UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO ANA MAROLT DIPLOMSKA NALOGA UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA Ljubljana, 2021

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ANA MAROLT DIPLOMSKA NALOGA

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ANA MAROLT

ANALIZA SESTAVE EKSTRAKTOV KONOPLJE (Cannabis sativa), PRIDOBLJENIH S POSTOPKI EKSTRAKCIJE Z ORGANSKIMI

TOPILI, SUPERKRITIČNIM CO

2

IN SUBKRITIČNO VODO

ANALYSIS OF THE COMPOSITION OF CANNABIS (Cannabis sativa) EXTRACTS OBTAINED BY EXTRACTION PROCEDURES WITH ORGANIC SOLVENTS, SUPERCRITICAL CO

2

AND SUBCRITICAL

WATER

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA

Ljubljana, 2021

(3)

Marolt A. Analiza sestave ekstraktov konoplje (Cannabis sativa), pridobljenih s postopki ekstrakcije z organskimi topili, superkritičnim CO2 in subkritično vodo. Diplomsko Delo. Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2021

iii

Diplomsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, na Katedri za farmacevtsko biologijo, pod mentorstvom izr. prof. dr. Nine Kočevar Glavač, mag. farm., in somentorstvom Katje Schoss, mag. ind. farm.

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici izr. prof. dr. Nini Kočevar Glavač in somentorici Katji Schoss za vso pomoč, strokovnost in prijaznost pri nastajanju ter pisanju diplomskega dela. Hkrati bi se zahvalila vsem sodelavcem Katedre za farmacevtsko biologijo za prijetno vzdušje v laboratoriju in vso pomoč pri delu. Zahvala gre tudi podjetju Škrlj, d. o. o., za vzorce rastline konoplje, izvedbo ekstrakcij s superkritičnim CO2 in subkritično vodo.

Največja zahvala pa gre moji družini in fantu, ki so mi tekom študija vedno stali ob strani, me spodbujali in podpirali.

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod vodstvom mentorice izr. prof.

dr. Nine Kočevar Glavač, mag. farm., in somentorice Katje Schoss, mag. ind. farm.

Ljubljana, 2021

Ana Marolt

(4)

iv

Vsebina

Kazalo slik ... v

Kazalo preglednic ... vi

Povzetek ... vii

Abstract ... viii

Seznam okrajšav in simbolov ... ix

1. UVOD ... 1

1.1. Uporaba ... 2

1.2. Sekundarni metaboliti ... 3

1.3. Konopljini ekstrakti ... 5

1.3.1. Ekstrakcija s subkritično vodo ... 5

1.3.2. Ekstrakcija s superkritičnim CO2 ... 6

2. NAMEN DELA... 8

3. MATERIALI IN METODE DELA ... 9

3.1. Rastlinski material ... 9

3.2. Kemikalije ... 9

3.3. Laboratorijske aparature in oprema ... 10

3.4. Laboratorijski pribor ... 11

3.5. Metode dela ... 11

3.5.1. Ekstrakcija s subkritično vodo ... 11

3.5.2. Ekstrakcija s superkritičnim CO2 ... 13

3.5.3. Ekstrakcija z organskimi topili in vodo ... 15

3.5.4. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ... 16

3.5.5. Plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo (GC-MS) ... 17

3.5.6. Metoda DPPH za določanje antioksidativne aktivnosti ... 18

3.5.7. Metoda ABTS za določanje antioksidativne aktivnosti ... 20

4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 22

(5)

v

4.1. Primerjava sestave ekstraktov – HPLC... 22

4.2 Primerjava sestave ekstraktov konoplje – GC-MS ... 25

4.3. Vrednotenje antioksidativne aktivnosti z metodama DPPH in ABTS ... 28

4.4. Končno ovrednotenje rezultatov eksperimentalnega dela ... 31

5. SKLEP ... 33

6. LITERATURA ... 35

Kazalo slik

Slika 1: Cannabis sativa L. (a) cvetenje moške rastline; (b) plodenje ženske rastline; (1) moški cvet; (2, 3) prašnik; (4) cvetni prah; (5) ženski cvet s krovnim listom; (6) ženski cvet brez krovnega lista; (7) ženski cvet z vidno plodnico, vzdolžni prerez; (8) plod s krovnim listom; (9) plod brez krovnega lista; (10) plod (stranski pogled); (11) plod (prečen prerez); (12) plod (vzdolžen prerez); (13) plod brez oplodja (oluščen) (4). ... 1

Slika 2: Strukture kanabinoidov (12)... 3

Slika 3: Shema naprave za izvedbo subkritične ekstrakcije z vodo. (RV) rezervoar za vodo; črpalka; (OV) odzračevalni ventil; (VV) varnostni ventil; dušik; pečica; (EC) ekstrakcijska celica; (SV) statični ventil; (ZP) zbirna posoda; (OP) odpadna posoda; odzračevalnik (19). ... 6

Slika 4: Shema naprave za izvedbo superkritične ekstrakcije s CO2. (1) črpalka CO2; (2) modifikacijska črpalka; (3) celica za ekstrakcijo trdnih vzorcev; (4) ločevalnik 1; (5) ločevalnik 2; (6) ventil (19). ... 7

Slika 5: Liofiliziran vzorec ekstrakta SV15. (foto: A. Marolt) ... 12

Slika 6: Ekstrakti s superkritičnim CO2; CV1, CV2 in CV3. (foto: A. Marolt) ... 13

Slika 7: Vodni del vzorca CV3. (foto: A. Marolt) ... 14

Slika 8: Pripravljeni vzorci ekstraktov s superkritičnim CO2 za vrednotenje antioksidativne aktivnosti. (foto: A. Marolt) ... 14

Slika 9: Ekstrakti, pripravljeni z organskimi topili in vodo. Od leve proti desni: ekstrakt z vodo, metanolom, heksanom, izopropanolom in etanolom. (foto: A. Marolt) ... 15

Slika 10: Rotavapirani ekstrakti konoplje z organskimi topili zmešani z metanolom. (foto: A. Marolt) ... 16

(6)

vi

Slika 11: Reakcijske zmesi pred merjenjem absorbance v namen določanja antioksidativne aktivnosti vzorcev z metodo DPPH. (foto: A. Marolt) ... 20 Slika 12: Reakcijske zmesi pred merjenjem absorbance v namen določanja antioksidativne aktivnosti vzorcev z metodo ABTS. (foto: A. Marolt) ... 22 Slika 13: Število neznanih spojin v posameznem ekstraktu. ... 27 Slika 14: Antioksidativna aktivnost ekstraktov konoplje z metodo DPPH. Masna koncentracija kontrolne raztopine je 2,13 mg/l, ekstraktov, pridobljenih z organskimi topili in vodo, 10 mg/ml, ekstraktov SV15 6,152 mg/ml, SV20 1,102 mg/ml, suhih ekstraktov, pridobljenih z organskimi topili, 2 mg/ml in ekstraktov, pridobljenih s superkritičnim CO2, prav tako 2 mg/ml. ... 30 Slika 15: Antioksidativna aktivnost ekstraktov konoplje z metodo ABTS. Masna koncentracija kontrolne raztopine je 0,02 g/ml, ekstraktov, pridobljenih z organskimi topili in vodo, 10 mg/ml, ekstraktov SV15 6,152 mg/ml, SV20 1,102 mg/ml, suhih ekstraktov, pridobljenih z organskimi topili, 2 mg/ml in ekstraktov, pridobljenih s superkritičnim CO2, prav tako 2 mg/ml. ... 30

Kazalo preglednic

Preglednica I: Procesni parametri liofilizacije... 12 Preglednica II: Analizni parametri sistema HPLC-UV-VIS. ... 17 Preglednica III: Vsebnost kanabinoidov (% ali mg kanabinoida/ 100mg droge konoplje) v posameznem ekstraktu. Rezultati so pridobljeni s pomočjo HPLC analize. Oznaka »-«

pomeni, da spojine nismo detektirali, »v.sled« pa prisotnost v sledovih. ... 23 Preglednica IV: Rezultati analize GC-MS monoterpenov in monoterpenoidov, prisotnih v ekstraktih konoplje. Vrednosti so podane kot relativni odstotek površin kromatografskih vrhov. ... 25 Preglednica V: Rezultati analize GC-MS seskviterpenov in seskviterpenoidov, prisotnih v ekstraktih konoplje. Vrednosti so podane kot relativni odstotek površin kromatografskih vrhov. ... 26

