UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NEŽA ZALOŽNIK DIPLOMSKO DELO
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
NEŽA ZALOŽNIK
VREDNOTENJE VPLIVA LAMELARNIH TEKOČIH KRISTALOV NA BARIERNO FUNKCIJO KOŽE
EVALUATION OF LAMELLAR LIQUID CRYSTALS' IMPACT ON SKIN BARRIER FUNCTION
UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM KOZMETOLOGIJA
Ljubljana, 2021
Diplomsko nalogo sem opravljala na Katedri za farmacevtsko tehnologijo na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm. za prijaznost, nasvete, usmeritve, spodbudne besede, strokovno pomoč pri delu v laboratoriju in pisanju diplomske naloge ter možnost opravljanja diplomskega dela pod njenim mentorstvom.
Zahvaljujem se tudi vsem bližnjim za vso podporo in spodbudo tekom študija in izdelave diplomske naloge.
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelala samostojno pod vodstvom mentorice doc. dr.
Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm.
Neža Založnik
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Igor Locatelli, mag. farm.
Člani komisije: doc. dr. Stane Pajk, mag. farm.
VSEBINA
POVZETEK ... I ABSTRACT ... II SEZNAM OKRAJŠAV ... III
1. UVOD ... 1
1.2.1. TRANSEPIDERMALNA IZGUBA VODE ... 3
1.2.2. HIDRATACIJA KOŽE ... 6
1.4.1. TEKOČI KRISTALI V KOZMETOLOGIJI ... 11
2. NAMEN DELA ... 14
3. MATERIALI IN METODE ... 15
3.1.1. SESTAVINE NOSILNIH SISTEMOV ... 15
3.1.2. REAGENTI IN TOPILA ... 17
3.1.3. APARATURE ... 17
3.2.1. PRIPRAVA SISTEMA FRANZ-OVIH DIFUZIJSKIH CELIC IN VITRO ... 17
3.2.2. PRIPRAVA TEKOČIH KRISTALOV ... 18
3.2.3. PRELIMINARNO TESTIRANJE ... 20
3.2.4. MERITVE TRANSEPIDERMALNE IZGUBE VODE... 21
3.2.5. MERITVE HIDRATACIJE ... 22
3.2.6. STATISTIČNA ANALIZA REZULTATOV ... 23
4. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 24
5. SKLEP ... 42
6. VIRI ... 43
KAZALO SLIK
Slika 1: Zgradba kože z označenimi plastmi in kožnimi priveski (prirejeno po 3). ... 2 Slika 2: Prikaz odprte in zaprte celice za merjenje TEWL. a) odprta celica, b) zaprta celica, c) zaprta celica s kondenzatorjem (prirejeno po 8)... 3 Slika 3: Primer nekaterih naprav za merjenje TEWL z različnimi tipi merilnih celic (prirejeno po 9-11, 43). ... 5 Slika 4: Najpogostejše naprave za merjenje hidratacije (17). ... 7 Slika 5: Shema mezofaz liotropnih TK glede na vrednost kritičnega ureditvenega parametra (prirejeno po 29). ... 10 Slika 6: Nastanek različnih struktur glede na delež vode in olja ob prisotnosti površinsko aktivnih snovi: a) reverzni miceli, b) reverzna heksagonalna faza, c) reverzna bikontinuirana kubična faza, d) lamelarna faza, e) micelarno kubična faza, f) heksagonalna faza, g) miceli (30). ... 11 Slika 7: Strukturna formula izopropilmiristata (38). ... 15 Slika 8: Strukturna formula fosfatidilholina. R in R´ predstavljata maščobno kislino (38).
... 16 Slika 9: Strukturna formula Tween-a 80 (41). ... 17 Slika 10: Psevdotrikomponentni trikotnik, z označenimi oglišči (A=100 % vode, B=100 % EZ in C=100 % IPM) za sistem lecitin/Tween 80/IPM/voda. Sistemi TK, ki smo jih vrednotili, se nahajajo na razredčitveni premici (EZ/IPM=7/3), označeni z rdečo. ... 19 Slika 11: Prikaz izvedbe meritve TEWL s Tewametrom® TM 300. ... 22 Slika 12: Prikaz meritve hidratacije s Corneometrom® CM 825. ... 23 Slika 13: Vrednosti TEWL po nanosu TK1 (20 % vode + 80 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK1 (T = 25,0 °C, RH
= 35,6 %), n=5. ... 27 Slika 14: Vrednosti hidratacije po nanosu TK1 (20 % vode + 80 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK1 (T = 25,0 °C, RH = 35,6 %), n=5. ... 28 Slika 15: Vrednosti TEWL po nanosu TK2 (25 % vode + 75 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK2 (T = 25,3 °C, RH
= 45,9 %), n=4. ... 29
Slika 16: Vrednosti hidratacije po nanosu TK2 (25 % vode + 75 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK2 (T = 25,3 °C, RH = 45,9 %), n=4. ... 30 Slika 17: Vrednosti TEWL po nanosu TK3 (30 % vode + 70 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK3 (T = 24,5 °C, RH
= 46,9 %), n=5. ... 30 Slika 18: Vrednosti hidratacije po nanosu TK3 (30 % vode + 70 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK3 (T = 24,5 °C, RH = 46,9 %), n=5. ... 31 Slika 19: Vrednosti TEWL po nanosu TK4 (35 % vode + 65 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK4 (T = 23,5 °C, RH
= 35,9 %), n=4. ... 32 Slika 20: Vrednosti hidratacije po nanosu TK4 (35 % vode + 65 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK4 (T = 23,5 °C, RH = 35,9 %), n=4. ... 33 Slika 21: Vrednosti TEWL po nanosu TK5 (40 % vode + 60 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK5 (T = 24,2 °C, RH
= 51,5 %), n=4. ... 33 Slika 22: Vrednosti hidratacije po nanosu TK5 (40 % vode + 60 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK5 (T = 24,2 °C, RH = 51,5 %), n=4. ... 34 Slika 23: Vrednosti TEWL po nanosu TK6 (45 % vode + 55 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK6 (T = 25,3 °C, RH
= 53,1 %), n=3. ... 35 Slika 24: Vrednosti hidratacije po nanosu TK6 (45 % vode + 55 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK6 (T = 25,3 °C, RH = 53,1 %), n=3. ... 36 Slika 25: Vrednosti TEWL po nanosu TK7 (50 % vode + 50 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK7 (T = 26,3 °C, RH
= 48,9 %), n=4. ... 36 Slika 26: Vrednosti hidratacije po nanosu TK7 (50 % vode + 50 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK7 (T = 26,3 °C, RH = 48,9 %), n=4. ... 37
Slika 27: Vrednosti TEWL po nanosu TK8 (55 % vode + 45 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK8 (T = 25,5 °C, RH
= 53,5 %), n=4. ... 38 Slika 28: Vrednosti hidratacije po nanosu TK8 (55 % vode + 45 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK8 (T = 25,5 °C, RH = 53,5 %), n=4. ... 39
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Kvantitativna sestava posameznega sistema TK in SMES. ... 20 Preglednica II: Rezultati preliminarnega testa za določitev časovne točke za bazalne meritve. ... 24 Preglednica III: Vrednosti TEWL in hidratacije kože za določitev časovnih točk za izvedbo meritev po odstranitvi tekočih kristalov. ... 25 Preglednica V: Povprečno znižanje TEWL za posamezen sistem TK glede na bazalno vrednost. ... 40 Preglednica VI: Povprečno zvišanje hidratacije za posamezen sistem TK glede na bazalno vrednost. ... 41
I POVZETEK
Tekoči kristali predstavljajo vmesno stanje med tekočinami in trdnimi snovmi. S trdnimi snovmi jih povezujemo zaradi anizotropnosti, dvolomnosti, urejenosti in mehanske stabilnosti, tok pa odraža lastnost tekočin. Glede na njihov nastanek jih delimo na termotropne in liotropne. Liotropni obstajajo v več oblikah: lamelarni, kubični in heksagonalni. Lamelarni tekoči kristali predstavljajo aktualen dermalni dostavni sistem, predvsem zaradi podobnosti njihove strukturne urejenosti z medceličnimi lipidi rožene plasti kože.
V okviru diplomskega dela smo na modelu in vitro na prašičji koži vpeti v Franz-ove difuzijske celice vrednotili vpliv lamelarnih tekočih kristalov na osnovi lecitina na barierno funkcijo kože, natančneje na transepidermalno izgubo vode in hidratacijo. Izdelali smo osem sistemov tekočih kristalov z različno kvantitativno sestavo (razmerje med oljno fazo in emulgatorsko zmesjo je bilo konstantno ob naraščajočem deležu vodne faze) in ugotavljali vpliv na vrednosti proučevanih parametrov. Najprej smo v sklopu preliminarnih testov določili čas predhodne hidratacije kože v Franz-ovih difuzijskih celicah za določitev bazalnih vrednosti, čas delovanja tekočih kristalov na koži in časovne točke za oceno učinka tekočih kristalov po odstranitvi s kože. Transepidermalno izgubo vode smo določali s Tewametrom® TM 300 in nato v enakih časovnih točkah še hidratacijo s Corneometrom® CM 825. Vrednosti, ki smo jih izmerili pred nanosom tekočih kristalov (bazalne vrednosti), smo primerjali s končnimi vrednostmi, tj. 30 min in 90 min po odstranitvi.
