DIPLOMSKO DELO

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

DIPLOMSKO DELO

PETRA OSTERMAN

(2)

(3)

UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIČNA FAKULTETA

Študijski program: Biologija in gospodinjstvo

Vpliv listnega tretiranja z nanodelci titanovega dioksida na rast in razvoj sončnice

DIPLOMSKO DELO

Mentorica: Katarina Vogel-Mikuš Kandidatka: Petra Osterman

Ljubljana, julij, 2013

(4)

(5)

Osterman, P. Vpliv listnega tretiranja z nanodelci titanovega dioksida na rast in razvoj sončnice.

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija biologije in gospodinjstva.

Opravljeno je bilo na katedri za botaniko in fiziologijo rastlin, Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Meritve koncentracij elementov v vzorcih so bile s pomočjo rentgensko fluorescenčne spektrometrije s popolnim odbojem opravljene na Institutu Jožef Stefan, na Odseku za fiziko nizkih in srednjih energij.

Študijska komisija Oddelka za biologijo je na mentorico diplomskega dela imenovala doc.

dr. Katarino Vogel-Mikuš, za somentorja pa dr. Marijana Nečemra.

Predsednica komisije: dr. Jelka Strgar, prof. biol.

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za Biologijo Mentorica: doc. dr. Katarina Vogel-Mikuš

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za Biologijo Somentor: dr. Marijan Nečemer

Institut Jožef Stefan, Odsek za fiziko nizkih in srednjih energij Recenzentka: prof. dr. Marjana Regvar

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za Biologijo

Datum zagovora:

Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Podpisana se strinjam z objavo svojega diplomskega dela v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.

Petra Osterman

(6)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd

DK UDK 620.3:546:582.998.16(043.2)=163.6

KG nanodelci/titanov(IV) oksid/sončnica/elementarna sestava AV OSTERMAN, Petra

SA VOGEL-MIKUŠ Katarina (mentorica)/NEČEMER Marijan (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2013

IN VPLIV LISTNEGA TRETIRANJA Z NANODELCI TITANOVEGA DIOKSIDA NA RAST IN RAZVOJ SONČNICE

TD Diplomsko delo (univerzitetni študij) OP XI, 57 str., 10 pregl., 23 sl., 8 pril., 60 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Nanotehnologija je zelo obetajoča in hitro razvijajoča se industrija. Njeni produkti so nanodelci, ki jih odlikujejo posebne lastnosti, te pa se bistveno razlikujejo od lastnosti večjih delcev enake kemijske sestave. Namen naloge je bil preučiti vplive listnega tretiranja z nanodelci TiO2 na rast in razvoj sončnic. Sončnice smo gojili v rastnih komorah. Po treh tednih smo foliarno tretirali stare liste. Od 15 rastlin smo jih 5 tretirali s standardno obliko, 5 z nano obliko TiO2, preostalih 5 rastlin pa je bilo kontrolnih. Izmerili smo koncetracije fotosinteznih pigmentov ter določili koncentracije elementov v rastlinskih organih s pomočjo TXRF metode. Določili smo tudi vsebnost Ti in njegov transportni indeks. Rezultati so pokazali, da oblika tretmaja vpliva na koncentracijo fotosinteznih pigmentov, na koncentracijo in vsebnost Ti v rastlinah, na njegov transportni indeks ter morfološki razvoj. Rastline tretirane z nano obliko TiO2 so bile morfološko najslabše razvite, vendar so imele večjo suho biomaso od standardne oblike tretmaja. Poleg tega, pa je bila motena tudi preskrba rastline s K in Ca.

(7)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Dd

DC UDK 620.3:546:582.998.16(043.2)=163.6

CX nanoparticles/titanium(IV) oxide/sunflower/elemental composition AU OSTERMAN, Petra

AA VOGEL MIKUŠ Katarina (supervisor)/NEČEMER Marijan (co-supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111

PB University of Ljubljani, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2013

TI THE FOLIAR EFFECT OF TITANIUM DIOXIDE NANOPARTICELS ON GROWTH AND DEVELOPMENT OF SUNFLOWER

DT Graduation thesis (university studies) NO XI, 57 p., 10 tab., 23 fig., 8 ann., 60 ref.

LA sl AL sl/en

AB Nanotechnology is a very promising and fast-developing industry. Its products are nano-particles which have special characteristics and are fundamentally different from bigger particles with the same chemical properties. The purpose of this diploma thesis was to observe and determine the effects of nano-particles TiO2

leaf-treatment on growth and development of sunflowers. Sunflowers were grown in growth chambers. After three weeks we applied foliar treatment on old leaves.

Out of 15 plants, we treated 5 with standard form and 5 with nano-form of TiO2. The remaining 5 were used as a control group. We measured the concentration of photosynthetic pigments and determined the concentration of elements in organs of plants by means of TXRF method. We also determined the content of Ti and its transport index. The results showed that form of treatment effects concentration of photosynthetic pigments, concentration of content of Ti in plants, its transport index and morphological development of plants. Plants that were treated with nano-form of TiO₂ were morphologically less developed, although they had bigger dry biomass in comparison to the standard form of treatment. Furthermore, supply of K and Ca was also disturbed.

(8)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO TABEL... VIII KAZALO SLIK ... IX KAZALO PRILOG ... X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... XI

1 UVOD... 1

2 PREGLED OBJAV ... 2

2.1 NANOTEHNOLOGIJA... 2

2.1.1 Izvor nanodelcev ... 3

2.1.2 Živalski in rastlinski svet ... 3

2.2 LASTNOSTI NANODELCEV ... 4

2.2.1 Velikost ... 4

2.2.2 Oblika ... 4

2.2.3 Fizikalne in kemijske lastnosti ... 5

2.3 UPORABA NANOTEHNOLOGIJE V VSAKDANJEM ŽIVLJENJU ... 6

2.4 TVEGANJA NANOTEHNOLOGIJE ... 7

2.4.1 Vplivi nanodelcev na organizme ... 7

2.4.2 Vpliv nanodelcev na rastline ... 8

2.5 TITANOV(IV) OKSID (TiO2) ... 11

2.6 VPLIV NANODELCEV TiO₂ ... 12

2.7 SONČNICA (Helianthus annuus) ... 13

3 NAMEN RAZISKAV ... 14

3.1 DELOVNE HIPOTEZE ... 14

4 MATERIALI IN METODE ... 15 4.1 KARAKTERIZACIJA TiO2 V NANO IN STANDARDNI KEMIJSKI OBLIKI

15

(9)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. VI

4.1.1 Prevodnost ... 15

4.1.2 Nečistoče ... 15

4.2 NASTAVITEV POSKUSA ... 17

4.3 PRIPRAVA TRETMAJEV, TER FOLIARNI NANOS NANO IN STANDARDNE KEMIJSKE OBLIKE TiO2 ... 18

4.4 PRIPRAVA RASTLIN ZA MORFOLOŠKE MERITVE ... 18

4.5 PRIPRAVA VZORCEV ZA MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ... 19

4.6 DOLOČANJE KONCENTRACIJ ELEMENTOV V RASTLINSKIH ORGANIH SONČNICE ... 19

4.6.1 Razklop rastlinskega materiala in priprava vzorcev za meritve z metodo rentgensko fluorescenčne spektroskopije s popolnim odbojem ... 19

