BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA
DIPLOMSKO DELO
TINA VOGRINEC
UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA Študijski program: Kemija in biologija
Vpliv vnosa vode na koncentracijo mikroveziklov v periferni krvi
DIPLOMSKO DELO
Mentorica: prof. dr. Marija Bešter Rogač Kandidatka: Tina Vogrinec Somentorica: prof. dr. Veronika Kralj-Iglič
Ljubljana, september 2016
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija kemije in biologije na Pedagoški fakulteti Univerze v Ljubljani. Opravljeno je bilo v Laboratoriju za klinično biofiziko Zdravstvene fakultete in Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija Oddelka za kemijo je za mentorico diplomske naloge imenovala prof. dr.
Marijo Bešter-Rogač, za somentorico pa prof. dr. Veroniko Kralj-Iglič.
Predsednik: izr. prof. dr. Iztok Devetak
UL, Pedagoška fakulteta, Oddelek za biologijo, kemijo in gospodinjstvo Mentorica: prof. dr. Marija Bešter-Rogač
UL, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Oddelek za kemijo in biokemijo
Somentorica: prof. dr. Veronika Kralj-Iglič
UL, Zdravstvena fakulteta, Laboratorij za klinično biofiziko
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod mentorstvom prof. dr. Marije Rogač-Bešter in somentorstvom prof. dr. Veronike Kralj-Iglič.
Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Tina Vogrinec
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dn
KG membranski mikrovezikli/ voda/ hidracija/ homeostaza/ pretočna citometrija AV VOGRINEC, Tina
SA BEŠTER-ROGAČ Marija (mentorica)/ KRALJ-IGLIČ Veronika (somentorica) KZ SI-1000 Večna pot 113/ Zdravstvena 5
ZA Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Oddelek za kemijo in biokemijo/ Zdravstvena fakulteta, Laboratorij za klinično biofiziko LI 2016
IN Vpliv vnosa vode na koncentracijo mikroveziklov v periferni krvi TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)
OP IX, 40 str., 5 tab., 10 sl., 50 vir.
IJ sl JI sl/en
AL V sklopu diplomske naloge smo želeli izdelati študijo populacije zdravih oseb, ki bi obravnavala vpliv vnosa tekočine na koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz periferne krvi. Ugotovili smo, da se je koncentracija celičnih mikroveziklov v izolatih iz krvi znatno (26%) in mejno statistično značilno (p = 0,055) povečala pri preiskovancih, ki so zaužili 30% manj vode kot običajno. Ugotavljali smo tudi koreliranost med koncentracijami posameznih sestavin v urinu in koncentracijo mikroveziklov. Večina koncentracij teh sestavin statistično značilno korelira s koncentracijo mikroveziklov. Med koncentracijami posameznih sestavin krvne plazme in celic v krvi na eni strani ter koncentracijo mikroveziklov na drugi strani pa razen v dveh primerih (natrij, kloridi) nismo ugotovili statistično pomembne koreliranosti.
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Dn
CX membrane microvesicles/ water/ hydration/ homeostasis/ flow citometry AU VOGRINEC, Tina
AA BEŠTER-ROGAČ Marija (supervisor)/ KRALJ-IGLIČ Veronika (co-supervisor) PP SI-1000 Večna pot 113/ Zdravstvena 5
PB University of Ljubljana, Faculty of Chemistry and Chemical Technology, Department of Chemistry and Biochemistry /Faculty of Health Sciences, Laboratory of Clinical Biophysics
PY 2016
TI The impact of water intake on concentrations of mikrovesicles in peripheral blood DT Graduation thesis (University studies)
NO IX, 40 p., 5 tab., 10 fig., 50 ref.
LA sl AL sl/en
AB Within the thesis we wanted to make a study on a population of healthy individuals, which would address the impact of liquids intake on concentration of isolated microvesicles from peripheral blood. We found a significant (26%) and marginally statistically significant (p = 0,055) increase of concentration of isolated microvesicles from blood in subjects, who have consumed 30% less water than usual. We also determined a correlation between individual components in urine and the contreation of microvesicles. Most of the concentrations of those components are in statistically significant correlation with the concentration of microvesicles. We haven't found any statistically significant correlation between the concentrations of individual components of blood plasma and blood cells on the one hand, and the concetration of microvesicles on the other, except in two cases (sodium, chlorides).
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO TABEL ... VII KAZALO SLIK ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... IX
1 UVOD ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 CELIČNI MIKROVEZIKLI ... 3
2.1.1 Celični mikrovezikli in njihov pomen ... 3
2.1.2 Mehanizmi mikrovezikulacije bioloških membran ... 4
2.1.3 Določanje mikroveziklov v izolatih iz telesnih tekočin ... 6
2.2 HIDRACIJA ČLOVEŠKEGA TELESA ... 7
3 NAMEN RAZISKAV ... 10
4 OSNOVNE HIPOTEZE ... 11
5 MATERIALI IN METODE ... 12
5.1 PREISKOVANE OSEBE ... 12
5.2 ODVZEM VZORCEV PERIFERNE KRVI IN ODDAJA VZORCA URINA ... 13
5.2.1 Odvzem krvi... 13
5.2.2 Oddaja naključnega urina ... 13
5.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJE MIKROVEZIKLOV IZ PERIFERNE KRVI ... 13
5.3.1 Izolacija mikroveziklov iz periferne krvi ... 14
5.3.1.1 Priprava fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom s soljo (PBS) ... 14
5.3.1.2 Postopek izolacije MV ... 14
5.3.2 Določanje koncentracije mikroveziklov s pretočnim citometrom ... 15
5.4 DOLOČANJE HEMATOLOŠKIH IN BIOKEMIJSKIH PARAMETROV PERIFERNE KRVI ... 16
5.4.1 Hematološka analiza krvi ... 16
5.4.2 Biokemijska analiza krvi ... 16
5.5 DOLOČANJE PARAMETROV NAKLJUČNEGA URINA ... 17
5.6 STATISTIČNA ANALIZA VZORCEV ... 17
6 REZULTATI ... 19
7 RAZPRAVA ... 23
7.1 VPLIV VNEŠENE VODE PRED ODVZEMOM KRVI NA KONCENTRACIJO MIKROVEZIKLOV ... 23
7.2 POVEZAVA KONCENTRACIJE CELIČNIH MIKROVEZIKLOV S PARAMETRI
URINA ... 23
7.3 POVEZAVA KONCENTRACIJE CELIČNIH MIKROVEZIKLOV S PARAMETRI KRVI ... 24
7.4 MOŽNOSTI IZBOLJŠANJA PONOLJIVOSTI IN ZANESLJIVOSTI METODE DOLOČANJA MV IZ KRVI ... 26
8 SKLEPI ... 27
9 POVZETEK ... 28
10 PRENOS TEME V ŠOLSKO PRAKSO ... 29
10.1 RAZTOPINE ... 29
10.2 MAŠČOBE ... 32
11 LITERATURA ... 36
KAZALO TABEL
Tabela 1: Klasifikacija dehidracije po smernicah WHO (Davenport M. in Sinha C.K.
2010). ... 8 Tabela 2: Biokemične preiskave krvnega seruma in načini določanja standardnih
parametrov krvi (vir: interno gradivo AdriaLab d.o.o). ... 16 Tabela 3: Preiskave naključnega urina in načini določanja posameznih parametrov urina (vir: interno gradivo Laboratorija za analitiko urina in spremljanje koncentracije zdravil, UKC Ljubljana). ... 17 Tabela 4: Vpliv vnosa tekočine na parametre urina in krvi. ... 19 Tabela 5: Korelacije parametrov urina in krvi s koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz krvi. ... 21
KAZALO SLIK
Slika 1: Izolat iz periferne krvi zdravega človeka. Slika je bila pridobljena z vrstičnim elektronskim mikroskopom (Šuštar V. in sod., 2011a). Vidni so residualni eritrociti in številni MV. ... 3 Slika 2: Shema brstenja celične membrane (levo) (Kralj-Iglič, 2015), in brstenje celice linije urotelijskega raka T24, slikano z vrstičnim elektronskim mikroskopom (desno), (neobjavljeni rezultati V. Šuštarja in sodelavcev, z dovoljenjem avtorjev). ... 5 Slika 3: Shema brstenja celične membrane navznoter (Kralj-Iglič, 2015). ... 5 Slika 4: Apoptoza celice linije Purkat (levo) in izolirana apoptotska telesca iz teh celic (desno). Vzorci so bili slikani z vrstičnim elektronskim mikroskopom (neobjavljeni
rezultati V. Šuštarja, D. Pisetskega in sodelavcev, z dovoljenjem avtorjev). ... 5 Slika 5: Shema fragmentacije celice zaradi strižnih sil (A-I) in deformirani fragmenti v izolatih iz konjske krvi (J in K). Bela puščica prikazuje fragment s tankimi vratovi (Šuštar in sod. 2011a)... 6 Slika 6: Izolat MV iz periferne krvi zdrave osebe, slikan z vrstičnim elektronskim
mikroskopom (neobjavljeni rezultati V. Šuštarja in sodelavcev, z dovoljenjem avtorjev). ... 7 Slika 7: Pretočni citometer MACSQuant analizator (Miltenyi Biotec GMbH, Bergisch Gladbach, Nemčija), (levo) (dostopna na internetu: http://www.ortopedska-
klinika.si/pages.php?id_meni=86&id=62). Prikaz potovanja delca in sipanja svetlobe v pretočni citometriji (desno) (dostopna na internetu:
http://www.abcam.com/protocols/introduction-to-flow-cytometry) ... 15 Slika 8: Analizator Siemens ADVIA 2120i za hematološko analizo krvi (dostopna na internetu: http://mclabor.de/Siemens-Haematologie-Analysator-Advia-2120i). ... 16 Slika 9: Eksperiment – Raztapljanje sladkorja v vodi (dostopna na internetu:
https://eucbeniki.sio.si/nit5/1328/index1.html) ... 31 Slika 10: Zmes olja in vode (levo), zmes olja, vode in tekočega mila (desno) (Vir: lasten).