Vsi sistemi tekočih kristalov so izboljšali barierno funkcijo, kar se je izražalo v znižanju transepidermalne izgube vode in zvišanju hidratacije. Največje znižanje TEWL je 30 min po odstranitvi TK s kože znašalo 18,6 %, po 90 min pa 22,3 %, medtem ko je bilo največje zvišanje hidratacije po 30 min za 158,3 %, po 90 min pa za 165,5 %. Izboljšanje barierne funkcije kože, zlasti hidratacije, je bilo odvisno od kvantitativno sestave tekočih kristalov, in sicer deleža oljne faza in emulgatorske zmesi, ki vplivata na nastanek semipermeabilnega filma na površini kože, prav tako je bil učinek časovno odvisen.
Ključne besede: barierna funkcija, transepidermalna izguba vode, hidratacija, lamelarni tekoči kristali, Franz-ova difuzijska celica
II ABSTRACT
Liquid crystals are considered to be an intermediate state between liquids and solids. They are associated with solids because of their anisotropy, birefringence, structure and mechanical stability, while their flowability correlate them with liquids. According to their origin, they are divided into thermotropic and lyotropic liquid crystals. Lyotropic ones exist in several forms: lamellar, cubic and hexagonal Lamellar liquid crystals represent the innovative dermal delivery system, mainly because of their structure, which is similar to that of the intercellular lipids of the stratum corneum of the skin.
For the purposes of this thesis, the influence of lecithin-based lamellar liquid crystals on the skin’s barrier function, more precisely on transepidermal water loss and hydration, was evaluated in vitro on a porcine skin model embedded in Franz diffusion cells. Influence of eight liquid crystal systems with different quantitative compositions (while the proportion of the aqueous phase was rising, the ratio of the oil phase to the emulsifiers was constant) on the studied parameters was determined. First, as a part of the preliminary tests, we determined the time of the skin’s pre-hydration in Franz diffusion cells to determine basal values, the amount of time the liquid crystals were exposed to the skin, and time points to assess the effect of liquid crystals after removal from the skin. Transepidermal water loss was determined using the Tewameter® TM 300. Afterwards, the hydration was determined at the same time points using the Corneometer® CM 825. The values measured before the application of the liquid crystals (basal values) were compared with the final values, i.e. 30 minutes and 90 minutes after the liquid crystals had been removed.
Following skin application, the liquid crystals improved the barrier function as seen in decreased transepidermal water loss and increased hydration. The maximum decrease in TEWL was 18,6 %, 30 minutes after, and 22,3 %, 90 min after the liquid crystal system had been removed from the skin. The maximum increase in hydration was 158,3 %, 30 minutes after, and 165,5 %, 90 min after the liquid crystal had been removed from the skin. The improvement of skin barrier function, especially hydration, correlates with quantitative composition of liquid crystals, namely the proportion of oil phase and emulsifier mixture, contributing to formation of semipermeable film on the skin surface. Moreover, the effect was time dependent.
Key words: barrier function, transepidermal water loss, skin hydration, lamellar liquid crystals, Franz diffusion cell
III SEZNAM OKRAJŠAV
AU arbitrarne enote (angl. Arbitrary Units)
CPP kritični ureditven parameter (angl. Critical Packing Parameter)
EZ emulgatorska zmes
IPM izopropil miristat
NMF naravni vlažilni faktor (angl. Natural Moisturizing Factor) PAS površinsko aktivna snov
SC rožena plast (angl. Stratum corneum) SD standardna deviacija
SMES samomikroemulgirajoči sistem
TEWL transepidermalna izguba vode (angl. Transepidermal Water Loss) TK tekoči kristali
1 1. UVOD
Stanje kože je bistvenega pomena za dobro počutje in zdravje. Je naša povezava z zunanjim svetom in zaznava vse od nežnih dotikov do bolečine. Da lahko opravlja svojo vlogo in nas ščiti, mora biti njena barierna funkcija neokrnjena, zato je pomembno, da ohranjamo njeno hidratacijo, jo ne izpostavljamo škodljivim dejavnikom ter ustrezno negujemo.
KOŽA
Koža je največji organ in nas ščiti pred raznimi dejavniki iz okolja, kot so patogeni, ultravijolična svetloba, kemikalije, mehanske poškodbe ... Sestavljena je iz treh plasti:
povrhnjice (epidermis), usnjice (dermis), in podkožja (subcutis) (slika 1). Najgloblja plast je podkožje, ki predstavlja mejo med kožo in mišicami. Vsebuje veliko maščobnih celic in vode, zaradi česar služi kot izolator, ter telesu daje obliko. Nad podkožjem se nahaja usnjica, ki predstavlja 90 % kožne mase. V tej plasti se nahajajo žilni spleti, ki so pomembni za oskrbovanje povrhnjice s hranilnimi snovmi in kisikom. Usnjica vsebuje fibroblaste, ki tvorijo kolagenska in elastinska vlakna, ki zagotavljajo elastičnost in prožnost kože.
Povrhnjica je zgornja in najtanjša plast kože, ki se nenehno obnavlja. Sestavljajo jo keratinociti, melanociti, Langerhansove in Merklove celice. Povrhnjico delimo na štiri plasti: bazalna plast (stratum basale), trnasta plast (stratum spinosum), zrnata plast (stratum granulosum) in rožena plast (stratum corneum (SC)) (1). Glavne celice epidermisa so keratinociti, ki imajo pomembno vlogo pri zagotavljanju strukture kože, saj proizvajajo različne tipe keratina, ki tvori notranjo strukturo in predstavljajo do 80 % beljakovin prisotnih v diferenciranih kerationocitih. Keratinociti nastajajo v bazalni plasti, kjer so razporejeni vzdolž bazalne membrane v enem sloju. Vsebujejo okrogla jedra in imajo več citoplazme kot celice nad njimi. Z nastajanjem novih keratinocitov na bazalni membrani, ena od dveh hčerinskih celic potuje v naslednje plasti, kjer je podvržena vrsti biokemičnih sprememb in se diferencira. Trnasta plast običajno vsebuje od pet do deset plasti celic.
Naslednja plast je zrnata in vsebuje eno do deset celic, ki so bolj ploske in nepravilne oblike kot tiste v trnasti plasti. Ko keratinociti dozorijo in preidejo v roženo plast so popolnoma keratinizirani in diferencirani, nimajo več jedra, oblikujejo se debeli snopi premreženih proteinov na notranji strani membrane, da nastane čvrsta celična ovojnica, keratinska vlakna v notranjosti celice pa poveže ogrodni protein filagrin. Tako nastale celice imenujemo korneociti. Slednji se v encimsko vodenemu procesu deskvamacije, ki je odvisen tudi od vsebnosti vode in pH v roženi plasti, odluščijo s površine kože (2).
2
Slika 1: Zgradba kože z označenimi plastmi in kožnimi priveski (prirejeno po 3).
BARIERNA FUNKCIJA KOŽE
Ustrezna zgradba rožene plasti je ključna za barierno funkcijo kože, in sicer jo poenostavljeno predstavlja model malte in opeke, pri čemer predstavljajo korneociti opeko, lipidi, ki se nahajajo v zunajceličnem prostoru in obdajajo korneocite, pa malto. Glavni lipidi rožene plasti so ceramidi, holesterol in proste maščobne kisline, ki urejeni v lamelarne faze nadzorujejo fiziološki proces transepidermalne izgube vode (TEWL, angl. transepidermal water loss) (4). Korneocite obdaja čvrsta proteinsko-lipidna ovojnica, ki je sestavljena iz visoko zamreženih netopnih beljakovin in z zunanje strani kovalentno vezana na medcelične lipide. V roženi plasti so korneociti še dodatno povezani z medceličnimi proteinskimi strukturami, imenovanimi korneodezmosomi (2). Barierno funkcijo povezujemo tudi z preprečevanjem vdora eksogenih snovi in mikroorganizmov v telo, za kar so poleg ekstracelularnih lipidov odgovorni tudi protimikrobni peptidi, kot so β-defenzini in katelicidini (4).
Barierna funkcija kože je torej odvisna od integritete rožene plasti, natančneje njene urejenosti in sestave, zlasti medceličnih lipidov. Do izgube barierne funkcije pride, če je koža preveč suha, pri čemer se pojavi luščenje, srbečica in izguba elastičnosti, ali če je koža
živec krvne žile izvodilo
znojnic dlaka
žleza lojnica
povrhnjica
usnjica
podkožje
bazalna plast melanociti
Subcutis
žleza znojnica
3
preveč hidratirana, zaradi česar pride do nabrekanja korneocitov. Takšno stanje lahko zaznamo z merjenjem TEWL, hidratacije in pH kože (5).
1.2.1. TRANSEPIDERMALNA IZGUBA VODE
Za oceno barierne funkcije kože najpogosteje uporabljamo meritve TEWL. TEWL predstavlja izgubo vode z difuzijo iz notranjosti telesa preko intaktne rožene plasti in je normalen kontinuiran biološki proces. Če je koža poškodovana, je TEWL zvišan zaradi okrnjene barierne funkcije (5).