4.7 RENTGENSKO FLUORESCENČNA SPEKTROSKOPIJA S POPOLNIM ODBOJEM ... 20

4.7.1 Osnovni princip delovanja metode z rentgensko fluorescenčno spektroskopijo s popolnim odbojem ... 21

4.7.2 Sestavni deli rentgensko fluorescenčnega spektrometra ... 22

4.8 STATISTIČNA ANALIZA ... 22

5 REZULTATI ... 23

5.1 MORFOLOŠKE SPREMEMBE ... 23

5.1.1 Kontrola ... 24

5.1.2 Standardna oblika ... 25

5.1.3 Nano oblika ... 26

5.1.4 Primerjava tretmajev ... 27

5.1.5 Biomasa rastlin ... 28

5.2 KONCENTRACIJA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ... 30

5.3 KONCENTRACIJE ELEMENTOV V POGANJKIH IN KORENINAH SONČNICE ... 33

5.3.1 Titan ... 33

5.3.2 Kalij ... 39

(10)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. VII

5.3.3 Kalcij ... 40

5.3.4 Ostali elementi ... 41

6 RAZPRAVA ... 42

6.1 KARAKTERIZACIJA TiO2 V NANO IN STANDARDNI KEMIJSKI OBLIKI 42 6.2 VPLIV TiO2 NA RASTLINE ... 42

6.2.1 Vplivi TiO2 na morfologijo in rast rastlin ... 42

6.2.2 Vpliv TiO2 na koncentracijo fotosinteznih pigmentov ... 43

6.2.3 Vpliv TiO2 na koncentracijo elementov v poganjkih in starih listih ... 44

7 SKLEPI ... 47

8 POVZETEK... 48

9 VIRI ... 50

ZAHVALA ... 1

(11)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. VIII

KAZALO TABEL

Tabela 1: Izmerjena prevodnost pri kontroli, standardni in nano kemijski obliki TiO2... 15

Tabela 2: Koncentracije nečistoč v standardni in nano kemijski obliki TiO2 ... 16

Tabela 3: Morfološke spremembe tretiranih delov rastlin – stari listi v primerjavi s kontrolo ... 23

Tabela 4: Morfološke spremembe netretiranih delov rastlin ... 23

Tabela 5: Rezultati faktorske analize za suho biomaso korenin ... 29

Tabela 6: Rezultati faktorske analize za suho biomaso mladih listov. ... 30

Tabela 7: Rezultati faktorske analize za koncentracijo a) klorofila a v starih listih, b) klorofila b v starih listih in c) karotenoidov v mladih listih ... 31

Tabela 8: Rezultati faktorske analize za koncentracijo Ti v a) mladih listih in b) starih listih ... 34

Tabela 9: Vsebnost Ti v starih listih ... 36

Tabela 10: Rezultati faktorske analize za transportni indeks a) mladih listov, b1) korenin (tretirane in kontrolne rastline) in b2) korenin (le tretirane rastline). ... 37

(12)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. IX

KAZALO SLIK

Slika 1: Shematski prikaz obnašanja vodne kapljice na različnih površinah ... 6

Slika 2: Kristalne strukture TiO2 ... 12

Slika 3: Sončnica (Helianthus annuus) ... 13

Slika 4: Rentgensko fluorescenčni spekter posnet po vzbujanju vzorcev TiO2 v nano in standardni kemijski obliki z radioizotopskim izvorom Cd-109. ... 16

Slika 5: Sončnice v rastni komori ... 17

Slika 6: a) Foliarno tretirana rastlina in b) povečava lista foliarno tretirane rastline. ... 18

Slika 7: Shematski prikaz principa delovanja TXRF metode ... 20

Slika 8: Shematski prikaz fotoefekta (povzeto po Gangl, 1997) ... 21

Slika 9: a) Kontrolne rastline v rastnih komorah, b) primerek kontrolne rastline ob koncu poskusa ... 24

Slika 10: Pojav kloroz na starih listih rastline tretirane s standardno obliko TiO2 ... 25

Slika 11: a) in b) pojav kloroz in nekroz na poganjkih in starih listih rastline, ki je bila tretirana z nano obliko TiO₂ ... 26

Slika 12: a) in b) primerjava tretmajev (kontrola, standardna in nano oblika TiO₂) ... 28

Slika 13: Suha biomasa poganjkov in korenin sončnic pri različnih tretmajih ... 29

Slika 14: Suha biomasa mladih (netretiranih) in starih listov (tretiranih) sončnic pri različnih tretmajih ... 30

Slika 15: Koncentracija klorofila a pri različnih tretmajih. ... 31

Slika 16: Koncentracija klorofila b pri različnih tretmajih ... 32

Slika 17: Koncentracija karotenoidov pri različnih tretmajih... 33

Slika 18: Koncentracija Ti v mladih in starih listih pri različnih tretmajih ... 35

Slika 19: Vsebnost Ti v starih (tretiranih) listih pri različnih tretmajih ... 36

Slika 20: Transportni indeks za mlade liste pri različnih tretmajih ... 38

Slika 21: Transportni indeks za korenine pri različnih tretmajih ... 38

Slika 22: Koncentracija K v mladih in starih listih pri različnih tretmajih ... 39

Slika 23: Koncentracija Ca v mladih in starih listih pri različnih tretmajih ... 40

(13)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. X

KAZALO PRILOG

Priloga A: Vpliv oblike TiO2 na suho biomaso

Priloga B: Vpliv oblike TiO2 na koncentracijo fotosinteznih pigmentov Priloga C: Vpliv oblike TiO2 na koncentracijo Ti

Priloga D: Vpliv koncentracije TiO2 na vsebnost Ti

Priloga E: Vpliv oblike TiO2 na vrednost transportnega indeksa tretiranih rastlin Priloga F: Vpliv oblike TiO2 na koncentracijo K v tretiranih rastlinah

Priloga G: Vpliv oblike TiO2 na koncentracijo Ca v tretiranih rastlinah Priloga H: Koncentracije ostalih elementov

(14)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. XI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Am americij

Ca kalcij

Cd kadmij

ER endoplazemski retikulum

Fe železo

Ga galij (interni standard) GA Golgijev aparat H202 vodikov peroksid

K kalij

ND nanodelci

O2 superoksidni anion O2H hidroperoksilni radikal O3 ozon

OH hidroksilni radikal PS I fotosintezni sistem I PS II fotosintezni sistem II ROS reaktivne kisikove spojine Ti titan

TiO2 titanov(IV) oksid

TXRF rentgensko fluorescenčna spektroskopija s popolnim odbojem

(15)

(16)

Dipl. delo, Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Pef, Bf, 2013. 1

1 UVOD

Nanotehnologija je hitro razvijajoča se industrija (Daohui in Baoshan, 2007), ki se ukvarja s proizvodnjo nanodelcev. Nanodelci (ND) so delci v nanometrskem merilu in v vsaj eno dimenzijo merijo manj kot 100 nm (Remškar, 2009). Takšni delci imajo povsem nove fizikalne in kemijske lastnosti, te pa se bistveno razlikujejo od lastnosti večjih delcev enake kemijske sestave (Navodnik, 2007). Prav zaradi teh posebnih lastnosti so ND še posebej zanimivi.

Uporabljajo se na mnogih področjih, predvsem v zdravstvu, kozmetiki, prehranski, gradbeni in avtomobilski industriji. Njihova uporaba posledično vpliva na globalno- ekonomsko in družbeno-politično dogajanje ter v končni fazi tudi na okolje. K industrijsko proizvedenimi ND sodijo tudi kovinski oksidi, kot npr. TiO₂, ki je najbolj vsestransko uporaben nanomaterial. Zaradi svojih antibakterijskih lastnosti služi kot dodatek hrani, največ pa se uporablja v kozmetični industriji, saj omogoča zaščito pred UV sevanjem.

Najdemo ga tudi v samočistilnih premazih, ter sončnih celicah (Remškar, 2009).