... 34
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
CRP – C-reaktivni protein KO – klinični oddelek MV – mikrovezikli OŠ – osnovna šola
PBS – fosfatni pufer s soljo (z NaCl) SŠ – srednja šola
UKC – Univerzitetni klinični center WHO – World health organization
1 UVOD
Celični mikrovezikli (MV) so z membrano obdani delci, ki se odcepijo od celične membrane in postanejo prosto gibljivi z obtokom telesnih tekočin. Imajo pomembno vlogo pri medcelični komunikaciji in s svojo zmožnostjo prenašanja beljakovin, lipidov ter nukleinskih kislin vplivajo na številne fiziološke in patološke funkcije celic in tkiv (Yanez- Mo M in sod. 2015).
V svojih lastnostih MV odražajo stanje in vrsto celice, iz katere izvirajo. Pri različnih boleznih je stanje celic spremenjeno, zato lahko mikrovezikli, ki izvirajo iz teh celic, značilno predstavljajo bolezensko stanje (Šuštar in sod., 2011a). Potencialna manipulacija vezikulacije in uporaba mikroveziklov kot biomarkerjev patološkega stanja pa bi lahko omogočala zgodnje odkrivanje in učinkovitejše zdravljenje različnih bolezni. (Müller G.
2012).
MV lahko izoliramo iz telesnih tekočin. Rezultati številnih kliničnih raziskav so pokazali, da je pri bolnikih z rakom, različnimi motnjami strjevanja krvi, avtoimunskimi boleznimi in sladkorno boleznijo tipa 2, koncentracija mikroveziklov v izolatih iz periferne krvi večja kot pri kontrolah brez ugotovljene bolezni (Burger D. in sod. 2013, Gyorgy B in sod. 2011).
Čeprav je bil v zadnjem desetletju dosežen velik napredek na področju raziskovanja MV, je naše razumevanje mehanizmov, preko katerih mikrovezikli delujejo, še vedno pomanjkljivo.
Metode za pridobivanje in določanje mikroveziklov iz telesnih tekočin kljub številnim raziskavam še niso dovolj ponovljive in natančne, da bi jih lahko uporabili v klinični praksi.
Poleg parametrov, ki izvirajo iz tehnologije pridobivanja mikroveziklov iz krvi, je pomembno tudi, kako mora biti darovalec krvi pripravljen na odvzem. Opazili so namreč, da vnos hrane na nivoju populacije vpliva na koncentracijo MV v izolatih iz krvi (Šuštar in sod., 2011b).
Preliminarne raziskave v okviru dela Laboratorija za klinično biofiziko Zdravstvene in Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani, ki so bile izdelane na nekaj posameznikih, so pokazale, da tudi vnos tekočine lahko vpliva na koncentracijo mikroveziklov v izolatih.
Namreč, na homeostazo organizma lahko vplivamo s fiziološkimi in vedenjskimi prilagoditvami (Cheuvront S.N. in sod., 2010), kar bi se lahko odrazilo tudi na lastnostih krvnih celic in plazme.
Mehanizem uravnavanja ravnovesja telesnih tekočin je pri sesalcih zelo dobro razvit. Vrši se preko mehanizma žeje in osmotskoreceptorskega ledvičnega mehanizma, ki omogoča resorbcijo vode v ledvicah. Ker je ta mehanizem izredno občutljiv na spremembo osmolalnosti plazme (zazana 1% spremembo osmolalnosti krvne plazme) (Bourque C.W.
2008), smo želeli preveriti, kako vnos vode vpliva na parametre krvi in urina in njihovo povezanost s koncentracijo celičnih mikroveziklov v izolatih iz krvi.
Zato smo v okviru tega dela želeli izdelati študijo populacije zdravih oseb, ki bi obravnavala vpliv vnosa tekočine na koncentracijo MV v izolatih iz krvi. Ugotovitve so pomembne za izdelavo protokola priprave preiskovancev za odvzem krvi zaradi določanja MV.
Pričakujemo namreč, da bi to prispevalo k izboljšanju ponovljivosti in zanesljivosti metod, ki temeljijo na določanju MV.
2 PREGLED OBJAV
2.1 CELIČNI MIKROVEZIKLI
2.1.1 Celični mikrovezikli in njihov pomen
Opis membranskih veziklov, izoliranih iz krvne plazme, je mogoče najti že iz leta 1946 (Chargaff E. in sod., 1946). Kasneje so z elektronsko mikroskopijo opazili fragmente trombocitov, izoliranih iz krvi in jih opisali kot inerten trombocitni prah (Wolf P., 1967).
Danes pa membranske vezikle opisujemo kot z membrano obdane delce, ki odcepljeni od celične membrane in prosto gibljivi z obtokom telesnih tekočin, predstavljajo pomemben medcelični komunikacijski sistem. Proces membranske vezikulacije so opazili pri prokariontskih celicah in skoraj pri vseh tipih eukariontskih celic tako in vitro kot in vivo (Pap in sod., 2009, Yanez-Mo M in sod., 2015).
Membranski vezikli so bili izolirani iz številnih telesnih tekočin: krvi, možganske tekočine, sline, urina, plevralnega izliva, amnionske tekočine, materinega mleka, semenske tekočine, solz pa tudi iz običajnih celičnih gojišč (Yanez-Mo M in sod., 2015). So običajna sestavina krvne plazme in drugih telesnih tekočin. V izolatih iz krvi v normalnih pogojih od 50-90%
vseh mikroveziklov nosi receptorje, značilne za trombocite, do 25% nosi receptorje, značilne za eritrocite, nekaj procentov nosi receptorje, značilne za endotelne celice, nekaj % MV ostane tudi neobarvanih s protitelesi, ki obarvajo naštete receptorje (Diamant M. in sod., 2002; Šuštar in sod., 2011b).
Slika 1: Izolat iz periferne krvi zdravega človeka. Slika je bila pridobljena z vrstičnim elektronskim mikroskopom (Šuštar V. in sod., 2011a). Vidni so residualni eritrociti in številni MV.
V medcelični komunikaciji imajo mikrovezikli pomembno vlogo. Preko površinskih membranskih molekul in z neposrednim prenašanjem proteinov, nukleinskih kislin, bioaktivnih lipidov, membranskih receptorjev, infektivnih delcev (kot npr. virus HIV), signalov in informacij med celicami, ki so v neposredni bližini, ter med različnimi tkivi, stimulirajo, aktivirajo ali zavirajo procese v celici.
Številne fiziološke funkcije MV in vpliv tovora, ki ga prenašajo v prejemniške celice ostajajo še neznane vendar njihovo vlogo v patofiziologiji, imunologiji in onkologiji intenzivno raziskujejo (Lee T.H. in sod., 2011, Muralidharan-Chari V. in sod., 2010, Pap in sod., 2009, Ratajczak in sod., 2006).
Proces vezikulacije bioloških membran poteka tako pri zdravih osebah kot pri osebah z razvitimi bolezenskimi znaki (Raposo G. in sod., 2013). Mikrovezikli igrajo pomembno vlogo pri poškodbah (Ratajczak in sod., 2006), vnetjih in infekcijah (Pap in sod., 2009, Ratajczak in sod., 2006), krvožilnih obolenjih – tromboza (Van Wijk in sod., 2003, Ratajczak in sod., 2006), angiogenezi (Van der Pol E. in sod., 2012), avtoimunih boleznih (Lee in sod., 2012), rakavih obolenjih (Kralj-Iglič V., 2012, Muralidharan-Chari V. in sod. 2010), homeostazi in koagulaciji (Van Wijk in sod., 2003; Pap in sod., 2009) in še mnogih drugih boleznih.
Znanje o mikroveziklih nam lahko služi kot diagnostično orodje pri prepoznavanju različnih bolezni (rak, tromboze, vnetja) ter kot morebitno tarčno orodje pri zdravljenju teh bolezni.