(7)

vii

Povzetek

Konoplja, Cannabis sativa, ena izmed rastlin, katerih uporaba sega v tisočletja pred našim štetjem, je rastlina »tisočerih molekul«. Znana je po številnih lastnostih, zaradi katerih predstavlja surovino, uporabno za najrazličnejše namene v kozmetični, prehranski, farmacevtski in gradbeni industriji. Je tudi osrednja tema številnih strokovnih in znanstvenih literaturnih virov, pa vendar v slednjih redko najdemo primerjavo različnih metod za pripravo konopljinih ekstraktov. Namen tega diplomskega dela je bil analizirati sestavo različnih ekstraktov konoplje, pridobljenih s postopki ekstrakcije s subkritično vodo, superkritičnim CO2 in organskimi topili. S pomočjo metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) smo analizirali prisotnost kanabinoidov, s plinsko kromatografijo, sklopljeno z masno spektrometrijo (GC-MS), smo raziskovali prisotnost hlapnih spojin, ter z metodama DPPH in ABTS ugotavljali antioksidativno aktivnost posameznih ekstraktov. S pridobljenimi rezultati smo prikazali razlike v sestavi ekstraktov glede na različne metode pridobivanja in hkrati ovrednotili primernost in smiselnost posamezne metode za pridobivanje preiskovanih spojin.

Ugotovili smo, da se ekstrakti med seboj bistveno razlikujejo, tako po kvalitativni kot kvantitativni vsebnosti preiskovanih spojin. Največjo vsebnost kanabinoidov je med ekstrakti, pridobljenimi s superkritičnim CO2, imel CV3 (52,71 %), med ekstrakti, pridobljenimi s subkritično vodo SV15 (0,06 %), in med ekstrakti, pridobljenimi z organskimi topili, etanolni ekstrakt (5,28 %). Največjo vsebnost celokupnih terpenskih spojin je imel ekstrakt, pridobljen s subkritično vodo pri 190 °C in 20 bar (52,22 %), sledil mu je ekstrakt, pridobljen s superkritičnim CO2 CV3 (38,18 %), in njegov vodni zaostanek, ekstrakt »CO2 voda« (32,09 %). Med ekstrakti, pridobljenimi z organskimi topili, je imel največjo vsebnost celokupnih terpenskih spojin metanolni ekstrakt (4,59 %). Največjo antioksidativno aktivnost so izkazovali ekstrakti, pridobljeni s superkritičnim CO2, predvsem ekstrakt CV3, sledili so mu ekstrakti, pridobljeni s subkritično vodo, kjer je prevladal ekstrakt SV15, najmanjšo pa so imeli ekstrakti, pridobljeni z organskimi topili, med katerimi je imel najboljše antioksidativno delovanje metanolni ekstrakt.

Ključne besede: Cannabis sativa, CO2 ekstrakcija, ekstrakcija s subkritično vodo

(8)

viii

Abstract

Cannabis, Cannabis sativa, which use dates back to millennia BC, is a plant of »thousands of molecules«. It is known for its many properties, which make the raw material useful for a variety of purposes in the cosmetics, food, pharmaceutical, and construction industries. It is also the main topic in many professional and scientific publications, yet we rarely find a comparison of cannabis extraction methods. The purpose of this thesis was to analyze the composition of various cannabis extracts obtained by extraction processes with subcritical water, supercritical CO2, and organic solvents. The presence of cannabinoids was analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC), the presence of volatile compounds was investigated by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS), and the antioxidant activity of individual extracts was determined by DPPH and ABTS. With the obtained results, we showed the differences in the composition of extracts according to different methods of extraction, and at the same time evaluated the suitability and significance of each method for obtaining the investigated compounds.

We found out that the extracts differ significantly, both in the qualitative and quantitative content of the tested compounds. CV3 had the highest content of cannabinoids among extracts obtained with supercritical CO2 (52.71%), SV15 (0.06%) among extracts obtained with subcritical water, and ethanolic extract among extracts obtained with organic solvents.

(5.28%). The highest content of total terpene compounds was found in the extract obtained with subcritical water at 190 ° C and 20 bar (52.22%), followed by the extract obtained with supercritical CO2 CV3 (38.18%), and its aqueous residue, CO2 water (32.09%). Among the extracts obtained with organic solvents, the methanol extract had the highest content of total terpene compounds (4.59%). The highest antioxidative activity was shown by extracts obtained with supercritical CO2, mainly the CV3 extract, followed by extracts obtained with subcritical water, where SV15 extract predominates, and the extracts obtained with organic solvents had the lowest antioxidative activity, among which the methanol extract had the best effect.

Key words: Cannabis sativa, CO2 extraction, extraction with subcritical water

(9)

ix

Seznam okrajšav in simbolov

ABTS – 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina) C. – Cannabis

CBC – kanabikromen

CBCA – kanabikromenska kislina CBD – kanabidiol

CBDA – kanabidiolna kislina CBDV – kanabidivarin CBG – kanabigerol

CBGA – kanabigerolna kislina

CBGVA – kanabigerovarinska kislina CBN – kanabinol

CBV – kanabivarin CBL – kanabiciklol CO2 – ogljikov dioksid

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil

GC-MS – plinska kromatografija sklopljena z masnim spektrometrom HPLC – tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

HIV – virus humane imunske pomanjkljivosti Δ8-THC – Δ8-tetrahidrokanabinol

Δ9-THC – Δ9-tetrahidrokanabinol

Δ9-THCA – Δ9-tetrahidrokanabinolna kislina Δ9-THCV – Δ9-tetrahidrokanabivarin

Δ9-THCVA – Δ9-tetrahidrokanabivarinska kislina

(10)

1

1. UVOD

Navadna konoplja, Cannabis sativa (slika 1), je enoletna rastlina, ki sodi v družino konopljevk (Cannabinaceae). Naravno gre za dvodomno rastlino, kar pomeni, da moški in ženski cvetovi rastejo na ločenih rastlinah. Konoplja ima močno korenino, z običajno oglatimi, brazdnimi, razvejanimi in pokončnimi stebli z olesenelo notranjostjo. V višino zraste od 1 do 6 m.Listi so zelene barve, dlanasto deljeni, z grobo nazobčanimi robovi.

Listne ploskve so po površini prekrite s smolnatimi trihomi (žleznimi laski). Socvetja sestavljajo številni cvetovi. Moški cvetovi so v latastih socvetjih in so sestavljeni iz petih bledo zelenih, dlakavih čašnih listov, ženski cvetovi rastejo v parih in v zalistjih. Plod je enosemenski, s trdo lupino, tesno prekrito s tanko steno plodnice, ki je elipsoidne oblike, gladke površine in lisasto rjavkaste barve (1). Poleg dvodomnih rastlin za pridobivanje konopljinega olja in vlaken uporabljamo tudi enodomne ali hermafroditne sorte, primer katerih je sorta Fedora. Za njih je značilno, da ženska in moška cvetova rasteta na isti rastlini (2). Konoplja izvira iz Kitajske, trenutno pa je razširjena po vsem svetu in raste v spremenljivih habitatih, nadmorskih višinah, v različnih prsteh in podnebnih razmerah (3).

Slika 1: Cannabis sativa L. (a) cvetenje moške rastline; (b) plodenje ženske rastline; (1) moški cvet; (2, 3) prašnik; (4) cvetni prah; (5) ženski cvet s krovnim listom; (6) ženski cvet brez krovnega lista; (7) ženski cvet z

(11)

2

vidno plodnico, vzdolžni prerez; (8) plod s krovnim listom; (9) plod brez krovnega lista; (10) plod (stranski pogled); (11) plod (prečen prerez); (12) plod (vzdolžen prerez); (13) plod brez oplodja (oluščen) (4).

