoksičnost ni omejena le na transpozone, ampak predstavlja tveganje tudi pri intergaciji s pomočjo virusnih vektorjev. Galvan in sod.
(2009) so z genome-wide mapping študijo na humanih limfocitih T pokazali, da se integracija transpozonov v proto-onkogene zgodi manjkrat kot pri gama-retrovirusnih vektorjih.
2.2.2.3 Prehodno in stalno izražanje
Za stalno izražanje genov je potrebna integracija le-teh v genom. Kot že rečeno to dosežemo z npr. virusnimi sistemi ali s sistemi transpozon/transpozaza. Pri terapevtskih aplikacijah, kot so celične ali genske terapije, pri katerih je zaželena daljša terapevtska učinkovitost, želimo doseči čim bolj stabilno izražanje genov.
Ker stalno izražanje prinaša tudi nekatere slabosti, npr. genotoksičnost, se uporabljajo tudi metode prehodnega izražanja genov. Prehodno izražanje dosežemo s transfekcijo celic z in vitro prepisanim in ustrezno prilagojenim mRNA zapisom. S tem dosežemo izražanje gena, ki je po dveh dneh že za polovico manjša od maksimalne in po enem tednu že nezaznavna. Prednosti RNA transferja so izražanje, ki je odvisno od količine elektroporirane RNA, omogoča izražanje dveh ali več molekul RNA hkrati, izražanje je zaznavno že po 12 urah po elektroporaciji, poleg tega pa celic pred vnosom RNA ni potrebno aktivirati (Riet in sod., 2012).
3 MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI
3.1.1 Aparature in pripomočki
• Brezprašna komora (Ehret)
• Centrifuga s hlajenjem 5804 R (Eppendorf)
• Celični inkubator HERAcell 150i (Thermo Fisher Scientific)
• Elektroporator NEON Transfection system (Thermo Fisher Scientific)
• Pretočni citometer FACS Aria I (BD Biosciences)
• Števna komora Bürker – Türk (Sigma)
• Invertni mikroskop (Olympus)
• Invertni fluorescenčni mikroskop s kamero Eclipse Ti – S (Nikon)
• Inkubator za gojišča in kemikalije (HERAtherm)
• Spektrofotometer Epoch (BioTek)
• Spiralec plošč Hydroflex (Tecan)
• Tehtnica (Exacta)
• pH meter (Mettler Toledo)
• Spektrofotometer BioPhotometer (Eppendorf)
• Avtomatske pipete in nastavki
• 15 in 50 ml centrifugirke (VWR)
• Plastične 5 ml centrifugirke
• Inokulacijske zanke
• Petrijevke
• Kivete (Eppendorf)
• Plasmid Midi Kit (Qiagen)
• Filter s porami premera 0,22 μm (Corning)
• Filter s porami premera 0,4 μm (Corning)
• Serološke pipete
• Kadička z ledom
• Krovna stekelca (d = 12 mm)
• Objektna stekla
• Gojitvene posodice za pritrjene in suspenzijske kulture površine 25 in 75 cm2 (Sarstedt)
• Gojitvene plošče s 6 in 96 vdolbinami (VWR)
• Mikrotitrske plošče s 96 vdolbinami za test ELISA (Corning)
3.1.2 Kemikalije
Preglednica 1: Uporabljene kemikalije s pripadajočimi proizvajalci.
Kemikalija Proizvajalec
Sterilna destilirana voda Baxter
Nigrozin Sigma
Etanol 96 % Merck
DPBS Gibco
Fetalni goveji serum (FBS) Sigma
RPMI-1640 Gibco
Streptamicin Sigma
Penicilin Sigma
L-glutamin Sigma
TMB substrat Thermo Fisher Scientific
Dimetil sulfoksid (DMSO) Sigma
Tripsin Sigma
Tween 20 Sigma
Klorovodikova kislina (HCl) Sigma Aldrich
Žveplova kislina (H2SO4) Merck
Barvilo 7-AAD Miltenyi Biotech
DMEM gojišče v prahu Sigma
Natrijev bikarbonat Na2HCO3 Sigma
Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) Sigma Natrijev dihidrogen fosfat (Na2HPO4) Sigma
Kalijev klorid (KCl) Sigma
Natrijev klorid (NaCl) Sigma
3.2 METODE
3.2.1 Priprava kulture enojedrnih celic periferne krvi iz levkocitnega pripravka Levkocitne koncentrate nam je zagotovil Oddelek za preskrbo s krvjo, Zavoda Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, (Mnenje Komisije RS za medicinsko etiko št 0120- 279/2017-3 KME 74/06/17). PBMC smo izolirai iz levkocitnih koncentratov zdravih krvodajalcev s krvno skupino 0+. Celice smo izolirali, šteli, zamrzovali in odmrzovali v skladu s standardnimi operativnimi postopki Zavoda RS za transfuzijsko medicino.