Podane pa so bile hipoteze, da bi lahko z manipuliranjem vezikluacije membran vplivali na homeostazo in s tem delovali anti-metastasko, anti-koagulantno ter protivnetno (Ratajczak in sod., 2006, Kralj-Iglič V., 2015, Štukelj R. in sod., 2013).
2.1.2 Mehanizmi mikrovezikulacije bioloških membran
Membranski vezikli se odcepljajo iz vseh vrst celic, še posebej pa če so celice izpostavljene različnim oblikam stimulacije ali stresa (Van der Pol E. in sod., 2012). Stimulacijo lahko povzročajo kemični dražljaji, kot so citokini, trombin in endotoksini ali fizikalni dražljaji kot je strižna sila (Štukelj R., 2014). Poznamo več mehanizmov nastanka membranskih veziklov, ki še niso popolnoma raziskani.
Prvi mehanizem je nastanek MV z neposrednim izvihavanjem celične membrane navzven (Slika 2). Membranski brsti se odcepijo od površine membrane in postanejo prosti MV (Kralj-Iglič, 2015).
Slika 2: Shema brstenja celične membrane (levo) (Kralj-Iglič, 2015), in brstenje celice linije urotelijskega raka T24, slikano z vrstičnim elektronskim mikroskopom (desno), (neobjavljeni rezultati V. Šuštarja in sodelavcev, z dovoljenjem avtorjev).
Drugi mehanizem je brstenje celičnih membran v notranjost celice. Eksosomi tako nastanejo znotraj celice in se sproščajo iz multivezikularnih endosomov, ko se le-ti zlijejo s celično plazmalemo (Colombo M. in sod., 2014) (Slika 3).
Slika 3: Shema brstenja celične membrane navznoter (Kralj-Iglič, 2015).
Tretji mehanizem je fragmentacija celice pri programirani celični smrti ali apoptozi. V procesu apoptoze se v zunanjo raztopino celice sprostijo z membrano obdani fragmenti- apoptotska telesca, ki vsebujejo celične organele in posamezne dele DNA (Gyorgy B. in sod., 2011) (Slika 4).
Slika 4: Apoptoza celice linije Purkat (levo) in izolirana apoptotska telesca iz teh celic (desno).
Vzorci so bili slikani z vrstičnim elektronskim mikroskopom (neobjavljeni rezultati V. Šuštarja, D.
Pisetskega in sodelavcev, z dovoljenjem avtorjev).
Četrti mehanizem pa je vezikulacija zaradi mehanskega stresa, ki je zelo izražena v procesu izolacije. Zaradi velikih strižnih sil takrat nastanejo vezikli različnih velikosti (Šuštar in sod, 2011a).
Slika 5: Shema fragmentacije celice zaradi strižnih sil (A-I) in deformirani fragmenti v izolatih iz konjske krvi (J in K). Bela puščica prikazuje fragment s tankimi vratovi (Šuštar in sod. 2011a).
2.1.3 Določanje mikroveziklov v izolatih iz telesnih tekočin
Pogosto uporabljani postopki za izolacijo MV so sestavljeni iz centrifugiranja in izpiranja vzorca. V literaturi smo zasledili različne protokole (Diamant M. in sod., 2002, Yuana Y. in sod., 2010), vendar metoda izolacije in analize MV še ni dovolj primerljiva in zanesljiva, da bi jo lahko uporabili pri diagnostiki in terapiji (Witwer K.W. in sod., 2013). To so potrdile tudi klinične študije Laboratorija za klinično biofiziko, Zdravstvene fakultete in Medicinske fakultete, UL (Slokar T., 2015).
Najpogostejše uporabljeni pristop za določanje MV je pretočna citometrija, poznamo pa tudi druge metode kot so mikroskopiranje, testi ELISA itd. Z metodo pretočne citometrije merimo sipanje svetlobe na MV, ki je v povezavi s številom in velikostjo populacije MV. Z
mikroskopiranjem izolatov MV pa pridobimo informacije o obliki mikroveziklov (SEM - vrstična elektronska mikroskopija) in njihovi notranji strukturi (TEM - transmisijska elektronska mikroskopija) (Šuštar V. in sod., 2010).
Za določanje mikroveziklov je potrebno zelo previdno ravnanje z vzorci (odvzem krvi, transport, priprava in shranjevanje vzorca), da zmanjšamo eksperimentalne artefakte. Na učinkovitost izolacije mikroveziklov iz periferne krvi imajo pomemben vpliv parametri izolacije (temperatura, hitrost centrifugiranja, vrsta in koncentracija antikoagulanta) (Witwer K.W. in sod., 2013, Štukelj R., 2014).
Slika 6: Izolat MV iz periferne krvi zdrave osebe, slikan z vrstičnim elektronskim mikroskopom (neobjavljeni rezultati V. Šuštarja in sodelavcev, z dovoljenjem avtorjev).
2.2 HIDRACIJA ČLOVEŠKEGA TELESA
Voda ima številne vloge v človeškem telesu . Je glavna sestavina človeškega telesa, je topilo in sodeluje v kemijskih reakcijah kot medij ali reaktant. Po telesu prenaša hranilne in odpadne snovi, sodeluje v termoregulaciji, deluje kot blažilec stresa. Je topilo in sodeluje v kemijskih reakcijah (Jequier E in sod., 2009).
Odstotek vode v telesu se spreminja glede na starost, spol in sestavo telesa. Najvišji je pri novorojenčkih in odraslih moških, najmanjši pa pri odraslih ženskah in odraslih z obilo maščobnega tkiva (Rupnik M., 2005).
Voda se v telesu nahaja kot znotrajcelična in zunajcelična tekočina. Pri plodu in novorojenčku je zunajcelične tekočine več kot znotrajcelične. V prvem letu starosti se pri razmerje med znotrajcelično in zunajcelično tekočino ustali na enakem razmerju kot pri odraslih; moški imajo nekoliko večji delež znotrajcelične tekočine. Tako je znotrajcelične tekočine približno 30-40 % telesne teže, zunajcelične tekočine pa 15 % v intersticiju in 5 % v plazmi (Kržišnik C. in sod., 2013).
Vse telesne tekočine imajo približno enako osmolalnost. Osmolalnost je definirana kot število osmotsko aktivnih delcev na kilogram topila. Normalna osmolalnost tekočin v človeškem telesu znaša med 285–295 mosm/l (Popkin B.M.,. 2010).
Človeško telo ves čas uravnava volumen in osmolalnost tekočine v žilah. Osmolalnost plazme uravnavamo z vnosom in izločanjem vode. V ravnovesju sta vnos vode in nastajanje vode ob oksidaciji enaka izgubi vode skozi kožo, pljuča in z urinom ter blatom; uravnavamo lahko le vnos vode s pitjem in izločanje z urinom. Že zelo majhen porast osmolalnosti sproži občutek žeje in poveča izločanje antidiuretičnega hormona (ADH), ki poveča število vodnih kanalčkov (akvaporinov) v ledvičnih zbiralcih in tako zmanjša izločanje vode skozi ledvice.
Nadzor nad osmolalnostjo se podreja nadzoru znotrajžilne prostornine, ki v primeru pomembne izgube sproži žejo in izločanje ADH ne glede na osmolalnost (Kržišnik C. in sod., 2013).
Po smernicah WHO lahko ocenimo stopnjo dehidracije (Tabela 1).
Tabela 1: Klasifikacija dehidracije po smernicah WHO (Davenport M. in Sinha C.K. 2010).
Blaga dehidracija Zmerna dehidracija Huda dehidracija Izguba % telesne
teže odras. Človeka < 3 % 3 – 9 % > 9 %
Žeja da da da
Suha ustna sluznica da da da
Znižan turgor kože ne da da
Srčni utrip normalen hiter hiter in slab
Sistolični tlak normalen normalen ali nižji nizek ali neizmerljiv
Količina seča primerna zmanjšana zmanjšana ali
odsotna
Pri določanju kliničnega statusa preiskovance so standardne preiskave koncentracije sečnine, kreatinina, glukoze in elektrolitov v krvnem serumu, ter koncentracije in lastnosti krvnih celic v krvi. Ob dehidraciji je v krvi manj vode, zato ugotavljamo povečano vrednost prostorninskega deleža krvnih celic in povečano vrednost koncentracije hemoglobina v krvi.
Pri dehidraciji v urinskem vzorcu zasledimo povišane vrednosti osmolalnosti urina ali specifične teže urina, volumna urina (Perrier E., 2013, Kržišnik C. in sod., 2013).
Specifična teža urina je povečana (≥ l,025) in se z rehidracijo postopno zmanjšuje. V urinu lahko zasledimo nekaj levkocitov, eritrocitov in beljakovin (0,3-1 g/I), kar je po rehidraciji manj verjetno (Kržišnik C., 2013). Še bolj kot specifična teža urina, nam informacijo o koncentraciji urina poda osmolalnost urina (Reddi, A.S. 2014).