Namen diplomskega dela je bil preučiti vplive listnega tretiranja ND TiO2 na rast in razvoj sončnic (Helianthus annuus). Preučili smo vplive TiO2 na koncentracijo fotosinteznih pigmentov, ter na koncentracijo Ti, K in Ca v listih. Opazovali in beležili smo morfološke spremembe, dobljene rezultate pa smo primerjali s kontrolnimi rastlinami, ter z rastlinami, ki smo jih listno tretirali s TiO2 v standardni kemijski obliki. Sončnico smo izbrali zaradi nezahtevnega gojenja in hitrega zaključka razvojnega cikla.

(17)

2 PREGLED OBJAV

2.1 NANOTEHNOLOGIJA

Beseda nano izhaja iz grške besede ''nannos'' in v prevodu pomeni škrat oz. pritlikav. Isto besedo uporabljamo tudi kot predpono, ki v matematičnem merilu označuje desetiško potenco 10^-9. Nanometer (nm) predstavlja milijardinko metra. Ko govorimo o ND, govorimo o skupkih materiala, ki vsaj v eni dimenziji merijo manj kot 100 nm (Remškar, 2009) in jih s prostim očesom ne moremo videti. Lastnosti delcev, ki imajo manj kot 10⁶ atomov, se bistveno razlikujejo od lastnosti masovnih materialov (Navodnik, 2007 in Schulenburg, 2006).

Nanotehnologija je hitro razvijajoča se industrija, ki se ukvarja z delci v nanometrskem merilu in podaja povsem nov pristop v načinu razumevanja lastnosti ND (Remškar, 2009).

S pojavom nanotehnologije je v porastu tudi uporaba ND na različnih področjih industrije, predvsem pa se le ta usmerja v komercialne namene (kreme za sončenje, samočistilni premazi, gorilne celice, antibakterijske prevleke, itd.).

V prihodnosti bo nanotehnologija poskrbela za rešitve mnogih tehnoloških problemov, po drugi strani pa se bo z naraščajočo industrijsko proizvodnjo ND, povečeval tudi njihov vpliv na okolje. Predvsem problematični bodo nenadzorovani izpusti ND v prašni oz.

tekoči obliki. Posledice bodo vidne kot kopičenje ND v užitnih delih rastlin (listih, plodovih, semenih, gomoljih), kar pa bo posledično vplivalo tudi na preostale člene v prehranjevalni verigi.

Tako, se vedno znova pojavljala pereče vprašanje o morebitnih negativnih posledicah uporabe ND. Zato je smiselno in hkrati tudi nujno potrebno pridobiti čim več informacij o morebitni strupenosti in pojavu tveganja pri uporabi namensko oz. industrijsko proizvedenih ND. Iz tega je možno sklepati, da bo imela nanotehnologija močan vpliv tudi na ekonomijo ter globalno družbeno dogajanje (Remškar, 2009).

(18)

2.1.1 Izvor nanodelcev

Glede na izvor jih delimo v 2 skupini in sicer na naravne in proizvedene ND. Naravne ND najdemo v puščavskem prahu, lahko pa nastanejo tudi pri vulkanskih izbruhih in gozdnih požarih, eroziji, itd. Proizvedene ND pa nadaljnje delimo še v 2 podskupini in sicer na namensko oz. inženirsko proizvedene, ter na nenamensko proizvedene ND. K namensko proizvedenim ND prištevamo tiste ND, ki se jih poslužujemo v medicini, kozmetični, avtomobilski industriji, itd. Običajno je njihova površina kemijsko obdelana, kar preprečuje spontano združevanje v večje skupke. Glede na kemijsko sestavo pa se inženirski ND delijo na kovine, kovinske okside, polimere, ter hibridne ND (Remškar, 2011). V drugo podskupino, torej k nenamensko proizvedenim ND pa sodijo vsi tisti, ki so bodisi stranski produkt v industrijski proizvodnji (mletje, varjenje, brušenje) ali pa nastanejo pri izgorevanju biomase in fosilnih goriv (saje). Najdemo jih tudi v izpuhih motorjev z notranjim izgorevanjem, predvsem pri dizelskih motorjih (Remškar, 2009).

Raziskave, s katerimi so preiskovali vplive inženirsko proizvedenih ND, je pokazala da so le ti v velikih koncentracijah toksični (Xingmao in sod., 2010).

2.1.2 Živalski in rastlinski svet

Tudi v naravi obstaja nanosvet in lep primer uporabe nanotehnologije nam daje gekon, ki ima sposobnost hoje po steni. To mu omogočajo zelo tanke in mehke dlačice na nogah, s pomočjo katerih se površini približa le na nekaj nm. Pri tem se med atomi dlačic in podlago vzpostavijo Van der Waalsove vezi, ki kljub šibkosti posamezne vezi, vendar množičnosti le teh, nosijo težo živali. Podoben princip oprijemanja podlage z dlačicami imajo tudi muhe, hrošči in pajki (Schulenburg, 2006). Znane so tudi t.i. magnetotaktične bakterije, kot npr. Magnetotacticum bavaricum, ki imajo sposobnost orientacije v magnetnem polju (Navodnik, 2007). Slednje jim omogočajo nanomagneti, ki se nahajajo v magnetosomih (Bazylinski in Frankel, 2004).

(19)

Nanotehnologija pa se pojavlja tudi pri rastlinah. Te se poslužujejo pojava lotosovega efekta, ki je znan pri 200 rastlinskih vrstah. Gre za t.i. samočistilni mehanizem listov (Schulenburg, 2006).

2.2 LASTNOSTI NANODELCEV

Ena izmed glavnih lastnosti ND v primerjavi z ostalimi delci večje velikosti je ta, da imajo prvi veliko večje razmerje med površino in prostornino. To vpliva tudi na samo reaktivnost delcev. Se pravi, večje ko bo razlika v razmerju, bolj reaktiven bo delec. Takšni delci lahko veliko dlje časa obstanejo v zraku (Navodnik, 2007).

Prav tako se drugačne karakteristike pojavljajo pri električni prevodnosti, optični absorpciji, povečana pa je tudi želja po aglomeraciji oz. kopičenju in agregaciji oz.

združevanju. Na slednjo vpliva temperatura, pH, koncentracija, ter sama velikost in oblika ND (Navarro in sod., 2008). Toksičnost pa je lahko odvisna tudi od same kristalne strukture ND (Sayes in sod., 2006).

2.2.1 Velikost

Velikost je zelo pomemben parameter. Z majhnostjo delcev narašča trdnost, razteznost, reaktivnost, termični raztezek, difuzija, specifična površina in viskoznost (Navodnik, 2007 in Chang in sod., 2005). Medtem pa po drugi strani z majhnostjo delcev pada tališče, termična prevodnost, gostota in sposobnost razsipa svetlobe (Navodnik, 2007).

2.2.2 Oblika

Oblika ND natančno določa njegovo površino. Na njej so proste kemijske vezi, ki vplivajo tako na fizikalne, kot tudi kemijske lastnosti delca (Remškar, 2009). Če imamo ploščat delec, ima ta v primerjavi s sferičnim delcem enake mase, večjo površino (Čebulj, 2007).

Oblika določa tudi aerodinamični premer delca. Slednji je pomemben za razumevanje uhajanja in potovanja ND po ozračju. Okrogli delci se zelo hitro gibljejo v plinu oz.

(20)

tekočinah in z lahkoto prehajajo preko luknjic filtrov. Medtem ko so ploščati delci zaradi večje mase podvrženi sedimentaciji in jih zato tudi lažje prestrežemo s filtri (Remškar, 2009).

2.2.3 Fizikalne in kemijske lastnosti

Kot smo že omenili, nam razmerje med površino in prostornino pove, kako reaktiven bo delec. Sile med delci so posledica reaktivnosti površinskih atomov. Torej, če je atomov na površini več oz. imajo ti več prostih vezi, se delci hitreje in močneje vežejo (Remškar, 2009). Če se vežejo med seboj, se združujejo v skupke. Aglomeracija je odvisna od vrste nanodelca, koncentracije, raztopine, temperature, pH, itd. (Čebulj, 2007).