Za izolacijo PBMC iz levkocitnega pripravka smo uporabili metodo centrifugiranja z gostotnim gradientom. Gostotni gradient smo pripravili tako, da smo v štirih 50 ml centrifugirkah zmešali po 11,5 ml reagenta Histopaque 1077 in 1 ml pufra PBS. Levkocitni pripravek iz krvi smo prelili iz krvodajalske vrečke v 250 ml plastenko in dopolnili do 125 ml s pufrom PBS. 125 ml razredčenega pripravka smo nato previdno ob steni centrifugirke prenesli na gostotni gradient. Centrifugirke smo previdno preneseli v centrifugo in centrifugirali pri 950 xg, 15 min, z zmanjšanim pospeškom in zaviranjem.
Preglednica 2: Sestava pufra PBS (pH=7,2).
Komponenta Koncentracija (g/L)
Kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 0,20
Natrijev dihidrogen fosfat (Na2HPO4) 1,44
Kalijev klorid (KCl) 0,20
Natrijev klorid (NaCl) 8,00
S centrifugiranjem ločimo zmes na frakcije: plazma, PBMC, Histopaque 1077 in plast posedenih celic. S serološko pipeto poberemo PBMC iz dveh centrifugirk in združimo v eno ter dopolnimo do 50 ml s pufrom PBS, ostalo zavržemo. Ponovno centrifugiramo, tokrat pri 660 xg, 10 min. Supernatant zavržemo, pelet pa resuspendiramo v 8 ml PBS.
Združimo resuspendirane pelete v svežo centrifurigirko in dopolnimo do 50 ml.
Centrifugiramo pri 300 xg. 10 min, zavržemo supernatant in pelet resuspendiramo v 50 ml pufra PBS. Spiranje ponovimo še najmanj dvakrat, dokler supernatant ni bister. Po končanih centrifugiranjih PBMC resuspendiramo v popolnem gojišču RPMI z 10 % FBS in nasadimo v štiri T75 gojitvene posodice.
Slika 6: Pred centrifugiranjem: zgornja rdeča plast - razredčen levkocitni pripravek, spodnja bistra plast - gostotni gradient Histopaque.
Slika 7: Po centrifugiranju: zgornja plast - plazma, plast "Buffy Coat"- PBMC, plast Histopaque, posedli eritrociti in preostanek drugih celic.
3.2.2 Štetje in določanje viabilnosti PBMC
PBMC smo šteli s pomočjo Bürker – Türk (Sigma) števne komore pod invertnim mikroskopom (Nikon). Celice smo 5-krat redčili v 0,2 % nigrozinu. Nigrozin je barvilo modre barve, ki prehaja le membrane mrtvih celic, tako se mrtve celice obarvajo modro, žive pa ostanejo neobarvane. Viabilnost izrazimo kot odstotek živih celic glede na celotno število celic. Razredčen vzorec celic smo dobro premešali in 10 µl vzorca nanesli na vsako polje števne ploščice. Pod mikroskopom smo v 8 kvadrantih prešteli žive in mrtve celice, ter izračunali koncentracijo in viabilnost celic. Koncentracijo živih in celokupnih celic smo izračunali po formuli (1):
… (1) C – koncentracija celic (živih, celokupno)
N – število celic v vseh kvadrantih (živih, celokupno) R – faktor redčenja
Viabilnost celic smo izračunali po formuli (2):
… (2) Cž – koncentracija živih celic
Cc – koncentracija celokupnih celic
3.2.3 Gojenje celičnih kultur
Celično kulturo PBMC smo gojili v gojišču RPMI z dodatkom L-glutamina in antibiotikov streptamicina in penicilina, ki smo mu dodali 10 volumskih odstotkov govejega fetalnega seruma (FBS). Celični liniji Raji in Jurkat smo prav tako gojili v mediju RPMI z dodatkom L-glutamina in antibiotikov ter 10 volumskih odstotkov FBS. Celično linijo HEK 293T/17 smo gojili v gojišču DMEM z dodatkom antibiotikov streptamicina in penicilina ter 10 volumskimi odstotki FBS.