3 NAMEN RAZISKAV
Ugotoviti, kako vnos tekočine pred odvzemom krvi vpliva na koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz periferne krvi zdravih preiskovancev.
Ugotoviti, kakšna je povezava koncentracije mikroveziklov v izolatih iz periferne krvi s standardnimi parametri krvi (parametri hematograma in biokemičnih laboratorijskih preiskav).
Ugotoviti, kakšna je povezava koncentracije mikroveziklov v izolatih iz periferne krvi s parametri analize prvega jutranjega urina (specifična teža, gostota, sestava).
Izboljšati zanesljivost in ponovljivost metode določanja koncentracije mikroveziklov iz periferne krvi.
4 OSNOVNE HIPOTEZE
Na osnovi podatkov in ugotovitev iz literature smo postavili naslednje hipoteze:
1. Koncentracija MV v izolatih iz periferne krvi je manjša, če preiskovanci pred odvzemom krvi pijejo več vode.
2. Koncentracija MV v izolatih iz krvi pozitivno korelira s koncentracijo sestavin v urinu.
3. Koncentracija MV v izolatih iz krvi pozitivno korelira s koncentracijo sestavin krvne plazme in koncentracijo celic v krvi.
5 MATERIALI IN METODE
5.1 PREISKOVANE OSEBE
Za raziskavo ugotavljanja vpliva hidriranosti na homeostazo smo pridobili vzorce kri in urina 26 prostovoljcev, od tega je bilo 18 žensk in 7 moških. Populacijo so predstavljale zdrave osebe. Ženske so bile stare med 25 in 57 let, njihova povprečna starost je bila 39,6 let. Moški so bili stari med 28 in 67 let, povprečna starost pa je bila 40,4 let.
Eksperiment smo izvajali v dveh serijah. Posamezen poskus ugotavljanja povezave hidriranosti s koncentracijo MV smo izvajali tri dni.
Preiskovanci so sodelovali v raziskavi tako, da so v tednu pred odvzemom krvi beležili podatke o dnevno zaužiti tekočini. Za tekočino so upoštevali vso tekočino, tudi tisto v živilih (sadje, zelenjava, tekoča hrana npr. juhe, jogurti). Preiskovance smo naključno razdelili v dve skupini: kontrolno skupino (KS) in testno skupino (TS). Prosili smo jih, naj se v času izvajanja raziskave vzdržijo pitja alkoholnih pijač, zmerno pijejo kavo ter se zmerno telesno rekreirajo.
Preiskovanci v kontrolni skupini so ves čas poteka raziskave pili običajno dnevno količino tekočine. Pred odvzemom krvi so bili tešči 12 ur.
Preiskovanci v testni skupini so dan pred prvim odvzemom krvi zaužili okrog 30 % več od svoje povprečne dnevno zaužite količine tekočine. Poleg tega so popili dan pred odvzemom krvi pred spanjem še 0,5 L vode in naslednji dan zjutraj približno uro pred odvzemom še 0,5 L vode. Na dan odvzema so po odvzemu popili običajno količino tekočine, naslednji dan (dan pred drugim odvzemom krvi) pa so popili okrog 30% manj od svoje povprečne dnevno zaužite količine tekočine. Tako kot kontrolna skupina so bili pred odvzemom krvi tešči 12 ur.
Vse telesne tekočine smo dobili s pisnim privoljenjem prostovoljcev. Ob odvzemu krvi in urina smo upoštevali določila deklaracije o biomedicinskih raziskavah na človeku in konvencije o varovanju človekovih pravic in dostojanstva človeškega bitja v zvezi z uporabo biologije in medicine (WMA Declaration of Helsinki, 2016).
5.2 ODVZEM VZORCEV PERIFERNE KRVI IN ODDAJA VZORCA URINA 5.2.1 Odvzem krvi
V Laboratoriju za klinično biofiziko na Katedri za ortopedijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani smo odvzeli vsem prostovoljcem kri iz medialne kubitalne vene z iglo debeline 21 gauge (MULTI Sample Needle, Nipro Corporation, Tokyo, Japonska). Z odvzemi smo začeli ob 7h zjutraj. Vsak preiskovanec je daroval okrog 10 ml krvi v tri epruvete:
3 ml periferne krvi za hematološko analizo krvi (epruveta z antikoagulantom K3EDTA (C10H13N2O8K3 · 2H2O))
4 ml periferne krvi za biokemijsko analizo krvi (epruveta z antikoagulantom heparin (C12H19NO20S3))
2,7 ml periferne krvi za izolacijo mikroveziklov (epruveta z antikoagulantom trinatrijev citrat dihidrat (Na3C6H5O7 · 2H2O)).
5.2.2 Oddaja naključnega urina
Preiskovane osebe so v standardnem plastičnem lončku za urin oddale tudi 10 ml naključnega urina. Oddaja urina se je izvedla neposredno po odvzemu krvi v sanitarnih prostorih Ljubljani Laboratorija za klinično biofiziko na Katedri za ortopedijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Urin je bil primerno transportiran v Laboratorij za analitiko urina in spremljanje koncentracije zdravil, Poliklinika, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, UKC Ljubljana.
5.3 DOLOČANJE KONCENTRACIJE MIKROVEZIKLOV IZ PERIFERNE KRVI Postopek izolacije membranskih veziklov iz periferne krvi in določanje koncentracije mikroveziklov s pretočnim citometrom smo izvedli takoj po odvzemu krvi v prostorih Laboratorija za klinično biofiziko na Katedri za ortopedijo, UKC Ljubljana.
5.3.1 Izolacija mikroveziklov iz periferne krvi
5.3.1.1 Priprava fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom s soljo (PBS)
Za izolacijo mikroveziklov smo predhodno pripravili fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom s soljo (PBS). Za pripravo le-te smo potrebovali naslednje kemikalije:
8 g natrijevega klorida (NaCl): SIGMA-ALDRIHOL (1kg, Lot 90070),
0,2 g kalijevega klorida (KCl): SIGMA-ALDRIHOL (1kg, Lot 80520),
1,15 g dinatrijevega hidrogenfosfata dihidrata (Na2HPO4 · 2H2O): SIGMA-ALDRIHOL (500 g, Lot 81330),
0,2 g mono kalijevega fosfata (KH2PO4): SIGMA-ALDRIHOL (500g, Lot 9191A),
vode (H2O) do prostornine 1L
trinatrijevega citrata dihidrata (Na3C6H5O7· 2H2O): CARLO ERBA REAGENTS: smo dodali PBS v razmerju 84 μL 0,123M citrata na 10 ml fiziološke raztopine s fofatnim pufrom.
5.3.1.2 Postopek izolacije MV
V postopku izolacije MV iz periferne krvi smo uporabili modificirani protokol M. Diamant in sodelavcev (Diamant in sod., 2002).
Celoten postopek izolacije mikroveziklov smo izvedli pri temperaturi 37 °C. Na enako temperaturo smo pred odvzemom krvi ogreli tudi epruvete krvi z trinatrijevim citratom.
Pridobljene vzorce krvi smo pred nadaljnjo izvedbo postopka izolacije mikroveziklov inkubirali pri temperaturi 37 °C.
Za ločitev krvnih celic od plazme smo vzorce 20 minut centrifugirali pri 1550 obratih s centrifugo Centric 400/R (Domel, d.o.o, Železniki, Slovenija). Nato smo zgornjih 250 μL plazme posameznega vzorca odpipetirali v 1,8 mL mikrocentrifugirke Eppendorf. Od vsake preiskovane osebe smo pripravili dva vzorca.
Mikrocentrifugirke z vzorci smo nato centrifugirali pri 17570 obratih 30 minut s centrifugo Centric 200/R (Domel, d.o.o, Železniki, Slovenija). Z vrha posameznega vzorca smo odpipetirali 225, preostalih 25 µL plazme z usedlino pa razredčili z 225 µL PBS - citrata (pH
= 7,4). Vzorce smo nato premešali v mešalniku s 1200 obrati nato pa jih v celoti
resuspendirali ter znova centrifugirali 5 minut na 17570 obratih. Nato smo odstranili zgornjih 225 supernatanta ter v 25 μL usedline dodali 75 µL pufra PBS - citrata (pH = 7,4).
5.3.2 Določanje koncentracije mikroveziklov s pretočnim citometrom
Pretočna citometrija je tehnika za identifikacijo in kvantifikacijo delcev, ki v suspenziji drug za drugim potujejo skozi ozek snop laserske svetlobe. Laserski žarek se ob stiku s celico sipa in absorbira na delcih (slika 7 (desno)).