V rastlinski sistematiki obstaja polemika o številu vrst, ki sestavljajo rod konoplje. Poznamo tri podvrste C. sativa, in sicer Cannabis sativa L. subsp. indica, Cannabis sativa L. subsp.

sativa in Cannabis sativa L. subsp. ruderalis. Razlikujejo se predvsem glede na vsebnost kanabinoidov in čas cvetenja rastline (5). Subsp. sativa in subsp. indica se med seboj razlikujeta tudi po videzu rastline. C. indica je bolj nizka in košata, listi so širši in krajši.

Socvetja C. indice so široka, čvrsta in gosta. C. sativa je visoka, listi so daljši z daljšo listno ploskvijo, brsti so dolgi in tanki (6).

1.1. Uporaba

Začetki uporabe konoplje segajo v tisočletja pred našim štetjem. Od takrat pa vse do danes predstavlja surovino, uporabno za najrazličnejše namene, kot na primer za izdelavo vlaken, vrvi, tkanine in papirja. Predstavlja potencialen energetski vir, saj ima visoko kurilno vrednost. Uporabljamo jo v gradbeni, avtomobilski, lesni industriji in industriji kompozitov.

V namen prehranjevanja uporabljamo vse od semen do olja, saj je vir (esencialnih) nenasičenih maščobnih kislin, vitaminov, mineralov, aminokislin in drugih spojin (7). Zaradi bogate vsebnosti kanabinoidov in drugih farmakološko aktivnih spojin je pomembna v medicinske namene, uporabljana pa je tudi v rekreativne namene. Nekdaj so z njo zdravili epilepsijo, tetanus, revmatizem, migreno, astmo, trigeminalno nevralgijo, utrujenost in nespečnost (8). Sodobne raziskave kažejo, da izvlečki konoplje izkazujejo antiepileptično, antikonvulzivno, antinevrodegenerativno, antiemetično in analgetično delovanje. Prav tako imajo protivnetne in protibakterijske lastnosti (9).

Uporaba konoplje je razširjena tudi v kozmetične namene, vendar je regulatorno omejena.

Sestavine, ki so v kozmetičnih izdelkih prepovedane, najdemo v Prilogi II Uredbe (ES) št.

1223/2009 (10). Pod št. 306 so opredeljeni naravni in sintezni narkotiki s seznama snovi v preglednicah I in II Konvencije o prepovedanih drogah, podpisane v New Yorku 30. marca 1961. Od takrat je uporaba konoplje, konopljine smole, njunih ekstraktov in tinktur prepovedana v kozmetične namene. V kozmetični bazi sestavin (Cosing) so kot prepovedani navedeni kanabinoidi in sestavine, pridobljene iz smole, cvetnih ali plodnih vršičkov, ne glede na obliko ali vrsto rastline konoplje in obliko sestavine (tinktura, ekstrakt itd.) (10).

Ker konvencija ne omenja uporabe kanabidiola (CBD), je bil le-ta dovoljen za uporabo v kozmetiki, vendar do leta 2021 le CBD, pridobljen sintezno. Po novem lahko v kozmetiki

(12)

3

uporabljamo tudi CBD naravnega izvora - iz rastline konoplje in njenih listov (11). Konoplja ima v kozmetiki številne ugodne učinke. Po Cosingu ekstrakti delujejo antioksidativno, protimikrobno, vlažilno, emolientno, ugodni so za nego normalne in aknaste kože. CBD deluje antioksidativno, sebostatično, kožo neguje in jo ščiti, konopljino olje pa deluje emolientno (11).

1.2. Sekundarni metaboliti

Stebla, listi in cvetovi konoplje so po površini pokriti s trihomi, v katerih se nahajajo številni sekundarni metaboliti. Med najpomembnejšimi so kanabinoidi ter terpeni in terpenoidi. Do danes so izolirali približno 600 sekundarnih metabolitov konoplje, od tega več kot 20 % kanabinoidov (slika 2) (9, 12).

Slika 2: Strukture kanabinoidov (12).

V konoplji z reakcijo geranil pirofosfata z olivetolno in divarinsko kislino nastajata pomembna predhodnika fitokanabinoidov C21 kanabigerolna kislina (CBGA) in C19 kanabigerovarinska kislina (CBGVA). Iz teh dveh kislin z encimsko pretvorbo nastajajo številni drugi kanabinoidi, vključno Δ9-THC, CBD, kanabikromen (CBC), kanabigerol (CBG), kanabinol (CBN) ter njihovi homologi Δ9-tetrahidrokanabivarin (Δ9-THCV), kanabivarin (CBV) in kanabidivarin (CBDV). Med rastjo oz. gojenjem se v konoplji večina teh kanabinoidov sprva tvori v obliki karboksilnih kislin, na primer Δ9-

(13)

4

tetrahidrokanabinolna kislina (Δ9-THCA), kanabidiolna kislina (CBDA), kanabikromenska kislina (CBCA), tetrahidrokanabivarinska kislina (Δ9-THCVA), po sušenju, segrevanju ali staranju konoplje kot rastlinske droge pa se s kemijsko reakcijo v večji meri dekarboksilirajo (13, 14). Na splošno je koncentracija teh spojin odvisna od vrste tkiva, starosti, sorte, pogojev rasti (tla, vlaga, svetloba), časa žetve in pogojev skladiščenja (6). Obstajajo tudi različni izomeri fitokanabinoidov, kot na primer Δ8- tetrahidrokanabinol (Δ8-THC). Ta je izomer spojine Δ9-THC, razlikuje se le po položaju dvojne vezi v cikloheksanskem obroču (13, 14). Pomembno je omeniti, da je CBN edini kanabinoid, ki v rastlini ni prisoten, temveč nastane kot oksidativni produkt Δ9-THC pri staranju (13).

Med vsemi kanabinoidi sta v ospredju pozornosti farmakološko delujoča psihoaktivni Δ9- THC in nepsihoaktivni CBD. Prisotna sta v različnih koncentracijah v različnih kemotipih konoplje, kar v veliki meri določa njihovo moč in farmacevtske lastnosti (5,12). Poznamo tri kemotipe konoplje. Kemotip I vsebuje veliko THC (> 0,3 %) in malo CBD (< 0,5 %), tip II veliko THC (> 0,3 %) in veliko CBD (> 0,5 %) ter tip III veliko CBD (> 0,5 %) in malo THC (< 0,3 %) (15). V mnogih evropskih državah je predelava konoplje omejena na rastline z 0,2-odstotno vsebnostjo THC. Kanabinoide lahko izoliramo iz različnih delov rastline vključno z listi, cvetovi, stebli, koreninami in semeni. Medtem ko se glavna količina Δ9- THC kopiči v listih rastline, so nepsihoaktivni kanabinoidi prisotni predvsem v semenskem olju (9).

Edinstven vonj konoplje ne izvira iz kanabinoidov, temveč iz preko 100 terpenskih spojin.

Razvrščeni so v različne družine glede na število ponavljajočih se osnovnih gradnikov – izoprenskih enot C5H8. Monoterpene sestavlja deset ogljikovih atomov, seskviterpene petnajst, diterpene dvajset in triterpene trideset ogljikovih atomov.Gre za preproste linearne verige ali pa kompleksne policiklične molekule. Te lahko vključujejo alkoholne, etrske, aldehidne, ketonske ali estrske funkcionalne skupine in v takih primerih govorimo o terpenoidih. Terpene in terpenoide zlahka pridobimo iz rastlinskega materiala s parno destilacijo, katere končen produkt je eterično olje (14). Donos ekstrakcije terpenov in sestava eteričnega olja se razlikujeta glede na številne parametre, kot so postopki za pridobivanje eteričnega olja, okoljski pogoji ali zrelost rastline. V cvetovih, koreninah in listih konoplje se nahajajo mono- in seskviterpeni, glavno mesto proizvodnje pa so izločevalne žlezne dlake. Med monoterpeni na splošno prevladujejo limonen, β-mircen, α- in β-pinen, terpinolen in linalool, med seskviterpeni zlasti β-kariofilen in α-humulen. Izmed diterpenov

(14)

5

je najbolj poznan fitol. V konopljinih koreninah sta kot predstavnika triterpenov najpogostejša friedelin in epifriedelanol, v konopljinih vlaknih β-amirin in v konopljinem olju cikloartenol, β-amirin in damaradienol. Terpene so skupaj s kanabinoidi nekdaj uspešno uporabljali kot kemotaksonomske označevalce konoplje, saj obe skupini veljata za glavna fiziološko aktivna sekundarna metabolita (12, 13, 15, 16).