ND v vodi načeloma niso topni (Stampoulis in sod., 2009). Kemijsko stabilnejši so kovinski oksidi. Ti zaradi večjega števila možnih oksidacijskih stanj kovinskega iona, različno reagirajo (Remškar, 2009). Zanimivo je, da so magneti v nanometerskem merilu 10-krat močnejši od magnetov večjih dimenzij. Kovine lahko postanejo izolatorji ali polprevodniki, plini pa postanejo superfluidni. Pojavijo se tudi spremembe v temperaturi tališča, (Navodnik, 2007).

Optične lastnosti ND se spreminjajo glede na pogoje, v katerih se ti nahajajo. Značilna je menjava barve v odvisnost od velikosti delcev, temperature in tlaka. Nemalokrat pride tudi do pojava fluorescence (Navodnik, 2007). Kvantni pojavi so posledica povečane kemijske aktivnosti. Ta se pojavi tudi pri delcih velikosti 1 nm, pri katerih se kar 58% vseh atomov nahaja na površini (Remškar, 2009).

Delci imajo v nanometrskem merilu nekoliko drugačen kot omočitve, kar vpliva na stopnjo hidrofilnosti. Posledica takšnih lastnosti je pojav t.i. lotosovega efekta (Remškar, 2009).

Omočitveni kot nam pove, koliko znaša kot med hidrofilno ploskvijo in kapljico. Vrednost kota se giblje med 90° in 150°, lahko pa znaša ekstremnih 180° (slika 1). Zaradi izredno velikega kota se kapljica vode zelo težko obdrži na površini. Odkotali se že pri zelo majhni spremembi nagiba. Kapljice se zaradi strmenja k minimalnemu kontaktu s podlago kotalijo in ne polzijo (Remškar, 2009). Po istem principu, naj bi delovali tudi nanotehnološko obdelan samočistilni tekstil, keramika, avtomobilski laki, itd.

(21)

Slika 1: Shematski prikaz obnašanja vodne kapljice na različnih površinah (povzeto po Grum, 2008)

2.3 UPORABA NANOTEHNOLOGIJE V VSAKDANJEM ŽIVLJENJU

Kot smo omenili so ND prisotni povsod okoli nas. Danes se na tržišču pojavlja vse več izdelkov in polizdelkov, ki vsebujejo ND. Tako je tudi v avtomobilski industriji, kjer je prišlo do revolucionarnih odkritij kar se tiče lakov in barv odpornih na praske. Vedno več je termoodbojnih premazov za steklo in samočistilnih premazov za površine. Prvi preprečujejo toplotnemu sevanju, da bi prehajalo v notranjost avtomobila, drugi pa preprečujejo, da bi se umazanija prijela na površino avtomobila.

Pojav nanotehnologije je viden tudi v gradbeništvu, kjer se uporabljajo premazi za betonske tlakovce in fasade. Princip delovanja temelji na lotosovem efektu. V prodaji pa je tudi že t.i. samočistilna keramika (Remškar, 2009).

V vse večji meri se nanotehnologija pojavlja tudi v vsakdanji prehrani. Govorimo o t.i.

nanohrani. Ta označuje hrano, ki je bila bodisi predelana ali pakirana s pomočjo nanotehnologije. V hrano dodajo ND Fe, Zn, Ti ali celo nanokapsule. Slednje služijo kot nosilke za koencim Q10, Ω3 in Ω6 maščobne kisline, vitamine, minerale ter antioksidante.

Obstojnost hrane podaljšujejo nanoprevleke, ki preprečujejo izgubo vode, hkrati pa izboljšujejo okus. Poleg načrtno dodanih ND hrani, pa ti vanjo zaidejo tudi zardi mehanske obrabe orodja pri obdelavi hrane (mešanje, gnetenje, itd.), (Remškar, 2009).

Nanotehnologija je svoj delež doprinesla tudi medicini. Težnja po boljši diagnostiki, preprečevanju in zdravljenju bolezni vključuje uporabo ND. Ti so lahko obdani s proteini, vse skupaj pa se veže na rakave celice. Tako npr. ND Au ali železovega oksida pod vplivom šibkega elektromagnetnega polja segrejejo rakasto tvorbo, da se le-ta ''skuha'', pri

(22)

čemer okoliške celice ostanejo nepoškodovane (Remškar, 2009). V uporabi so tudi magnetni ND. Prednost slednjih je v tem, da jih je s pomočjo usmerjenega magnetnega polja možno izločiti iz telesa (Pisanic in sod., 2007). Poleg tega pa takšni ND izboljšujejo kontrast slik posnetih z magnetno resonanco (Remškar, 2009).

Po sintetično proizvedenih ND pa vse bolj posega tudi kozmetična industrija. Daleč najbolj vsestransko uporaben je TiO₂. Zaradi sposobnosti zaščite pred UV sevanjem, ga dodajajo kremam za sončenje (Remškar, 2009). Sintetično proizvedeni ND pa se pojavljajo tudi v tekstilni industriji saj nudijo antimikrobno zaščito, hkrati pa preprečujejo mečkanje tkanin (Navodnik, 2007).

Kot vidimo ima nanotehnologija velik potencial in predvidevamo lahko, da se bo v bodoče njen razvoj le še povečal.

2.4 TVEGANJA NANOTEHNOLOGIJE

Kljub temu, da nam nanotehnologija ponuja širok spekter uporabe nanotehnoloških

aplikacij, pa se istočasno poraja vprašanje, kako ustrezno poskrbeti za varovanje zdravja in okolja. V trgovinah je že možno kupiti izdelke, ki vsebujejo ND, vendar pa le-ti ne

vsebujejo oznak, ki bi potrošnike opozarjale na njihovo prisotnost.

Znano je, da so ND bolj toksični od večjih delcev enake kemijske sestave, saj jim njihova majhnost omogoča lažji prodor v notranjost celic (Gurr in sod., 2005). Raziskave nakazujejo, bi bilo tudi v bodoče smiselno preučevati vplive različnih ND (Drobne, 2007, Long in sod., 2006), hkrati pa bi bilo potrebno razvijati primerno metodo za detekcijo le- teh.

2.4.1 Vplivi nanodelcev na organizme

Znano je, da ND v organizem prehajajo preko kože, prebavil in dihal. V notranjosti telesa pa se nalagajo predvsem v vranici, jetrih in bezgavkah. (Remškar, 2009). Delci velikosti 70 nm prodrejo v pljučne mešičke, od koder lahko neposredno preidejo v krvni obtok, ta pa

(23)

jih prenese v preostale dele telesa. Delci velikosti 50 nm lahko prodrejo v notranjost celic, medtem ko delci velikosti 30 nm prodrejo celo v celično jedro (Schulenburg, 2006).

Novejše raziskave so pokazale, da so zdravju nevarni tudi izpušni plini motorjev z notranjim izgorevanjem. Problematični so predvsem dizelski motorji, ki navkljub manjši produkciji CO2, proizvedejo večjo količino ND (Remškar, 2009). Takšni delci s pomočjo endocitoze prečkajo celično membrano, ali pa za vstop uporabijo transportne proteine oz.

ionske kanalčke. Pri tem prihaja do motenj v metabolizmu oz. do nepravilnega delovanja celičnih organelov (ER, GA, itd.), (Navarro in sod., 2008). Dokazano je, da so pri miših poškodbam najbolj podvržene predvsem mikroglija celice v možganih, saj so te ob prisotnosti ND dizelskega izpuha pričele sproščati proste kisikove radikale (Block in sod, 2004). Podoben odziv se je pojavil tudi pri celicah, ki so bile v stiku z ND TiO2. Te so bile ob prisotnosti ND TiO2 podvržene oksidativnemu stresu. Slednji je viden v povečani koncentraciji H2O2, pojavi pa se lahko tudi hiperpolarizacja mitohondrijskih membran (Long in sod., 2006). Podoben odziv na povišanje koncentracije ND je bil viden tudi v raziskavah, kjer so deževnike (Esenia fetida) izpostavljali različnim koncentracijam ND TiO2 in ZnO v zemlji. Pri višjih koncentracijah so bile vidne poškodbe na DNA verigi. Po 7 dnevnem tretiranju so imel mitohondrijih spremenjeno obliko, zmanjšalo pa se je tudi njihovo število (Hu in sod., 2010).