Slika 7: Pretočni citometer MACSQuant analizator (Miltenyi Biotec GMbH, Bergisch Gladbach, Nemčija), (levo) (dostopna na internetu: http://www.ortopedska-
klinika.si/pages.php?id_meni=86&id=62). Prikaz potovanja delca in sipanja svetlobe v pretočni citometriji (desno) (dostopna na internetu: http://www.abcam.com/protocols/introduction-to-flow- cytometry)
Za merjenje koncentracij mikroveziklov v izolatih krvi smo uporabili metodo pretočne citometrije. Uporabili smo pretočni citometer MACSQuant analizator (Miltenyi Biotec GMbH, Bergisch Gladbach, Nemčija) z različico 2.4. programa MACSQuantifyTM (Militenyi Biotec GmbH, Bergish Gladbach, Nemčija) s 405 nm, 488 nm in 640 nm zračno hlajenimi laserji (slika 7 (levo)).
Kljub enaki količini zaužite vode, je v koncentraciji MV pri predstavnikih kontrolne skupine med odvzemoma (ko so bili preiskovanci testne skupine dobro hidrirani in manj hidrirani) prišlo do večjih razlik, za katere smo predpostavili, da izvirajo iz slabe ponovljivosti metode.
Povprečno razliko koncentracij MV kontrolne skupine med obema odvzemoma smo zato prišteli (odšteli) meritvam MV testne skupine, saj so vzorci testne in kontrolne skupine bili tretirani enako (so bili hkrati centrifugirani in podvrženi istim zunanjim parametrom).
5.4 DOLOČANJE HEMATOLOŠKIH IN BIOKEMIJSKIH PARAMETROV PERIFERNE KRVI
Hematološke in biokemijske analize krvi je izvedel zasebni diagnostični laboratoriju Adria lab d.o.o., Ljubljana.
5.4.1 Hematološka analiza krvi
Za hematološko analizo krvi je bil uporabljen analizator Siemens ADVIA 2120i (Siemens Healthcare Diagnostics, Združene države Amerike) (slika 8), ki deluje po principu pretočne citometrije. Za analizo pa se uporablja Technic-onova tehnologija, ki je osnovana na optičnih načinih zaznave celic in njihovih lastnosti.
Slika 8: Analizator Siemens ADVIA 2120i za hematološko analizo krvi (dostopna na internetu:
http://mclabor.de/Siemens-Haematologie-Analysator-Advia-2120i).
5.4.2 Biokemijska analiza krvi
Tabela 2: Biokemične preiskave krvnega seruma in načini določanja standardnih parametrov krvi (vir: interno gradivo AdriaLab d.o.o).
Preiskava Tip vzorca za preiskavo Princip metode
S-Sečnina serum Ureaza/GLDH
S-Kreatinin serum Jaffe kinetična metoda
S-Urat serum Urikaza-PAP
S-Glukoza serum Heksokinazna encimska metoda
S-Kalij serum ISE Indirektna potenciometrija
S-Natrij serum ISE Indirektna potenciometrija
S-Kloridi serum ISE Indirektna potenciometrija
S- CRP serum Imunoturbidimetrična metoda
Za biokemijsko analizo krvi je bil uporabljen analizator Beckman Coulter AU680 (Beckman Coulter, Nyon, Švedska). Določevanje serumskih koncentracije biokemijskih parametrov krvi temelji na principu spektrofotomerije in potenciometrije.
5.5 DOLOČANJE PARAMETROV NAKLJUČNEGA URINA
Kvantitativno določanje koncentracij nekaterih analitov (molskih koncentracij kalija, natrija, klorida, sečnine, kreatinina, urata) in določitev znižanja zmrzišča v naključnem urinu (tabela 3) je izvedel Laboratorij za analitiko urina in spremljanje koncentracije zdravil, Poliklinika, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, UKC Ljubljana.
Kvantitativno določanje koncentracij nekaterih analitov (molskih koncentracij kalija, natrija, klorida, sečnine, kreatinina, urata) in določitev znižanja zmrzišča v naključnem urinu je izvedel, Poliklinika, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, UKC Ljubljana.
Parametri v preglednici 2 so bili analizirani na aparatu Olympus AU 400 (Beckman Coulter).
Tabela 3: Preiskave naključnega urina in načini določanja posameznih parametrov urina (vir:
interno gradivo Laboratorija za analitiko urina in spremljanje koncentracije zdravil, UKC Ljubljana).
Preiskava Tip vzorca za preiskavo Metoda analize
U-Kalij Naključni urin ISE indirektna potenciometrija U-Natrij Naključni urin ISE Indirektna potenciometrija U-Klorid Naključni urin ISE Indirektna potenciometrija
U-Sečnina Naključni urin Encimska barvna metoda Ureaza/GLDH U-Kreatinin Naključni urin Jaffe kinetična metoda
U-Urat Naključni urin Kinetična UV metoda - urikaza PAP
Z znižanjem zmrzišča določamo osmolalnost vzorca naključnega urina. Določanje znižanja zmrzišča so izvedli na analizatorju Osmomat auto proizvajalca Gonotec.
5.6 STATISTIČNA ANALIZA VZORCEV
Podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Pri tem smo uporabili MS Excel 2013 (Microsoft, ZDA, Office Professional Plus 2013). S parnim dvorepim student-t
testom smo določili statistično pomembne razlike (p) med biokemičnimi in hematološkimi parametri krvi, parametri urina med testno in kontrolno skupino preiskovanih oseb. Med posameznimi izmerjenimi parametri smo določali korelacijske povezave pri čemer smo uporabili Pearsonov korelacijski koeficient (r) in ustrezno verjetnost (p), pri čemer smo uporabili program Free Statistics Calculators, Version 4. (Soper D., 2016)
6 REZULTATI
V spodnji tabeli (Tabela 4) so zbrani rezultati raziskave vpliva vnosa tekočine na parametre urina in krvi, kratka razlaga teh rezultatov pa sledi na naslednji strani.
Tabela 4: Vpliv vnosa tekočine na parametre urina in krvi.
Vpliv vnosa tekočine na parametre urina in krvi
povečan vnos vode
enak vnos vode
zmanjšan vnos vode
razlika med zmanjšanim in povečanim vnosom vode (%)
N p
Preiskave urina
Znižanje zmrzišča (mK) 386±166 937±375 1132±524 98 10 210-4 ***
K (mmol/l) 21±11 46±22 39±16 59 10 610-3 ***
Na (mmol/l) 29±13 95±49 79±39 92 10 810-4 ***
Klorid (mmol/l) 39±16 104±61 69±50 55 10 0,07
Sečnina (mmol/l) 91±53 196±82 315±174 110 10 410-4 ***
Kreatinin (mmol/l) 3,4±2,7 11±7,0 13±7,6 119 10 610-4 ***
Urat (mmol/l) 1,1±0,4 2,0±0,9 2,4±1,1 96 10 210-4 ***
Preiskave krvi
Sečnina (mmol/l) 3,7±1,0 4,0±1,2 4,3±1,3 15 10 0,18
Kreatinin (μmol/l) 69±10 69±6,8 72±10 3 10 0,57
Urat (μmol/l) 283±41 298±51 313±55 10 10 0,11
Glukoza (mmol/l) 4,5±0,4 4,55±0,6 4,6±0,4 3 10 0,41
Kalij (mmol/l) 3,9±0,2 4,3±0,2 4,0±0,2 3 10 0,30
Natrij (mmol/l) 134±4 137±1,6 136±4,4 1 10 0,39
Kloridi (mmol/l) 100±3 103±1 101±4 1 10 0,55
CRP (mg/l) 0,7±0,6 2,0±1,9 1,1±1,2 46 10 0,27
Levkociti (109/l) 6,5±1,4 6,2±1,1 6,5±1,5 0 10 0,95 Eritrociti (109/l) 4,8±0,3 4,7±0,4 4,8±0,4 1 10 0,80
Hemoglobin (g/l) 140±10 138±12 141±12 0 10 0,91
Hematokrit 0,42±0,03 0,42±0,03 0,42±0,03 1 10 0,78
MCV (fl) 88±4 88±5 88±4 0 10 1
MCH (pg) 29,5±1,8 29,5±1,9 29,7±1,8 1 10 0,77
MCHC (g/l) 335±7 332±7 334±9 0 10 0,75
MPV (fl) 8,1±0,9 8,8±0,9 8,1±0,8 0 10 1
Trombociti (109/l) 254±51 252±30 267±44 5 10 0,48
Koncentracija
mikroveziklov v izolatih iz krvi (/µl)
2275 2464 2950 26 10 0,055 *
Tabela 4 prikazuje povprečja izmerjenih vrednosti standardnih parametrov urina in krvi ter koncentracije MV v izolatih iz krvi testne skupine (povečan vnos vode in zmanjšan vnos vode) in kontrolne skupine (enak vnos vode). Vidimo, da so standardni parametri urina povedni za status hidriranosti, saj so vrednosti vseh parametrov bile znatno višje ob slabši hidriranosti testne skupine, razlike pa so bile pri šestih parametrih od sedmih statistično zelo pomembne. Tudi standardni parametri krvi so izkazali višje vrednosti ob slabši hidriranosti, vendar pa so bile razlike, razen pri C-reaktivnem proteinu, majhne in statistično nepomembne. Vendar pa na spremenjen status krvi vendar kaže povečana koncentracija MV v izolatih, ki je znatna (26%) in mejno statistično pomembna (p = 0.055).
