UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
ANJA MARINČ
MAGISTRSKA NALOGA
MAGISTRSKI ŠTUDIJ LABORATORIJSKA BIOMEDICINA
Novo mesto, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
ANJA MARINČ
RAZMERJE ESENCIALNIH IN TOKSIČNIH KOVIN PRI OTROCIH S SPEKTROM AVTISTIČNIH MOTENJ
THE RATIO OF ESSENTIAL AND TOXIC METALS IN CHILDREN WITH AUTISM SPECTRUM DISORDERS
MAGISTRSKI ŠTUDIJ LABORATORIJSKA BIOMEDICINA
Novo mesto, 2021
Magistrsko nalogo sem opravljala na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana pod vodstvom mentorja prof. dr. Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem.
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Jošku Osredkarju, mag. farm., spec. med. biokem., za strokovno pomoč, nasvete in vodenje pri izdelavi magistrske naloge.
Zahvaljujem se tudi sodelavkam Nastji, Nataliji, Eriki, Lidiji, Andreji in Darinki za vso razumevanje, bodrenje in pomoč v času študija. Iskrena hvala tudi vsem mojim nadrejenim, ki so mi odobrili fleksibilnost pri delavnem času in mi na ta način omogočili opravljanje študija.
Hvala tudi prijateljici Maruši za vse nasvete, spodbudo in razumevanje ter ekipi pomožnih sodnikov KK Krka za vso zabavo in sproščanje v stresnih situacijah.
Še posebaj pa se zahvaljujem svojim najbljižjim: staršem, ki so mi omogočili študij, bratu Aljažu, sestrični Alenki in ostalim družinskim članom za spodbudo, podporo in razumevanje.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr.
Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem.
Naloga je del projekta Laboratorijske preiskave pri otrocih s spektroavtistično motnjo in drugimi razvojnonevrološkimi motnjami; Terciarni projekt UKC Ljubljana številka
20150085, Določanje kazalcev oksidativnega stresa pri otrocih s spektroavtistično motnjo katere nosilec je prof. dr. Joško Osredkar, mag. far., na Univerzitetnem Kliničnem centru Ljubljana.
Predsednik magistrske komisije: prof. dr. Lucija Peterlin Mašič Člani komisije: doc. dr. Urša Pečar Fonović
Ljubljana, 2021
KAZALO VSEBINE
POVZETEK ... I ABSTRACT ... III SEZNAM OKRAJŠAV ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VIII
1. UVOD ... 1
1.1. AVTIZEM,ASPERGERJEVSINDROMINSPEKTERAVTISTIČNIHMOTENJ(SAM)... 1
1.1.1. ZGODOVINA SPEKTRA AVTISTIČNIH MOTENJ ... 3
1.1.2. PREVALENCA SPEKTRA AVTISTIČNIH MOTENJ ... 4
1.1.3. ZNAKI SPEKTRA AVTISTIČNIH MOTENJ, POSTAVLJANJE DIAGNOZE, ZDRAVLJENJE ... 5
1.1.4. SPREMLJAJOČE TEŽAVE SAM IN SOOBOLEVNOST ... 8
1.2. ETIOLOGIJASAM ... 9
1.2.1. GENETSKI DEJAVNIKI ... 10
1.2.2. OKOLJSKI DEJAVNIKI ... 11
1.3. TOKSIČNIELEMENTITEŽKIHKOVIN ... 13
1.3.1. Hg - ŽIVO SREBRO ... 13
1.3.2. Al - ALUMINIJ ... 17
1.3.3. Pb - SVINEC ... 19
1.3.4. As - ARZEN ... 21
1.3.5. Cd - KADMIJ ... 25
1.4. TEŽKEKOVINEVPOVEZAVISSPEKTROMAVTISITČNIHMOTENJ ... 28
1.4.1. IZBIRA BIOLOŠKEGA VZORCA ZA ANALIZO TEŽKIH KOVIN V POVEZAVI S SAM ... 29
1.4.2. PODAJANJE REZULTATOV ... 30
2. NAMEN DELA ... 31
3. MATERIALI IN METODE ... 33
3.1. VZORCI ... 33
3.2. SPLOŠNANAVODILAZADELOVLABORATORIJU ... 33
3.3. MERJENJETEŽKIHKOVINVURINU ... 34
3.3.1. ANALIZATOR ZA MERJENJE KOVIN V URINU ... 34
3.3.2. REAGENTI IN MATERIALI ZA MERJENJE KOVIN ... 34
3.3.3. METODA DOLOČANJA ... 36
3.4. MERJENJEKREATININAVURINU ... 42
3.5. STATISTIČNAOBDELAVAPODATKOV ... 43 4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 44
4.1. OPISNASTATISTIKAZASKUPINOSAMINKONTROLNOSKUPINO ... 45 4.2. NORMALNOSTPORAZDELITEVIZMERJENIHVREDNOSTIVSKUPINIOTROKSSAMINKONTROLNI SKUPINIOTROK ... 47 4.3. PRIMERJAVAKONCENTRACIJTOKSIČNIHINESENCIALNIHKOVINMEDSKUPINOOTROKSSAMIN KONTROLNOSKUPINOOTROK ... 53 4.4. STATISTIČNAOBDELAVAPODATKOVTREHLOČENIHSKUPIN ... 56 4.5. NORMALNOSTPORAZDELITVEIZMERJENIHVREDNOSTIVVSEHTREHSKUPINAH ... 59 4.6. PRIMERJAVAKONCENTRACIJTOKSIČNIHINESENCIALNIHKOVIN/KREATININMEDVSEMITREMI SKUPINAMI ... 61 5. SKLEP ... 66 6. LITERATURA ... 69
POVZETEK
Spekter avtističnih motenj (SAM) spada med razvojno, pervazivno nevrološko-biološko motnjo. Za to motnjo so značilne težave z verbalno in neverbalno komunikacijo, motnje v socialnih stikih, nenavadne, ponavljajoče in zelo omejene spretnosti ter zanimanja. To pomeni prisotnost značilnega in posebnega vzorca vedenja pri bolnikih s SAM. Prav tako je pri bolnikih s SAM tudi izrazito zanimanje za specifično aktivnost. Etiologija SAM je zelo kompleksna. Posledica kompleksnosti je, da vzrok za nastanek SAM še vedno ni povsem pojasnjen, zaradi česar ga še vedno množično preiskujejo. Prevalenca SAM se spreminja in narašča iz leta v leto, zato se v zadnjem desetletju precej razlikuje glede na starejše podatke.
Razmerje med dečki in deklicami je konstantno in se giblje med 2:1 in 6,5:1. Mnoge študije, ki so jih izvedli in objavili v zadnjih 50.-60. letih, so pokazale, da so odločilni genetski dejavniki za razvoj SAM. Danes se raziskave fokusirajo predvsem na okoljske dejavnike, ki vplivajo na razvoj SAM. Med raziskovane okoljske dejavnike spadajo infekcije, zdravila, cepiva. Eden najpomembnejši okoljskih dejavnikov so zagotovo elementi težkih kovin, ki se v človeškem organizmu pojavljajo kot elementi v sledovih. Med najbolj toksične elemente kovine spadajo živo srebro, svinec, aluminij, arzen in kadmij, ki povzročajo raznorazne poškodbe v organizmu. Kljub vsem raziskavam vzroki nastanka SAM ostajajo neznani.
Kljub temu, da SAM spada med nevrobiološke motnje, njegova diagnostika temelji na zbiranju natančnih anamnestičnih podatkov o razvoju otroka na številnih zdravniški pregledih. Poleg zdravniških pregledov je opravljeno tudi psihološko testiranje in spremljanje otroka v različnih, v naprej pripravljenih situacijah. Biološkega testa ali specifičnega označevalca, kljub številnim raziskavam na tem področju, še nimamo. Odkritje le tega bi olajšalo diagnostiko bolezni ter omogočilo zgodnje vključevanje otrok v specifične terapevtske skupine, ki pripomorejo k boljšemu razvoju socialnih in komunikacijskih veščin ter tako omogočajo lažje vključevanje v družbo in nadaljnje življenje bolnikov.
V naši študiji smo v skupino s spektrom avtističnih motenj vključili 141 otrok. V kontrolno skupino, ki je predstavljala zdrave otroke, pa je bilo vključenih 49 otrok. Starost otrok je bila med 2 in 18 let. Želeli smo ugotoviti in pokazati ali obstajajo statistično značilne razlike v koncentraciji esencialnih in toksičnih kovin izmerjenih v urinu oziroma podanih na gram kreatinina med skupino otrok s spektrom avtističnih motenj in kontrolno skupino zdravih otrok.
Toksične in esencialne kovine v urinu smo določali z metodo masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS).
Naši rezultati kažejo, da ima skupina otrok s SAM višje vrednosti koncentracij večine toksičnih kovin podanih na kreatinin v urinu (aluminij, arzen, kadmij in živo srebro) kot kontrolna skupina zdravih otrok ter tudi višje koncentracije esencialnih kovin/kreatinin v urinu (litij, kalcij, krom, mangan, železo, kobalt, baker, cink in selen) kot kontrolna skupina zdravih otrok.
Statistično značilna razlika med otroci s SAM in kontrolno skupino zdravih otrok se je pokazala samo pri toksičnih kovinah arzen in kadmij ter esencialnih kovinah magnezij, krom in baker.