Iz raziskav je vidno, da prisotnost ND vpliva na nastanek poškodb na proteinih, lipidih, DNA verigi in živčnih celicah. Posledično to lahko vodi do nastanka Parkinsonove in Alzheimerjeve bolezni, ter pojava amiotrofične lateralne skleroze (Remškar, 2009).

2.4.2 Vpliv nanodelcev na rastline

Zaradi vse večjega pojava in uporabe mehansko proizvedenih ND, pa tudi morebitne onesnaženosti okolja z namensko proizvedenimi ND lahko sklepamo, da bodo njihovi vplivi vidni tudi na rastlinah. Preživele bodo le tiste rastline, ki se bodo sposobne hitreje adaptirati na takšno okolje (Monica in Cremonini, 2009).

(24)

2.4.2.1 Privzem in transport nanodelcev v rastlinskih tkivih

ND v rastline prehajajo preko koreninskega sistema in preko listne površine. Na listni površini izmenjava snovi poteka preko listnih rež, ki so velike od 5 do 50 µm. Ker ND ne presegajo velikosti listnih rež, nemoteno vstopajo v notranjost celic (Fleisher in sod., 1999). Lahko pa se zgodi, da se listne reže ob prisotnosti ND povečajo, kar pomeni, da je tudi večjim delcem omogočen vstop v notranjost celice.

Če je rastlina po površini lista tretirana z ND, lahko le-ti preko listnih rež oz. baz trihomov vstopajo v listni mezofil. Od tu se lahko preko apoplasta oz. simplasta transportirajo v preostale dele (Fernandez in Eichert, 2009), kjer vplivajo na potek metabolnih procesov (Jia in sod., 2005), transpiracijo, izmenjavo plinov, regulacijo temperature in v končni fazi na sam potek fotosinteze (Da Silva in sod., 2006).

ND morajo za vstop preko koreninskega sistema najprej preiti celično steno ter plazmalemo epidermalnih celic korenin. Od koder se lahko po ksilemu oz. prevodnih tkivih nemoteno prenesejo v preostale dele rastline. Privzem ND preko koreninskega sistema je odvisen predvsem od njihove sestave, oblike in velikosti ter rastlinske vrste (Ma in sod., 2010).

Pri raziskavah ND Cu je bilo ugotovljeno, da se s povečevanjem koncentracije povečujeta tako privzem kot tudi akumulacija ND v rastlinskih tkivih (Lee in sod., 2008). Raziskave o sposobnosti privzema ND ZnO pri Ljuljki (Lolium perenne) niso pokazale trenda translokacije iz korenin v poganjke, zaznali pa so, da se ND ZnO lepijo na površino korenin. Posamezne ND so opazili tudi v apoplastu, ter simplastu pri koreninskem endodermisu in steli (Lin in Xing, 2008).

2.4.2.2 Akumulacija nanodelcev

Akumulacija oz. kopičenje ND na fotosinteznih površinah povzroča segrevanje le-teh, hkrati pa otežuje izmenjavo plinov in zavira potek fotosinteze. Ugotovljeno je bilo , da je bila akumulacija železovih ND manjša na listih, katerih površina je bila gladka in prekrita z voskom. Pri nagubanih in z voskom neprekritih listih pa je bila po pričakovanjih akumulacija železovih ionov precej večja (Da Silva in sod., 2006).

(25)

2.4.2.3 Odziv rastlin na prisotnost nanodelcev

Pri večini raziskav se je pokazalo, da imajo ND negativen vpliv na rast in razvoj rastlin (Monica in Cremonini, 2009). Slednje se odraža v zmanjševanju biomase, zavrtem razvoju koreninskega sistema in deformacijah koreninskih čepic (Ma in sod., 2010, Grošelj in sod., 2009).

Pri preučevanju vpliva ND na kalitev semen in rast korenin, je bilo ugotovljeno, da to variira tako z vrsto ND, kot tudi z vrsto tretirane rastline (Lin in Xing, 2007, Zhu in sod., 2008). S povečevanjem koncentracije ND, se je zmanjšala koreninska rast (Lin in Xing, 2007), celice koreninskih čepic so se pričele krčiti, celice epidermisa in korteksa pa so pričele propadati (Lin in Xing, 2008). Zanimivo je, da ND ne vplivajo na kalitev semen.

To lahko pripišemo predvsem semenskemu ovoju, ki opravlja zaščitno funkcijo (Lin in Xing, 2007). Nadaljnje raziskave so pokazale, da imajo celice koreninskih čepic čebule (Allium cepa) zaradi prisotnosti srebrovih ND motnje v proces delitve (Kumari in sod., 2010).

Vendar pa ND ne prinašajo vedno negativnih posledic. Presenetljivo je, da ND TiO2

pozitivno vplivajo na kalitev semen in tudi nadaljnjo rast špinače, saj izboljšujejo svetlobno absorpcijo, ter spodbujajo delovanje encima Rubisco (Nair in sod., 2010).

Ugotovljeno je bilo tudi, da prisotnost ND TiO2 povečuje sposobnost fiksacije dušika (Yang in sod., 2007), ter vpliva na povečanje suhe biomase (Zhang in sod., 2005).

2.4.2.4 Oksidativni stres in reaktivne kisikove spojine (ROS)

Oksidativni stres nastopi, ko se poruši ravnotežje med tvorbo oksidantov (reaktivnih kisikovih spojin - ROS) in antioksidantov v celici (Količ, 2009). Porušenje ravnotežja je posledica interakcije ND z organizmi. Pojavi se lahko tudi zaradi izpostavljenosti celic različnim okoljskim faktorjem, kot npr. UV sevanju, toploti, prisotnosti oksidantov, itd.

(Navarro in sod., 2008). Posledice so vidne kot poškodbe tkiv, celičnih organelov, itd.

(Remškar, 2009).

ROS so zelo reaktivne in nestabilne molekule, saj imajo na vsaj enem od energijskih nivojev neparen elektron. Zaradi energijske neuravnovešenosti stremijo k zapolnitvi oz.

(26)

nadomestitvi manjkajočega elektrona. Ko spojini, ki ni radikal, odvzamejo elektron, ta sama postane radikal, s tem pa se sproži verižna reakcija. Reagirajo lahko tudi s celičnimi komponentami, ki vsebujejo nenasičene maščobne kisline, beljakovine, nukleinske kisline in ogljikove hidrate. V normalnih razmerah je produkcija ROS nizka in je stranski produkt celičnega metabolizma (Količ, 2009). Med najpomembnejše ROS sodijo hidroksilni (OH ) in hidroperoksilni radikali (O2H ), superoksidni anion (O2 ), vodikov peroksid (H2O2), ozon (O₃), itd.