1.3. Konopljini ekstrakti

Ekstrakcija spojin iz konoplje je osrednja tema raziskav, zlasti v zadnjih desetih letih. Več kot 70 % od 1799 člankov s tega področja je bilo objavljenih v obdobju od 2010 do 2020 (PubMed, 5. 7. 2021; iskalni gesli Cannabis, extraction). To nakazuje na veliko zanimanje znanosti za konopljo, zlasti veliko prispevkov je dostopnih o nepsihotropnih kanabinoidih.

Poleg običajnih postopkov ekstrakcije, kot je maceracija oz. ekstrakcija s topili, obstaja vse več tehnik za pridobivanje kanabinoidov in drugih pomembnih spojin konoplje, vključno z ekstrakcijama s subkritično vodo in superkritičnim ogljikovim dioksidom (CO2).

Organska topila, kot so metanol, etanol, izopropanol, butan, kloroform in n-heksan, so najpogostejša topila za običajno ekstrakcijo kanabinoidov. Poleg vrste topila je pri ekstrakciji pomembno upoštevati tudi velikost delcev rastlinske droge, temperaturo ekstrakcije, hitrost mešanja, razmerje topila in rastlinske droge ter čas ekstrakcije. Po končani ekstrakciji moramo organska topila odstraniti, saj zmanjšajo kakovost izdelka.

Mnogim topilom niti ni dovoljena prisotnost v izdelku, zlasti za farmacevtske in kozmetične namene. Slabosti te metode so predvsem dolgi časi ekstrakcije, potreba po naknadni obdelavi (dekarboksilacija) in s tem povezani večji stroški in poraba energije. Poleg tega smo omejeni z nizko selektivnostjo ekstrakcije zaradi soekstrakcije številnih drugih sestavin in posledično nizkega odstotka želenih spojin (8, 17).

1.3.1. Ekstrakcija s subkritično vodo

Ekstrakcija s subkritično vodo je okolju prijazna tehnika za izolacijo različnih sestavin naravnega izvora. Ekstrakcijsko topilo oz. menstrum predstavlja voda, segreta nad temperaturo vrelišča (100 °C) in pod temperaturo kritične točke (374 °C), pri kritičnem tlaku (10 do 221 bar), ki ohranja vodo v tekočem stanju (18). Pri sobni temperaturi je voda zelo polarno topilo z dielektrično konstanto blizu 80 (19). Ko vodo segrejemo na 250 °C in tlak povečamo do 25 barov, vrednost dielektrične konstante pade na 25. To je vmesna vrednost med dielektrično konstanto metanola (ε = 33,0) in etanola (ε = 24,0) pri temperaturi 25 °C.

V takšnih pogojih so nekatere lastnosti vode podobne organskim topilom, ki lahko raztopijo

(15)

6

različne zmerno in nizkopolarne spojine. Polarnost subkritične vode upada s povišanjem temperature, zato lahko ekstrahiramo različno polarne spojine (20). Prav tako se z višanjem temperature zmanjšujeta viskoznost in površinska napetost vode, njene difuzijske lastnosti pa so relativno visoke. Prednosti pred tradicionalnimi ekstrakcijskimi tehnikami (tj.

hidrodestilacija, parna destilacija, ekstrakcija s topili itd.) so hitrejša ekstrakcija, večja učinkovitost in s tem večji izkoristek, nižji stroški ekstrakcijskega medija oz. menstruma, uporaba topil, ki so splošno priznana kot varna, in možnost neposredne povezave z analiznimi kromatografskimi tehnikami, kot sta plinska ali tekočinska kromatografija.

Naprava za izvedbo subkritične ekstrakcije (slika 3) je sestavljena iz rezervoarja za vodo, ki je povezan z visokotlačno črpalko za aplikacijo topila v sistem, peči, kjer poteka ekstrakcija, in ventila za vzdrževanje tlaka. Ekstrakti se zbirajo v zbirni posodi, nameščeni na koncu ekstrakcijskega sistema. Poleg tega je sistem lahko opremljen s hladilno napravo za hitro hlajenje nastalega ekstrakta (19).

Slika 3: Shema naprave za izvedbo subkritične ekstrakcije z vodo. (RV) rezervoar za vodo; črpalka; (OV) odzračevalni ventil; (VV) varnostni ventil; dušik; pečica; (EC) ekstrakcijska celica; (SV) statični ventil; (ZP)

zbirna posoda; (OP) odpadna posoda; odzračevalnik (19).

1.3.2. Ekstrakcija s superkritičnim CO2

Pri ekstrakciji s superkritičnim CO2 so vrednosti procesnih parametrov večje od kritičnih vrednosti, kar pomeni nad kritičnima temperaturo in tlakom. Kot topilo je najbolj zaželen CO2. Ima številne prednosti, kot so nizka cena, lahka dostopnost in na splošno šteje kot varno in okolju prijazno topilo. Je inerten, nepolaren in nevnetljiv plin brez vonja in okusa. Ima nizko vrednost kritičnih parametrov: kritična temperatura znaša 31,1 °C in kritični tlak 73,8 bara (19, 21). Pri sobni temperaturi je plin, zato po končani ekstrakciji uparjanje ni potrebno,

(16)

7

pri čemer ni zaostankov topila. V industrijskem merilu je njegova uporaba velika, saj ga je mogoče nadzorovati in reciklirati. Subkritični CO2 je nizko polaren, s tem pa manj učinkovit pri pridobivanju polarnih spojin. Da povečamo polarnost, mu dodajamo sotopila oziroma modifikatorje, kot so na primer kisline, voda, nizkomolekularni alkoholi, aldehidi, estri in ketoni (21). To so polarne spojine, ki dodane v majhnih količinah omogočajo boljše lastnosti in večji izkoristek ekstrakcije (19, 22). Najpogosteje uporabljano sotopilo je etanol. Poleg vseh naštetih prednosti pred tradicionalnimi metodami so tu še visoka učinkovitost, visoka selektivnost in kratka ekstrakcija.

Sistem za izvedbo ekstrakcije s superkritičnim CO2 (slika 4) je opremljen z regulatorjem tlaka, ki vzdržuje tlak v ekstrakcijski posodi, regulatorjem protitlaka, ki omogoča nadzorovano zmanjšanje tlaka CO2, regulatorjem temperature, ločevalnikov kamor se raztopljeno komponento občasno ali kontinuirano prenaša iz ekstrakcijske posode.

Ekstrahirani material iz raztopine izpade v ločevalnike glede na topnost posameznih komponent v ekstraktu. To omogoča selektivno separacijo ekstrakta na posamezne komponente (19, 22).

Slika 4: Shema naprave za izvedbo superkritične ekstrakcije s CO2. (1) črpalka CO2; (2) modifikacijska črpalka; (3) celica za ekstrakcijo trdnih vzorcev; (4) ločevalnik 1; (5) ločevalnik 2; (6) ventil (19).

(17)

8

2. NAMEN DELA

Navadna konoplja (Cannabis sativa L.) je rastlina z veliko uporabno vrednostjo v farmacevtski, prehrambni in kozmetični industriji kot tudi v drugih industrijskih panogah.

Obstaja ogromno literature z osrednjo temo konoplje, kjer pa redko zasledimo primerjavo metod ekstrakcije konoplje in s tem vrednotenje, katera metoda omogoča največje donose sestavin rastlinske droge.