• VREDNOTENJE TEWL
Kljub temu, da TEWL predstavlja gostoto toka vode v tekočem agregatnem stanju, ki difundira skozi kožno bariero, z instrumenti posredno merimo gostoto toka vodnih hlapov v zraku nad kožo. Zaradi difuzije vode nastane tlak, ki ga je mogoče izmeriti kot TEWL. Kadar je TEWL edini vir vode na površini kože, je TEWL enak gostoti toka vodnih hlapov. Za merjenje TEWL poznamo dve vrsti instrumentov, ki se razlikujeta v merilni celici, in sicer je lahko ta odprta ali zaprta glede na zunanjo atmosfero (slika 2). V primeru odprte celice je meritev bolj občutljiva na pogoje v okolju kot so gibanje zraka, relativna vlažnost in temperatura, medtem ko pri zaprti celici zunanji dejavniki ne vplivajo na meritve (6, 7). Na meritve vplivata tudi znojenje in temperatura kože, zato je potrebno preiskovance predhodno aklimatizirati.
Slika 2: Prikaz odprte in zaprte celice za merjenje TEWL. a) odprta celica, b) zaprta celica, c) zaprta celica s kondenzatorjem (prirejeno po 8).
Odprta celica
Odprto celico na eni strani namestimo na kožo, na drugi strani pa je odprta v atmosfero, kamor se odvaja vlaga. V mirujočih pogojih zrak v komori miruje, vodna para pa iz površine kože potuje v zunanjo atmosfero. S tem se vlažnost pri površini kože poviša, medtem ko
4
vlažnost pri odprtem delu celice ostane blizu vlažnosti zunanjega zraka. Ta gradient vlažnosti omogoča merjenje gostote toka. Gradient izračunamo iz odčitkov relativne vlažnosti in temperature, ki jih pridobimo z dvema senzorjema, ki sta nameščena v celici.
Meritve lahko izvajamo kontinuirano (6).
Zaprta celica
Poznamo dva tipa zaprtih celic, in sicer zaprto celico s kondenzatorjem in zaprto celico brez prezračevanja.
V primeru zaprte celice s kondenzatorjem, je merilna celica na vrhu zaprta s kondenzatorjem, ki vzdržuje temperaturo pod lediščem vode. Spodnji del celice je odprt in je v stiku s kožo.
Kondenzator zapre merilno celico in ščiti področje difuzije pred vplivi gibanja zraka v okolici, ter nadzoruje relativno vlažnost mikrookolja v celici neodvisno od relativne vlažnosti v okolici. Relativna vlažnost na kondenzatorju je nizka in stabilna, ter odvisna le od temperature. Vodni hlapi iz površine rožene plasti difundirajo proti kondenzatorju, saj ta vzdržuje gradient relativne vlažnosti. Vodne hlape odvede tako, da jih spremeni v led.
Shranjevanje vodnih hlapov v močno kondenzirani obliki omogoča kontinuirano merjenje.
Difuzijski gradient lahko izračunamo iz dveh vrednosti vlažnosti. Eno vrednost dobimo iz senzorja za vlažnost in temperaturo v steni celice, drugo pa z izračunom vlage na kondenzatorju na podlagi njegove temperature (6, 7).V primeru zaprte celice je vrh celice zaprt, spodnji del celice pa ima merilno odprtino, ki jo prislonimo na kožo. Celica vsebuje senzor za temperaturo in vlago. Vlaga se iz celice ne odvaja, zato začne najprej počasi nato linearno naraščati. Gostoto toka vodnih hlapov tako izračunamo iz naklona linearnega dela krivulje. Pri tej metodi morajo biti meritve kratke, kontinuirano merjenje pa ni mogoče zaradi nasičenja vlage znotraj merilne celice (6).
Naprave, ki so dostopne na tržišču za izvedbo meritev TEWL, so Aquaflux (Biox Systems Ltd, Anglija) - zaprta celica s kondenzatorjem, AS-CT1 (Asahi Biomed Company Ltd, Japonska) - zaprta celica, DermaLab (Cortex Technology, Danska) - odprta celica, Evaporimeter EP1 in EP2 (ServoMed, Švedska) - odprta celica, Tewameter TM 210 in Tewameter TM 300 (Courage & Khazaka, Nemčija) - odprta celica in VapoMeter SWL3 (Delfin Technologies, Finska) - zaprta celica (7) (slika 3).
5
Slika 3: Primer nekaterih naprav za merjenje TEWL z različnimi tipi merilnih celic (prirejeno po 9-11, 43).
Cohen in sodelavci so proučevali razlike v merjenju TEWL z odprto in zaprto celico. Za izvedbo meritev so uporabili DermaLab z odprto celico, in VapoMeter z zaprto celico. V študiji so uporabili kožni model Vitro-Skin® N-19-5X, ki ima površinske lastnosti enake koži in je služil tudi kot vir vode (predhodno so ga hidrirali 18 ur). Vzorce so nato med izvedbo meritev postavili pod kote 0˚, 45˚ in 90˚, kjer je kot 0˚ predstavljal osnovni položaj, pri čemer je bil kožni model v vodoravnem položaju (naprava za merjenje je bila na vzorec vedno nameščena pod pravim kotom). TEWL so izmerili z obema napravama pod vsakim kotom. Ko je bil vzorec pod kotom 45˚ in 90˚, so bile izmerjene vrednosti pri obeh napravah bistveno nižje od tistih, kjer je bil vzorec v vodoravnem položaju. S tem so ovrgli trditev, da lahko meritve z zaprto celico opravimo ne glede na smer in položaj merilne celice, saj je sprememba položaja kožnega modela vplivala na obe napravi, zato je potrebno meritve vedno opraviti s preiskovano površino v vodoravnem položaju. Uporaba komore z zaprto celico se je izkazala za hitrejšo, vendar na koncu poda le eno izračunano vrednost TEWL, prav tako ne vidimo kontinuirane izgube skozi celoten čas meritve kot v primeru meritev z odprto celico. Kot pomanjkljivost se je izkazal tudi daljši čas normaliziranja zaprte celice, ki se povečuje s povečanjem izgube vode. Naprava je namreč zasnovana tako, da se po dveh minutah samodejno ponastavi, tudi če je v celici še vedno prisotna vlaga in omogoča nadaljevanje meritve. Kadar so izgube vode velike, obstaja verjetnost, da celica na začetku nove meritve še vedno vsebuje vlago, zaradi česar se pogoji ne ponastavijo na sobne, kar se odraža v napačnih meritvah (12).
6 1.2.2. HIDRATACIJA KOŽE
Poleg TEWL je pomemben pokazatelj zdrave, normalne kože tudi stopnja hidratacije kože.
Normalna vsebnost vode v roženi plasti znaša od 13 % do 20 %. Ustrezna hidratacije kože je pomembna tudi za aktivnost encimov, vključenih v proces deskvamacije. Če vsebnost vode v korneocitih pade pod 10 %, je deskvamacija onemogočena in začne prihajati do adhezije in kopičenja korneocitov na površini. Takšna koža je suha in hrapava (13, 14).
Za ustrezno hidratacijo kože je pomembna urejenost medceličnih lipidov ter ustrezna količina naravnega vlažilnega faktorja (NMF, angl. natural moisturizing factor). NMF je zmes higroskopnih molekul, ki vežejo vodo in s tem vzdržujejo ustrezno vlažnost rožene plasti. Nahajajo se znotraj korneocitov, kjer tvorijo interakcije s keratinskimi filamenti, kar zmanjšuje medmolekulske sile med njimi in s tem povečuje elastičnost rožene plasti. Ta elastičnost koži omogoča, da ne pride do luščenja in razpok ob mehanskih obremenitvah.
Del molekul NMF nastane kot produkt razgradnje proteina filagrina, npr. piroglutaminska kislina, urokanska kislina, proste aminokisline. Druge sestavine, ki so del NMF, so laktati, sečnina, mineralne soli, sladkorji, organske kisline in peptidi. Pomembno vlogo pri naravnem vlaženju imata tudi endogeni glicerol in hialuronska kislina. Izvor glicerola so predvsem žleze lojnice, saj glicerol nastaja s proteolizo trigliceridov sebuma, prav tako pa prehaja v povrhnjico iz krvnega obtoka. Hialuronska kislina je znana kot ena glavnih sestavin dermisa in je higroskopni polimer molekule sladkorja. Prisotna je tudi v povrhnjici, kjer je vezana na površino keratinocitov, in poleg vlaženja vpliva tudi na medcelične stike.
NMF predstavlja približno 10 % mase korneocitov in 20 – 30 % suhe mase rožene plasti.
Vpliv na nastanek NMF imajo tako zunanji kot notranji dejavniki. Nizka relativna vlažnost (< 10 % relativne vlažnosti) onemogoči normalno delovanje hidrolitičnih encimov, ki sodelujejo pri proteolizi filagrina, zaradi česar je posledično zmanjšan tudi nastanek sestavin NMF. Encimska razgradnja filagrina do osmozno aktivnih aminokislin je motena tudi pri izpostavljenosti ultravijoličnemu sevanju zaradi zmanjšane hidratacije kože (13).
• VREDNOTENJE HIDRATACIJE KOŽE
Za določanje hidratacije kože imamo na voljo več tako posrednih kot neposrednih metod.