V 2., 3., in 4. stolpcu so podane povprečne vrednosti ± standardna deviacija. V 5. stolpcu je podana razlika med dvema povprečjema (X in Y) deljena s srednjo vrednostjo: 2(X- Y)/(X+Y), v 6. stolpcu je podana velikost testne skupine (N), katere vzorce smo primerjali po povečanem in zmanjšanem vnosu tekočine, verjetnost p je bila izračunana s parnim dvorepim t-testom. Ena zvezdica in svetlejša obarvanost polj označuje mejno statistično pomembnost razlike (p manjši od 0,05), tri zvezdice in temnejša obarvanost označujejo veliko statistično pomembnost razlike (p manjši od 0,001).
Tabela 5 prikazuje Pearsonove koeficiente korelacij med standardnimi parametri urina in koncentracijo MV v izolatih iz krvi ter med standardnimi parametri krvi in koncentracijo MV v izolatih iz krvi. Upoštevane so bile meritve testne in kontrolne skupine. Pet od sedmih korelacij s parametri urina in dve korelaciji s parametri krvi sta bili statistično pomembni, vse statistično pomembne korelacije so imele pozitivne Pearsonove korelacijske koeficiente.
Tabela 5: Korelacije parametrov urina in krvi s koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz krvi.
Korelacije parametrov urina in krvi s koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz krvi
Pearsonov
koeficient N p
Parameter urina
Znižanje zmrzišča 0,30 48 0,04 *
K 0,32 48 0,03 *
Na 0,10 48 0,50
Klorid 0,32 48 0,03 *
Sečnina 0,26 48 0,07
Kreatinin 0,28 48 0,05 *
Urat 0,28 48 0,05 *
Preiskave krvi
Sečnina 0,05 49 0,74
Kreatinin -0,26 49 0,07
Urat 0,10 49 0,49
Glukoza 0,25 44 0,10
Natrij 0,48 27 0,01 *
Kloridi 0,42 27 0,03 *
CRP 0,20 49 0,17
Levkociti 0,09 49 0,53
Eritrociti 0,03 49 0,84
Hemoglobin 0,07 49 0,63
Hematokrit 0,06 48 0,68
MCV 0 49 1
MCH 0,04 49 0,78
MCHC 0,11 49 0,45
MPV 0,09 49 0,53
Trombociti 0,15 49 0,30
Hidriranost se je najbolj izrazila v parametrih urina in koncentraciji MV v izolatih iz krvi in manj v standardnih biokemičnih parametrih krvi, medtem ko je bil vpliv na koncentracijo celic v krvi in njihove lastnosti najmanjši.
V 2. stolpcu so podani Pearsonovi korelacijski koeficienti, v 3. stolpcu je podano število primerjanih parov (N), v 4. stolpcu je z verjetnostjo (p) podana statistična pomembnost korelacij. Ena zvezdica in obarvanost polj označuje šibko statistično pomembnost (0,05 > p
> 0,01). Verjetnost je bila izračunana z dvorepim testom.
7 RAZPRAVA
7.1 VPLIV VNEŠENE VODE PRED ODVZEMOM KRVI NA KONCENTRACIJO MIKROVEZIKLOV
V pregledu znanstvenih člankov nismo zasledili analiz krvi in merjenj koncentracij mikroveziklov v izolatih krvi v povezavi z vnosom vode pred odvzemom.
V naši raziskavi je bila koncentracija mikroveziklov v izolatih iz krvi ob 30% manjšem vnosu tekočine za 26% večja. Razlika je bila mejno statistično značilna (p = 0,055) (Tabela 4). Tudi pri temu parametru pričakujemo, da bi razlika bila statistično pomembna, če bi bila analizirana populacija preiskovancev večja. Koncentracija mikroveziklov v izolatih iz krvi je tako parameter, dobljen iz krvi, ki se je izkazal kot občutljiv na vnos tekočine.
Ugotovili smo dve statistično pomembni korelaciji med parametroma krvi natrijem in kloridom s koncentracijo mikroveziklov v izolatu iz krvi (Tabela 5). Ob povečanem številu preiskovancev bi se lahko tudi korelaciji z glukozo in C reaktivnim proteinom izkazali kot statistično pomembni, saj sta vrednosti ustreznih verjetnosti bile blizu mejne vrednosti pet procentov (0,1 in 0,07).
Naši rezultati torej kažejo, da je vnos tekočine pred odvzemom krvi pomemben, saj se je koncentracija mikroveziklov v izolatih iz krvi zaradi zmanjšanega vnosa tekočine znatno (26%) in mejno statistično značilno (p = 0,055) povečala, pri čemer je iz parametrov urina razvidno, da je na klinični status preiskovancev pomembno vplival vnos tekočine. Torej lahko rečemo, da rezultati raziskave potrjujejo našo prvo hipotezo o manjši koncentraciji MV v izolatih iz periferne krvi v primeru povečanega vnosa vode v telo.
7.2 POVEZAVA KONCENTRACIJE CELIČNIH MIKROVEZIKLOV S PARAMETRI URINA
Z določanjem znižanja zmrzišča lahko ocenimo osmolalnost vzorca naključnega urina.
Osmolalnost je merilo, ki izraža število delcev v raztopini, in je neodvisna od velikosti in teže teh delcev. Izračunana je kot število osmolov (število molov snovi, ki prispeva k osmotskemu tlaku) na kilogram topila. Za izločanje vode skozi ledvice ima ključno vlogo antidiuretični hormon (ADH). Njegova naloga je zmanjšnje izgubljanja tekočine z urinom ob povišani osmolalnosti krvne plazme (Cheng C.Y.Y. in sod. 2009).
Vsi obravnavani parametri urina so bili ob zmanjšanem vnosu tekočine višji kot ob povečanem vnosu vode (Tabela 4).
Glede na pridobljene rezultate lahko sklepamo, da je vnos tekočine pomembno vplival na parametre urina, saj so bile razlike statistično pomembne pri šestih parametrih (znižanju zmrzišča, ter koncentracijah natrija, kalija, sečnine, kreatinina in urata) (Tabela 4).. Le v enem od parametrov urina (kloridih) razlika ni bila statistično pomembna (Tabela 4). Zaradi majhnega števila preiskovancev v testni skupini (10) in relativno majhne vrednosti verjetnosti p = 0,07 (Tabela 4) pa bi lahko pričakovali, da bi se pri večjem številu preiskovancev tudi pri tem parametru pokazala statistično pomemba razlika. Razlike v vseh parametrih urina so bile tudi znatne (večje kot 50%).
Dvorepi test je prikazal statistično pomembne korelacije petih izmed sedmih parametrov urina s koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz krvi (Tabela 5). Koncentracija mikroveziklov tako pozitivno korelira z naslednjimi parametri: znižanje zmržišča, koncentracija kalija, klorida, kreatinina, urata. Korelacija koncentracije mikroveziklov s koncentracijo sečnine je blizu mejne vrednosti 5% (0,07), medtem ko je korelacija s koncentracijo natrija statistično nepomembna. Rezultati raziskave torej potrjujejo drugo v nalogi postavljeno hipotezo. Glede na zgoraj ugotovljeni korelaciji med količino vnešene vode in koncentracijo MV ter med količino vnešene vode in posameznimi parametri urina, je korelacija med večino parametrov urina in koncentracijo MV pričakovana.
7.3 POVEZAVA KONCENTRACIJE CELIČNIH MIKROVEZIKLOV S PARAMETRI KRVI
V naši raziskavi smo izmerili koncentracije celičnih mikroveziklov v periferni krvi ter določili biokemijske, hematološke parameter krvi. Vsi parametri krvi so bili ob zmanjšanem vnosu vode višji kot ob povečanem vnosu vode. Noben od standardnih parametrov krvi (sečnina, kreatinin, urat, glukoza, kalij, natrij, kloridi, C reaktivni protein, levkociti, eritrociti, hemoglobin, hematokrit, MCV, MCH, MCHC, MPV in trombociti) pa ni prikazal statistično pomembnih razlik zaradi povečanega in zmanjšanega vnosa tekočine. Večina parametrov krvi je v povprečju ostala nespremenjena v okviru standardne deviacije (Tabela 4). Razlika je bila znatna (46%) le pri C reaktivnem proteinu, vendar ni bila statistično značilna (Tabela 4).
Pričakovali smo, da se bodo ob dehidraciji povečale koncentracije sečnine v krvnem serumu, saj v klinični praksi pri dehidraciji ugotavljajo povečano koncentracijo sečnine ob normalni koncetraciji kreatinina. Višja koncentracija sečnine je posledica večje pasivne resorpcije v proksimalnem tubulu zaradi aktivnega ohranjanja natrija in vode (Kržišnik in sod., 2013).