Kot zanimivost smo naredili tudi ločitev znotraj skupine s SAM in sicer na skupino otrok z avtizmom in skupino otrok z visoko funkcionalnim avtizmom oziroma Aspergerjevim sindromom. V raziskavi smo ugotovili, da ima skupina otrok z visoko funkcionalnim avtizmom v primerjavi s skupino otrok z avtizmom nižje koncentracije toksičnih in esencialnih kovin/kreatinin v urinu. Izjema je bila zgolj koncentracija kadmija/kreatinina v urinu, ki je bila pri otrocih z visoko funkcionalnim avtizmom višja kot pri otrocih z avtizmom. Statistično značilna razlika med otroci z avtizmom, otroci z visoko funkcionalnim avtizmom in kontrolno skupino zdravih otrok se je pokazala pri toksičnih kovinah aluminij in svinec ter esencialnih kovinah krom, mangan in baker, pri čemer je bila razlika dokazana pri vseh kovinah med otroci z visoko funkcionalnim avtizmom v primerjavi z zdravimi otroci. Razlika pa ni bila dokazana za nobeno kovino med otroci z avtizmom v primerjavi z zdravimi otroci.
Statistično značilno razliko smo dokazali tudi med skupino otrok z visoko funkcionalnim avtizmom in skupino otrok z avtizmom za toksično kovino svinec in esencialni kovini krom in baker.
Na osnovi rezultatov lahko zaključimo, da je med skupino otrok s SAM in kontrolno skupino zdravih otrok prišlo do določenih statistično značilnih razlik. Vzrok za razlike je lahko v vplivih okolja, vendar bi bilo za potrditev potrebno analizirati še prehranske navade, življenjsko okolje, potek nosečnosti in ostale parametre v okolju.
Ključne besede: spekter avtističnih motenj, toksične kovine, esencialne kovine
ABSTRACT
Autism spectrum disorder (ASD) belongs to the developmental, pervasive neurological- biological disorder. This disorder is characterized by problems with verbal and nonverbal communication, social interaction, unusual, repetitive and very limited interests and skills. This means that patients with ASD have a special and characteristic pattern of behavior, interest, and activity that manifest in very limited and different ways. The etiology of ASD is very complex and still unexplained up to this day, so the causes are still being intensively investigated. The prevalence of ASD is changing and growing from year to year. Over the past decade it has varied considerably depending on the older data. However the ration between boys and girls is constant and ranges between 2:1 and 6,5:1. many studies that have been conducted and published over the last 50. - 60. years, have demonstrated the decisive genetic factors for the development of ASD. Today, however, more and more research is focusing on the environmental factors that influence ASD development. Among the studied environmental factors include infections, drugs, vaccines. One of the most important environmental factors is certainly heavy metals, which appear in the organism as trace elements. Among the most toxic metals are mercury, lead, aluminium, arsenic and cadmium, which causes various injuries in the organism. Despite all the research, the cause of ASD remain unknown.
Despite the fact that ASD is neurobiological disorder, its diagnosis is based on the collection of accurate anamnestic data on the development of the child at numerous doctors examinations, observation of the child in various situations, conditions and psychological testing. We do not yet have a biological test or a specific marker, despite a lot of research in this area. The discovery of this would facilitate the diagnosis of the disease and enable the early intervention.
This would allow to include children to a specific therapeutic groups, which would contribute to the better development of social and communication skills and enable the integration into society, which would further to a better life of a patients.
In our study, we included 141 children in the group with the ASD, and 49 children in the control group, which represented healthy children. The age of the children was between 2 and 18 years.
We wanted to determine whether there were statistically significant differences in the concentration of essential and toxic metals measured in urine between children with ASD and the control group of healthy children. The results are presented according to the creatinine concentration for easier interpretation. Toxic and essential metals in urine were determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).
Our results show that children with ASD has higher urinary concentrations of most toxic metals/creatinine (aluminium, arsenic, cadmium and mercury) than healthy children, as well as higher urinary concentrations of essential metals/creatinine (lithium, calcium, chromium ,manganese, iron, cobalt, copper, zinc and selenium) as a control group of healthy children. A statistically significant difference between children with ASD and healthy children was shown only for the toxic metals arsenic and cadmium, and the essential metals magnesium, chromium and copper.
As an interesting fact, we also made a separation within the group with ASD, namely the group of children with autism and the group of children with high-functioning autism or Asperger's syndrome. The study show that children with high-functioning autism had lower urinry concentrations of toxic and essential metals/creatinin compared to children with autism. The only exception was the concentration of cadmium/creatinin in the urine, which was higher in children with high-functional autism than in children with autism. A statistically significant difference between children with autism, children with high-functioning autism and a control group of healthy children was shown in the toxic metals aluminium and lead and essential metals chromium, manganese and copper, with a difference in all mentioned metals between groups of children with high-functioning autism and a control group of healthy children.
However, no difference was demonstrated for any metal between the groups of children with autism and the control group of healthy children.
A statistically significant difference was also demonstrated between the children with high- functional autism and the children with autism for toxic metal lead and the essential metals chromium and copper.
Based on the reaults, we can conclude that certain statistically significant differences occurred between the group of children with ASD and the control group of healthy children. The reason for the differences may be in the influences of the environment, but to confirm it would be necessary to analyze environmental factors such as dietary habits, living environment, the course of pregnancy and other parameters in the environment.
Keywords: autism spectrum disorder, toxic metals, essential metals
SEZNAM OKRAJŠAV
• ADDM - Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network
• Al – aluminij
• ALA - d-aminolevulinska kislina
• As - arzen
• ASA - Združenje ameriških psihiatrov
• ASD – Autism spectrum disorder
• ATP - adenozin trifosfat
• d-ALAD - encim dehidrataza d-aminolevulinske kisline
• Ca - kalcij
• Cd – kadmij
• Co - kobalt
• Cr – krom
• Cu - baker
• DMA - dimetil arzen
• DNA – deoksiribonukleinska kislina
• DSM-IV - Diagnostični in statistični priročnik za mentalne bolezni, 4. izdaja
• DSM-IV-TR - Diagnostični in statistični priročnik za mentalne bolezni, revidirana 4.
izdaja (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, Text Revision)
• DSM-5 - Diagnostični in statistični priročnik za mentalne bolezni, 5. izdaja
• EDTA – Etilendiamin tetraocetna kislina
• EKG - elektrokardiogram
• FDA - Ameriška zvezna agencija za hrano in zdravila (Food and Drug Administration)
• Fe - železo
• HCl – klorovodikova kislina
• HNO3 – dušikova kislina
• Hg – živo srebro
• ICD-10 - Mednarodna klasifikacija bolezni, 10. revizija (International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems, 10th Revision)
• ICP - Induktivno sklopljena plazma
• ICP-MS - masna spektrometrija z induktivno sklopljeno plazmo
• ISTD – interni standard
• K3Fe(CN)6 - kalijev ferocianid
• KIKKB – Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo
• KME – Komisija za medicinsko etiko
• Li – litij
• Mg - mangan
• MMA - monometil arzen
• Mn - mangan
• NAG - N-acetil-b-D-glukozaminidaza
• NaOH – natrijev hidroksid
• Pb - svinec
• PDD-NOS - pervazivne razvojne motenje, ki niso drugače opredeljene (pervasive developmental disorder not otherwise specified)
• SAM – spekter avtističnih motenj
• Se - selen
• SH - sulfhidrilna skupina
• SPECT - Enofotonska emisijska računalniška tomografija
• SPSS - Statistical Package for Social Sciences
• UKC – Univerzitetni Klinični center
• WHO - Svetovna zdravstvena organizacija
• ZDA – Združene države Amerike
• Zn - cink
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Vsebnost reagenčnega kompleta CREA FlexÒ reagent cartidge za določanje
kreatinina v urinu ... 42
Preglednica II: Prikaz preiskovancev v posameznih skupinah glede na spol in starost ... 45
Preglednica III: Prikaz opisne statistike za skupino SAM ... 46
Preglednica IV: Prikaz opisne statistike za kontrolno skupino ... 47
Preglednica V: Rezultati Shapiro-Wilkovega testa normalne porazdelitve v skupini otrok s SAM in kontrolni skupini otrok ... 51
Preglednica VI: Rezultati rangov Mann-Whitneyevega U-testa za meritve koncentracij toksičnih in esencialnih kovin/kreatinin ... 53
Preglednica VII: Rezultati Mann-Whitneyevega U-testa za koncentracijo toksičnih in esencialnih kovin/kreatinin in z zeleno označene vrednosti p, kjer je prišlo do statistično značilne razlike ... 55
Preglednica VIII: Prikaz opisne statistike skupine otrok z avtizmom ... 56
Preglednica IX: Prikaz opisne statistike skupine otrok z visoko funkcionalnim avtizmom ... 57
Preglednica X: Normalnost porazdelitve s Shapiro-Wilkovim testom za vse tri skupine otrok in z zeleno označene vrednosti p, kjer je prišlo do statistično značilne razlike ... 60
Preglednica XI: Rezultati rangov koncentracij toksičnih in esencialnih kovin/kreatinin v vseh treh skupinah... 62
Preglednica XII: Rezultati Kruskal-Wallisovega testa več neodvisnih vzorcev v vseh treh skupinah in z zeleno označene vrednosti p, kjer je prišlo do statistično značilne razlike... 64
Preglednica XIII: Rezultati post-hoc testa s Holm-Bonferroni popravkom primerjave vseh treh skupin in z zeleno označene vrednosti p s popravkom, kjer je prišlo do statistično značilne razlike ... 65
KAZALO SLIK
Slika 1: Analizator Agilent 7700 ... 34
Slika 2: Shematski prikaz induktivno sklopljene plazme (povzeto po (128)) ... 37
Slika 3: Prikaz osnovnih komponent analizatorja ICP-MS (povzeto po (127)) ... 38
Slika 4:Shematski prikaz sistema za uvajanje vzorca v ICP-MS (povzeto po (130)) ... 39
Slika 5: Shematski prikaz detekcije ICP-MS (povzeto po (129))... 40
Slika 6: Prikaz kemijske reakcije določanja kreatinina v urinu... 43
Slika 7: Histogrami normalnost porazdelitve esencialnih kovin (Li, Mg, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Cu, Zn in Se) v skupini otrok s SAM in kontrolni skupini otrok ... 50
Slika 8: Histogrami normalnost porazdelitve toksičnih kovin (Cd, Hg, Pb, As in Al) v skupini otrok s SAM in kontrolni skupini otrok ... 51
Slika 9: Kvantilni diagrami porazdelitve esencialnih (Li, Mg, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Cu, Zn in Se) in toksičnih (Cd, Hg, Pb, As in Al) kovin za vse tri skupine otrok ... 59
1. UVOD
Avtizem in Aspergerjev sindrom sta kompleksni bolezni, ki po najnovejših smernicah spadata med avtistične spektrične motnje. Med te motnje spadajo še pervazivna razvojna motnja, Rettejev sindrom in sindrom krhkega kromosoma X. Obe bolezni se izražata na zelo različne načine iz česar lahko predpostavljamo, da je različen tudi vzrok za nastanek bolezni, ki pa je danes še vedno neznan. Čeprav sta bolezni po novem karakterizirani kot nevrobiološki motnji, specifičnega označevalca in s tem povezanega biološkega testa za odkrivanje bolezni še ne poznamo (1, 2, 3). Diagnostika obeh motenj poteka na podlagi mnogih kriterijev, ki izhajajo iz vedenjskih in razvojnih vzorcev. Glavni cilj raziskav na tem področju je najti vzroke za nastanek teh bolezni ter odkriti dovolj specifične biokemične označevalce, ki bi omogočili zgodnje odkrivanje bolezni, ki je ključno za zdravljenje in vključevanje obolelih v terapije, ki blažijo simptome ter dajejo boljše prognoze za življenje. Raziskave vključujejo področja kot so genetika, okoljski dejavniki, prenatalne in postnatalne poškodbe, možgansko delovanje, nevrokemične in imunološke dejavnike (1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9).