Med posredne metode prištevamo merjenje TEWL. Razmerje med TEWL in hidratacijo je obratno sorazmerno, saj višji TEWL pomeni nižjo hidratacijo. To je lahko posledica poškodbe kožne bariere ali sprememb v keratinizaciji povrhnjice. Posredno lahko hidratacijo
7
določimo tudi s sesalnimi in torzijskimi metodami, saj ima suha koža slabše elastične lastnosti kot hidratirana (15).
Merjenje vode v roženi plasti omogočajo tudi sprektroskopske metode. S Fourierjevo transformirano infrardečo spektroskopijo z oslabljenim odbojem lahko v roženi plasti detektiramo in kvantificiramo več snovi, kot so voda, lipidi in keratini, saj imajo različne absorpcijske spektre infrardeče svetlobe. Pomanjkljivost te metode je, da lahko merimo le vodo v zgornjih plasteh rožene plasti. Tudi z bližnjo infrardečo spektroskopijo lahko določimo hidratacijo kože na podlagi vidnih vrhov absorpcije vode v absorpcijskem spektru.
S to metodo lahko ločimo med vezano in prosto vodo v koži. Med direktne metode uvrščamo še slikanje z magnetno resonanco, kjer merimo resonanco vodika (v bistvu protonov molekul vode) pod vplivom magnetnega polja (15, 16).
Najpogosteje se za vrednotenje hidratacije kože uporabljajo metode, ki temeljijo na fizikalnih lastnostih kože. Električne lastnosti kože se spreminjajo v odvisnosti od njene hidratiranosti, zato lahko hidratacijo izmerimo kot impedanco, električno prevodnost ali kapacitivnost. Najpogosteje uporabljene naprave za merjenje teh lastnosti so NOVA DPM 9003 (Nova Technology Corporation, Združene države Amerike) - merjenje sprememb v impedanci kože, Skicon 200 in 200 EX (ISBS Co Ltd, Japonska) - merjenje prevodnosti, in Corneometer CM 820 in 825 (Courage & Khazaka, Nemčija) - merjenje kapacitivnosti (slika 4). Ostale naprave, ki prav tako temeljijo na meritvah električnih lastnosti kože so ASA-M2 (Asahi Biomed Company Ltd, Japonska), Dermalab Moisture Unit (Cortex Technology, Danska) in MoistureMeter SC (Delfin Technologies, Finska) (7, 16).
Slika 4: Najpogostejše naprave za merjenje hidratacije (17).
DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA HIDRATACIJO KOŽE IN TEWL
Pri vrednotenju barierne funkcije je potrebno upoštevati, da se vrednosti hidratacije in TEWL spreminjajo v odvisnosti od zunanjih dejavnikov, kot so kajenje, kofein, umivanje kože, nanosa različnih izdelkov na kožo (na primer vpliv površinsko aktivnih snovi (PAS),
8
okluzije...) (18). Vpliv kajenja na kožno bariero so preiskovali Muizzuddin in sodelavci, ki so z meritvami TEWL ocenjevali barierno funkcijo, stanje suhe kože pa so ocenjevali glede na količino rožene plasti, ki so jo odstranili z lepljivim trakom. Meritve TEWL so bile pri nekadilcih znatno nižje kot pri aktivnih in pasivnih kadilcih. Prav tako so pri nekadilcih pri analizi slike lepljivih trakov zaznali manjšo količino rožene plasti, kar nakazuje, da imajo aktivni in pasivni kadilci bolj suho kožo kot nekadilci (19). Z nepravilno nego kože ali prekomernim umivanjem lahko zmanjšamo integriteto bariere in povečamo izgubo vode, saj pride do odstranjevana medceličnih lipidov rožene plasti, kar je lahko posledica uporabe močnih detergentov kot je natrijev lavrilsulfat (20). Velik vpliv na kožno bariero imajo tudi okolijski dejavniki, predvsem relativna vlažnost in temperatura okolja, kar sta proučevala Cravello in Ferri. Prostovoljce so v krajših časovnih intervalih izpostavili različni relativni vlažnosti in temperaturi, ter ugotavljali kratkoročne spremembe TEWL in hidratacije.
Rezultati so potrdili večjo povezavo med TEWL in temperaturo okolja kot z relativno vlažnostjo. Hidratacija pa se je tako z višanjem temperature okolja kot relativne vlažnosti povečala (21).
Endogeni dejavniki, in sicer starost, anatomsko mesto, zdravje kože, znojenje in temperatura kože, prav tako vplivajo na barierno funkcijo kože (16). Najnižje vrednosti TEWL so v mnogih študijah dokazali na podlahti, najvišje pa na obrazu, predvsem na čelu in licu, s čimer so potrdili, da se TEWL na različnih mestih telesa pri posameznikih razlikuje (22 - 24). Vpliv starosti na TEWL in hidratacijo je bil vrednoten v številnih raziskavah, pri čemer v večini študij neposredne povezave med starostjo in TEWL niso potrdili, medtem ko se hidratacija rožene plasti s staranjem znižuje (22, 25). Oslabljena barierna funkcija je pogosta tudi pri kožnih bolezni, kot sta atopijski dermatitis in luskavica. Pri posameznikih s tem pojavom so opažene povišane vrednosti TEWL in nižje vrednosti hidratacije v primerjavi z zdravimi posamezniki (26).
LIOTROPNI TEKOČI KRISTALI KOT NOSILNI SISTEMI
Ustrezna vlažilna nega suhe kože z okrnjeno barierno funkcijo lahko pomembno izboljša njeno stanje. V ta namen kot kozmetično aktivne sestavine uporabljamo vlažilce, ki jih delimo na tri skupine: okluzive, humektante in emoliente. Okluzivi (vazelin, dimetikon...) s tvorbo hidrofobne plasti na površini kože predstavljajo oviro za izgubo vode iz kože.
Humektanti (glicerol, hidroksi kisline, sečnina...) imajo v primerjavi z okluzivi več hidrofilnih skupin, ter so v večini vodotopni. So higroskopne molekule zato privlačijo in
9
zadržujejo molekule vode (iz dermisa in iz zunanjega okolja) ter omogočajo tvorbo vodnega filma na površini kože. V kozmetičnih izdelkih se humektanti pogosto kombinirajo z okluzivi, saj tako preprečimo, da bi prišlo do prekomerne izgube vode iz dermisa. Z uporabo emolientov (klasično naravna rastlinska olja) pa lahko izboljšamo videz in teksturo kože, saj zapolnijo razpoke med korneociti. Koža je po njihovem nanosu mehka in gladka (27).
Poleg kozmetično aktivnih sestavin, ki vplivajo na hidratacijo in TEWL, je pomemben tudi nosilni sistem, da dosežemo najboljši učinek vlaženja. Pogosti nosilni sistemi so kreme, geli, mazila, paste, suspenzije, emulzije in tudi tekoči kristali (TK). TK lahko opišemo kot vmesno stanje med tekočimi in kristaliničnimi snovmi. Lastnosti, ki so skupne TK in trdnimi snovem so anizotropnost, dvolomnost, urejenost in mehanska stabilnost, s tekočinami pa jih povezujemo zaradi toka. Glede na njihov nastanek jih delimo na termotropne in liotropne.
Nastanek termotropnih TK je povezan s spremembo temperature, nastanek liotropnih TK pa je odvisen tako od temperature kot koncentracije snovi (28).
Liotropne TK, ki se uporabljajo kot nosilni sistem, tvorijo amfifilne molekule ob prisotnosti topila. Glede na stopnjo ukrivljenosti in geometrijsko obliko molekul, ki tvorijo TK, ločimo lamelarne, heksagonalne in kubične tekoče kristale oziroma mezofaze (slika 5). Mehanizem faznih prehodov lahko razložimo z kritičnim ureditvenim parametrom (CPP, angl. critical packing parameter), ki temelji na prostorskem zlaganju molekul in na podlagi njega lahko predvidevamo katera struktura TK bo nastala. CPP definiramo kot razmerje med volumnom hidrofobnega dela molekule, ter produktom efektivne površine hidrofilnega dela molekule z dolžino hidrofobne verige molekule. Kadar je CPP < 1, se emulgatorski film ukrivi proti oljni fazi in nastanejo normalne strukture, kadar je CPP > 1 se emulgatorski film ukrivi proti vodni fazi in nastanejo reverzne strukture, v primeru ko pa je CPP enak 1, pride do nastanka lamelarne faze (slika 5) (29).
10
Slika 5: Shema mezofaz liotropnih TK glede na vrednost kritičnega ureditvenega parametra (prirejeno po 29).
Na nastanek mezofaz pomembno vpliva tudi razmerje vodne in oljne faze glede na delež PAS, kot prikazuje slika 6. Miceli nastanejo ob združevanju PAS v vodni raztopini. Ob dodajanju oljne faze pa lahko nastanejo naslednje strukture oz. mezofaze: heksagonalna, micelarno kubična, bikontinuirana kubična, lamelarna, reverzna bikontinuirana kubična, reverzna heksagonalna faza, reverzna micelarno kubična in ob odsotnosti vode reverzni miceli (30). V primeru lamelarnih struktur se molekule PAS urejajo v ravninske dvosloje, med katerimi se nahaja voda. Hidrofilni deli molekul so obrnjeni navzven proti vodi, hidrofobni deli pa se orientirajo v notranjost dvosloja (31). Notranja struktura lamel je odvisna tudi od molekularne strukture uporabljenih olj. Pride do različnega razporejanja alkilnih verig znotraj lamel, kar se odraža v različni gibljivosti oziroma rigidnosti le teh (32).