Namen tega diplomskega dela je analizirati sestavo različnih ekstraktov konoplje in rezultate primerjati med seboj. S postopkom ekstrakcije s subkritično vodo bomo pridobili ekstrakt konoplje ter ga primerjali z ekstrakti, pridobljenimi s superkritičnim CO2, in ekstrakti, pridobljenimi z organskimi topili. S pomočjo analizne metode tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) bomo analizirali prisotnost kanabinoidov, s plinsko kromatografijo, sklopljeno z masno spektrometrijo (GC-MS), bomo raziskovali prisotnost hlapnih spojin, kamor med drugim sodijo terpenske spojine, ter s testoma DPPH in ABTS preiskovali antioksidativno aktivnost posameznih ekstraktov. S pridobljenimi rezultati želimo prikazati razlike v sestavi ekstraktov glede na različne metode pridobivanja. Tako bomo ovrednotili tudi primernost in smiselnost posamezne metode pridobivanja preiskovanih spojin.

(18)

9

3. MATERIALI IN METODE DELA 3.1. Rastlinski material

Pri delu smo kot rastlinski material uporabljali zmleto celo rastlino konoplje Cannabis sativa, sorte Fedora. Rastlina je bila gojena v kontroliranih pogojih v Avstriji.

3.2. Kemikalije

＊ Izvlečki Cannabis sativa,

＊ etanol (96 %), Carlo-Erba Reagents, Francija,

＊ prečiščena voda, Fakulteta za farmacijo,

＊ heksan, Riedel-de Haën, Sigma-Aldrich, ZDA,

＊ propan-2-ol, Carlo-Erba Reagents, Francija,

＊ metanol, Carlo-Erba Reagents, Francija,

＊ 2,2-difenil-1- pikrilhidrazil, Sigma-Aldrich, Nemčija,

＊ galna kislina, Fluka, Nemčija,

＊ 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina) diamonijeva sol. Sigma- Aldrich, Nemčija,

＊ kalijev peroksodisulfat, Fluka, Nemčija,

＊ kemikalije za HPLC-analizo:

- 2-odstotni acetonitril, Baker analyzed HPLC, J.T.Baker, Phillipsburg, ZDA, - prečiščena voda HPLC, J.T. Baker, Phillipsburg, ZDA,

- trifluoroocetna kislina 99 % za HPLC, Fisher Chemical, UK, - 96-odstotni etilni alkohol KEFO, Ljubljana, Slovenija.

-

heksan za plinsko kromatografijo, Suprasolv®, Merck, Nemčija,

＊ standardni vzorci za HPLC-analizo:

- CBD, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1 mg/mL, - CBD-A, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1 mg/mL, - Δ9-THC, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1 mg/mL, - Δ9-THC-A, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1 mg/mL, - CBG, Restek, Bellefonte, PA, USA 1 mg/mL,

- CBG-A, Restek, Bellefonte, PA, USA 1 mg/mL, - CBC, Restek, Bellefonte, PA, USA 1 mg/mL,

(19)

10

- CBN, Restek, Bellefonte, PA, USA, 1 mg/mL, - CBDV, Restek, Bellefonte, PA, USA, 1 mg/mL, - CBDV-A, Restek, Bellefonte, PA, USA, 1 mg/mL.

3.3. Laboratorijske aparature in oprema

＊ Analizna tehtnica Mettler Toledo XS205 DualRange,

＊ precizna tehtnica KERN PCB, Nemčija,

＊ orbitalni stresalnik, Vibromix 40, Tehtnica, Domel, Železniki, Slovenija,

＊ digestorij, Variolab Mobilien W90, Waldner, Wangen, Nemčija,

＊ avtomatske pipete, Biohit-Proline, Biohit, Helsinki, Finska,

＊ rotacijski uparjevalnik sestavljen iz:

- Buchi Rotavapor R-210, Buchi, Flawil, Švica, Buchi Vacuum Controller V-850, Buchi, Flawil, Švica, Vacuum Pump V-710, Buchi, Flawil, Švica, Heating bath B-491, Buchi, Flawil, Švica, recirkulacijski hladilnik Julabo F250, Julabo, Nemčija,

＊ kromatograf proizvajalca Shimadzu, sestavljen iz:

- razplinjevalca DGU-20As, črpalke LC-20AD XR, avtomatskega vzorčevalnika SIL-20AC XR, prostora za kolone CTO-20AC in detektorja SPD-M20A,

＊ kromatografska kolona Phenomenex Kinetex C18, Medical Products UK Ltd, Aldershot, Hants, UK,

＊ spektrofotometer NANOCOLOR® UV/VIS II, Macherey-Nagel, Düren, Nemčija,

＊ kiveta QS 1.001, Hellma GmbH & Co. KG, Nemčija,

＊ liofilizator Lio-2000P, Kambič d.o.o.,

＊ sistem: GCMS-QP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska,

- kolona: nepolarna kapilarna, Rxi-5Sil MS, 30 m × 0,25 mm, df = 0,25 µm, SF:

1,4-bis(dimetilsiloksi)fenilendimetilpolisiloksan, Restek, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA,

- računalniški program: GCMS Solution 4.2, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska,

- podatkovni GC-MS knjižnici: NIST 14 in FFNSC 3, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska,

＊ ultrazvočna kadička Bandelin Sonorex Digitec DT 103H, Nemčija,

(20)

11

＊ stresalnik, Vibromix 40, Tehtnica, Slovenija,

＊ stresalnik, Vibormix 10, Tehtnica, Slovenija.

3.4. Laboratorijski pribor

＊ Nastavki za pipete, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Nemčija,

＊ membranski filter 13mm, Frisenette Q-Max, Frisenette ApS, Nizozemska

＊ injekcijske brizge in igle,

＊ filter papir, Macherey-Nagel, Düren, Nemčija,

＊ filter HPLC, 0,20 µm Frisenette, Danska,

＊ temne viale za HPLC,

＊ steklovina: čaše, epruvete, merilni valji, erlenjamerice, merilne bučke, bučke z okroglim dnom, čolnički za tehtanje, lij,

＊ ostali pribori: aluminijeva folija, plastične kapalke, plastične epruvete, plastične mikroepruvete, spatule, žličke, stojalo za epruvete.

3.5. Metode dela

Iz droge C. sativa smo pripravili različne ekstrakte s postopki ekstrakcije s subkritično vodo, s superkritičnim CO2 in organskimi topili; vsi ekstrakti so bili pripravljeni iz iste rastline konoplje. Ekstrakte smo analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti, sklopljeno z UV-VIS detektorjem na diodni niz (HPLC-UV-VIS), plinsko kromatografijo, sklopljeno z masno spektrometrijo (GC-MS), in jim določili antioksidativno aktivnost (AA) s testoma DPPH in ABTS.

3.5.1. Ekstrakcija s subkritično vodo

Ekstrakcijo s subkritično vodo smo izvedli v podjetju Škrlj, d. o. o. (Batuje 90, Črniče).

Pripravili smo dva ekstrakta, enega pri temperaturi 120 °C in tlaku 15 bar (oznaka: SV15) ter drugega pri temperaturi 190 °C in tlaku 20 bar (oznaka: SV20). Ekstrakte smo shranjevali v zamrzovalniku in jih pred analizo odtalili na sobni temperaturi.

Za HPLC-analizo smo ekstrakta pripravili z liofilizacijo, tako da smo v 10-mililitrske čaše odpipetirali trikrat po 5 ml ekstraktov SV15 in SV20. Pokrili smo jih z aluminijevo folijo in jo naluknjali, da smo vodi omogočili izhlapevanje. Proces liofilizacije je potekal po hišni metodi, katere parametri so navedeni v preglednici I. Po končanem sušenju smo liofilizirane vzorce (slika 5) združili, natehtali 31,8 mg SV15 in 42,0 mg SV20 v plastične mikroepruvete

(21)

12

in dodali 1 ml etanola. Vzorce smo izpostavili ultrazvoku pri sobni temperaturi za 10 minut.