1.1. AVTIZEM, ASPERGERJEV SINDROM IN SPEKTER AVTISTIČNIH MOTENJ (SAM)
Avtizem manifestira v zgodnjem otroštvu in gre za razvojno motnjo. Uvrščamo jo med pervazivne nevrološke-biološke motnje. Zanjo so značilne motnje v socialnih interakcijah, izrazit odklon v komunikacijskih veščinah (težave z verbalno in neverbalno komunikacijo), omejena ter ponavljajoča se obnašanja, interesi in aktivnosti (RRBs). Te simptomi so prisotni od zgodnjega otroštva in omejujejo ter slabšajo vsakodnevno delovanje. Kljub temu, da se fenotip spreminja z duševno starostjo otroka, ti simptomi ostajajo enaki skozi celotno obdobje.
Ker ti simptomi vplivajo na celoten razvoj otroka, je avtizem uvrščen med pervazivne motnje.
Uvrščenost med razvojne motnje pa je posledica spreminjanja vedenja z odraščanjem (1, 10, 11, 12). Klinični znaki se začnejo izražati nekje pri 12-14 mesecih, največkrat pa jih zaznamo pri 18 mesecih, vendar je končna diagnoza postavljena šele okoli 3 leta starosti ali kasneje (10, 12, 13, 14). Popolnoma vsi otroci z diagnozo avtizem imajo hude motnje na področju socialnih interakcij, močno pa se razlikujejo v resnosti in oblikah motenj na področju kognitivnih motenj.
Prav tako se zelo razlikuje intelektualna sposobnost otrok z avtizmom. Razlike so ogromne, vse od otrok z visoko inteligenco pa do otrok z duševno zaostalostjo, ki prevladuje in je izražena pri 70% otrocih (6, 13, 14). Mnogokrat se pojavi tudi preobčutljivost ali zmanjšana
občutljivost za čutne dražljaje, kar je velikokrat razlog tudi za samopoškodbe (1, 15). Zaradi tako obširnega in širokega spektra kliničnih znakov in motenj, so strokovnjaki določili izraz
»spekter avtističnih motenj« ali skrajšano SAM (16). Med SAM uvrščamo avtizem, ki velja za najtežjo obliko, Aspergerjev sindrom, ki velja za blažjo obliko in ga danes označujejo tudi kot visoko funkcionalni avtizem ter skupino pervazivnih razvojnih motenj, ki niso drugače opredeljene (pervasive developmental disorder not otherwise specified: PDD-NOS). V revizirani četrti izdaji Diagnostičnega in statističnega priročnika za mentalne bolezni (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition, Text Revision: DSM- IV-TR) je bil SAM uvrščen v skupino pervazivnih razvojnih motenj (PDDs). Med pervazivne razvojne motnje po teh kriterijih spadajo tudi Rettejev sindrom in otroška dezintegrativna motnja. Po novih kriterijih pete izdaje Diagnostičnega in statističnega priročnika za mentalne bolezni DSM-5 pa je opisana samo ena kategorija spektra avtističnih motenj, ki nadomešča podtipe avtističnih motenj, Aspergerjev sindrom in PDD-NOS četrte izdaje. Spremenili so se tudi kriteriji za diagnostiko, ki so v četrti izdaji zajemali tri področja, v novejši peti izdaji pa so bili skrčeni na dve področji (8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19).
Aspergerjev sindrom je po stari klasifikaciji razvojna motnja, ki manifestira v zgodnjem otroštvu. Uvrščamo jo med pervazivne-nevrološke-biološke motnje. Zanj so značilne motnje v socialnih interakcijah, komunikacijske, govorne in slušne motnje ter senzorična občutljivost.
Oboleli zelo težko spontano navezujejo socialne stike in sklepajo prijateljstva, imajo omejene interese, ko pa jih nekaj zanima se na to popolnoma fokusirajo. Bolniki z Aspergerjevim sindromom nimajo jezikovnih in intelektualnih težav, zato se danes ta sindrom imenuje kar visoko funkcionalni avtizem. Vsi simptomi so prisotni od zgodnjega otroštva, vendar jih je zelo težko zaznati, saj ne ovirajo toliko vsakodnevnega delovanja. Veliko ljudi ravno zato ostane brez diagnoze za čas življenja. Kljub temu, da se fenotip spreminja z duševno starostjo, ostajajo simptomi enaki. Od kar se šteje tudi za diskretno motnjo, je Aspergerjev sindrom uvrščen med SAM. Klinični znaki se začnejo izražati med 18 in 24 mescem starosti, največkrat pa so zaznani šele po 3 letu starosti. Ker nekateri otroci z Aspergerjevim sindromom izkazujejo akutno zavedanje okolice in močno razvite prilagoditvene sposobnosti, se diagnozi v otroštvu izognejo. Kasneje kot najstniki in odrasli pa so redko kdaj obravnavani v povezavi z Aspergerjevim sindromom. Njihovo obravnavo in postavitev diagnoze lahko izzove stres, sprememba okolja ter soočanje z nekaterimi življenjskimi dogodki. Večinoma imajo normalne inteligenčne sposobnosti, ali so celo zelo nadarjeni in dosegajo velike uspehe na področju znanosti (računalništva, matematike, fizike) ali umetnosti (film, glasba, slikarstvo). Zaradi
njihovega fokusa in posvečanja določenemu področju lahko razvijejo nadpovprečne spretnosti.
Mnogokrat se pojavi tudi preobčutljivost ali zmanjšana občutljivost za določene dražljaje kot so zvok, dotik, okus, vonj, bolečina, temperatura in pogled. V revidirani četrti izdaji Diagnostičnega in statističnega priročnika za mentalne bolezni je bil Aspergerjev sindrom zaznan kot podtip avtističnih motenj. Po novih kriterijih pete izdaje Diagnostičnega in statističnega priročnika za mentalne bolezni DSM-5 pa Aspergerjev sindrom spada v SAM zabeležen kot visoko funkcionalni avtizem, spremenjeni pa so bili tudi kriteriji za diagnosticiranje (2, 8, 18).
1.1.1. ZGODOVINA SPEKTRA AVTISTIČNIH MOTENJ
Prvič je avtistično motnjo opisal psihiater Leo Kanner leta 1943. Njegovi bolniki so kazali hude jezikovne okvare, socialno izolacijo in vztrajne ponavljajoče se motorične stereotipe.