Suspenzijske celične kulture (PBMC, Jurkat in Raji) smo gojili v gojilnih posodicah T25 in T75. Suspenzijske kulture smo presajali s pomočjo centrifugiranja pri 470 xg 5 min. S centrifugiranjem pri taki hitrosti dosežemo, da se žive celice posedejo na dno, mrtve celice in celični delci pa ostanejo v supernatantu. Po centrifugiranju odstranimo supernatant (izrabljeno gojišče) in celice resuspendiramo v svežem gojišču ter jih nasadimo v sveže posodice za gojenje.
Pritrjeno celično kulturo HEK 293T/17 smo gojili v gojitvenih posodicah T25 in T75. Pri presajanju pritrjenih celičnih kultur tem najprej odsesamo gojišče in jih dvakrat speremo s PBS. Nato jih odlepimo od površine gojitvene posode s pomočjo encima tripsina. Tripsin razgradi zunajcelični matriks, s katerim se celice povezujejo v skupke in se pritrjujejo na steno gojitvene posodice. Tripsin inaktiviramo z dodatkom popolnega gojišča s FBS.
Tripsinizirane celice nato centrifugiramo in resuspendiramo v svežem gojišču ter prenesemo v sveže gojitvene posodice.
Vse celične kulture gojimo v celičnem inkubatorji pri 37°C in atmosferi nasičeni z vodno paro ter s 5 % CO2.
3.2.4 Zamrzovanje celičnih kultur
Za dolgotrajno shranjevanje celic in celičnih kultur te zamrznemo in jih shranjujemo v kriobankah v tekočem dušiku. Za zamrzovanje celic uporabljamo zamrzovalne medije, ki vsebujejo krioprotektante. Krioprotektanti so kemikalije, ki preprečijo nastanek vodnih kristalov pri zmrzovanju. Uporabili smo zamrzovalni medij, ki je vseboval 90-odstotni volumski delež FBS in 10-odstotni volumski delež krioprotektanta dimetilsulfoksida (DMSO). Zamrzovali smo celice v eksponentni fazi rasti z visoko viabilnostjo. Pred zamrzovanjem smo celice prešteli in ohladili na -20°C. Enako smo ohladili tudi zamrzovalni medij. Celice smo nato centrifugirali v ohlajeni centrifugi na 4°C pri 490 xg 5 min. Celice smo nato resuspendirali v primernem volumnu zamrzovalnega medija, da smo dosegli koncentracijo 5×106 celic/ml. V predhodno ohlajene krioviale smo nato alikvotirali po 1 ml celic v zamrzovalnem mediju. Čez noč smo krioviale shranili v zamrzovalniku na - 80°C, nato pa smo jih prenesli v kriobanko v tekoči dušik.
3.2.5 Odmrzovanje celičnih kultur
Pri odmrzovanju celičnih kultur moramo upoštevati, da so celice zamrznjene v mediju, ki vsebuje DMSO, ki je toksičen za celice. Zato moramo celice odmrzniti čim hitreje in jih nato čim prej prenesti v večji volumen gojišča, da razredčimo DMSO. Kriovialo odtalimo tako, da jo podržimo v topli vodi. Nato vsebino krioviale prenesemo v 50 ml nekompletnega gojišča. Nato celice centrifugiramo na 490 xg 5 min. Supernatant odstranimo in celice resuspendiramo v 7 ml popolnega gojišča z 10 % FBS ter prenesemo v T25 gojitveno posodico. Celice pregledamo pod mikroskopom, preštejemo in določimo viabilnost celic.