Parameter sečnine se je pri naših preiskovancih ob zmanjšanem vnosu tekočine povečal (Tabela 4), vendar je bila razlika majhna (15%) in statistično nepomembna.
Poleg tega ob dehidraciji zaradi hemokoncentracije ugotavljajo povečane vrednosti hematokrita in hemoglobina (Kržišnik in sod. 2013). Vrednosti hematokrita in hemoglobina so se ob zmanjšanem vnosu pri testni skupini sicer povečale (Tabela 4), vendar razlike niso bile statistično pomembne. Relativno majhen učinek hidriranosti pripisujemo temu, da je bila razlika v vnosu tekočine relativno majhna (30 % običajnega vnosa v vsako smer) in kratkotrajna (znotraj 3 dni).
Pri ugotavljanju korelacij med koncentracijo sestavin krvne plazme oz. koncentracijo celic v krvi in koncentracijo MV je raziskava pokazala na statistično pomembno korelacijo za koncentracijo natrija in kloridov (0,01 in 0,03). Blizu mejne vrednosti (0,07) je tudi korelacija med koncentracijo kreatinina in koncentracijo MV (Tabela 5). Za preostalih 13 parametrov krvi raziskava ni pokazala na korelacijo s koncentracijo MV. Tretje hipoteze tako ne moremo potrditi.
Sesalci imamo zelo dobro razvit in učinkovit mehanizem, ki je odgovoren za ohranjanje ravnovesja telesnih tekočin. Majhne spremembe osmolalnosti plazme (1%) sprožijo tri različne nadzorne sisteme, ki delujejo tesno povezani v uravnavanju osmolalnosti izvencelične tekočine in koncentracije natrija v njej (sestava osmoreceptorjev in antidiuretični hormon (ADH), mehanizem žeje, mehanizem želje za zaužitje soli).
Spremembe osmolalnosti krvne plazme so pri zdravih, mladih osebah težko zaznavne (Sharif-Naeini R 2008).
Na koncentracijo mikroveziklov v izolatih iz krvi pa vplivajo tudi drugi zunanji dejavniki kot je na primer vnos hrane na nivoju populacije (Šuštar in sod., 2011b).
7.4 MOŽNOSTI IZBOLJŠANJA PONOLJIVOSTI IN ZANESLJIVOSTI METODE DOLOČANJA MV IZ KRVI
Metoda določanja celičnih mikroveziklov še ni standardizirana, zato tudi ni vpeljana v klinično prakso. Za natančnejšo oceno vpliva vnosa vode na koncentracijo mikroveziklov v periferni krvi bi bilo potrebno število preiskovancev v testni in kontrolni skupini povečati.
Prav tako bi bilo koristno, da bi preiskovanci beležili dnevnik svojih aktivnosti, prehrane in morebitne posebnosti.
8 SKLEPI
Glede na rezultate opravljene raziskave smo prišli do sledečih zaključkov:
Izolirali smo celične mikrovezikle iz periferne krvi človeka.
Ob zmanjšanem vnosu vode (30% manj kot običajno) se je koncentracija celičnih mikroveziklov v izolatih iz krvi znatno (26%) in mejno statistično značilno (p = 0,055) povečala.
Biokemijski in hematološki parametri krvi (sečnina, kreatinin, urat, glukoza, kalij, natrij, kloridi, C reaktivni protein, levkociti, eritrociti, hemoglobin, hematokrit, MCV, MCH, MCHC, MPV in trombociti) so bili ob zmanjšanem vnosu vode višji kot ob povečanem vnosu vode. Vendar noben od standardnih parametrov krvi ni prikazal statistično pomembnih razlik zaradi povečanega in zmanjšanega vnosa tekočine.
Vnos vode je pomembno vplival na parametre urina, saj so bile razlike statistično pomembne pri šestih parametrih (znižanju zmrzišča, ter koncentracijah natrija, kalija, sečnine, kreatinina in urata). Le v enem od parametrov urina (kloridih) razlika ni bila statistično pomembna.
9 POVZETEK
Membranske mikrovezikle (MV) lahko izoliramo iz telesnih tekočin. V številnih kliničnih raziskavah so dokazali, da imajo MV pomembno vlogo pri medcelični komunikaciji ter tako vplivajo na številne fiziološke in patološke funkcije tkiv, celic. Vendar kljub velikemu napredku na področju raziskav MV mehanizmi mikrovezikulacije še niso popolnoma znani.
Tudi metode izolacije in merjenja celičnih mikroveziklov še niso dovolj ponovljive in zanesljive, zato jih v klinični praksi zaenkrat še ne moremo uporabiti.
Mehanizem uravnavanja ravnovesja telesnih tekočin, osmoregulacija, je pri sesalcih zelo dobro razvita. Vključuje prefinjene mehanizme fizioloških in vedenjskih odzivov, ki omogočajo nadzor nad osmolalnostjo izvencelične tekočine in koncentracije natrija v njej.
V raziskavi nas je zanimalo, kako se pri hidraciji/dehidraciji telesa spreminja koncentracija mikroveziklov v krvi ter želeli izboljšati razumevanje vpliva homeostaze na mehanizme mikrovezikulacije. Raziskali smo tudi kako se spremenijo parametri urina ob povečanem ter zmanjšanem vnosu vode in kakšen je vpliv vnosa/izgube vode na biokemijske, hematološke parametre krvi.
Membranske MV smo iz periferne krvi izolirali s centrifugiranjem in izpiranjem ter s pretočnim citometrom določili koncentracije mikroveziklov. Vzorce krvi preiskovanih oseb pa smo poslali tudi na hematološko, biokemijsko analizo ter analizirali vzorce naključnega urina.
Pokazali smo, da se je koncentracija celičnih mikroveziklov pri zmanjšanem dnevnem vnosu (30% manjši vnos vode kot običajno) znatno (26%) in mejno statistično značilno (p = 0,055) povečala.
Biokemijski in hematološki parametri krvi so bili ob zmanjšanem vnosu tekočine višji kot ob povečanem vnosu tekočine, vendar noben od standardnih parametrov krvi ni prikazal statistično pomembnih razlik zaradi povečanega in zmanjšanega vnosa tekočine.
Vnos vode je pomembno vplival na parametre urina, saj so bile razlike statistično pomembne pri šestih parametrih (znižanju zmrzišča, ter koncentracijah natrija, kalija, sečnine, kreatinina in urata). Le v enem od parametrov urina (kloridih) pa razlika ni bila statistično pomembna.
10 PRENOS TEME V ŠOLSKO PRAKSO
Tema diplomske naloge je za osnovnošolsko in srednješolsko raven prezahtevna. Glede na to da smo v raziskavi preučevali parametre krvi in urina ter celične mikrovezikle pa lahko v šolsko prakso prenesemo določene naravoslovne pojme in kemijske zakonitosti, ki jih lahko obravnavamo v posameznih vsebinskih sklopih Raztopin in Maščob.
10.1 RAZTOPINE
Raztopine so del našega vsakdanjega življenja, čeprav se njihove prisotnosti mnogokrat sploh ne zavedamo. Uporabljamo in uživamo jih vsak dan npr. v gospodinjstvu: soljenje testenin pri kuhanju, sladkanje čaja, gazirane pijače, uporaba fiziološke raztopine pri zdravljenju pacientov itd.
Da dobimo raztopino potrebujemo topilo in topljenec. Snov, v kateri raztapljamo topljenec se imenuje topilo. V večini primerov je topilo voda (polarno), toda poznamo še nekaj drugih topil (alkohol, aceton, bencin). Topila lahko delimo na polarna in nepolarna topila. Da dobimo raztopino potrebujemo še topljenec (sol, sladkor), ki se raztopi v topilu. Torej je topljenec snov, ki jo raztapljamo v topilu (Krašovec U. 2014).
Pregled vsebine Raztopine skozi učni načrt v OŠ in SŠ
Osnovna šola
Učenci se z naravoslovnimi vsebinami srečajo že v 1., 2., in 3. razredu osnovne šole pri predmetu spoznavanje okolja ter v 4. razredu s predmetom naravoslovje in tehnologija.
Od 5. do 7. razreda učenci v vsebinskem sklopu Snovi spoznajo različne pojme in kemijske zakonitosti o raztopinah. V 5. razredu usvojijo pojme raztopina, topljenec ter topilo, v 6.
razredu pa spoznajo lastnosti snovi – gostota. V 7. razredu spoznajo raztopine kot primere zmesi, spoznajo dejavnike, ki vplivajo na hitrost raztapljanja snovi. Srečajo se s pojmoma topnost snovi in nasičenost raztopine in spoznajo, da čiste snovi v zmesi ohranjajo svoje lastnosti (Skvarč M. in sod., 2011).
Učenci 8. razreda v učnem načrtu kemija v vsebinskem sklopu Povezovanje delcev (ionska vez, kovalentna vez) spoznajo nastanek ionske/kovalentne vezi, razlikujejo med (ne)polarnostjo vezi oz. molekule (Bačnik A. in sod., 2011).