Kljub zelo jasnim in poglobljenim opisom motnje, je avtizem dolgo veljal za vrsto otroške psihotične motnje, mnogokrat celo kot shizofrenična motnja. Ko je postalo jasno, da avtizem in shiziofrenija nimata istih dejavnikov, so vzroke za razvoj avtizma iskali v neustreznih razvojnih pogojih. Do leta 1964 je veljala Bettleheimova teorija, da je avtizem duševna bolezen. Leta 1964 pa je Rimland dokazal, da gre za biološko motnjo in s tem ovrgel Bettleheimovo teorijo (14, 20, 21). Pomembno vlogo sta imela leta 1977 Susan Flostein in Michael Rutter, ki sta objavila študijo v kateri sta preučevala dvojčke z avtizmom in tako dokazala vlogo dednih dejavnikov pri nastanku avtizma (9).
Aspergerjev sindrom je prvič opisal psihiater Hans Asperger leta 1944 po katerem nosi sindrom tudi ime. Njegovi bolniki so kazali motnje v socialnih interakcijah ter omejena, ponavljajoča se vedenja in interese. Tako kot Kanner je za to skupino otrok uporabljal izraz »avtizem«.
Mislili so, da so to bolniki s shizofrenijo, ki kažejo skrajni socialni umik ter samocentričnost.
Njegovo delo je bilo objavljeno v Nemčiji in tako ostalo neznano mednarodni znanstveni skupnosti skoraj pol stoletja, dokler ga niso leta 1991 omenili v učbeniku Ute Frith o avtizmu in Aspergerjevem sindromu. Do takrat je bil Aspergerjev sindrom opisan s strani Lorne Wing leta 1981, ki je predlagala, da se izraz nanaša na posebno skupino otrok, za katere je bilo po prvotnem opisu Aspergerja značilno socialna izolacija in pomanjkanje vzajemnosti v socialnih interakcijah, normalno ali predčasno jezikovno znanje, nadpovprečne jezikovne spretnosti s subtilnimi nepravilnostmi besedne in neverbalne komunikacije (npr. netipična sklanjatev, pedantni besednjak in odsotna ali stereotipna prosodija), omejen in ozek fokus interesov, prekomerno doseganje določenih kognitivnih področij in motorična nerodnost. Asperger je pri
svojih bolnikih zelo poudarjal pozitivne lastnosti (izvirne misli, abstraktni in intelektulizirani interesi). Njegovi opisi bolnikov so imeli ključno vlogo v zgodovini sindroma. Kljub temu, da so nekateri tako avtizem kot Aspergerjev sindrom pripisovali motnjam avtističnega spektra, je zaživela ideja Aspergerjevega sindroma kot avtonomne motnje, ločena od avtizma.
Tako so v devetdesetih letih prejšnjega stoletja začeli odkrivati kromosome, ki so povezani z avtizmom in Aspergerjevim sindromom. Pri avtizmu so bile pomemben predvsem spremembe na kromosom 15, ki jih najdemo tudi pri sindromu krhkega kromosoma X. Poleg kromosoma 15 je bil v ospredju tudi kromosom 9, kasneje pa tudi kromosomi 2q, 7q, 13, 16p in 19p. Za Aspergerjev sindrom pa so bili pomembni predvsem kromosomi 5q21, 3p14, 3q25, 3p23, 15q11-13 in 16p11. Kljub vsemu pa še vedno ni odkrit specifični kromosom povezan z avtizmom in Aspergerjevim sindromom. Mnenje strokovnjakov danes je, da na razvoj SAM vplivajo tudi okoljski dejavniki (3, 14, 20, 21, 22, 23, 24). Kljub številnim raziskavam, hipotezam in trudu strokovnjakov zadnjih 80 let, vzrok za nastanek avtizma in Aspergerjevega sindroma še vedno ni znan.
Združenje ameriških psihiatrov (ASA) je leta 1994 izdalo Diagnostični in statistični priročnik DSM-IV in njegovo revidirano izdajo DSM-IV-TR leta 2000, ki še vedno služi kot podpora pri diagnostiki SAM. Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) je leta 1992 predstavila priročnik Mednarodna klasifikacija bolezni ICD-10 v katerem je prvič opredelila pojem spektra avtističnih motenj in podala kriterije za diagnostiko avtizma in Aspergerjevega sindroma, ki so bili podobni kriterijem iz DSM-IV (1, 4, 15, 16, 17).
Opravljeno je bilo veliko raziskav, ki so skušale odgovoriti na vprašanje, ali je Aspergerjev sindrom posebna motnja ali je visoko funkcionalni avtizem. Ne glede na nekatere klinične in biološke razlike med Aspergerjevim sindromom in visoko funkcionalnim avtizmom, so se končno odločili, da ni dovolj dokazov, ki bi podprli smiselno razlikovanje med motnjami in to vključili v izdajo Diagnostičnega in statističnega priročnika DSM-5 leta 2013 (2, 8, 20, 31).
1.1.2. PREVALENCA SPEKTRA AVTISTIČNIH MOTENJ
SAM je v pediatrični populaciji danes vsaj enako pogost ali pa celo pogostejši od nekaterih zelo dobro poznanih obolenj, kot so sladkorna bolezen, shizofrenija, Downov sindrom, spina bifida, itn. (6, 15, 25).
Podatki o prevalenci se sicer zelo razlikujejo. Na začetku, ko o SAM ni bilo veliko znanega, je bila prevalenca majhna in se je gibala med 3-4 na 10.000 otrok, kasneje pa je močno narasla.
Po podatkih ADDM (Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network) je bila
prevalenca avtizma pri 8 let starih otrocih v ZDA med leti 2000 in 2002 en oboleli otrok na 150 otrok. V samo desetih letih je močno narasla in tako med leti 2010 in 2012 znašala enega obolelega na 68 otrok. Ne moremo z zagotovostjo trditi, da je porast v prevalenci avtizma posledica dejanske povečave prevalence ali pa je povečava posledica sprejetja natančnejših diagnostičnih kriterijev in sprememb v metodah pri diagnostiki (1, 16, 25, 26).
V različnih študijah iz ZDA in Kanade se prevalenca Aspergerjevega sindroma giblje od 1 obolelega na 250 otrok pa vse do 1 obolelega na 10.000. Na Švedskem so izvedli populacijsko študijo katere rezultati so pokazali prevalenco 1 oboleli na 300 otrok. Vendar nam to še vedno ne daje točnih podatkov o prevalenci. Glede na to, da ostane veliko otrok z Aspergerjevim sindromom spregledanih zaradi njihovih zelo dobrih prilagoditvenih sposobnosti, je lahko prevalenca sindroma veliko večja kot nam kažejo dosedanji podatki. Predvidevajo, da je prevalenca Aspergerjevega sindroma petkrat večja kot prevalenca avtizma (2, 6, 18).
Prevalenca je močno odvisna tudi od rase in spola. Razlika v prevalenci med moškim in ženskim spolom se že od samega začetka, ne glede na leto raziskave in prevalenco, giblje okoli 4 – 4,5:1. Kljub temu, tako avtizma kot Aspergerjevega sindroma, ne bi smeli obravnavati kot moške bolezni, saj razlika po vsej verjetnosti nastane zaradi drugačnih bioloških karakteristik med spoloma.
Z izdajo novega priročnika DSM-5 je prevalenca SAM v ZDA pri 8 let starih otrocih narasla na 29,3 na 1.000 otrok (25, 26). SAM se prav tako pogosteje pojavi pri otrocih, ki imajo sorojenca pri katerem je že potrjen SAM (2 - 8%), in pri ljudeh, ki imajo določene druge razvojne motnje (sindrom krhkega kromosoma X, tuberozna skleroza, mentalna retardacija,...) (1, 2, 6, 16, 18).
1.1.3. ZNAKI SPEKTRA AVTISTIČNIH MOTENJ, POSTAVLJANJE DIAGNOZE, ZDRAVLJENJE
Značilna klinična slika avtizma se kaže kot prisotnost motenj oziroma primanjkljaj na področju komunikacije in socialnih stikov z ostalimi ter prisotnost ponavljajočih se stereotipnih gibov in interesov. SAM pokriva veliko simptomov in znakov, ki so od posameznika do posameznika zelo različni ter variirajo od blagih pa do zelo hudih in težkih oblik, odvisni so od starosti obolelega, stopnje storilnosti in sposobnosti posameznika. Razvojni potek otrok s SAM je zelo različen, na nekaterih področjih se razvijajo počasneje (govor in socialni stiki) in tako zelo zaostajajo za vrstniki, na drugih področjih (motorika) pa za vrstniki ne zaostajajo in so dobro razviti (1, 15, 16).
Pri približno 30% otrok z avtizmom se zazna očiten zaostanek in regresijo v razvoju med 14.
in 22. mesecem starosti. Najprej opazimo socialni umik, izgubo očesne komunikacije ter izgubo uporabe besed. Včasih prvotne znake spremljajo tudi spremembe v prehranjevalnih in spalnih navadah ter pojav nenavadnega vedenja (1, 3, 16).
Diagnostične kriterije pri otrocih zelo težko potrjujemo, saj se vedenje otrok konstantno spreminja, se zelo razlikuje od otroka do otroka ter se spreminja s starostjo. Izvedene retrospektivne študije nakazujejo, da večina staršev opazi določene spremembe, težave in odstopanja pri starosti otroka okoli 18 mesecev. Zanesljiva postavitev diagnoze avtizma je tako možna pri starosti otrok med 2. in 3. letom, vendar je postavitev diagnoze širšega spektra avtističnih motenj bolj natančna pri starejših otrocih (1, 3, 15).