3.2.6 Namnoževanje in izolacija plazmidov
Za namnoževanje plazmidov smo te transformirali v kompetentne celice Escherichia coli DH5α. V 1 ml alikvote bakterijske kulture smo dodali 1 µl plazmidne DNA. Na vseh plazmidih je zapis za ampicilinsko rezistenco, zato smo uspešnost transformacije preverili z gojenjem na trdnem selekcijskem gojišču LB z dodatkom ampicilina. Rezistentne kolonije smo precepili v tekoče LB gojišče z dodatkom ampicilina in jih gojili dokler nismo dobili 100 ml bakterijske kulture. Izolacijo plazmidne DNA iz E. coli smo uporabili Plasmid Midi Kit (Qiagen). Po navodilih proizvajalca smo izolirali plazmidno DNA in jo raztopili v 100 µl vode za PCR.
3.2.7 Kontrola kvalitete
Da smo preverili uspešnost namnoževanja in izolacije plazmidov, smo pomerili koncentracijo DNA in preverili velikost plazmidov na elektroforetskem gelu.
Koncentracijo DNA smo merili s spektrofotometrom (Eppendorf), pri čemer smo vzorce petdesetkrat redčili. Merili smo absorbanco pri 230 nm, 260 nm in 280 nm. Absorbanca pri 260 nm nam pove koncentracijo DNA v vzorcu. Razmerje absorbanc 260/280 nam da informacijo o kontaminiranosti s proteini ali fenoli. Za primerno čist DNA naj bi ta vrednost znašala približno 1,8. Če je razmerje nižje od 1,8, pa to nakazuje na kontaminacijo s proteini ali fenoli. Razmerje absorbanc 260/230 naj bi bilo za med 2,0 in 2,2. Nižje razmerje nakazuje na kontaminacijo z EDTA, fenoli ali ogljikovimi hidrati (Tools.thermofisher.com, 2020). Meritev vsakega vzorca smo opravili v treh paralelah, da smo dobili povprečno vrednost.
Za elektroforezo smo pripravili 0,8 % agarozni gel. V erlenmajerico smo zatehtali 0,32 g agaroze v prahu in dodali 40 ml 1X TBE pufer. V mikrovalovni pečici smo tekočino večkrat segrevali do vretja, da smo popolnoma raztopili agarozo. Tekoči gel smo nekoliko ohladili, nato pa dodali 1 µl barvila Midori Green Advance (NIPPON Genetics), ki se veže na DNA in fluorescira ob ekscitaciji s svetlobo valovne dolžine 490 nm. Gel smo nato
prelili v elektroforezne kadičke. Vzorce smo pred nanašanjem na gel najprej 10-krat redčili, nato pa smo 6 µl vzorca dodali 1 µl barvila za nanašanje. Na gel smo nanesli tudi označevalec velikosti GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific). Napetost smo nastavili na 100V in pustili teči 30 min.
3.2.8 Elektroporacija
Za vnos plazmidov v celice smo uporabili metodo elektroporacije. Uporabili smo transfekcijski sistem Neon (Thermo Fisher Scientific, Slika 8), primeren za elektroporacijo sesalskih celic. Transfekcijski sistem Neon je sestavljen iz več delov: transfekcijske naprave (1), pipetne postaje (2), elektroporacijske kivete (3) in pipete (4) s pipetnimi nastavki (6). Kompletu so priloženi še elektroporacijski pufri (5), v katerih poteka elektroporacija in pufri, v katerih resuspendiramo celice. Namen transfekcijske naprave je, da generira nastavljeno število električnih pulzov nastavljene napetosti (V) in dolžine (ms), ki jih preko povezave pošilja v pipetno postajo. Prva elektroda se nahaja v elektroporacijski kiveti, ki jo pred uporabo vstavimo v pipetno postajo in vanjo dodamo ustrezni elektroforetski pufer. Druga elektroda pa se nahaja v pipetnem nastavku, v katerega zajamemo celice v ustreznem pufru. Tako so celice med pulzom ujete med obe elektrodi in izpostavljene električni napetosti, ki prehodno odpre membransko strukturo in omogoči vnos plazmidne DNA v celice.
Slika 8: Transfekcijski sistem Neon, 1 Transfekcijska naprava, 2 pipetna postaja, 3 elektroporacijska kiveta, 4 pipeta, 5 pufri, 6 nastavki (Thermofisher.com, 2021).