Posledice so vidne v upadu rasti in zmanjšani produktivnost rastlin. Če njihovega škodljivega vpliva rastlina ni sposobna zaustaviti, lahko nastopi smrt (Hegedüs in sod., 2001). Zato so bile rastline tekom evolucije primorane razviti obrambne mehanizme, ki bi jih varovali pred posledicami oksidativnega stresa. Nastali so kompleksni antioksidativni obrambni sistemi, ki sestojijo iz encimskih in neencimskih antioksidantov. Med neencimske antioksidante prištevamo askorbat (vitamin C), reduciran glutation (GHS), α- tokoferol (vitamin E), karotenoide, flavonoide, itd. Med encimske antioksidante pa prištevamo superoksid dimutaze (SOD), katalaze (CAT), peroksidaze (askorbat peroksidaza (A-POD) in guaiakol peroksidaze (GPOD), glutation reduktaze (GR), itd.

(Strlič, 2008).

Vendar pa ROS niso le škodljivi metabolni produkti. Lahko delujejo tudi kot medcelične signalne molekule, ki aktivirajo obrambne odzive na biotski in abiotski stres. Poleg tega imajo pomembno vlogo tudi pri strukturi celične stene (Navarro, 2008). Običajno pa akumulacija ROS vodi v pospešeno senescenco (Dat s sod., 2000).

2.5 TITANOV(IV) OKSID (TiO2)

Titanov(IV) dioksid je najpomembnejša titanova spojina. V naravi se nahaja v treh polimorfnih strukturah, in sicer v rutilni, anatazni ter brukitni obliki (slika 2). Kristalne strukture se med seboj razlikujejo po zvitosti posameznih oktaedrov in po vzorcu zlaganja oktaedričnih verig. Razlike v masni gostoti se pojavljajo zaradi različnih mrežnih struktur (Šuligoj, 2011). Koordinacijsko število pri vseh polimorfnih oblikah znaša 6, kar pomeni da vsak titanov atom obdaja 6 atomov kisika (Brezovar, 2010). Pri našem poskusu smo uporabili TiO2, ki se nahaja v anatazni kristalni obliki.

(27)

Slika 2: Kristalne strukture TiO2: rutilna (levo), anatazna (sredina) in brukitna struktura (desno), v središču vsakega oktaedra se nahaja Ti atom, na vsakem oglišču pa je mesto za O atome (povzeto po Carp in sod., 2004)

TiO₂ kot najbolj vsestransko uporaben nanomaterial, odlikujejo fotokatalitične in antimikrobne sposobnosti. Omogoča zaščito pred UV sevanjem, zaradi česar ga dodajajo predvsem kremam za sončenje. Pojavlja se tudi v sončnih celicah in samočistilnih premazih, najdemo pa ga tudi v hrani, bodi si kot belilo oz. kot podaljševalec obstojnosti.

Izkazalo se je, da ima ob prisotnosti UV svetlobe antibakterijski učinek (Adams in sod.

2006). Zmanjševal naj bi tudi onesnaženost v mestih, saj katalizira pretvorbo dušikovega dioksida (NO2) v manj toksične nitrate (Fabiani in sod., 2008). Poleg tega pa je netopen v vodi ter v in številnih organskih topilih, ima tudi veliko kemično in termično stabilnost.

Odlikuje ga nizka cena (Brezovar, 2010).

2.6 VPLIV NANODELCEV TiO2

Zaradi širokega spektra uporabe in predvsem zaradi aktivnosti ND pod UV svetlobo, je potrebno veliko pozornost nameniti prav ND, manjšim od 200 nm (Remškar, 2009).

Zanimivo je, da se v nekaterih kremah za sončenje pojavljajo delci TiO2, katerih velikost se giblje od 20 do 50 nm. Slednje so tudi preučevali in ugotovili, da ND ob prisotnosti UV svetlobe povzročajo nastanek superoksidnih radikalov oz. hidroksidnih (OH^-) ionov (Dunford in sod. 1997). To pomeni, da bi interakcija ND z UV svetlobo lahko privedla do

(28)

nastanka poškodb na DNA verigi, s čimer bi se povečala verjetnost za pojav kožnega raka (Remškar, 2009).

Kot smo že omenili, anatazna oblika ND TiO2 spodbuja proces absorpcije nitratov, pri čemer se izboljša prehranjenost rastline z dušikom. S tem je pospešena tudi pretvorba anorganskega dušika v organskega, kar posledično pripomore k večji masi tako suhe kot tudi sveže snovi. Pozitiven vpliv je viden tudi na delovanju LHC II kompleksa, ki se nahaja v tilakoidnih membranah, čigar glavna naloga je prenos energije oz. fotonov na fotosintezni sistem II (FS II), (Lei in sod., 2007, Hong in sod., 2005).

2.7 SONČNICA (Helianthus annuus)

Sončnica (Helianthus annuus) sodi v družino nebinovk (Asteraceae), ki izvirajo iz Severne Amerike. Je enoletnica, nezahtevna za gojenje in v višino zraste do 3 m. Socvetje je veliko in sploščeno, ter obdano z značilnimi rumenimi sterilnimi cvetovi. V 16. stoletju so semena sončnice prinesli v Evropo, od koder se je kot kulturna rastlina razširila na vzhod. Iz njenih semen pridobivajo sončnično olje, ki se uporablja kot jedilno olje oz. kot surovina za izdelavo margarine. Uporaba se je razširila tudi na kozmetiko (Sunflower, 2012).

Slika 3: Sončnica (Helianthus annuus)

(29)

3 NAMEN RAZISKAV

Namen naloge je bil preučiti vplive listnega tretiranja s TiO2 v nano in standardni kemijski obliki na rast in razvoj sončnice (Helianthus annuus), ter preučiti stopnjo privzema in prerazporejanja Ti in ostalih elementov (predvsem Ca in K) v organih in tkivih sončnice.

3.1 DELOVNE HIPOTEZE

Predvidevamo, da bodo:

a) ND TiO2 negativno vplivali na rast in razvoj sončnic, saj bodo v primerjavi s TiO2 v standardni kemijski obliki lažje vstopali v globlja listna tkiva in jih s tem poškodovali.

Pri tem bo motena fotosinteza in preskrba rastline z ogljikovimi hidrati, kar se bo odražalo na zmanjšani rasti rastlin.

b) Rastline tretirane z ND TiO₂ bodo v svojih organih in tkivih, v primerjavi z rastlinami tretiranimi s TiO₂ v standardni kemijski obliki zaradi večje mobilnosti ND vsebovale višje koncentracije Ti, motena pa bo preskrba s Ca in K.

(30)

4 MATERIALI IN METODE

4.1 KARAKTERIZACIJA TiO2 V NANO IN STANDARDNI KEMIJSKI OBLIKI 4.1.1 Prevodnost

Pri obeh oblikah TiO2 smo s pomočjo konduktometra (Seven Multi, Mettler Toledo) izmerili prevodnost raztopin s katerimi smo foliarno tretirali stare liste rastlin. Predvidevali smo, da bo imela nano kemijska oblika TiO2 večjo prevodnost, saj vsebuje večje število ionov.

Tabela 1: Izmerjena prevodnost pri kontroli, standardni in nano kemijski obliki TiO₂

Tretma Prevodnost (µS/cm)

Kontrola (bidestilirana voda) 2,97

Standardna oblika TiO₂ 4,01

Nano oblika TiO₂ 67,6

4.1.2 Nečistoče

Obe kemijski obliki TiO_2, ki smo ju uporabili za poskus, na svojih embalažah nista imeli zabeleženih nečistoč. Slednje smo določili s pomočjo rentgensko fluorescenčne spektroskopije, pri čemer smo vzorce vzbujali z radioizotopskimi izvori Cd-109, Fe-55 in Am-241. S pomočjo Fe-55 smo določali elemente, ki imajo energijo K oz L črt pri 1-5,9 keV, Cd-109 pri 2-20 keV, ter Am-241 pri 10-50 keV.

Pri obeh spojinah so bile opazne sledi K, Nb, Cd, Ba in Zr. Nano oblika TiO2 pa je vsebovala še sledove Cu in Br (Tabela 2, slika 4).