Kljub temu, da je bil avtizem uvrščen v nevrobiološke motnje, še vedno nimamo znanega specifičnega označevalca in diagnostičnega parametra, s pomočjo katerega bi postavljali diagnozo (1, 3, 13). Sum na avtizem postavi pediater na osnovi pogovora s starši in vedenjskih značilnosti otroka. Postavitev diagnoze zajema dve stopnji. Prva stopnja poteka na sistematskih pregledih, kjer opravijo razvojni presejalni test in postavijo hipotezo avtistična motnja na osnovi socialne odmaknjenosti ali komunikacijskih težav, ki pa jo je potrebno sistematično preveriti. Druga stopnja diagnoze zajema vključitev multidisciplinarnega tima, v katerega je vključen pediater, psiholog, psihiater, logoped, specialni pedagog, razvojni nevrolog in drugi strokovnjaki. Opravi se poglobljen zdravniški pregled, zbere se natančne anamnestične podatke o razvoju otroka, otroka se postavi v različne razmere in se ga opazuje. Naredi se tudi psihološko testiranje. Po prejemu vseh rezultatov se strne ugotovitve in dobljene rezultate ter sprejme ali ovrže začetno hipotezo (1, 3, 10, 15, 27). Poznamo številna diagnostična orodja za ocenjevanje otrokovega socialnega in komunikacijskega razvoja (1, 15).
Kriteriji, ki se danes uporabljajo za diagnosticiranje avtizma so zapisani v ICD-10 iz leta 1992, DSM-IV-TR iz leta 2000 in v DSM-5 iz leta 2013 (1, 4, 15, 16, 17).
Zgodnje diagnosticiranje spektra avtističnih motenj se je izkazalo za zelo pomembno, saj s tem omogočimo vključitev otrok s SAM v primeren vzgojni program in terapije, ki vplivajo na razvoj možganov (razvoj možganov na katerega lahko vplivamo s terapijami traja do otrokovega 6 leta starosti) in s tem pripomoremo k boljšim sposobnostim otroka v kasnejših letih (1, 3, 15, 16). Postavitev diagnoze je prav tako pomembna za genetsko svetovanje staršem otrok z avtizmom v primeru načrtovanja nove nosečnosti, saj je tveganje, da bo imel tudi naslednji otrok SAM, večje (1, 16).
Specifičnega zdravila, ki bi izboljšalo simptome in znake SAM, zaenkrat še ni na voljo. Pri terapiji se uporabljajo nekatera zdravila, ki samo izboljšujejo in blažijo pridružene simptome,
kot so težave z zmanjšano pozornostjo in koncentracijo, hiperaktivnostjo, obsesijo, agresijo, stereotipnim vedenjem, anksioznostjo, pretiranim strahom, depresijo, avtoagresivnostjo, težave s spanjem in impulzivnostjo. Med zdravila, ki jih uporabljamo sodijo selektivni inhibitorji ponovnega privzema serotonina, inhibitorji prenosa impulzov v dopaminergičnih nevronih, antikonvulzivi in zdravila, ki delujejo na adrenalinske in noradrenalinske sisteme (1, 10, 15, 28). Ta zdravila lahko omilijo simptome in so lahko v pomoč pri nekaterih pacientih, vendar je še vedno najučinkovitejše strukturirano zdravljenje, ki zajema učenje veščin, ukrepanje na vedenjskem in razvojnem področju ter na področju senzorično motoričnih in socialnih veščin. Cilj zdravljenja je pridobitev spretnosti na področju, kjer je bil zaznan primanjkljaj in s tem omogočiti posamezniku boljše vsakodnevno delovanje in zmanjšanje učinka pridruženih motenj (1, 10, 15, 28, 29).
Kot alternativne terapije se omenjajo različne terapije, ki vplivajo na imunski sistem, kot je na primer uporaba imunoglobulinov ali protivirusnih zdravil, prehrana brez glutena in/ali kazeina ter terapij, ki delujejo na gastrointestinalni trakt (uporaba antimikotikov, antibiotikov, prebavnih encimov, probiotikov), uporaba detoksikacijskih terapij (kelacija). Nekateri uporabljajo tudi prehranska dopolnila, kot so vitamini, minerali in določene aminokisline, z namenom moduliranja nevrološkega prenosa, imunskega odgovora ali delovanja preko epigenetskih mehanizmov. Pri alternativnih terapijah za zdaj še ni dovolj znanstvenih dokazov, ki bi nakazovali na njihove pozitivne in negativne učinke pri SAM (1, 10, 15).
Prvi pokazatelji Aspergerjevega sindroma se opazijo okoli starosti 30 mesecev, veliko več pa se jih odkrije pri poznejših letih ali ko začnejo obiskovati šolo. Prvotno opazimo motnje v socialni interakciji, ne opazi pa se komunikacijskih težav tako kot pri avtizmu (4, 32).
Diagnostične kriterije pri otrocih zelo težko potrjujemo zaradi njihovega konstantnega spreminjanja v vedenju, razlik med otroki in spreminjanja s starostjo. Izvedene študije nakazujejo, da starši opazijo določene spremembe, težave in odstopanja pri starosti otroka okoli 3 let. Zanesljiva postavitev diagnoze Aspergerjevega sindroma je možna okoli 5 leta starosti, vendar je povprečna starost otrok, ko jim postavijo diagnozo 11 let. Povprečno mine okoli 8-9 let od zaznanja simptomov s strani staršev in postavitve končne diagnoze (2, 4).
Kljub temu, da je Aspergerjev sindrom uvrščen v SAM in tako med nevrobiološke motnje, še vedno nimamo znanega specifičnega označevalca in diagnostičnega parametra, s pomočjo katerega bi postavljali diagnozo (1, 2). Sum na Aspergerjev sindrom prav tako kot za avtizem postavi pediater na osnovi pogovora s starši in vedenjskih značilnosti otroka. Tudi pri
dveh stopnjah z vključitvijo multidisciplinarnega tima v drugi stopnji diagnoze. Opravi se poglobljen zdravniški pregled, zbere se natančne anamnestične podatke o razvoju otroka, naredi se psihološko testiranje. Po prejemu vseh rezultatov se strne ugotovitve in dobljene rezultate ter postavi ustrezno diagnozo (1, 2, 3, 6, 10, 15, 27, 32).
Kriteriji, ki se danes uporabljajo za diagnosticiranje Aspergerjevega sindroma so zapisani v ICD-10 iz leta 1992, DSM-IV-TR iz leta 2000 in v DSM-5 iz leta 2013 (1, 2, 4, 6, 15, 16, 17, 18).
Zgodnje odkrivanje katere koli oblike spektra avtističnih motenj se je skozi leta izkazalo kot zelo pomembno, saj s tem omogočimo vključevanje otrok z motnjo v primerne vzgojne programe in terapije, ki pripomorejo k izboljšanju otrokovega razvoja in s tem pripomorejo k boljšim sposobnostim otroka v odrasli dobi (1, 2, 3, 4, 15, 16, 18).
Specifičnega zdravila za izboljšanje simptomov in znakov Aspergerjevega sindroma zaenkrat še ni na voljo. Pri terapiji se uporabljajo nekatera zdravila, ki samo izboljšujejo in blažijo pridružene simptome, kot so problemi s pozornostjo, motnje razpoloženja, vedenjske motnje, depresija, anksioznost, agresivnost. Med zdravila, ki jih uporabljamo sodijo selektivni inhibitorji ponovnega privzema serotonina, inhibitorji prenosa impulzov v dopaminergičnih nevronih in zdravila, ki delujejo na adrenalinske in noradrenalinske sisteme (1, 2, 28). Ta zdravila pomagajo omiliti simptome in so v pomoč pri nekaterih pacientih, vendar je še vedno najučinkovitejše strukturirano zdravljenje, ki zajema učenje veščin, ukrepanje na vedenjskem in razvojnem področju, na področju senzorično motoričnih in socialnih veščin. Cilj zdravljenja je pridobitev spretnosti na področju, kjer je bil zaznan primanjkljaj ter spodbujanje in izkoriščanje posebnih veščin v posameznem področju, kjer so bile zaznane večje spretnosti oziroma nadarjenost (2).
1.1.4. SPREMLJAJOČE TEŽAVE SAM IN SOOBOLEVNOST
SAM se najpogosteje pojavlja skupaj z mnogimi drugimi psihiatričnimi in nevro-razvojnimi motnjami. To je razlog, da je veliko število otrok z avtizmom (okoli 75%) duševno zaostalih in ima učne težave, te pa vodijo v razvoj vedenjskih motenj. Težave pri otrocih z motnjami avtističnega spektra se kažejo v motnjah pozornosti, delovnim spominom, hitrostjo motoričnega in mentalnega odziva in hiperaktivnostjo. Mnogi otroci s SAM imajo senzorične motnje, kar vpliva na njihovo preobčutljivost ali neobčutljivost na določene dražljaje (zvok, svetlobo, glasove), hrano, bolečino, oblike, okuse in vonje. Odstotek otrok, pri katerih se v zgodnjem otroštvu ali adolescenci razvije epilepsija, se giblje med 17 in 30. Prav tako pa so
otroci z avtizmom dvakrat bolj dovzetni za razvoj raznih psihiatričnih motenj kot ostali, zato se pri njih pojavlja več anksioznosti, depresije, motenj spanja, hranjenja in odvajanja, avtoagresivnosti, agresivnosti, motenj v pozornosti in hiperaktivnosti. Prisotnost avtizma so odkrili tudi pri nekaterih znanih genetskih mutacijah in kromosomskih nepravilnostih, kot so sindrom krhkega kromosoma X (2 – 5%), tuberozna skleroza (1 – 4%), fenilketonurija, Angelmanov sindrom. Zanimivo pa je, da pri 90% oseb z avtizmom ne najdemo nobenega od teh motenj/sindromov (1, 30).