11
Slika 6: Nastanek različnih struktur glede na delež vode in olja ob prisotnosti površinsko aktivnih snovi: a) reverzni miceli, b) reverzna heksagonalna faza, c) reverzna bikontinuirana kubična faza, d) lamelarna faza, e) micelarno kubična faza, f) heksagonalna faza, g) miceli (30).
1.4.1. TEKOČI KRISTALI V KOZMETOLOGIJI
TK prestavljajo aktualen dostavni sistem na področju kozmetologije. Njihova struktura predstavlja visoko podobnost z biološkimi strukturami, kot so celične membrane in drugi naravni sistemi. Prednosti njihove uporabe kot nosilnih sistemov za kozmetične izdelke temeljijo na enostavni izdelavi, biorazgradljivosti lipidov, ustreznih organoleptičnih lastnostih in prijetnem občutku na koži po nanosu, zaščiti vgrajenih aktivnih sestavin pred foto- in termodegradacijo, vlažilnih lastnostih, ki so posledica zadrževanja vode v roženi plasti, ter kemijski in fizikalni stabilnosti (32). Zaradi specifične mikrostrukture, ki jo tvorijo amfifilne molekule, omogočajo vgradnjo tako lipofilnih, hidrofilnih in amfifilnih kozmetično aktivnih sestavin. Glede na polarnost se aktivne molekule vgradijo na različna mesta: hidrofilne v bližino polarnih glav ali vodnih kanalov, lipofilne v hidrofobne verige molekul, amfifilne molekule pa se lahko vgradijo na mejo med hidrofilno glavo in hidrofobno verigo (29). Savić in soavtorji izdelali tri različne sisteme TK, kjer so potrdili, da razlike v polarnosti vgrajenih molekul in posledično mesto vgradnje vplivajo na profil sproščanja, ne pa na sam nastanek lamelarnih struktur. TK so izdelali na osnovi alkilpoliglukozidne emulgatorske zmesi, z dodatkom izopropil miristata, deciloleata ali srednje verižnih trigliceridov. V vsak sistem so nato vgradili ali amfifilno učinkovino (natrijev diklofenakat) ali neionsko učinkovino (kofein). V sistemih brez vgrajene učinkovine ali z vgrajenim diklofenakom oziroma kofeinom so potrdili lamelarno struktro.
12
Z reološkimi meritvami so vrednotili vpliv uporabljenega olja in vgrajene učinkovine na spreminjanje elastičnega in plastičnega modula. Ugotovili so, da je mikrostruktura lamel in gibljivost alkilnih verig povezana z različno kemijsko strukturo uporabljenih olj, posledica česar je drugačna sposobnost vezave vode. Na podlagi tega so s polarizacijsko mikroskopijo dokazali soobstoj tekoče lamelarne in gelne faze. Pri vgradnji neionske učinkovine so v sistemih z bolj polarnimi olji in emulgatorsko zmesjo, dosegli bolj elastične in manj viskozne sisteme v primerjavi s sistemi z vgrajeno amfifilno učinkovino. Ne glede na uporabljeno olje in vgrajeno učinkovino, pa so vsi vzorci tekočih kristalnih struktur imeli ustrezne lastnosti za nanos na kožo (sijaj, tekstura, mazljivost...) in pH (33). Zaradi podobnosti lamelarnih TK z medceličnimi lipidi se poveča penetracija molekul skozi kožo v primerjavi s klasičnimi emulzijami, kar so v študiji dokazali Li in soavtorji (34). Proučevali so optimalen nosilni sistem za aktivni učinkovini 3-O-etil askorbinsko kislino in kalijev 4-metoksi salicilat, ki delujeta kot sredstvi za posvetlitev kože. Hidrofilna narava obeh molekul sicer onemogoča njuno prehajanje skozi roženo plast v globlje plasti povrhnjice, v raziskavi pa so in vitro primerjali absorpcijo obeh spojin, vgrajenih v lamelarne TK ali klasično O/V emulzijo. V primeru vgradnje v TK so potrdili 2,62-krat in 2,22-krat večjo permeabilnosti obeh učinkovin v kožo, s čimer so dokazali, da lahko TK izboljšajo absorpcijo skozi kožo. Za dodatno potrditev so študijo izvedli še na miših, kjer so koncentraciji 3-O-etil askorbinske kisline in kalijevega 4-metoksi salicilata za primerjavo izmerili v koži in v mišicah. V mišicah sta bili koncentraciji znatno nižji od tistih v koži, kar kaže na to, da se je visok delež učinkovine zadržal na ciljnem mestu delovanja, tj. v koži, in je bila sistemska izpostavljenost nizka. Poleg tega, da povečano permeabilnost učinkovin pripisujemo interakcijam med TK in medceličnimi lipidi v povrhnjici, je razlog tudi v povečani hidrataciji povrhnjice ob nanosu TK. V primerjavi z emulzijami lahko s TK dosežemo boljšo hidratacijo kože, saj voda iz lamelarnih TK izhlapeva počasneje kot iz emulzije, kar so proučevali Iwai in sodelavci. Izdelali so emulziji O/V in V/O, ki sta se razlikovali le v vrsti emulgatorja, ter lamelarni gel. In vitro so vrednotili zmogljivost zadrževanja vode za posamezen sistem v okolju z nizko relativno vlažnostjo. V emulziji O/V voda predstavlja zunanjo oziroma kontinuirano fazo, zaradi česar je ta hitro izhlapela iz sistema, v emulziji V/O, pa je voda notranja faza, ki je obdana z oljnimi kapljicami, kar predstavlja oviro za izhlapevanje in povzroči daljše zadrževanje vode v sistemu. Najmanjša izguba vode je bila opazna pri sistemu TK zaradi vezane vode na gradnike lamelarnega gela. Da bi potrdili in vitro rezultate, so z in vivo testom preverili vpliv sistemov na hidratacijo suhe kože. V primeru
13
emulzije O/V se je stanje suhe kože takoj po nanosu sicer izboljšalo, ker pa taka vrsta emulzije ne zagotavlja okluzije, učinek ni bil dolgotrajen. Ravno obratno je bilo pri nanosu V/O emulzije, kjer ni prišlo do začetnega povečanja hidratacije, kasneje pa se je hidratacija začela zviševati na račun okluzije. Pri lamelarnem gelu so potrdili takojšen in dolgotrajen učinek zaradi združenih prednosti obeh emulzij: takojšnje vlaženje plus okluzija (35). Z vgradnjo učinkovin (npr. antioksidanti) v sisteme TK dosežemo podaljšano sproščanje, zaščito učinkovine pred razgradnjo ali oksidacijo, izboljšamo lahko topnost učinkovine v formulacijah in zmanjšamo možnost toksičnosti učinkovine (30). Zaradi termodinamske stabilnosti ima uporaba TK ponovno prednost pred pogosteje uporabljenimi emulzijami, ustrezne reološke lastnosti pa omogočajo lažji nanos v primerjavi z mikroemulzijami. Da je dermalni sistem primeren za nanos, mora biti biološko sprejemljiv. Takšen sistem so razvili Gosenca in sodelavci, ki so dokazali, da Tween 80/lecitin (1/1), izopropil miristat in voda lahko tvorijo lamelarne TK, ki imajo ustrezne reološke lastnosti in so fiziološko sprejemljivi.
Razvit sistem lamelarnih TK izkazuje velik potencial za nego starejše kože, sploh z vgrajenim askorbilpamitatom kot antioksidantom, saj izboljša elastičnost keratinocitov, ki postajajo s staranjem vedno bolj togi (36, 37).
14 2. NAMEN DELA
Cilj diplomske naloge je ovrednotiti vpliv lamelarnih tekočih kristalov na osnovi lecitina na barierno funkcijo kože, natančneje transepidermalno izgubo vode in hidratacijo. Vrednotili bomo osem sistemov lamelarnih tekočih kristalov, ki se bodo razlikovali v deležu vode ob konstantnem razmerju med lipofilno fazo in emulgatorsko zmesjo.
V okviru preliminarnih testov bomo določili optimalne časovne točke za izvedbo meritev, in sicer i) čas predhodne hidratacije kože v Franz-ovih difuzijskih celicah za določitev bazalnih vrednosti, ii) čas delovanja tekočih kristalov ter iii) časovne točke za izvedbo meritev po odstranitvi tekočih kristalov, ki bodo odražale čas izraženega učinka tekočih kristalov po nanosu na kožo. V sklopu vrednotenja vpliva TK na barierno funkcijo bomo meritve najprej izvedli s Tewameterom® TM 300 zaradi večje občutljivosti, nato pa bomo izmerili še hidratacijo s Corneometerom® CM 825.
Ker so lamelarni tekoči kristali vedno bolj pogosto uporabljeni dermalni dostavni sistem in se jim zaradi njihove strukturne podobnosti z lipidi rožene plasti pripisujejo boljše lastnosti kot klasičnim nosilnim sistemom, pričakujemo, da bomo po nanosu dokazali izboljšanje barierne funkcije kože, kar se bo kazalo kot znižanje transepidermalne izgube vode in povišanje hidratacije kože, učinek pa bo časovno odvisen. Ker bomo vrednotili sisteme z različno kvantitativno sestavo, predvidevamo, da bo hidratacija najvišja v primeru sistema TK8 z največjim deležem vode, medtem ko bo transepidermalna izguba vode najnižja po nanosu sistema TK1 z najnižjo vsebnostjo vode oz. najvišjo vsebnostjo oljne faze in emulgatorske zmesi zaradi nastanka semipermeabilnega zaščitnega filma na koži.