Raztopljene vzorce smo prefiltrirali v temne viale za HPLC-analizo. Vzorce smo injicirali direktno. Vsebnost suhe snovi v ekstraktu SV15 je znašala 3,17 %, v SV20 pa 4,21 %.

Preveriti smo želeli tudi, ali se karbokislirane oblike kanabinoidov po toplotni obdelavi pretvorijo v nevtralno obliko. 2,42 mg liofiliziranega vzorca SV15 smo natehtali v erlenmajerico in jo prepihali z argonom. Tesno zaprto erlenmajerico smo postavili v pečico na 140 °C za 30 minut. Toplotno obdelan liofiliziran ekstrakt smo prenesli v plastično mikroepruveto in dodali 1 ml etanola. Vzorec smo izpostavili ultrazvoku za 10 minut pri sobni temperaturi. Raztopljeni ekstrakt smo prefiltrirali v temne viale za HPLC-analizo.

Slika 5: Liofiliziran vzorec ekstrakta SV15. (foto: A. Marolt)

Preglednica I: Procesni parametri liofilizacije.

parametri vrednosti parametrov

temperatura zgornje police pred zamrzovanjem −20 °C

temperatura spodnje police pred zamrzovanjem −20 °C

strmina za doseg temperature 100 °C/h

vakum med primarnim sušenjem 0,5012 mb

temperatura primarno sušenje – zgornja polica −20 °C

temperature primarno sušenje – spodnja polica −20 °C

strmina za doseg temperature sekundarnega sušenja 100 °C/h temperaturna razlika za start sekundarnega sušenja 1 °C

temperatura sekundarno sušenje – zgornja polica +20 °C temperatura sekundarno sušenje – spodnja polica +20 °C

čas sekundarnega sušenja 12 h

(22)

13

Za GC-MS-analizo smo 20 ml posameznega ekstrakta odpipetirali v bučki in dodali 1 ml heksana za GC. Tako pripravljena vzorca smo čez noč stresali na stresalniku pri hitrosti, ki je omogočala temeljito mešanje celotne vsebine. Po končanem stresanju sta se plasti s heksanom in ekstraktom ločili. Zgornjo plast s heksanom smo odpipetirali v temne viale za GC-analizo. Vzorce smo injicirali direktno.

3.5.2. Ekstrakcija s superkritičnim CO2

Ekstrakcijo s superkritičnim CO2 smo izvedli v podjetju Škrlj, d. o. o. Batuje 90, Črniče.

Drogo konoplje smo ekstrahirali 6 ur pri tlaku 230 bar in temperaturi 40 °C. Ekstrakte smo zbirali v treh različnih zbiralnih posodah, ki so se razlikovale glede na temperaturo in tlak.

V zbiralni posodi CV1 smo zbirali spojine, ki so se iz ekstrakta izločile pri tlaku 150 bar in 40 °C, v CV2 pri tlaku 75 bar in temperaturi 35 °C in v CV3 pri tlaku 50 bar in temperaturi 30 °C. Za CV1 je značilno, da so spojine najmanj polarne, medtem ko je za CV3 značilna največja polarnost zbranih spojin. Pri diplomskem delu smo analizirali tudi vodni zaostanek (oznaka: »CO2 voda«), ki je del ekstrakta CV3, od katerega se je ločil v ločevalniku.

Za analizo s HPLC smo v plastične mikroepruvete natehtali po približno 5 mg vzorcev CV1, CV2 in CV3 (slika 6) in dodali 1 ml etanola. Vzorce smo izpostavili ultrazvoku za 10 min pri sobni temperaturi. Raztopljene vzorce CV in »CO2 vodo« (slika 7) smo nato prefiltrirali v temne viale za HPLC-analizo.

Slika 6: Ekstrakti s superkritičnim CO2; CV1, CV2 in CV3. (foto: A. Marolt)

(23)

14

Slika 7: Vodni del vzorca CV3. (foto: A. Marolt)

Za analizo z GC-MS smo natehtali po 10 mg vzorcev CV1, CV2 in CV3 v plastične mikroepruvete in dodali 1 ml heksana kakovosti za GC. Vzorce smo dobro premešali in jih prefiltrirali v temne viale. 20 ml CO2 vode smo odpipetirali v bučko in dodali 1 ml heksana.

Mešanico smo čez noč stresali na stresalniku. Po stresanju smo zgornjo plast s heksanom odpipetirali v temno vialo za GC-analizo.

Za preverjanje antioksidativne aktivnosti smo po 20 mg CV1, CV2 in CV3 natehtali v plastične epruvete in dodali 10 ml metanola (slika 8). Vzorce smo izpostavili ultrazvoku za 10 minut pri sobni temperaturi. Tako pripravljene vzorce smo uporabili za testa DPPH in ABTS. Predhodna priprava vzorca s CO2 vodo ni bila potrebna.

Slika 8: Pripravljeni vzorci ekstraktov s superkritičnim CO2 za vrednotenje antioksidativne aktivnosti. (foto:

A. Marolt)

(24)

15 3.5.3. Ekstrakcija z organskimi topili in vodo

Ekstrakte z organskimi topili smo pripravili po predhodno razviti metodi (23). V 50- mililitrske plastične epruvete smo točno natehtali priližno 200 mg zmlete suhe droge konoplje in dodali 20 ml posameznega topila. Topila, ki smo jih uporabili za ekstrakcijo, so bila metanol, etanol, izopropanol, heksan in prečiščena voda. V nadaljevanju bo ekstrakt z metanolom označen kot EM, z etanolom EE, s heksanom EH, z izopropanolom EI in vodo EV. Vzorce (slika 9) smo nato izpostavili ultrazvoku pri sobni temperaturi za 15 minut.

Dobljene ekstrakte smo prefiltrirali v temne viale za HPLC-analizo.

Slika 9: Ekstrakti, pripravljeni z organskimi topili in vodo. Od leve proti desni: ekstrakt z vodo, metanolom, heksanom, izopropanolom in etanolom. (foto: A. Marolt)

Ekstrakte smo uporabili tudi za določevanje antioksidativne aktivnosti s testoma DPPH in ABTS, del ekstraktov pa smo posušili na rotavaporju, da smo jim odstranili organska topila in ekstrakt koncentrirali.

Po 10,0 g ekstraktov (EE, EM, EI, EH) smo natehtali v steklene bučke z okroglim dnom in jih uparili pod znižanim tlakom pri 50 °C. Ko je topilo skoraj povsem izhlapelo, smo tlak v rotacijskem uparjevalniku zmanjšali na 5 mbar za 10 minut. Suhe ekstrakte (v nadaljevanju označeni kot REE, REM, REH, REI) smo nato stehtali in izračunali izkoristek ekstrakcije, ki je znašal od 0,1 do 0,2 %. Dodali smo jim po 10 g metanola. Razmerje mase ekstrakta pred uparevanjem in mase dodanega metanola je bilo 1 : 1. Te vzorce smo uporabili za določanje antioksidativne aktivnosti z metodama DPPH in ABTS (slika 10).

(25)

16

Slika 10: Rotavapirani ekstrakti konoplje z organskimi topili zmešani z metanolom. (foto: A. Marolt)

V sistemu GC-MS smo analizirali ekstrakte EI, EE, EM in EV ter uparjene ekstrakte REH, REI, REM in REE. Za analizo smo vzorce odpipetirali v temno vialo za GC-MS analizo.

Vsebnost suhe rastlinske mase v teh vzorcih je bila 20 mg droge na 10 g metanola.