Elektroporacija različno uspešno deluje pri različnih celičnih linijah in tipih celic, zato je treba optimizirati pogoje elektroporacije za vsako celično linijo posebej. Za optimizacijo elektroporacije celičnih linij HEK 293T/17 in Jurkat smo uporabili plazmid EF1α GFP
p007G PB, plazmid v transpozonski obliki z zapisom za zeleni fluorescentni protein (GFP). Pri uspeli transformaciji bi tako pod fluorescentnim mikroskopom opazili zeleno fluorescenco. Pri vsaki elektroporaciji smo dodali še plazmid z zapisom za transpozazo PiggyBac. Za negativne kontrole smo uporabili: a.) celice v elektroporacijskem pufru, ki jih nismo elektroporirali, b.) celice, ki smo jim dodali plazmide brez elektroporacije, c.) celice, ki smo jih elektroporirali brez dodatka plazmidov.
Celice je pred elektroporacijo treba pripraviti. Če delamo s pritrjenimi kulturami jih tripsiniziramo, da dobimo celice v suspenziji. Celice centrifugiramo pri 490 xg 5 minut in jih resuspendiramo v pufru DPBS brez kalcijevih in magnezijevih ionov, da se znebimo ostankov gojišča in ionov prisotnih v njem, kar bi lahko motilo proces elektroporacije.
Nato celice preštejemo in v ustrezni koncentraciji po ponovnem centrifugiranju pri 490 xg 5 minut resuspendiramo v elektroporacijskem pufru. Suspenziji celic dodamo še plazmid z zapisom za GFP in plazmid z zapisom za transpozazo PiggyBac, vsakega v končni količini 5 µg na reakcijo. Za elektroporacijo smo uporabljali 100 µl pipetne nastavke z elektrodo.
Po elektroporaciji smo celice pustili 10 min v nastavku.
Vnaprej smo pripravili plošče s 6 vdolbinami, v vsako vdolbino pa smo pripravili 2 ml kompletnega gojišča z 20 % FBS in antibiotiki. Celice smo s pipetnim nastavkom prenesli v gojišče in gojili v celičnem inkubatorju pri atmosferi nasičeni z vodo, 5 % CO2 in 37°C.
Naslednji dan smo celice pregledali pod fluorescenčnim mikroskopom in tako ugotovili uspešnost transformacije.
Optimizirali smo pogoje za elektroporacijo treh celičnih linij: HEK 293T/17, Jurkat in PBMC.
Preglednica 3: Optimizacija pogojev elektroporacije celične linije HEK293T/17. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5 µg DNA transpozaze.
Protokol Napetost (V) Dolžina pulza (ms) Število pulzov
Število celic v nastavku
DNA v nastavku (µg)
1 1400 10 1 4x10^5 5+5
2 1400 20 1 4x10^5 5+5
3 1600 10 1 4x10^5 5+5
4 1600 20 1 4x10^5 5+5
5 1800 10 1 4x10^5 5+5
6 1800 20 1 4x10^5 5+5
7 1900 10 1 4x10^5 5+5
8 1900 20 1 4x10^5 5+5
Preglednica 4: Optimizacija pogojev elektroporacije celične linije Jurkat. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5 µg DNA transpozaze.
Protokol Napetost (V)
Dolžina pulza
(ms) Število pulzov Število celic v nastavku
DNA v nastavku (µg)
1 2000 10 1 1x10^6 5+5
2 2100 10 1 1x10^6 5+5
3 2100 20 1 1x10^6 5+5
4 2200 10 1 1x10^6 5+5
5 2200 20 1 1x10^6 5+5
6 2300 10 1 1x10^6 5+5
7 2300 20 1 1x10^6 5+5
8 2400 10 1 1x10^6 5+5
9 2400 20 1 1x10^6 5+5
Po optimizaciji pogojev elektroporacij za celični liniji Jurkat in HEK 293T/17 smo pri izbranih optimalnih pogojih celice elektroporirali s plazmidom P007G EF1α scFvCD19_4- 1BB_CD3ζ_p2A_GFP, ki nosi zapis za anti-CD19 CAR in GFP. Plazmid je v transpozonski obliki, zato smo pri elektroporaciji dodali tudi plazmid z zapisom za PiggyBac.