15 3. MATERIALI IN METODE
MATERIALI
3.1.1. SESTAVINE NOSILNIH SISTEMOV Lipofilna faza
• IZOPROPIL MIRISTAT (Sigma-Aldrich, Nemčija)
Izopropil miristat (IPM, molekulska formula C17H34O2) je ester izopropanola in miristinske kisline (slika 7). Je nizko viskozna, brezbarvna, bistra tekočina in je praktično brez vonja.
Topen je v acetonu, etanolu (95 %), kloroformu, etil acetatu, maščobah in maščobnih alkoholih, tekočih ogljikovodikih, toluenu in voskih. Raztaplja voske, holesterol in lanolin, ni pa topen v vodi, glicerolu in glikolih. Deluje kot emolient, ki se zlahka absorbira v kožo, zato ga pogosto najdemo v farmacevtskih in kozmetičnih formulacijah za dermalno uporabo.
IPM deluje kot pospeševalce absorpcije, istočasno pa izboljša hidratacijo kože, saj preprečuje izgubo vode iz rožene plasti. Na koži ne pušča mastnega občutka (38).
Slika 7: Strukturna formula izopropilmiristata (38).
Hidrofilna faza
• PREČIŠČENA VODA
Prečiščena voda je pripravljena z reverzno osmozo na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.
Emulgatorska zmes
• LIPOID S-100 (Lipoid GmbH, Nemčija)
Lipoid S-100 ali sojin lecitin predstavlja kompleksno mešanico fosfolipidov, predvsem fosfatidilholina (najmanj 94 % m/m) (slika 8), v kombinaciji z drugimi naravnimi sestavinami kot so trigliceridi, maščobne kisline in ogljikovi hidrati. Maščobne kisline, ki sestavljajo fosfolipid tega proizvajalca, so palmitinska (15 %), stearinska (3 %), oleinska (12
16
%), linolna (62 %) in linolenska kislina (5 %) (39). Lecitin je sicer komponenta celične membrane, v praksi pa se po navadi pridobiva predvsem iz rastlinskih virov. Najpogosteje se uporablja sojin lecitin, sledijo mu arašidov, bombažni, sončnični in repični, medtem ko je bil prvi odkrit jajčni lecitin. Fizikalne lastnosti lecitina so odvisne od stopnje prečiščenosti in vira lecitina. Posledično je glede na izvor različna tudi sestava in vsebnost fosfolipidov.
Obstajajo v različnih barvah in agregatnih stanjih; vse od svetlo rumene do rjave odvisno do stopnje čistosti, ter kot tekočina ali praškasta snov v odvisnosti od vsebnosti prostih maščobnih kislin.
Lecitini so stabilni v širokem pH območju, so pa podvrženi razgradnji pri visokih temperaturah ter mikrobiološki razgradnji. Topni so v alifatskih in aromatskih ogljikovodikih, halogeniranih ogljikovodikih, mineralnem olju in maščobnih kislinah. Ne raztapljajo se v hladnih rastlinskih in živalskih oljih, polarnih topilih in vodi. Uporaba je razširjena na področju farmacije, kozmetike in prehrane, najpogosteje v vlogi solubilizatorja, emulgatorja in stabilizatorja (38).
Slika 8: Strukturna formula fosfatidilholina. R in R´ predstavljata maščobno kislino (38).
• TWEEN® 80 (Merck KGaA, Nemčija)
Tween 80 oziroma polisorbat 80 (molekulska formula C64H124O26) je ester polioksietilen sorbitana z višjimi maščobnimi kislinami (polioksietilen (20) sorbitan monooleat) med katerimi prevladuje oleinska kislina s približno 70 % deležem (40) (slika 9). Je viskozna tekočina, rumene barve z rahlim značilnim vonjem. Topen je v etanolu in vodi, ne pa v oljih.
Zaradi prisotne dvojne vezi oleinske kisline je podvržen oksidaciji. Polisorbati so hidrofilne, neionske PAS, ki imajo v emulzijah vlogo emulgatorja, kot solubilizatorji omogočajo raztapljanje številnih snovi kot so eterična olja in lipofilni vitamini, v peroralnih in
17
parenteralnih formulacijah pa služijo tudi kot vlažilno sredstvo. So pogosto uporabljena sestavina predvsem v farmacevtski, kozmetični in prehranski industriji (38).
O
O O O
O
O O
H H
H
O O
O w
x y z
w + x + z = 20
Slika 9: Strukturna formula Tween-a 80 (41).
3.1.2. REAGENTI IN TOPILA
• Natrijev klorid (INCI: sodium chloride, Merck, KGaA, Nemčija)
• Prečiščena voda (pridobljena z reverzno osmozo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)
3.1.3. APARATURE
• Franz-ove difuzijske celice (Verrerie Villeurbannaise, Francija)
• tehtnica AG245 (Mettler, Toledo, Švica)
• magnetno mešalo IKA RCT basic (Artisan Technology Group®, Združene države Amerike)
• Tewameter® TM 300 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija)
• Corneometer® CM 825 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija)
• Probe Heater® PR 100 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija)
• Ambient Condition Sensor RHT 100 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija) METODE
3.2.1. PRIPRAVA SISTEMA FRANZ-OVIH DIFUZIJSKIH CELIC IN VITRO Franz-ova difuzijska celica je sestavljena iz receptorskega dela z mestom za vzorčenje in donorskega dela. Receptorski del z magnetnim mešalom smo napolnili s fiziološko raztopino do točke, da je nastala konveksna površina. Pripravljeno kožo smo z epidermisom obrnjenim proti donorskemu delu vpeli med receptorski in donorski del ter fiksirali s kovinsko sponko.
Tako pripravljene celice smo termostatirali v vodni kopeli eno uro (časovne točke smo določili v preliminarnih testih kot opisano v poglavju 4.2). Vodna kopel je bila segreta na 37
°C, celice pa so bile vanjo potopljene do zgornjega nivoja receptorskega dela, pri čemer voda
18
ni bila v stiku s kožo na robu celice, da ne bi prišlo do dodatne hidratacije kože z vodo iz vodne kopeli. S tem smo tudi posnemali pogoje in vivo, saj temperatura telesa znaša 37 °C.
Zaradi nižje temperature prostora (približno 25 °C), v katerem je bila koža ter donorski del celice, se je ustvaril temperaturni gradient, ki se je odražal v temperaturi vpete kože okrog 32 °C, kolikor tudi sicer znaša temperatura na površini kože (42).
Priprava kože
Vpliv tekočih kristalov na barierno funkcijo smo testirali na koži prašičjih uhljev. Prašičja koža ima podobno morfologijo in sestavo lipidov kot človeška koža, zato predstavlja ustrezen model za in vitro študije. Uhlji so bili odvzeti decembra 2020 in ustrezno shranjeni v zamrzovalniku. Pomembno je, da uhlje pred zamrzovanjem očistimo in posušimo, da kristali vode ne poškodujejo rožene plast. Za meritve smo uporabili distalne dele uhlja. Na dan meritve smo uhelj odmrznili in ga temperirali na sobni temperaturi za največ 15 minut.
Nato smo s škarjami odstranili dlake, s skalpelom odstranili hrustanec in kožo ločili od maščevja, ter pripravili koščke kože ustrezne velikosti za posamezno celico (približno 2 × 2 cm2).
Priprava receptorskega medija
Receptorski del Franz-ovih difuzijskih celic smo napolnili z receptorskim medijem, v našem primeru 0,9 % vodno raztopino natrijevega klorida (NaCl) oziroma fiziološko raztopino. Na tehtnici smo v tehtalni čolniček natančno natehtali 0,9 g natrijevega klorida in ga s prečiščeno vodo raztopili v 100 ml bučki.
3.2.2. PRIPRAVA TEKOČIH KRISTALOV
Liotropni TK, ki smo jih uporabili v okviru naloge, so bili že predhodno razviti na Katedri za farmacevtsko tehnologijo. Njihovo sestavo prikazuje psevdotrikomponentni fazni diagram, ki predstavlja vsa možna razmerja med emulgatorsko zmesjo lecitin/Tween 80 (1/1), IPM in vodo (slika 10). Vsako oglišče trikotnika (A, B in C) predstavlja 100 % ene komponente, medtem ko stranice predstavljajo zmes dveh komponent. Vrednoteni sistemi v okviru diplomske naloge imajo konstantno razmerje med emulgatorsko zmesjo (EZ) in lipofilno fazo, in sicer 7/3 ob naraščajočem deležu vode, in so prikazani na ti. razredčitveni premici na sliki 10.
19
Slika 10: Psevdotrikomponentni trikotnik, z označenimi oglišči (A=100 % vode, B=100 % EZ in C=100 % IPM) za sistem lecitin/Tween 80/IPM/voda. Sistemi TK, ki smo jih vrednotili, se nahajajo na razredčitveni premici (EZ/IPM=7/3), označeni s črno.