Tako kot ostale motnje avtističnega spektra, se tudi Aspergerjev sindrom pojavlja skupaj z mnogimi drugimi psihiatričnimi in nevro-razvojnimi motnjami. Bolniki z Aspergerjevim sindromom načeloma niso duševno zaostali in nimajo učnih težav, saj je njihov inteligenčni kvocient normalen ali nadpovprečen. Težave bolnikov z Aspergerjevim sindromom se kažejo v obliki depresije, anksioznosti, vedenjskih motenj (agresivnost, samopoškodovanje, hiperaktivnost), stereotipno gibanje ter motoričnih motenj. Mnogi bolniki z Aspergerjevim sindromom imajo senzorične motnje, kar vpliva na njihovo preobčutljivost ali neobčutljivost na dražljaje kot so dotik, temperatura, bolečina, zvok, svetloba, hrana, okus, vonj in oblika.
Odstotek bolnikov, pri katerih se razvije depresija in anksiozna motnja se giblje okoli 70.
Pojavljajo se tudi motnje spanja, hranjenja in odvajanja, agresivnost, motnje v pozornosti in hiperaktivnost. Pri 11 – 20% bolnikov so odkrili Tourettov sindrom (2, 6).
1.2. ETIOLOGIJA SAM
SAM je multifaktorska bolezen, pri kateri na nastanek njenega fenotipa vplivajo številni dejavniki tveganja. Ti učinki so rezultat delovanja tako toksičnih dejavnikov okolja kot epigenetskih dejavnikov, ki skupaj spremenijo funkcijo genov in s tem tudi funkcijo živčevja.
Razlog delovanja epigenetskih dejavnikov ni povsem znan. Na njih lahko vplivajo posledice fizičnega okolja med katere spadajo biokemične aktivne snovi ter psihološki dejavniki med katerimi je najbolj razširjen stres. Ti dejavniki skupaj lahko spremenijo biokemično delovanje možganov, povzročijo aktivacijo ali deaktivacijo nekaterih genov v določenem obdobju razvoja ali kakorkoli drugače vplivajo na izražanje genov (1, 2, 10).
Vedno več raziskav nakazuje vpletenost oksidativnega stresa ter motenj v presnovi aminokislin na patogenezo SAM. Pri otrocih s spektrom avtističnih motenj so ugotovili motnje predvsem v procesu transmetilacije in transsulfuracije aminokislin, ki vsebujejo žveplo. To je pomembno pri imunskih celicah in nevronih pri sintezi reduciranega glutationa. Ugotovljena je bila tudi spremenjena aktivnost encimov, ki sodelujejo pri antioksidaciji ter znižane vrednosti
glutationa, antioksidantnih metaloproteinov transferina in celuroplazmina in zvišane vrednosti razmerja med oksidirano ter reducirano obliko glutationa (13, 34, 35).
Izvedeno je bilo tudi veliko raziskav na področju imunološke funkcije pri otrocih s SAM, ki so pokazale zelo veliko in široko zbirko možnih nepravilnosti, ki segajo vse od zmanjšanega celičnega odziva, znižanih vrednosti koncentracije komponent komplementa, povečane humoralne imunosti, pa vse do prisotnosti avtoprotiteles (13, 36).
Ker etiologija še vedno ni povsem znana, obstaja veliko predpostavk. Ena takšnih je predpostavka, da so v nastanek SAM vpletene spremembe v gastrointestinalnem traktu.
Spremenjena prepustnost črevesne stene lahko nastane zaradi fizične poškodbe, infekcije, zmanjšanega delovanja sulfotransferaznega sistema, prekomerne razrasti bakterij in glivic ali kot posledica vnetne reakcije na antigene iz hrane (13). To vpliva na povečano absorpcijo eksogenih opioidnih peptidov, ki vplivajo na prenos impulzov v osrednjem živčnem sistemu ter na razvoj otroka v prenatalnem in postnatalnem obdobju, lahko pa vpliva tudi na zmanjšano absorpcijo vitamina B12 iz hrane, kar lahko vpliva na nastajanje mielina (37).
V zadnjih letih so se raziskave osredotočale na nevrobiološko osnovo spektra avtističnih motenj. Vedno bolj namigujejo, da naj bi se nevropatološke spremembe pri tistih, ki imajo povečano tveganje za razvoj spektra avtističnih motenj, zgodile že v zgodnjem prenatalnem obdobju ob sočasni izpostavljenosti teratogenim snovem, kot sta talidomid in valprojska kislina (16).
Pri bolnikih s SAM se že zelo hitro, v prenatalnem obdobju, pojavijo razlike v rasti in organiziranosti možganov. Vidne so tudi spremembe v številu celic, velikosti nevronov, številu serotoninskih receptorjev in receptorjev za ostale nevrotransmiterje (dopamin, glutamat) (5, 10, 16, 38). Prvotne raziskave strukturnega in funkcionalnega slikanja centralnega živčnega sistema so razkrile številne anomalije na nivoju možganskega debla, malih možganov in limbičnega sistema. Znano pa je, da so ti predeli najbolj povezani z razvojem komunikacijskih, motoričnih in socialnih veščin, ki so največja težava in ovira bolnikov s SAM (5, 10).
Čeprav danes že vemo, da so za razvoj SAM potrebni tako genetski dejavniki kot dejavniki okolja, so strukturni in biokemični vzroki za nastanek bolezni ter njihovo zaporedje, še vedno velika uganka (9, 16).
1.2.1. GENETSKI DEJAVNIKI
Ko sta leta 1977 Susan Flostein in Michael Rutter objavila rezultate raziskave na dvojčkih in pokazala, da je pojavnost avtizma pri enojajčnih dvojčkih večja kot pri dvojajčnih, je bilo jasno,
da so v razvoj SAM vpleteni tudi genetski dejavniki. Novejši podatki nakazujejo pojavnost SAM pri 92 % obeh enojajčnih dvojčkov in pri okoli 10 % obeh dvojajčnih dvojčkov.
Pojavnost SAM pri sorojencih pa se giblje med 2 in 8 % (16, 40, 41). Pri sorodnikih avtističnih otrok so bile ugotovljene težave s komunikacijo, izvršitvenimi funkcijami in druge motnje, kar nakazuje na genetsko nagnjenje za SAM. Vse te informacije nakazujejo na to, da je v razvoj bolezni vpletenih več genov. Ravno tako pa je različno izražanje značilnosti, ki so povezane s SAM (10, 11, 40). Vse več novejših raziskav podpira hipotezo, da se pri družinah s samo enim članom obolelim s SAM mutacije pojavijo na novo, pri tistih družinah, ki pa imajo več članov obolelih s spektrom avtističnih motenj, pa se mutacije dedujejo (42, 47).
Približno 10 % obolelih s SAM ima tudi kromosomske nepravilnosti in sindrome povezane z genetskimi spremembami. Najpogostejši so tuberozna skleroza, sindrom krhkega kromosoma X in po materi podedovane podvojitve v določenih regijah na kromosomu 15 (15q11-13) kar je razlog za razvoj Angelmanovega sindroma (10, 16, 40, 48). Pojavnost SAM je večja tudi pri nezdravljeni fenilketonuriji in fetalnem alkoholnem sindromu. Zaradi pojavnosti sindroma krhkega kromosoma X pri 3 – 4 % bolnikov s SAM in pojavnosti nekaj značilnosti SAM pri 30 – 50 % bolnikov s sindromom krhkega kromosoma X, predvidevajo, da je dedovanje genetske nagnjenosti za SAM vsaj delno vezano na kromosom X. Čeprav razlogi še vedno niso povsem jasni, bi z genetskimi boleznimi, ki so vezane na kromosom X in z imprintigom (genomskim vtisom), lahko vsaj delno pojasnili pogostejšo pojavnost spektra avtističnih motenj pri moškem spolu v primerjavi z ženskim spolom (10, 16, 40).
Do sedaj je objavljenih ogromno raziskav, ki opisujejo številne gene, ki ne povzročajo spektra avtističnih motenj, ampak povečujejo dovzetnost za njegov razvoj. Opravljene vsegenomske raziskave so odkrile regije na kromosomih 2, 3, 6, 7, 11, 15, 16, 17, 20 , 22 in X, ki lahko vsebujejo enega ali pa več genov, ki so povezani s SAM, čeprav samih genov do zdaj še niso identificirali (16, 40, 43, 44, 45, 46, 48, 49). Genetske raziskave so osredotočene na skupino genov za receptor GABA-A na kromosomu 15, na gene za serotoninski prenašalec 5-HTT (1, 36, 39, 40), na gene za dopaminsko b - hidroksilazo (40) ter genetske spremembe proteina ras (50, 51).