Preglednica 5: Pogoji elektroporacije HEK 293T/17 z anti-CD19 CAR/GFP plazmidom. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5 µg DNA transpozaze.
Protokol Napetost (V) Dolžina pulza (ms) Število pulzov
Število celic v nastavku
DNA v nastavku (µg)
1 1400 10 1 4x10^5 5+5
2 1500 10 1 4x10^5 5+5
3 1600 10 1 4x10^5 5+5
Preglednica 6: Pogoji elektroporacije Jurkat z anti-CD19 CAR/GFP plazmidom. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5 µg DNA transpozaze.
Protokol Napetost (V)
Dolžina pulza
(ms) Število pulzov Število celic v nastavku
DNA v nastavku (µg)
1 2100 10 1 1x10^6 5+5
2 2200 10 1 1x10^6 5+5
3 2300 10 1 1x10^6 5+5
Pri elektroporaciji PBMC smo že pri koraku optimizacije uporabili plazmid P007G EF1α scFvCD19_4-1BB_CD3ζ_p2A_GFP, ki nosi zapis za anti-CD19 CAR in GFP.
Preglednica 7: Pogoji elektroporacije PBMC z anti-CD19 CAR/GFP plazmidom. Podani so pogoji elektroporacije (napetost pulza, dolžina pulza, število pulzov, število celic v nastavku in količina DNA v nastavku). Oznaka 5+5 pomeni 5 µg DNA transpozona in 5 µg DNA transpozaze.
Protokol Napetost (V)
Dolžina pulza
(ms) Število pulzov
Število celic v nastavku
DNA v nastavku (µg)
1 1600 10 1 1x10^6 5+5
2 1600 10 2 1x10^6 5+5
3 1800 10 1 1x10^6 5+5
4 1800 10 2 1x10^6 5+5
5 2000 10 1 1x10^6 5+5
6 2000 10 2 1x10^6 5+5
7 2000 15 1 1x10^6 5+5
8 2000 15 2 1x10^6 5+5
9 2000 20 1 1x10^6 5+5
10 2100 10 1 1x10^6 5+5
11 2100 20 1 1x10^6 5+5
12 2100 15 2 1x10^6 5+5
13 2150 15 2 1x10^6 5+5
14 2200 10 1 1x10^6 5+5
15 2200 15 1 1x10^6 5+5
16 2250 15 2 1x10^6 5+5
17 2300 10 1 1x10^6 5+5
18 2400 10 1 1x10^6 5+5
19 2400 15 1 1x10^6 5+5
20 2450 15 1 1x10^6 5+5
21 2500 15 1 1x10^6 5+5
Uspešnost transformacije smo v vseh primerih spremljali s fluorescenčnim mikroskopom.
Dvojno izražanje hkrati molekule CAR in zelenega fluorescentnega proteina pa smo preverili preko analize s pretočnim citometrom.
3.2.9 Analiza s pretočnim citometrom
Pretočni citometer je naprava, ki s pomočjo laserjev določa lastnosti posameznih celic, kot sta velikost in granuliranost. Razpršitev vidne svetlobe merimo v dveh smereh, razpršitev svetlobe naprej (ang. Forward Scatter, FSC) nakazuje na relativno velikost celice celice, razpršitev v kotu 90° (ang. Side Scatter, SSC) pa nakazuje notranjo granuliranost celice.
Razpršitev vidne svetlobe ne moti merjenja fluorescence, ki jo prav tako lahko uporabljamo za določanje lastnosti celic. Fluorescenco lahko uporabimo tako, da v celicah izrazimo fluorescentne proteine (npr. zeleni fluorescentni protein, GFP), barvamo s fluorescentnimi barvami (npr. propidijev jodid) ali barvamo celice tako, da nanje vežemo protitelesa konjugirana s fluorescentnimi barvili (npr. CD3 FITC) (McKinnon, 2018).