Osnovo za izdelavo vseh sistemov TK je predstavljal samomikroemulgirajoči sistem (SMES), ki je zmes PAS in lipofilne faze brez vode (v našem primeru v razmerju 7/3). SMES smo pripravili iz emulgatorske zmesi lecitina in Tweena 80, ki smo ju natehtali v erlenmajerico v razmerju 1/1 ter dodali še IPM in mešali na magnetnem mešalu pri sobni temperaturi do nastanka homogene zmesi.
Za vrednotenje barierne funkcije kože smo izdelali osem sistemov TK z različnim deležem vode (preglednica I). V čašo smo natehtali ustrezno količino SMES ter postopoma dodajali vodo, ob konstantnem mešanju na magnetnem mešalu, dokler ni nastal sistem TK. Vse sisteme TK smo izdelali vsaj 24 ur preden smo jih nanesli na kožo, da se je struktura stabilizirala.
20
Preglednica I: Kvantitativna sestava posameznega sistema TK in SMES.
SISTEM LECITIN (m/m) %
TWEEN 80 (m/m) %
IPM (m/m) %
PREČIŠČENA VODA (m/m) %
SMES 35,0 35,0 30,0 /
TK1 28,0 28,0 24,0 20,0
TK2 26,0 26,0 23,0 25,0
TK3 24,5 24,5 21,0 30,0
TK4 22,5 22,5 20,0 35,0
TK5 21,0 21,0 18,0 40,0
TK6 19,0 19,0 17,0 45,0
TK7 17,5 17,5 15,0 50,0
TK8 15,5 15,5 14,0 55,0
3.2.3. PRELIMINARNO TESTIRANJE
V okviru preliminarnega testiranja smo najprej ovrednotili določene parametre z vidika optimalnega poteka nadaljnjega sklopa vrednotenj TK. V ta namen smo za izbrani sistem TK1 določili časovne točke z vidika optimalnosti izvedbe meritev. Natančneje, določili smo optimalen čas za bazalne vrednosti (čas temperiranja kože, vpete v Franz-ove difuzijske celice, po katerem je koža optimalno hidratirana z receptorskim medijem) in optimalen čas za končne meritve (koliko časa bodo TK v stiku s kožo ter časovne točke v katerih bomo izvedli meritve TEWL in hidratacije kože po odstranitvi TK s površine kože). Pri meritvah TEWL smo upoštevali povprečno vrednost TEWL z najnižjo standardno deviacijo (SD).
Posamezna meritev traja 60 s, tekom meritve dobimo vrednosti TEWL v posamezni časovni točki (tj. vsako sekundo) ter povprečno vrednost TEWL s SD v posamezni časovni točki za zadnjih deset sekund. Povprečna vrednost TEWL z najnižjo SD nakazuje na stabilno meritev. Pri hidrataciji smo upoštevali povprečje šestih meritev.
Preliminarne teste smo izvedli tako, da smo prašičjo kožo, pripravljeno po ustreznem postopku, vpeli v Franz-ove celice in temperirali v vodni kopeli na 37 °C 30 min ali 60 min.
Nato smo na ustrezno temperirane Franz-ove celice nanesli sistem TK1 in pustili delovati 60 oziroma 120 min. Po času delovanje (60 ali 120 min) smo potencialen zaostanek TK previdno odstranili s kože ter celice ustrezno nadalje temperirali. Vrednosti TEWL in hidratacije po delovanju smo nato pomerili po 15 min, 30 min, 60 min in 90 min.
21
3.2.4. MERITVE TRANSEPIDERMALNE IZGUBE VODE
Za merjenje TEWL smo uporabili napravo Tewameter® TM 300 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija) (v nadaljevanju Tewameter) z odprto sondo, ki omogoča kontinuirano merjenje. Kot omenjeno v poglavju 3.2.1 ima površina kože temperaturo 32 °C zaradi temperaturnega gradienta. Da smo zagotovili stabilnejše meritve, smo sondo zato pred meritvijo prav tako segreli na 32 °C v napravi Probe Heater® PR 100 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija).
Pripravljene Franz-ove celice smo najprej temperirali v vodni kopeli pri 37 °C eno uro, nato smo s Tewametrom izmerili bazalne vrednosti TEWL. Sledil je nanos posameznega sistema TK (TK1-TK8). Natančno smo natehtali 14,87 – 21,40 mg TK, ki smo jih nato enakomerno nanesli na kožo s kovinsko zaobljeno lopatko. Po nanosu TK smo celice temperirali 60 min, nato pa z vatirano palčko previdno popivnali ostanek TK s površine kože. Franz-ove celice smo nato nadalje temperirali ter izmerili vrednosti TEWL po 30 in 90 min glede na čas po odstranitvi TK s površine kože.
Vse meritve TEWL, ki smo jih izvedli v sklopu diplomske naloge, smo merili kontinuirano 60 s. Sondo smo prislonili pravokotno na površino kože, da je bila v vodoravnem položaju, in zagotovili tesen, vendar ne premočan, stik sonde s kožo (slika 11). Po končani meritvi smo kot rezultat dobili krivuljo z vrednostmi TEWL v enotah g/h/m2 v posameznih časovnih točkah. Za nadaljnjo interpretacijo rezultatov smo uporabili vrednosti pri 15 s, 30 s, 45 s, 60 s, ter pri času z najnižjo SD (povprečje 10-ih meritev, nakazuje na stabilne meritve). Pri izvajanju meritev je bilo pomembno, da smo celico držali pri miru, saj bi vsak premik lahko sprožil gibanje zraka, kar bi vplivalo na meritve. Meritve smo izvedli pri T med 23,5 in 26,3
°C ter RH med 29,3 in 53,5 % (določeno z Ambient Condition Sensor RHT 100 (Courage
& Khazaka GmbH, Köln, Nemčija).
22
Slika 11: Prikaz izvedbe meritve TEWL s Tewametrom® TM 300.
3.2.5. MERITVE HIDRATACIJE
Hidratacijo kože smo merili z napravo Corneometer® CM 825 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija) (v nadaljevanju Corneometer). Meritev temelji na merjenju kapacitete dielektrika (kože), saj ima voda večjo dielektrično konstanto kot preostale snovi v koži.
Corneometer ima na vrhu sonde zlate žičke, ki so od kože ločene s tanko stekleno ploščo.
Ena žica ustvari presežek elektronov (negativen naboj), druga pa pomanjkanje (pozitiven naboj). Naboji se začnejo med seboj privlačiti in med žicama se ustvari električno polje, ki deluje na kožo v globini od 10 do 20 µm. Sprememba dielektrične konstante kože je posledica spremenjene hidratacije, kar se odraža v spremembi kapacitivnosti na kondenzatorju. Višja kot je kapacitivnost, višja je hidratacija (43). Izmerjene vrednosti so podane v arbitrarnih enotah (AU, angl. arbitrary units).
Meritve hidratacije smo izvedli takoj za meritvami TEWL, v istih časovnih točkah: bazalne vrednosti po 60 min temperiranja, vrednosti po nanosu TK pa po 30 in 90 min. Posamezne meritve s Corneometrom so trajale 1 s, kar je preprečevalo nastanek okluzije, ki bi lahko vplivala na rezultat. Sondo smo držali navpično na kožo in s konstantnimi pritiski izmerili hidratacijo 6-krat zapored na istem mestu (slika 12). Med meritvami smo počakali približno 5 s, da se je koža povrnila v prvotno stanje. Rezultat smo podali kot povprečno vrednost šestih meritev. Meritve smo izvedli pri T med 23,5 in 26,3 °C ter RH med 29,3 in 53,5 % (določeno z Ambient Condition Sensor RHT 100 (Courage & Khazaka GmbH, Köln, Nemčija).
23
Slika 12: Prikaz meritve hidratacije s Corneometrom® CM 825.
3.2.6. STATISTIČNA ANALIZA REZULTATOV
Vpliv proučevanih dejavnikov (razlike v kvantitativni sestavi TK in čas nanosa) na vrednosti TEWL in hidratacije smo preverili s statistično analizo: s F-testom smo preverili podobnost varianc, nato pa izvedli dvostranski Studentov t-test s stopnjo tveganja α = 0,05.
24 4. REZULTATI IN RAZPRAVA
V okviru diplomskega dela smo vrednotili vpliv osmih sistemov TK, ki smo jih izdelali iz IPM kot lipofilne faze, emulgatorske zmesi lecitin/Tween 80 v razmerju 1/1, ter prečiščene vode kot hidrofilne faze. Vrednoteni sistemi se nahajajo na isti razredčitveni premici psevdotrikomponentnega faznega diagrama, kar pomeni, da imajo konstantno razmerje med EZ in lipofilno fazo (EZ/IPM = 7/3) ob naraščajočem deležu vodne faze. Sisteme smo vrednotili na prašičji koži s Franz-ovimi difuzijskimi celicami. Zanimala nas je sprememba TEWL in hidratacije kože po dermalnem nanosu TK za oceno vpliva TK na barierno funkcijo kože.
PRELIMINARNO TESTIRANJE Določitev časovne točke za bazalne vrednosti
Optimalni čas hidriranja kože, vpete v Franz-ove celice, pred nanosom TK, smo določili na treh paralelah (n = 3). Bazalne vrednosti TEWL in hidratacije smo izmerili po 30 in 60 min temperiranja (preglednica II) (Tprostora = 24,4 °C; RH = 39,0 %).