(31)

Tabela 2: Koncentracije nečistoč v standardni in nano kemijski obliki TiO₂ Nečistoče Koncentracija (ppm) pri

standardni kemijski obliki TiO2

Koncentracija (ppm) pri nano kemijski obliki TiO2

K Nb Cd Ba Cu Br Zr

846 ± 101 67 ± 5

7 ± 2 10 ± 2

/ / 140 ± 9

303 ± 0 347 ± 20

/ 6 ± 2 205 ± 34

80 ± 8 113 ± 7

Slika 4: Rentgensko fluorescenčni spekter posnet po vzbujanju vzorcev TiO₂ v nano in standardni kemijski obliki z radioizotopskim izvorom Cd-109.

(32)

4.2 NASTAVITEV POSKUSA

Semena sončnic smo posadili v zemlji Terra Brill, saj je ta po predhodnih meritvah s TXRF metodo, v primerjavi z zemljo Humko, vsebovala manjše koncentracije Ti. Večja prisotnost Ti bi potencialno lahko vplivala na končno vsebnost oz. koncentracijo Ti v rastlinah.

V vsakega izmed 15 plastičnih lončkov smo posadili po 3 semena. Rastline smo gojili v rastnih komorah pri temperaturi 26°C in 60 % relativni zračni vlagi. Po treh tednih smo od 15 rastlin 10 rastlin foliarno tretirali, in sicer 5 rastlin s standardno obliko TiO₂(slika 5), ter 5 rastlin z nano-anatazno obliko TiO₂(slika 6a, 6b)_.Preostalih 5 rastlin pa ni bilo tretiranih, ker so služile kot kontrola. Foliarni tretma smo izvedli le na starih listih, preostali deli rastline, torej mladi poganjki, pa so ostali netretirani. Koncentracija TiO2 s katero smo tretirali liste je znašala 5000 mg/l. Po opravljenem nanosusmo rastline gojili še nadaljnjih 20 dni.

Slika 5: Sončnice v rastni komori

(33)

4.3 PRIPRAVA TRETMAJEV, TER FOLIARNI NANOS NANO IN STANDARDNE KEMIJSKE OBLIKE TiO2

V 2 čaši smo nalili po 50 ml destilirane vode, ter dodali po 250 mg TiO2 v nano oz.

standardni kemijski obliki. Vse skupaj smo 5 minut mešali na magnetnem mešalniku, da je suspenzija postala homogena. Slednjo smo s čopičem nanašali po starih listih. Pazili smo, da je bila suspenzija po celotni listni ploskvi enakomerno nanesena. Opravili smo tri nanose.

Slika 6: a) Foliarno tretirana rastlina in b) povečava lista foliarno tretirane rastline.

4.4 PRIPRAVA RASTLIN ZA MORFOLOŠKE MERITVE

Po končanem poskusu je najprej sledil popis morfoloških sprememb (barva, oblika in dolžina rastlinskih organov). Nato smo s korenin previdno odstranili substrat, ter jih oprali z navadno, ter destilirano vodo. Rastline smo ločili na posamezne organe (listi, steblo, korenine), jih zavili v aluminijasto folijo, ter zamrznili v tekočem dušiku. Sledilo je sušenje, ki je potekalo v liofilizatorju (Christ alpha 2-4). Po končanem liofiliziranju smo

a) b)

(34)

določili suho biomaso rastlinskih organov, te pa s pomočjo terilnice in tekočega dušika uprašili.

4.5 PRIPRAVA VZORCEV ZA MERJENJE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Vsebnost fotosinteznih barvil v listih smo določili tako, da smo v epruvete zatehtali po 30 mg vzorcev, ter vanje dolili po 5 ml 80 % acetona. Vsako epruveto posebej smo premešali z vorteksiranjem, da se je raztopina homogenizirala. Po končani homogenizaciji, smo epruvete pokrili z aluminijasto folijo in vse skupaj čez noč pustili v hladilniku. Naslednji dan smo epruvete z vzorci ponovno premešali in jih 3 minute centrifugirali na 2500 obratih. Sledilo je merjenje absorpcije na spektrofotometru 8452A (HP-Hewlett Packard) pri valovnih dolžinah 647 nm, 664 nm in 470 nm. Za umeritev spektrofotometra smo uporabili slepi vzorec oz. aceton (Lichtenthaler, 1987).

4.6 DOLOČANJE KONCENTRACIJ ELEMENTOV V RASTLINSKIH ORGANIH SONČNICE

Meritve koncentracije posameznih elementov v rastlinskih organih sončnic so bile opravljene na Institutu Jožef Stefan na Oddelku za fiziko nizkih in srednjih energij (F2) s pomočjo rentgensko fluorescenčne spektrometrije s popolnim odbojem (TXRF).

4.6.1 Razklop rastlinskega materiala in priprava vzorcev za meritve z metodo rentgensko fluorescenčne spektroskopije s popolnim odbojem

Razklop smo opravili s pomočjo mikrovalovne pečice CEM MARS 5 (Matthews, ZDA). V teflonske epruvete smo zatehtali po 100 mg vzorca, dolili 3 ml HNO3 in jih zatesnili s pokrovčki. Tako pripravljene epruvete smo namestili v stojalo (rotor) in vse skupaj postavili v mikrovalovko.

Razklop je potekal 1 uro. Prvih 20 minut je temperatura postopoma naraščala do 180°C.

Nadaljnjih 30 minut je pri 180°C potekal razklop, zadnjih 10 minut pa je bilo namenjeno

(35)

postopnemu ohlajanju. Razklopljene vzorce smo čez noč pustili stati, naslednji dan pa smo vsebino teflonskih epruvet prelili v plastične epruvete. Slednjim smo dolili destilirano vodo, tako da smo dobili 10 ml raztopine, ter vanjo odpipetirali 100 μl Ga. Galij je predstavljal interni standard. S pomočjo znane koncentracije Ga, smo lahko izračunali koncentracije preostalih elementov. Iz tako pripravljenih vzorcev smo odpipetirali po 10 μl mešanice in jo nanesli na sredino kvarčnih stekelc. Slednje smo čez noč pustili v eksikatorju, z namenom, da se vzorci na površini stekelc dobro posušijo.

4.7 RENTGENSKO FLUORESCENČNA SPEKTROSKOPIJA S POPOLNIM

ODBOJEM

Rentgensko fluorescenčna spektroskopija s popolnim odbojem (TXRF) je multielementna analizna tehnika, ki se uporablja za detekcijo elementov v sledeh pri različnih vzorcih.

Na optično gladki podlagi oz. kvarčnem stekelcu se s fokusiranim žarkom rentgenske svetlobe vzbuja zelo majhno količino vzorca pod kotom, ki je manjši od kritičnega kota za totalni odboj (α ≤ 1,8 mrad oz. α ˂ 0,1°), (Klockenkämper, 2001). Če je vpadni kot presega vrednost kritičnega kota, potem pogoj totalnega odboja ni več izpolnjen (slika 7).

Slika 7: Shematski prikaz principa delovanja TXRF metode (povzeto po Klockenkämper, 2001)

(36)

4.7.1 Osnovni princip delovanja metode z rentgensko fluorescenčno spektroskopijo s popolnim odbojem

Osnova metode temelji na vzbujanju oz. ionizaciji atomov v K in L orbitalah. Atome se vzbuja s pomočjo fotonov, katerih energija je enaka oz. večja od vezavne energije elektronov v atomu. Vzbujenemu stanju sledi relaksacija atoma (Nečemer, 1995), pri čemer prihaja do fotoefekta oz. interakcije med fotonom in vezanim elektronom v atomu.