3.5.4. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

Kromatografija je separacijska tehnika, ki jo uporabljamo za ločevanje posameznih komponent v vzorcu. Ločitev temelji na različnem porazdeljevanju komponent med dvema fazama – stacionarno fazo, ki se nahaja v kromatografski koloni, in mobilno fazo, ki se pomika skozi kolono. HPLC se od običajnih tehnik tekočinske kromatografije razlikuje po manjšem premeru kolon in manjši velikosti delcev. Učinkovitost ločbe se z manjšimi delci veča, s tem pa je potreben večji tlak mobilne faze (do 400 bar). Glede na mehanizem retencije ločimo več različnih tipov HPLC. Pri diplomskem delu smo uporabili reverzno–fazno porazdelitveno kromatografijo. Ta temelji na separaciji vzorca med nepolarno stacionarno fazo in polarno mobilno fazo. Med elucijo se nepolarne spojine zadržijo dlje časa v stacionarni fazi, zato imajo daljši retencijski čas. Polarne spojine se slabo zadržijo v stacionarni fazi, zato imajo krajši retencijski čas. Aparatura za HPLC je sestavljena iz šestih osnovnih enot: rezervoar za mobilno fazo, razplinjevalec, črpalka, injektor (lahko je avtomatski), termostatiran prostor za kolono, detektor, sistem za kontrolo in obdelavo podatkov (24).

Analize HPLC smo izvajali po predhodno razviti metodi (24). Analizne parametre smo povzeli v preglednici II. Uporabljali smo dve mobilni fazi, mobilna faza A je vsebovala vodo, 2-odstotni acetonitril in 0,1-odstotno trifluoroocetno kislino (TFA), mobilna faza B pa acetonitril, 2-odstotno vodo in 0,1-odstotno TFA.

(26)

17 Preglednica II: Analizni parametri sistema HPLC-UV-VIS.

čas analize 60 min

kolona l = 100 mm, ø = 4.6 mm, velikost delcev = 2.6 µm

pretok 2 mL/min

temperatura kolone 40 °C

valovna dolžina detekcije 220 nm, 280 nm

volumen injiciranja 5 µL

volumen igle za vzorec 50 µL

volumen zanke 20 µL

zajemanje podatkov 1,5625 Hz

volumen spiranja 500 µL

Za potrditev identitete posameznih spojin v pripravljenih ekstraktih smo primerjali njihove retencijske čase in spektre s standardnimi vzorci. Iz pridobljenih rezultatov smo z umeritveno premico, maso vzorca, faktorjem redčenja in faktorjem injiciranja določili dejansko vsebnost spojin (kanabinoidov) v ekstraktih.

3.5.5. Plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo (GC-MS)

Plinska kromatografija, sklopljena z masno spektrometrijo, je analizna metoda, ki združuje separacijsko moč plinske kromatografije z natančno identifikacijo in analizo struktur komponent v vzorcu masnega spektrometra. Uporabljajo jo predvsem za identifikacijo hlapnih in polhlapnih organskih sestavin. Analiza poteka tako, da v plinskem kromatografu vzorec uparimo in ga v plinastem stanju vodimo v kromatografsko kolono. Hlapne komponente vzorca se porazdeljujejo med trdno stacionarno fazo in inertno plinsko mobilno fazo, ki ji rečemo tudi nosilni plin. Kot detektor GC lahko uporabimo MS. Ta nam omogoča pridobitev informacij o elementni sestavi analita, strukturi anorganskih in organskih molekul, sestavi večkomponentnih vzorcev in izotopskih razmerij atomov v vzorcih. Da lahko MS deluje, morajo biti analiti ionizirani in v plinski fazi. Šele potem lahko MS loči analite glede na njihovo razmerje med maso in nabojem ionov v vakuumu ter jih detektira.

Za vsak vrh, ki se eluira iz kolone, aparat posname MS-spekter. S takšno sklopljeno tehniko izkoristimo prednosti posameznih tehnik pri enkratni uporabi vzorca, hkrati pa izboljšamo selektivnost glede na uporabo vsake posamične tehnike (25).

Vzorce smo analizirali z GC-MS s predhodno razvito metodo:

＊ nosilni plin: helij

(27)

18

＊ pretok plina: 1 mL/min (linearna hitrost)

＊ način injiciranja: »split« 1 : 10

＊ temperaturni program: 40→240 °C (v 60 min), 240 °C (20 min)

＊ temperatura injektorja: 250 °C

＊ temperatura ionskega izvora: 200 °C

＊ temperatura vmesnika: 300 °C

＊ volumen injiciranja: 1 µL

＊ napetost na detektorju: 1 Kv

＊ način ionizacije: EI

＊ energija ionizacije: -70 Ev

＊ frekvenca zajemanja podatkov: 5 Hz

＊ območje merjenja relativne molekulske mase (m/z): 40–400

＊ vklop filamenta pri 3,5 min

＊ začetek snemanja pri 3,5 min

＊ celoten čas analize: 86,50 min

Za analizo GC-MS smo uporabili ekstrakte, pripravljene s superkritičnim CO2, CO2 vodo, ekstrakte z organskimi topili ter ekstrakte, pripravljene s subkritično vodo. S pomočjo podatkovnih knjižnic NIST 14 in FFNSC 3 smo identificirali spojine, prisotne v naših ekstraktih.

3.5.6. Metoda DPPH za določanje antioksidativne aktivnosti

Metoda DPPH je najbolj enostavna in najpogosteje uporabljana metoda določevanja antioksidativne aktivnosti spojin. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) je stabilen radikal z nesparjenim zunanjim elektronom na enem dušikovem atomu, ki ne dimerizira. Zaradi delokalizacije prostega elektrona ima DPPH značilno vijolično barvo z močnim absorpcijskim maksimumom pri valovni dolžini 517 nm. Metoda temelji na reakciji med molekulo DPPH in snovjo, ki lahko donira vodikov atom (antioksidantom), pri čemer se radikal DPPH reducira do neradikala 2,2-difenil-1-pikrilhidrazina (DPPH-H). Pri redukciji se intenziteta vijolične barve spremeni v rumeno, kar določamo spektrofotometrično (s pomočjo UV-VIS spektrofotometra). Razbarvanje in zmanjšanje absorbance vzorca nakazuje na reakcijo z antioksidantom in s tem na njegovo antioksidativno aktivnost (26).

(28)

19 Izvedba:

Metodo DPPH smo izvajali po predhodno razvitem postopku (27). Antioksidativno aktivnost smo določali ekstraktom, pridobljenim s subkritično vodo (SV15 in SV20), superkritičnim CO2 (CV1, CV2, CV3, CO2 voda), z organskimi topili (EM, EH, EE, EI, EV) in uparjenim ekstraktom (REE, REI, REM, REH).

Pred izvedbo metode smo z redčenjem preizkusili različne koncentracije raztopine DPPH, kontrolne raztopine in ekstraktov vzorcev, da smo dobili optimalne vrednosti absorbanc.

Absorbanco smo merili s spektrometrom UV-VIS pri valovni dolžini 517 nm.

Antioksidativno aktivnost (AA) smo izračunali po naslednji formuli:

AA= 𝐴𝑠𝑙𝑒𝑝𝑎−𝐴𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐

𝐴𝑠𝑙𝑒𝑝𝑎−𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑎 𝑥 100

Raztopina DPPH

3,04 mg DPPH smo natehtali v 50-mililitrsko merilno bučko in dopolnili do oznake. Bučko smo za 5 minut izpostavili ultrazvoku pri sobni temperaturi, da se je reagent raztopil. Ker je raztopina občutljiva na svetlobo, smo ob pripravi pazili, da je postopek priprave raztopine DPPH in kasneje vzorcev potekal zaščiten pred svetlobo.

Priprava vzorcev

V epruvete smo s pipeto odmerili 2,90 ml prečiščene vode in 100 μl posameznih ekstraktov.

V vsako epruveto z vodo in ekstraktom smo dodali še 3 ml osnovne raztopine DPPH (slika 11).

Slepi vzorec

Kot slepi vzorec je služila raztopina prečiščene vode in DPPH. Pripravili smo jo tako, da smo v epruveto s pipeto odmerili 3 ml prečiščene vode in 3 ml DPPH.

Kontrolna raztopina

Kontrolno raztopino je predstavljala raztopina galne kisline. Pripravili smo jo tako, da smo v 10-mililitrsko merilno bučko natehtali 2,13 mg galne kisline in s prečiščeno vodo dopolnili do oznake. To raztopino smo redčili s faktorjem redčenja 100, tako da smo dobili

(29)

20

koncentracijo kontrolne raztopine 2,13 mg/l. 3 ml kontrolne raztopine smo odmerili v epruveto in ji dodali 3 ml DPPH ter pomerili absorbanco.