Preglednica II: Rezultati preliminarnega testa za določitev časovne točke za bazalne meritve.
MERITEV PO 30 MIN MERITEV PO 60 MIN
Franz-ova
celica TEWL [g/h/m2] ± SD* HIDRATACIJA
[AU] TEWL [g/h/m2] ± SD* HIDRATACIJA
[AU]
1 31,68 ± 0,21 2,1 22,60 ± 0,23 0,2
2 18,77 ± 0,28 1,2 12,05 ± 0,15 2,8
3 28,58 ± 0,17 1,3 22,62 ± 0,16 0,3
AU – arbitrarne enote; * – najnižja standardna deviacija vrednosti TEWL zaporednih 10 sekund tekom meritve, ki traja 60 sekund
Bazalne vrednosti za TEWL so po 30 min znašale med 18,77 in 31,68 g/h/m2, po eni uri pa so se vrednosti na vseh vzorcih znižale in so znašale med 12,05 in 22,62 g/h/m2. Vrednosti hidratacije so zelo sipale tako v posamezni časovni točki, kot primerjalno med obema časovnima točkama. Posledično smo se na podlagi vrednosti TEWL odločili, da bomo celice pred meritvijo bazalnih vrednosti temperirali 60 min, kar je tudi v skladu z izvedbo meritev v okviru diplomske naloge Š. Hribernik (44).
25
Določitev časa delovanja tekočih kristalov in časovnih točk za izvedbo meritev po odstranitvi tekočih kristalov
Nadalje smo določili časovne točke za izvedbo meritev po nanosu tekočih kristalov (čas TK v stiku s kožo ter časovne točke za izvedbo meritev TEWL in hidratacije kože po odstranitvi TK s površine kože). Meritve smo opravili na šestih paralelah (n = 6), ki smo jih predhodno hidrirali 60 min, nato pa nanje nanesli sistem TK1 (16,8 – 18,8 mg). Na paralelah 1-4 smo sistem pustili delovati 60 min, na paralelah 5 in 6 pa 120 min. Po odstranitvi TK1 smo vrednosti izmerili po 15 min, 30 min, 60 min in 90 min (preglednica III) (Tprostora = 24,3 °C;
RH = 29,3 %).
Preglednica III: Vrednosti TEWL in hidratacije kože za določitev časovnih točk za izvedbo meritev po odstranitvi tekočih kristalov.
FRANZ-OVA
CELICA MERITEV TEWL [g/h/m2] ± SD* HIDRATACIJA [AU]
Vzorec TK1 (delovanje na koži 60 min)
1
Bazalna vrednost 22,60 ± 0,23 0,2
15 min 26,84 ± 0,22 5,3
30 min 20,55 ± 0,21 8,5
60 min 23,51 ± 0,15 6,6
90 min 20,58 ± 0,15 5,0
2
Bazalna vrednost 12,05 ± 0,15 2,8
15 min 16,39 ± 0,18 28,8
30 min 12,04 ± 0,17 26,4
60 min 13,71 ± 0,14 23,6
90 min 11,33 ± 0,36 19,9
3
Bazalna vrednost 27,43 ± 0,53 2,3
15 min 33,50 ± 0,32 8,4
30 min 26,63 ± 0,49 11,1
60 min 38,86 ± 0,36 4,3
90 min 27,42 ± 0,36 3,4
4
Bazalna vrednost 24,03 ± 0,50 6,5
15 min 21,13 ± 0,29 6,4
30 min 17,72 ± 0,23 4,3
60 min 22,95 ± 0,19 5,4
90 min 27,13 ± 0,31 12,8
Vzorec TK1 (delovanje na koži 120 min)
5
Bazalna vrednost 22,62 ± 0,16 0,3
15 min 25,64 ± 0,49 0
30 min 35,49 ± 0,35 0
60 min 20,97 ± 0,30 0
26
90 min 20,35 ± 0,24 0
6 Bazalna vrednost 37,03± 0,61 1,2
15 min 33,74 ± 0,21 2,7
30 min 35,35 ± 0,53 1,0
60 min 27,92 ± 0,48 1,2
90 min 28,19 ± 0,19 0,6
AU – arbitrarne enote; * – najnižja standardna deviacija vrednosti TEWL zaporednih 10 sekund tekom meritve, ki traja 60 sekund
Bazalne vrednosti TEWL na vseh paralelah so znašale med 12,05 in 37,03 g/h/m2. Vrednosti so bile po 15 min v večini primerov višje v primerjavi z bazalnimi. Vzorec znižanja TEWL smo nato opazili po 30 min, ko so vrednosti znašale med 12,04 in 35,49 g/h/m2 in po 90 min med 11,33 in 28,19 g/h/m2.V časovni točki 60 min so se vrednosti TEWL na paralelah 1-3 zvišale, na paralelah 4-6 pa znižale v primerjavi z bazalnimi vrednostmi. Med Franz-ovimi celicami 1-4, kjer je sistem TK1 na koži deloval 60 min in Franz-ovima celicama 5-6, kjer je deloval 120 min ni prišlo do bistvenih razlik v meritvah po odstranitvi TK1.
Hidratacija se je na večini paralel zvišala v vseh časovnih točkah. Največje zvišanje je bilo največkrat izmerjeno po 15 ali 30 min, nato pa so vrednosti z vsako naslednjo časovno točko rahlo upadale. Pri vzorcu 3 smo najvišjo hidratacijo izmerili po 90min. Meritve hidratacije vzorca 5 niso bile relevantne, ker se je koža na sredini ugreznila v receptorski del in jih nismo upoštevali. Tako smo za primerjavo časa delovanja TK na koži uporabili Franz-ovo celico 6, kjer ni prišlo do zvišanja hidratacije, med tem ko smo na celicah 1-4 izmerili izboljšanje v vsaj eni točki.
Na podlagi preliminarnega testa smo se odločili, da bomo v nadaljnjem izvajanju meritev TK na koži pustili delovati 60 min, saj čas delovanja na TEWL ni imel bistvenega vpliva, medtem ko je bila hidratacija po 60 min višja od tiste po 120 min delovanja. Za meritve barierne funkcije kože po nanosu pa smo izbrali časovni točki 30 in 90 min po odstranitvi TK, saj smo v teh točkah izmerili najnižje vrednosti TEWL in najvišje vrednosti hidratacije.
VREDNOTENJE VPLIVA LAMELARNIH TEKOČIH KRISTALOV NA BARIERNO FUNKCIJO KOŽE
Lamelarni tekoči kristali predstavljajo aktualen dermalni dostavni sistem, predvsem zaradi njihove strukture, ki je v ureditvi molekul podobna lipidom rožene plasti in s tem omogoča boljše prehajanje in bolj nadzorovano sproščanje aktivnih učinkovin v globlje plasti kože.
Ravno ureditev molekul v TK je tista, ki ima velik vpliv tudi na hidratacijo kože, saj se voda,
27
vezana na polarne glave sestavin TK ter ujeta med lamelarne plasti, počasi sprošča in tako postopoma izboljšuje hidratacijo, lipofilne domene molekul pa na koži tvorijo semipermeabilen film, s čimer dodatno zadržujejo vodo v koži (45). V okviru diplomske naloge smo vrednotili vpliv TK na barierno funkcijo kože z merjenjem TEWL in hidratacije.
Vrednoteni TK na osnovi lecitina imajo potrjeno lamelarno strukturo in imajo stalno razmerje med lipofilno fazo in emulgatorsko zmesjo, razlikujejo pa se v deležu vode (20 – 55 %). Na podlagi rezultatov smo tako želeli ovrednotiti vpliv kvantitativne sestave TK na barierno funkcijo: slike 13-28 prikazujejo spremembo vrednosti TEWL po 30 min in 90 min v primerjavi z bazalnimi vrednostmi v g/h/m2 in spremembo vrednosti hidratacije po 30 min in 90 min v primerjavi z bazalnimi vrednostmi (pred nanosom TK).
SISTEM TK1 (20 % vode + 80 % SMES)
Vpliv sistema TK1 z najnižjim deležem vode na TEWL oziroma hidratacijo kože je prikazan na sliki 13 oziroma 14.
Slika 13: Vrednosti TEWL po nanosu TK1 (20 % vode + 80 % SMES) (delovanje na koži 1h): bazalne vrednosti in vrednosti 30 min in 90 min po odstranitvi TK1 (T = 25,0 °C, RH
= 35,6 %), n=5.
Vrednosti TEWL so tako po 30 min kot po 90 min nižje od bazalnih (slika 13), kar nakazuje na izboljšanje barierne funkcije kože. Največje zmanjšanje opazimo pri vzorcu 1 90 min po odstranitvi TK1, kjer se je vrednost značilno znižala za 11,0 g/h/m2 oziroma 31,9 % (p <
0,05). Pri vzorcu 2 je po 90 min prišlo do zvišanja TEWL v primerjavi z vrednostjo po 30 min, še vedno pa je bilo opazno statistično značilno znižanje za 1,40 g/h/m2 oziroma 4,2 % v primerjavi z bazalnimi vrednostmi, kar je bila najmanjša izmerjena sprememba po nanosu