Torej, ko foton iz atoma izbije elektron (fotoelektron), le ta postane nestabilen, saj mu na eni izmed atomskih orbital manjka elektron. Nastala praznina se nadomesti z elektronom iz višje orbitale, presežek energije pa izseva kot karakteristični foton (slika 8). Pojav imenujemo rentgenska fluorescenca in služi za določanje tako kvalitativne kot tudi kvantitativne sestave vzorcev (Gangl, 1997).

Slika 8: Shematski prikaz fotoefekta (povzeto po Gangl, 1997)

(37)

4.7.2 Sestavni deli rentgensko fluorescenčnega spektrometra

Rentgensko fluorescenčni spektrometer sestavljajo naslednje komponente:

- rentgenska cev z Mo anodo (AEG, Nemčija); napetost 30 kV, tok 30 mA - totalno-refleksijski modul (fokusni sistem in monokromator)

- visokoločljivostni rentgenski spektrometer s Si(Li) detektorjem (Princeton Gamma Tech Co, ZDA, FWHM)

Elektronski sistem detektorja sestavljajo visoko napetostni vir, ojačevalnik, analogno- digitalni pretvornik (ADC) in večkanalni analizator. Vse enote so združene v integriranem signalnem procesorju M 1520 in MCA računalniška kartica S 100 (Canberra, ZDA), (Nečemer in sod. 2008, Pongrac, 2004).

4.8 STATISTIČNA ANALIZA

Podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Pri tem smo uporabili MS Excel 2010 z nadgradnjo ANOVA in programski komplet Statistica 7.0 (StatSoft). Za izračun statistično značilnih razlik, smo uporabili Duncanov test (p<0,05). Pri izračun faktorske analize variance pa smo si pomagali s programom Faktorska ANOVA (p<0,05).

Med posameznimi izmerjenimi parametri smo določali tudi korelacijske povezave, pri čemer smo uporabili Spearmanov korelacijski koeficient (p<0,05).

(38)

5 REZULTATI

5.1 MORFOLOŠKE SPREMEMBE

Pregled morfoloških sprememb smo razdelili v dva dela. V prvem delu smo popisali tretirane dele rastlin – stare liste (tabela 3), v drugem delu pa je sledil popis morfoloških sprememb netretiranih delov rastlin (tabela 4). Iz tabel je razvidno, da se je največ sprememb pojavilo pri rastlinah, ki so bile tretirane z nano obliko TiO2. Nekoliko manj sprememb smo opazili pri rastlinah tretiranih s standardno obliko TiO2. Morfološke spremembe pri kontrolnih (netretiranih) rastlinah pa so nastopile kot posledica staranja. Ob popisu so bile rastline stare približno 5 tednov.

Tabela 3: Morfološke spremembe tretiranih delov rastlin – stari listi v primerjavi s kontrolo (N=15) Rastlinski

organ Morfološke spremembe Kontrola Standardna oblika TiO₂ Nano oblika TiO₂

Stari listi

Kloroze 3 2 0

Nekroze 2 0 3

Nagubanost listne ploskve 0 2 0

Tabela 4: Morfološke spremembe netretiranih delov rastlin (N=15) Rastlinski

organ Morfološke spremembe Kontrola Standardna oblika TiO₂ Nano oblika TiO₂

Mladi listi

Kloroze 0 0 2

Nekroze 0 0 3

Srednji listi

Kloroze 0 0 2

Nekroze 0 0 3

Korenine Dolžina 0 1 3

Legenda 0 - ni sprememb 1 - rahlo opazne 2 - dobro opazne 3 - zelo opazne

(39)

5.1.1 Kontrola

Pri kontrolnih rastlinah so bile korenine dolge in močno razvejane. Na splošno so bili poganjki nepoškodovani in normalno razviti (slika 9a). Na mladih in srednjih listih ni bilo opaziti kakršnihkoli sprememb oz. nenormalnost, so pa bile na nekaterih starih listih kot posledica staranja prisotne močne kloroze in rahle nekroze.

a)

b)

Slika 9: a) Kontrolne rastline v rastnih komorah, b) primerek kontrolne rastline ob koncu poskusa

(40)

5.1.2 Standardna oblika

Pri rastlinah, ki so bile tretirane s standardno obliko TiO2 (5000 mg/l), so imeli mladi in srednji listi močno nagubane listne ploskve, medtem ko kloroze in nekroze niso bile prisotne. Pri starih listih je bila nagubanost manj izrazita, prisotne so bile tudi rahle kloroze, nekroz ni bilo (slika 10).

Slika 10: Pojav kloroz na starih listih rastline, ki je bila tretirana s standardno obliko TiO2

(41)

5.1.3 Nano oblika

Pri rastlinah tretiranih z nano obliko TiO2 (5000 mg/l) so bili poganjki slabše razviti, nagubanost listnih ploskev pa ni bila opazna. Na spodnjih oz. starih listih so se pojavile močne nekroze, kloroz ni bilo. Pri mladih in srednjih listih pa so bile poleg rahlih kloroz prisotne tudi dobro vidne neenakomerne nekroze (slika 11a, b).

Slika 11: a) in b) pojav kloroz in nekroz na poganjkih in starih listih rastline, ki je bila tretirana z nano obliko TiO₂

a)

b)

(42)

5.1.4 Primerjava tretmajev

Pri medsebojni primerjavi rastlin tretiranih s standardno oz. nano kemijsko obliko TiO2

smo opazili, da so bile rastline tretirane s standardno obliko TiO2 morfološko bolj razvite.

Rastline tretirane z nano obliko TiO2 so imele opazno krajši in manj razvejan koreninski sistem, dobro je bila vidna tudi zaostalost v razvitosti nadzemnih rastlinskih organov (slika 12a). Pri standardni kemijski obliki tretmaja na mladih in srednjih listih nismo opazili nekroz oz. kloroz, so pa bile dobro vidne deformacije listov v obliki nagubanosti listne ploskve (slika 10). Obratno je bilo pri rastlinah tretiranih z nano obliko TiO2, kjer so se na mladih in srednjih listih pojavile rahle kloroze in nekroze, listne ploskve niso bile nagubane (slika 11). Stari listi rastlin tretiranih s standardno obliko TiO₂so imeli manj izrazito nagubanost listne ploskve, vidne so bile rahle kloroze, nekroz ni bilo. Ponovno je bilo ravno obratno pri rastlinah tretiranih z nano obliko TiO₂, kjer so se na starih listih pojavile močne nekroze, kloroz in nagubanosti listne ploskve ni bilo.

a)

(43)

Slika 12: a) in b) primerjava tretmajev (od leve proti desni; kontrola, standardna oblika TiO₂, nano oblika TiO₂)

5.1.5 Biomasa rastlin

Da bi ugotovili ali oblika TiO₂ vpliva na suho biomaso rastlin, smo med seboj primerjali suho maso poganjkov in korenin, ter suho maso mladih in starih listov.

Faktorska analiza variance je pokazala, da oblika TiO₂ vpliva na suho biomaso korenin (tabela 5, slika 13), medtem ko pri poganjkih tega vpliva ni bilo zaznati. Opazili smo, da se največja suha biomasa poganjkov pojavi pri rastlinah, tretiranih z nano obliko TiO2 (slika 13), vendar pa se tu niso pojavila statistično značilna odstopanja od kontrole.

Statistično značilne razlike suhe biomase so se pokazale med koreninam rastlin, ki so bile tretirane s standardno obliko TiO2 in rastlinami tretiranimi z nano obliko TiO2. Pri obeh oblikah TiO2 je bila suha biomasa poganjkov (neodvisno od tretmaja) večja od suhe biomase korenin (priloga A). Rastline tretirane s standardno obliko TiO2 so imele v primerjavi s kontrolo manjši in manj razvejan koreninski sistem, medtem ko je bil le ta pri rastlinah tretiranih z nanodelci TiO2 opazno krajši in precej manj razvejan.

b)