V 9. razredu pa v sklopu Povezovanje delcev spoznavajo izbrane lastnosti ionskih in kovalentnih spojin (npr. topnost, električno prevodnost idr.); v sklopu Elementi v periodnem sistemu spoznajo pojem masnega deleža; v sklopu Kisline, baze in soli pa pojme koncentrirane/razredčene/nasičene raztopine in topnost, masnega deleža topljenca v raztopini in masne koncentracije; v vsebinskem sklopu Množina snovi pa pojme množina snovi, molska masa snovi, molarnost (Bačnik A. in sod., 2011).
Srednja šola
Dijaki v srednji šoli nadgrajujejo znanje, ki so ga pridobili pri kemiji v osnovni šoli, in ga prednostno razvijajo. Temo raztopin v 1. letniku spoznavajo v vsebinskem sklopu Raztopine preko predlaganih vsebin: Sestava raztopin, Masni delež, Množinska in masna koncentracija raztopin, Pomen raztopljenih snovi v vodi za življenje. V 2. letniku pa preko vsebinskega sklopa Ravnotežja v vodnih raztopinah ter Reakcije oksidacije in redukcije (Bačnik A. in sod., 2008).
Eksperimentalno delo na temo raztopin
Pouk naravoslovja in kemije je zasnovan na izkustvenem, eksperimentalno raziskovalnem in problemskem pristopu, kar prispeva k razumevanju delovanja naravoslovnih znanosti in pozitivnemu odnosu do naravoslovja in kemije (Bačnik A. in sod., 2008). Eksperimentalno delo z raztopinami lahko poteka v sklopu obravnave nove učne vsebine, naravoslovnega dne, dodatnega pouka, priprav na tekmovanja iz znanja kemije itd.
Osnovna šola
Predmet, razred: Naravoslovje in tehnika, 5. razred Vsebinski sklop: Snovi
Vsebina: Voda
Učni cilj: učenci znajo opredeliti pojme topilo, topljenec in raztopina.
Primer eksperimenta: RAZTAPLJANJE SLADKORJA V VODI
voda (500g), sladkor (100g) voda in sladkor skupaj sladka voda (600 g) Slika 9: Eksperiment – Raztapljanje sladkorja v vodi (dostopna na internetu:
https://eucbeniki.sio.si/nit5/1328/index1.html)
Potek dela: Če vodi primešate sladkor, sladkor navidezno izgine, voda pa postane sladka.
Temu pojavu pravimo raztapljanje. Najbolj pogosto topilo v naravi je voda.
Voda je topilo, sladkor je topljenec, sladka voda je raztopina.
Masa raztopine je enaka masi topila in masi topljenca skupaj. Če je topljenec obarvan, je obarvana tudi raztopina. Raztopina ima večjo gostoto kot voda (Petrovec in sod., 2016).
Srednja šola
Predmet, letnik: Kemija, 2. letnik klasične, strokovne gimnazije Vsebinski sklop: Raztopine
Vsebina: Masni delež
Učni cilji: - učenci ponovijo pojme: topilo, topljenec, raztopina, nasičena raztopina itd.
- učenci uporabljajo masni delež za določanje sestave raztopin
Primer eksperimenta: PRIPRAVA RAZTOPINE NATRIJEVEGA KLORIDA Z MASNIM DELEŽEM
Navodilo: Pripravite raztopino natrijevega klorida, ki bo imela toliko raztopljenega natrijevega klorida, kot jo ima morska voda v Tržaškem zalivu, 3,8 %. Pripravite 200 g
raztopine.
Potrebščine: kuhinjska sol, voda, žlička, kuhinjska tehtnica, merilna posoda.
Postopek dela:
Najprej izračunajte, koliko gramov NaCl potrebujete za pripravo 200 g raztopine.
Računi:
topljenca topljenca
raztopine
w m
m
topljenca topljenca raztopine
m w m
topljenca 0,038 200,0 g 7,6 g
m
S kuhinjsko tehtnico na 0,1 g natančno stehtajte NaCl.
Izračunajte maso vode, ki jo potrebujete. Upoštevajte gostoto vode, ki je 1 g/mL, in z merilno posodo izmerite prostornino vode, ki odgovarja izračunani masi.
Računi:
topila raztopine topljenca
m m m
topila 200,0 g 7,6 g 192, 4 g
m
topila topila
topila
V m
Raztopite NaCl, ki ste ga stehtali mNaCl 7,6 g , v odmerjeni količini vode
H O2 192, 4 mL V .
Dijaki so pripravili raztopino, katere slanost odgovarja slanosti morske vode (Smrdu A. in sod, 2016).
10.2 MAŠČOBE
Maščobe so organske kemijske spojine, ki imajo velik pomen v zgradbi živih bitij. Delimo jih glede na agregatno stanje (trdne, tekoče maščobe) in glede na izvor (živalske, rastlinske maščobe). Zanje je značilno, da se ne topijo v vodi, se pa topijo v nekaterih organskih topilih.
Uporabljamo jih v prehrani, kot maziva, pri proizvodnji lakov in barv. Iz maščob pridobivamo mila in detergente. Maščobe so v živih bitjih pomembne tako za zgradbo kot za presnovo. Maščobne kisline so ključna sestavina celične ovojnice. Živa bitja v maščobah shranjujejo energijo (Vrtačnik M. in sod., 2014).
Pregled vsebine Maščobe in Lipidi skozi učni načrt v OŠ in SŠ
Osnovna šola
Učenci se z naravoslovnimi vsebinami srečajo že v 1., 2., in 3., razredu osnovne šole pri predmetu spoznavanje okolja ter v 4. razredu s predmetom naravoslovje in tehnologija v učnih enotah Razvrščanje snovi in snovne lastnosti, Spreminjanje lastnosti snovi.
V 5. razredu se učenci z učno vsebino maščobe srečujejo preko vsebinskega sklopa Snovi v učnih enotah Shranjevanje snovi, Snovi v naravi ter v vsebinskem sklopu Človek preko učnih enot Prehrana, Skrb za zdravje (Vodopivec I. in sod., 2011).
V 6. razredu se s pojmom maščobe srečujejo pri učnih enotah Snovi so iz delcev, Lastnosti snovi in njihova uporaba. V 7. razredu pa preko vsebinskega sklopa Snovi (učne enote:
Zmesi in čiste snovi, Raztopine, Metode ločevanja čistih snovi iz zmesi, Fizikalne in kemijske spremembe snovi), Živa narava (učna enota Celica) in Vplivi človeka na okolje (učna enota Človek onesnažuje zrak, vodo in tla) (Skvarč M.. in sod., 2011).
V 8. in 9. razredu pa v vsebinskem sklopu Kisikova družina organskih spojin znajo opredeliti sestavo maščob (maščobe kot estre maščobnih kislin in glicerola), poznajo njihove osnovne lastnosti in vire ter spoznajo zgradbo, delovanje mil (Bačnik A. in sod. 2011).
Srednja šola
Dijaki v 3. letniku SŠ podrobno spoznavajo maščobe v vsebinskem sklopu Organske kisikove spojine . Znotraj tega sklopa preko predlagnih vsebin (Delitev lipidov na umiljive in neumiljive, Kemijske lastnosti umiljivih lipidov in Površinsko aktivna sredstva) spoznajo zgradbo in razdelitev lipidov, pomen organskih kisikovih spojin v prehrambeni verigi ter pomen uporabe pralnih sredstev in vpliv njihove uporabe na okolje (Bačnik A. in sod., 2008).
Eksperimentalno delo na temo Maščobe
Osnovna šola
Predmet, razred: Kemija, 9. razred
Vsebinski sklop: Kisikova družina organskih spojin Vsebina: Lastnosti maščob in mila
Učni cilj: - učenci spoznajo osnovne lastnosti maščob
- učenci spoznajo zgradbo in delovanje mil ter njihovo pridobivanje iz maščob
Primer eksperimenta: MAŠČOBE IN MILA
Potrebščine: 100 mL vode, 100mL olja, 20 mL tekočega mila, 2 plastična kozarca, merilni valj, palčka
Postopek izvedbe:
1. V 100 mL vode dolijete 100 mL olja in zmes dobro premešajte.
2. Zmesi olja in vode dodate 20 mL tekočega mila in premešajte.
Slika 10: Zmes olja in vode (levo), zmes olja, vode in tekočega mila (desno) (Vir: lasten).
Olje ima manjšo gostoto, zato plava na vodi. Zmes olja in vode se meša z milom, ki omogoča odstranjevanje različnih madežev.
Srednja šola
Predmet, letnik: Kemija, 3. letnik klasične, strokovne gimnazije Vsebinski sklop: Kisikova družina organskih spojin
Vsebina: Lastnosti maščob in mila
Učni cilj: - učenci spoznajo osnovne lastnosti maščob
- učenci spoznajo zgradbo in delovanje mil ter njihovo pridobivanje iz maščob