1.2.2. OKOLJSKI DEJAVNIKI
Podatki raziskav zadnjih 50 let prepričljivo kažejo, da so za razoj SAM ključni genetski dejavniki (9, 16), saj je pojavnost klasičnega avtizma pri 60 % enojajčnih dvojčkov, pojavnost spektra avtističnih motenj pa pri kar 92 % enojajčnih dvojčkov. Zaradi nepopolnosti ujemanja
pri enojajčnih dvojčkih predvidevamo, da so v razvoj spektra avtističnih motenj vključeni tudi okoljski dejavniki (22, 23), ki lahko vplivajo na obstoječe genetske dejavnike odgovorne za razvoj spektra avtističnih motenj pri posameznem človeku (16).
V povezavi s SAM tako proučujejo številne okoljske dejavnike, ki bi lahko vplivali na razvoj in nastanek SAM v prenatalnem obdobju, med porodom in tudi postnatalnem obdobju. V prenatalnem obdobju se kot glavni razlog za nastanek spektra avtističnih motenj proučujejo virusne infekcije osrednjega živčnega sistema v maternici (rdečke, herpes, citomegalovirus) ali infekcije kmalu po porodu (16, 23, 52), spolni hormoni med nosečnostjo (13, 16), prisotnost materinih protiteles usmerjenih proti proteinom v človeških možganih, ki v času nosečnosti prehajajo placento (53), ter prisotnost mnogih kemičnih spojin (organofosfatni pesticidi, poliklorirani bifenili) (23, 54). Uživanje nekaterih zdravil v določenem gestacijskem obdobju vemo, da povzročajo simptome SAM (valprojska kislina, talidomid), vplive drugih pa še raziskujejo, predvsem vpliv alkohola, vitamina A ali retinoidov (13, 16, 23).
Povečano tveganje za razvoj SAM bi lahko bil vzrok hipoksičnih zapletov med porodom in hipoksije ploda (55, 56), huda hiperbilirubinemija, ki lahko povzroči nevrološke poškodbe (56), nizka porodna teža ter ekstremna nosečnost (52). Veliko raziskav je bilo opravljenih tudi o uporabi kombiniranega cepiva proti rdečkam, ošpicam in mumpsu in možnosti tveganja za SAM, vendar so zadnje epidemiološke raziskave pokazale, da vzročne povezave med SAM in cepivom ne morajo dokazati (16, 57, 58, 59, 60).
Preučevali so tudi starost staršev in ugotovili, da imajo povečano tveganje za razvoj spektra avtističnih motenj prvorojenci in otroci, ki se rodijo materam starejšim od 35 let (22, 56, 61) ter očetom starejšim od 40 let (55, 61).
Veliko vlogo dejavnikov okolja imajo tudi težke kovine, predvsem živo srebro in svinec, ki lahko poškodujejo živčni sistem v fazi njegovega razvoja (54). Izvedene so bile številne raziskave, ki so iskale možne vzročne posledice med izpostavljenostjo otrok v prenatalnem obdobju ter zgodnjem otroštvu, živemu srebru iz okolja in razvojem možganov pri SAM (16).
Največjo pozornost so namenili uporabi in vnosu tiomersala (etilnega živega srebra) v organizem, saj je to snov, ki se uporablja kot konzervans v cepivih. Rezultati raziskav so zelo različni, saj nekatere kažejo jasno povezanost med tiomersalom in spektrom avtističnih motenj (62, 63, 64, 65, 66) ter na pomankanje podatkov pri njegovi varni uporabi med nosečnostjo in pri nedonošenčkih z zelo nizko porodno težo (67), druge pa kažejo, da se pojavnost SAM zaradi uporabe cepiva s tiomersalom ni povečala (59, 60, 68, 69, 70, 71, 72). Raziskavi izvedeni v Kanadi in Danski sta pokazali, da se je incidenca SAM po uporabi cepiv brez tiomersala povečala (60, 70).
Kljub velikemu številu raziskav, ki so ovrgla povezavo med nevrološkimi motnjami in tiomersalom, ter zaključkom Ameriškega inštituta za medicino (Institute of Medicine – IOM), da ne obstaja vzročne povezave med SAM in tiomersalom (74), je Ameriška zvezna agencija za hrano in zdravila (Food and Drug Administration – FDA) izdala priporočilo, da se, če je le mogoče, za otroke do 6. leta starosti, uporablja cepiva brez tiomersala. Po njihovih podatkih sedaj večina cepiv vsebuje le etilno obliko živega srebra v sledovih (73).
1.3. TOKSIČNI ELEMENTI TEŽKIH KOVIN 1.3.1. Hg - ŽIVO SREBRO
Živo srebro je zelo razširjeno v našem okolju, saj je naša atmosfera in površina izpostavljena nekaj tonam živega srebra. Glavni vir živega srebra je naravno izhlapevanje iz zemeljske skorje, preostanek pa je antropogenega izvora (raznorazna industrija). Nahaja se v različnih fizikalno-kemijskih oblikah, ki imajo specifične toksikološke in kemične značilnosti.
Elementarna oblika živega srebra je toksičen neesencialen element (75, 86). Sodi med anorganske oblike živega srebra poleg anorganskih spojin Hg2+ in Hg+. Organske spojine živega srebra pa so alkil - živo srebro (metilno in etilno živo srebro), alkoksi – živo srebro in aril – živo srebro (fenilno živo srebro).
Glavni vir živega srebra vnesenega v organizem je prehrana, predvsem ribe, s katero vnesemo metilno živo srebro (75, 76, 86).
1.3.1.1. TOKSIKOKINETIKA Hg
Toksičnost spojin živega srebra je odvisna od mnogo dejavnikov, med katerimi so najpomembnejši kemična oblika spojine, odmerek spojine, časa izpostavljenosti spojini in seveda vstopna poti spojine v organizem.
Metilno živo srebro predstavlja največji in glavni delež obremenitve organizma z živim srebrom. Absorpcija metilnega živega srebra iz hrane poteka v tankem črevesu in doseže plato koncentracije živega srebra v krvi 4 do 14 ur po zaužitju s hrano.
Alkilno živo srebro se v krvi in tkivih veže na molekule z nizko molekulsko maso, hemoglobin in glutation, kar pomeni, da zelo hitro prehaja krvno – možgansko bariero, placento, prehaja pa tudi v materino mleko (75, 77). Koncentracije živega srebra v krvi pri novorojenčkih so kar 1,5 do 1,9 krat višje kot koncentracije živega srebra v krvi pri materi (76, 78).
V krvi se med 90 in 95 % vsega metilnega živega srebra nahaja v eritrocitih. Delež nakopičenega metilnega in etilnega živega srebra v možganih je do 10% (76, 79).
Največji delež metilnega živega srebra, kar 90 %, se izloči preko žolča v feces. Izločanje z urinom je sprva majhno, vendar s časom narašča in tako po približno 100 dneh po izpostavljenosti znaša že približno 20 % celotne izločene dnevne količine.
Toksičnost živega srebra je velik problem zaradi zelo dolge biološke razpolovne dobe metilnega živega srebra. Biološka razpolovna doba metilnega živega srebra se giblje vse od 42 dni v mleku doječih mater, 50 dni v polni krvi, 70 dni v celotnem telesu in kar 240 dni do 1 leta v možganih (76, 78, 79, 86).
1.3.1.2. KLINIČNA SLIKA IZPOSTAVLJENOSTI Hg
Na prizadetost organov in s tem tudi klinično sliko ter znaki pri izpostavljenosti živemu srebru je odvisno od spojine kateri smo izpostavljeni, količine ter časa izpostavljenosti, načinu absorpcije v organizem ter stopnji razvoja organizma. Najpogosteje prizadeti organi so pljuča, gastrointestinalni trakt, ledvica, osrednji živčni sistem in koža. Nekateri posamezniki pa lahko razvijejo tudi preobčutljivost na živo srebro, ki se imenuje akrodinija (76, 77, 80).
Na toksične vplive alkilne oblike živega srebra je najbolj občutljiv živčni sistem (77, 81).
Različne oblike živega srebra imajo drugačen vpliv na organizem. Pri izpostavljenosti organskim oblikam živega srebra se pojavijo predvsem nevrološki simptomi, ki se kažejo kot plahost, živčnost, razdražljivost, tremor, motnje čutil (vid, voh, okus, sluh), gibalne motnje, motnje spanja, težave s spominom, depresija. Sčasoma pa lahko pride tudi do paralize dihalnih mišic, ki vodi v smrt. Latentna faza pri izpostavljenosti metilnemu živemu srebru iz okolja je precej dolga, saj traja približno 10 let pred pojavom prvih kliničnih znakov nevrotoksičnosti.
Živo srebro vpliva na kopičenje živega srebra v osrednjem živčnem sistemu v anorganski obliki ter na prenašanje živčnih signalov. To delovanje naj bi povzročalo nevrotoksične učinke.
Anorganska oblika živega srebra sicer zelo slabo prehaja krvno – možgansko bariero, kar nakazuje na možnost biotransformacije metilnega živega srebra v anorgansko obliko po prehodu bariere in s tem ostane živo srebro ujeto v živčnem sistemu (76, 77, 78, 86).
Sposobnost regeneracije tkiva osrednjega živčnega sistema je zelo nizka, nalaganje živega srebra v osrednjem živčnem sistemu pa je zelo počasno, kar ima za posledico izražanje nevroloških učinkov še dolgo po izpostavljenosti živemu srebru (77). Vpliv staranja pa povzroči tudi izražanje sub - kliničnih lezij, ki ravno tako pripomorejo k zapoznelemu izražanju kliničnih znakov (78).