V osnovi naprava deluje tako, da suspenzijo celic v obliki tankega curka injecira mimo laserja. Curek je tako tanek, da so v njem celice razporejene v posamične kapljice. S tem omogočimo laserju in senzorjem, da pomerijo parametre vsake celice posebej. V kolikor je naprava sklopljena s celičnim ločevalcem, lahko hkrati z meritvijo že ločujemo celice na podskupine glede na njihove lastnosti. Celice ločimo v različne predelke s pomočjo uklanjanja kapljic v električnem polju (Ibrahim in van den Engh, 2007).
Slika 9: Princip delovanja pretočnega citometra in celičnega ločevalca (Ibrahim in van den Engh, 2007).
Celice v tankem curku potujejo mimo laserja v koloni. Senzorji zaznajo odboje svetlobe in fluorescenco vsake celice (vrh skice). V nadaljevanju poti se celice v električnem polju ločujejo tako, da posamezne populacije ločimo od tistih, ki niso zaželene in gredo v odpad.
S pretočnim citometrom smo preverili izražanje GFP in sočasno izražanje anti-CD19 CAR receptorja. Izražanje smo preverili pri celični liniji Jurkat (imortalizirani limfociti T CD4+), ki smo jo pri optimiziranih pogojih elektroporirali s plazmidom P007G EF1α scFvCD19_4-1BB_CD3ζ_p2A_GFP.
Medij za analizo je pufer FACS, katerega osnova je 1x PBS, dodamo pa mu še 0,5 % govejega serumskega albumina in 0,5 M EDTA.
Za pripravo celic za pretočni citometer smo najprej prenesli 3x105 celic v 5 ml centrifugirko in centrifugirali pri 490 xg 5 min. Celice smo nato resuspendirali v 50 µl pufra FACS. Najprej smo suspenziji celic dodali 2 µl kozjih protiteles proti humanim IgG konjugiranih s fluorescentnim barvilom Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific).
Inkubirali smo 5 minut v temi, nato pa smo dodali še 5 µl barvilo 7-AAD (7- Aminoaktinomicin D) (Miltenyi Biotech) ter inkubirali dodatnih 10 min v temi. Po končani inkubaciji smo dodali 1 ml pufra FACS in centrifugirali pri 490 xg 5 minut. Barvane celice smo resuspendirali v 300 µl FACS in do analize pustili v hladilniku na 4°C.
Za uspešno analizo izvedeno s pretočnim citometrom je treba uporabiti tudi negativno kontrolo in kompenzacijske kontrole. Za negativno kontrolo smo uporabili celično linijo Jurkat, ki ni bila transformirana. Barvali smo jo po istem postopku z vsemi fluorokromi.
Kompenzacijske kontrole uporabljamo, da preverimo morebitno prekrivanje emisijskih spektrov različnih fluorokromov, kar bi brez ustreznih popravkov pri analizi dalo netočne rezultate. Kompenzacijske kontrole pripravimo po enakem postopku kot transformirane celice, le da vsakič izpustimo en fluorokrom. Za kompenzacijsko kontrolo GFP smo uporabili celično linijo Jurkat, ki ni bila transformirana, za ostale kompenzacijske kontrole pa smo uporabili celično linijo Jurkat transformirano s CAR in GFP.
Slika 10: Postopek določanja lastnosti celic v suspenziji. Označena skupina celic na prvem grafu prikazuje celice ustrezne velikosti in granuliranosti. Tako smo izbrali homogeno skupino celic. Označene celice na drugem grafu so le posamezne celice izbrane homogene skupine. Iz te skupine smo izločili skupke celic.
Tretji graf prikazuje homogeno populacijo živih celic. Žive so tiste celice, v katerih ne zaznamo barvila 7- AAD.
Postopek analize celic na pretočnem citometru smo izvedli v štirih korakih. Najprej smo od vseh celic izbrali tiste z ustrezne velikosti in granuliranosti (levi graf, Slika 10). Nato smo od teh celic izločili skupke celic (sredinski graf, Slika 10). V tretjem koraku smo izbrali le posamezne žive celice. Žive celice so tiste, v katerih ne zaznamo barvila 7-AAD, katerega lastnost je, da prehaja le membrane mrtvih celic (desni graf, Slika 10). V zadnjem koraku smo nato od vseh živih celic izbrali le tiste, ki so izražale receptor CAR in GFP. Analizo smo opravili s programom BD FACSDiva 8.0.1.