Slika 11: Reakcijske zmesi pred merjenjem absorbance v namen določanja antioksidativne aktivnosti vzorcev z metodo DPPH. (foto: A. Marolt)

3.5.7. Metoda ABTS za določanje antioksidativne aktivnosti

Metoda ABTS velja za bolj občutljivo tehniko ugotavljanja antioksidativne aktivnosti spojin zaradi večje hitrosti reakcije.. ABTS ali 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina) se s pomočjo kalijevega persulfata oksidira do 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6- sulfonata (ABTS^'+). Metoda temelji na reakciji med kationskim radikalom ABTS^•+ in antioksidantom, ki donira vodik. Kationski radikal se tako reducira v prvotno obliko.

Kromofor ABTS je zeleno-modre barve, s tremi absorpcijskimi maksimumi pri 645, 734 in 815 nm. Ob dodatku antioksidanta se raztopina razbarva in absorbanca se zmanjša, kar kaže na antioksidativno sposobnost preizkušane spojin (28).

Izvedba:

Metodo ABTS smo izvajali po predhodno razvitem postopku (27). Antioksidativno aktivnost smo določali ekstraktom, pridobljenim s subkritično vodo (SV15 in SV20), s superkritičnim CO2 (CV1, CV2, CV3, CO2 voda), z organskimi topili (EM, EH, EE, EI, EV) in uparjenim ekstraktom (REE, REI, REM, REH).

Pred samo izvedbo metode smo z redčenjem preizkusili različne koncentracije raztopine ABTS, kontrolne raztopine in ekstraktov vzorcev, da smo dobili optimalne vrednosti

(30)

21

absorbanc. Absorbance preizkušenih vzorcev smo ugotavljali s spektrometrom z UV-VIS pri valovni dolžini 734 nm. Antioksidativno aktivnost smo izračunali po naslednji formuli:

AA= 𝐴𝑠𝑙𝑒𝑝𝑎−𝐴𝑣𝑧𝑜𝑟𝑒𝑐

𝐴𝑠𝑙𝑒𝑝𝑎−𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑎 𝑥 100

Raztopina ABTS

0,03818 g ABTS smo natehtali v 10-mililitrsko bučko in dopolnili do oznake s prečiščeno vodo. Raztopino smo za 5 minut izpostavili ultrazvočni kadički pri sobni temperaturi, da se je ABTS raztopil. Ker je raztopina občutljiva na svetlobo, smo celoten postopek izvajali zaščiten pred svetlobo.

Raztopina kalijevega persulfata

V 50-mililitrsko bučko smo natehtali 33,42 mg kalijevega peroksodisulfata ter jo dopolnili s prečiščeno vodo do oznake. Raztopino smo za 5 minut izpostavili ultrazvoku pri sobni temperaturi, da se je kalijev persulfat raztopil.

Raztopino ABTS in raztopino kalijevega persulfata smo združili v razmerju 1 : 1 in ju čez noč inkubirali (vsaj 16 h) na temnem. Nastala je modrozelena raztopina (ABTS^•+). Po inkubaciji smo raztopino ABTS^•+ ustrezno redčili, preden smo jo dodali vzorcem. Redčili smo jo z metanolom v razmerju 1 : 40 (ABTS^•+: metanol), pri čemer smo dobili absorbanco 0,857 nm.

Priprava vzorcev

40 μl posameznega ekstrakta smo odmerili v epruveto, dodali 80 μl prečiščene vode in 5 ml raztopine ABTS^•+ (slika 12).

Kontrolna raztopina

Kontrolna raztopina je bila raztopina galne kisline. Pripravili smo jo tako, da smo 0,202 g galne kisline prenesli v 10-mililitrsko bučko in dopolnili s prečiščeno vodo do oznake.

Raztopino smo redčili, tako da smo na koncu dobili kontrolno raztopino s koncentracijo 0,02 g/ml. 40 μl kontrolne raztopine in 5 ml ABTS^•+ smo odmerili v epruveto in pomerili absorbanco.

Slepi vzorec

(31)

22

Kot slepi vzorec je služila raztopina prečiščene vode in ABTS^•+. Pripravili smo jo tako, da smo v epruveto odpipetirali 120 μl prečiščene vode in 5 ml ABTS^•+.

Slika 12: Reakcijske zmesi pred merjenjem absorbance v namen določanja antioksidativne aktivnosti vzorcev z metodo ABTS. (foto: A. Marolt)

4. REZULTATI IN RAZPRAVA

4.1. Primerjava sestave ekstraktov – HPLC

HPLC-analizo smo izvedli za določitev vsebnosti kanabinoidov v različnih ekstraktih konoplje. Določali smo vsebnost naslednjih kanabinoidov: CBDA, CBD, CBGA, CBG, CBN, CBL, CBDVA, Δ9-THC, Δ8-THC, Δ9-THCA in CBC. Vsak vzorec smo injicirali enkrat. Detektor na diodni niz je glede na odzive identificiral kanabinoide (slika 13). Za interpretacijo rezultatov smo si pomagali z umeritvenimi premicami (24). Vsebnost kanabinoidov je v posameznem ekstraktu izražena v odstotkih (%) oziroma kot mg kanabinoida na 100 mg droge konoplje (preglednica III).

(32)

23

Preglednica III: Vsebnost kanabinoidov (% ali mg kanabinoida/ 100mg droge konoplje) v posameznem ekstraktu. Rezultati so pridobljeni s pomočjo HPLC-analize. Oznaka »-« pomeni, da spojine nismo detektirali, »v.sled« pa prisotnost v sledovih.

Analizirali smo ekstrakte, pridobljene z organskimi topili (EV, EE, EM, EH, EI), ekstrakte, pridobljene s subkritično vodo (SV15, SV20 in SV15, dodatno izpostavljen višji temperaturi v pečici), in ekstrakte, pridobljene s superkritčnim CO2 (CV1, CV2, CV3, CO2 voda).

Med vsemi ekstrakti, pridobljenimi z organskimi topili, je imel največjo vsebnost kanabinoidov etanolni ekstrakt (EE; 5,28 %), ki mu sledita heksanski (HE; 3,44 %) in izopropanolni ekstrakt (EI; 2,94 %). V metanolnem ekstraktu (ME) nismo zaznali nobenega preiskovanega kanabinoida, medtem ko smo v vodnem ekstraktu v sledovih zaznali le CBDA. Glede na rezultat sklepamo, da je med uporabljenimi organskimi topili za pridobivanje kanabinoidov najboljše topilo etanol, kar se ujema z literaturnimi podatki (29).

Ekst- rakt

CBD

A CBD CBG

A CBG CBC CBN CBL CBD- VA

Δ9- THC

A

Δ8- THC

SKU- PAJ

EV v.sled - - - - - - - - - - v.sled

EE 2,85 2,14 0,03 - 0,13 - - - 0,09 0,04 - 5,28

EM - - - - - - - - - - - 0,00

EH 1,53 1,69 - - 0,12 - - - 0,07 0,03 - 3,44

EI 1,50 1,26 0,01 - 0,10 - - - 0,05 0,02 - 2,94

CV1 20,13 14,10 0,24 - 0,82 0,11 - - 1,00 0,51 - 36,91

CV2 18,20 28,37 0,30 - 1,28 0,13 - - 1,14 0,14 - 49,56

CV3 12,34 37,54 0,25 - 1,32 0,10 - - 1,60 - - 52,71

CO2

voda - - - - - - - - - - - 0,00

SV15 0,01 v.sled v.sled 0,01 0,01 v.sled v.sled v.sled v.sled v.sled v.sled 0,03 SV20 v.sled v.sled v.sled v.sled 0,01 v.sled v.sled v.sled v.sled v.sled v.sled 0,01 SV15

pečic a

v.sled v.sled v.sled 0,07 0,19 v.sled v.sled v.sled v.sled 0,03 0,04 0,33