Vpliv in učinke živega srebra na otroke se obravnava od zanositve in vse do njihovega 18 leta starosti, ko so njihovi biološki sistemi popolnoma razviti. Pri tistih otrocih, katerih matere so
bile med nosečnostjo izpostavljene organskim oblikam živega srebra, so zaznali predvsem nevrološke simptome. Ti so variirali vse od zaostanka na verbalnem in motoričnem področju, vse do resnih in hudih poškodb možganov (76, 77, 81, 86). Prav tako pa so ugotovili, da resnost nevroloških simptomov pri otrocih korelira s količino zaužitega metilnega srebra matere med nosečnostjo. Bolj so bili prizadeti otroci, ki so bili izpostavljeni metilnemu živemu srebru v drugem tromesečju nosečnosti. Razlikovala pa se je tudi pojavnost glede na spol, saj so bili simptomi veliko bolj izraženi pri dečkih kot pri deklicah (77). Pri kroničnem izpostavljanju mater so pri otrocih opazili slabšo fino – motorično funkcijo, zmanjšano pozornost, primanjkljaj na govornem področju, zmanjšano sposobnost pomnjenja in učenja, zmanjšano vizualno – prostorsko sposobnost, ter zmanjšan inteligenčni kvocient (54, 77, 81, 82).
Dolgotrajno povišana koncentracija živega srebra v možganih povzroči spremembe v nevrološkem razvoju možganov. Vpliva na spremembe migracije in delitve živčnih celic (83).
Izpostavljenost ploda zelo visokim odmerkom metilnega živega srebra v maternici povzroči tudi zaostalost v duševnem razvoju (54). Izpostavljenost toksičnim učinkom v času razvoja se izrazi šele kasneje in se lahko še poglablja, tudi po prenehanju izpostavljenosti (77, 80).
Ugotavljanje izpostavljenosti živemu srebru najpogosteje poteka z določanjem koncentracije živega srebra v krvi in urinu. Za nedavno izpostavljenost živemu srebru se določi živo srebro v urinu in krvi, čeprav je korelacija pri nizki izpostavljenosti zelo slaba. Na trenutno koncentracijo živega srebra v krvi vpliva tudi koncentracija metilnega živega srebra, ki ga vnesemo s hrano, zato so vrednosti lahko lažno višje (79, 86). Možnost za hitro identifikacijo izpostavljenosti živemu srebru daje enostavno določanje živega srebra v urinu. V urinu se nahaja večji delež anorganskega živega srebra, koncentracija organskega živega srebra v urinu pa predstavlja zelo majhen delež, zato je določanje v urinu primernejša metoda za določanje izpostavljenosti anorganski oblikam živega srebra. Na žalost še ni povsem jasno, ali je razmerje v koncentraciji živega srebra v urinu in krvi pri različnih odmerkih izpostavljenosti konstantno (77). Za določanje dolgotrajne izpostavljenosti metilnemu živemu srebru je priporočljivo živo srebro določati v laseh, čeprav je koncentracija v laseh lahko lažno višja na račun zunanje kontaminacije (77, 79, 86).
Zaradi nefrotoksičnih učinkov pri obremenitvi z živim srebrom lahko določamo tudi biološke označevalce za zmanjšano ledvično funkcijo, kot so koncentracija serumskega kreatinina, aktivnost N-acetil-b-D-glukozaminidaze (NAG) in prisotnost proteinov v urinu (77, 86).
Biološki označevalci pri zvišani vrednosti metilnega živega srebra v urinu so porfirini, med katerimi so najpomembnejši specifični profili s povišanimi vrednostmi prekoproporfirna, koproporfirina ter pentakarboksiporfirina (84).
1.3.1.3. MEHANIZMI TOKSIČNEGA DELOVANJA Hg
Glavna lastnost mehanizma biološkega delovanja živega srebra je njegova visoka vezalna afiniteta do sulfhidrilnih skupin na proteinih zunajcelične in znotrajcelične membrane ter organelov. Njegova vezava najverjetneje povzroči deaktivacijo številnih encimov in strukturnih proteinov. Vpliva tudi na transportne procese v celici ter spremeni prepustnost celične membrane. Malo manjša je vezavna afiniteta na aminske in karkoksilne skupine.
Raziskave v povezavi z živim srebrom so se usmerile predvsem v spremembe, ki jih živo srebro povzroči pri prepustnosti krvno – možganske bariere, povečanju oksidativnega stresa, motnjah pri podvojevanju DNA, aktivnosti polimeraze DNA ter sintezi proteinov, motnjah simpatičnega prenosa signalov, motnjah imunskega sistema ter na številnih drugih področjih.
Živo srebro z vezavo na sulfhidrilne spojine povzroči spremembe statusa sulfhidrilnih spojin, kar pripelje do oksidativnega stresa, peroksidacije lipidov, motnje v delovanju mitohondrijev, spremembe v presnovi hema in tako zmanjša obrambo celic proti oksidativnemu stresu.
Oksidativni stres v ledvicah povzroči oksidativne poškodbe ledvic, ki lahko privedejo do številnih biokemičnih sprememb, med katerimi so tudi povečano izločanje porfirinov v ledvicah. Vezava živega srebra z glutationom in metalotioninom v ledvičnih celicah sproži sintezo številnih encimov, ki za svoje delovanje potrebujejo glutation, ter metalotionina in številnih stresnih proteinov (76, 77, 85, 86).
Predvidevajo, da zelo podobni mehanizmi delovanja potekajo tudi v nevronih, ki naj bi bili močno občutljivi na delovanje živega srebra zaradi nizke koncentracije endogenega glutationa ali pa so neučinkoviti pri obrambi proti oksidativnemu stresu.
Organske oblike živega srebra so dobro topne v lipidih, zato se lahko prerazporedijo v mielin in inhibirajo vzdraženost nevronov, ob enem pa z vezavo na transportne proteine vplivajo na njihovo funkcijo. Z eksperimenti so uspeli dokazati, da so učinki metilnega živega srebra na transport aminokislin in mikrotubule živčnih celic v razvijajočem se živčnem sistemu, vidni pred pojavom prvih znakov zastrupitve in predno se zmanjša aktivnost encimov. Vzrok za nevrotoksično delovanje v času pred rojstvom in v prvih tednih življenja so toksični učinki na mikrotubule, ki imajo vpliv na delitev in migracijo živčnih celic.
Vezava živega srebra na proteine povzroči spremembo v kemični strukturi ter v terciarni strukturi proteinov, kar ima za posledico izgubo biološke aktivnosti proteinov. Takšni proteini postanejo tudi imunogeni in povzročijo imunski odgovor organizma na lastne celice (75, 77).
1.3.2. Al - ALUMINIJ
Aluminij je najpogostejša kovina zemeljske skorje. Njegova uporaba je zelo razširjena, saj se uporablja v obliki dodatkov hrani, v kozmetiki, pri hemodializi kot vezalec fosfatov ter kot antacid (87). Vstop aluminija v telo poteka predvsem s hrano, v manjši meri pa tudi z vodo (do 3%). Veliko večje koncentracije v telesu pa imajo tisti, ki so aluminiju poklicno izpostavljeni (88).
1.3.2.1. TOKSIKOKINETIKA Al
Absorpcija aluminija in njegovih spojin je zelo slaba, saj se v gastrointestinalnem traktu absorbira manj kot 0,5 % dnevnega vnosa. Ves preostanek dnevnega vnosa aluminija se izloči s fecesom. Absorpcija je odvisna od kemične oblike, ionske moči, pH ter prisotnosti kelatorjev kot so citrat in askorbinska kislina (87, 88, 89). Dejavnika, ki vplivata na absorpcijo naj bi bila tudi prisotnost kalcija in železa ter starost (88).
V krvi se aluminij v večini nahaja v plazmi - 99 %, preostali 1 % pa je v eritrocitih. V plazmi ga je večina vezanega na proteine, največ na albumin in transferin (75, 88, 89).
Aluminij se porazdeljuje po vseh tkivih, vendar ga največ, kar 50 %, najdemo v kosteh, četrtina ga je v pljučih, kopiči pa se tudi v možganih (75, 87). Raziskave na živalskih modelih so pokazale, da aluminij prehaja placento in se kopiči tudi v plodu, nekaj pa ga prehaja tudi v materino mleko (87).
Izločanje absorbiranega aluminija poteka predvsem z urinom (83 %), majhen delež pa s fecesom (manj kot 2 %). Razpolovna doba se razlikuje glede na izpostavljenost in pri kronični izpostavljenosti znaša 6 mesecev ali več, pri akutni izpostavitvi pa približno 8 ur (88).
1.3.2.2. KLINIČNA SLIKA PRI IZPOSTAVLJENOSTI Al
Akutnih primerov zastrupitve z orlanim vnosom aluminija v populaciji, ki mu poklicno ni izpostavljena, ni znanih.
Povečana količina aluminija v telesu je lahko vzrok zmanjšane ledvične funkcije in/ali velik vnos aluminija v organizem. V teh primerih lahko pride do toksičnih učinkov, ki se najbolj izražajo na kosteh ter v osrednjem živčnem sistemu. Pri kronični izpostavljenosti oziroma
