Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega zunajceličnega dela človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah

Ljubljana, 2021

Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega zunajceličnega dela

človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah

DIPLOMSKO DELO

Nika Vegelj

Ljubljana, 2021

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega zunajceličnega dela

človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah

DIPLOMSKO DELO

Nika Vegelj

M

: prof. dr. Brigita Lenarčič

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Nika Vegelj sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega zunajceličnega dela človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Brigite Lenarčič;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št.

16/2007));

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, Podpis avtorja:

Iskreno se zahvaljujem mentorici prof. dr. Brigiti Lenarčič za vzpodbudne besede, dobre delovne pogoje, ter usmeritev pri pisanju diplomskega dela. Prav tako bi se iskreno zahvalila članici komisije doc. dr. Veri Župunski za natančen ter hiter pregled diplomske naloge.

Asist. dr. Aljažu Gabru se iskreno zahvaljujem za vse napotke in nasvete, uvajanje v delo, pregledu diplomske naloge ter motivacijo, ki nam jo je dajal skozi vsa tri leta.

Iskreno bi se zahvalila Urošu Prešernu, ki me je uvajal v delo v laboratoriju, za vse dobronamerne nasvete ter, da nam je vendo priskočil na pomoč.

Za pomoč in prijetno vzdušje tekom dela, bi se rad zahvalil študentom in zaposlenim, s katerimi smo si delili laboratorij 2004, pa tudi vsemu ostalemu osebju Katedre za biokemijo.

Na koncu pa bi se rada iskreno zahvalila svoji družini za vso podrporo tekom študija.

Posebno bi se rada zahvalila mojemu fantu Denisu za podporo, ljubezen in potrpljenje tekom študija.

Povzetek

Protein EGFR je transmembranski glikoprotein, ki spada v skupino tirozin kinaznih receptorjev in ima pomembno vlogo pri proliferaciji, diferenciaciji ter signalizaciji celice. Velik vpliv pri pravilni signalizaciji proteina EGFR imajo post-translacijske modifikacije, predvsem pravilna glikozilacija. Da bi okarakterizirali vpliv glikozilacije EGFR na vezavo liganda EpEX, smo protein EGFR izrazili v sesalskih celičnih linijah z uporabo sistema Flp-In, ki omogoči, da se željeni gen vključi na točno določeno mesto v genomu. Pripravili smo 4 različne zapise za zunajcelični del EGFR (EGFR-Ex) in sicer z nativnim signalnim peptidom z in brez elementa WPRE ter z albuminskim signalnim peptidom z in brez elementa WPRE. S tem smo želeli preveriti vpliv albuminskega signalnega peptida ter elementa WPRE na nivo izražanja EGFR-Ex, saj naj bi oba prispevala k povišanemu izražanju rekombinantih priteinov. Transfekcijo smo izvedli v celicah Flp-In™-CHO in Flp-In™-293. Izražanje proteina EGFR smo s prenosom western ter imunodetekcijo potrdili pri vseh štirih konstruktih v celicah HEK, kjer je izražanje potekalo prehodno. Pri celicah CHO, kjer je potekalo stabilno izražanje vseh štirih konstruktov, pa smo uspeli potrditi le izražanje konstrukta z nativnim signalnim peptid ter elementom WPRE v samem vektorju. Kvantitativne analize vpliva albuminskega signalnega peptida in elementa WPRE na nivo izražanja EGFR-EX nam žal ni uspelo izvesti.

Abstract

The EGFR protein is a transmembrane glycoprotein that belongs to the group of tyrosine kinase receptors and plays an important role in cell proliferation, differentiation and signalling. Post-translation modifications, especially the correct glycosylation, have tremendous influence with regards to the signalization of the EGFR protein. To characterize the effect of EGFR glycosylation on EpEX ligand binding, EGFR protein was expressed in mammalian cell lines CHO and HEK293 using the Flp-In system, which allows the desired gene to integrate at a specific spot in the genome. We prepared 4 different constructs for the extracellular part of EGFR (EGFR-Ex); one with a native signal peptide with the WPRE element, the second one with a native signal peptide, but without WPRE element, the third one with an albumin signal peptide with the WPRE element, and the fourth one with an albumin signal peptide without the WPRE element.

The goal was to check the influence of albumin signal peptide and the element WPRE on the level of EGFR-Ex expression, as both are thought to contribute to the increased expression of recombinant proteins. The expression of the EGFR protein was confirmed by western blot and immunodetection in all four constructs in HEK cells where the expression was with transient transfection. In stabile cell line CHO, we were able to confirm only the expression of the construct with the native signal peptide and the WPRE element in the vector itself. Quantitative analysis of the influence of albumin signal peptide and WPRE element on the level of EGFR-EX expression was unfortunately not performed.

Kazalo

1 UVOD ...1

1.1 Celično signaliziranje ...1

1.2 Receptor za epidermalni rastni faktor...1

1.2.1 Signalizacija EGFR ...3

1.2.2 Post-translacijske modifikacije ...4

1.3 Izražanje v sesalskih celicah ...5

1.3.1 Prehodno in stabilno izražanje ...5

1.3.2 Flp-In^TM sistem ...6

1.3.2.1 Sekvence FRT ...7

1.4 Elementi za povečano količino izločanja rekombinantnega proteina...8

1.4.1 Albuminski signalni peptid ter element WPRE ...8

2 NAMEN DELA ...10

3 MATERIALI IN METODE ...11

3.1 Materiali ...11

3.1.1 Materiali pri delu z nukleinskimi kislinami ...11

3.1.1.1 Sesalski ekspresijski vektor pcDNA™FRT⁄TO ...11

3.1.1.2 Izhodiščna DNA ...12

3.1.1.3 Začetni oligonukleotidi ...12

3.1.1.4 Materiali pri verižni reakciji s polimerazo (PCR)...14

3.1.1.5 Restrikcija in ligacija DNA ...14

3.1.1.6 Agarozna gelska elektroforeza (AGE) ...15

3.1.1.7 Materiali pri metodi SLiCE ...16

3.1.1.8 Kompleti reagentov za izolacijo DNA ...16

3.1.2 Materiali pri delu z bakterijskimi celicami ...17

3.1.2.1 Bakterijski sevi ...17

3.1.2.2 Gojišča za bakterijske kulture ...17

3.1.3 Materiali pri delu s proteini ...17

3.1.4 Materiali pri delu s sesalskimi celicami ...18

3.1.4.1 Celične linije ...18

3.1.4.2 Gojišča za celične linije ...18

3.1.5 Ostala pomembnejša oprema ...18

3.1.6 Materiali pri delu s proteini ...19

3.1.6.1 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS ...19

3.1.6.2 Materiali pri prenosu western in imunodetekciji ...20

3.2 Metode ...21

3.2.1 Delo z nukleinskimi kislinami ...21

3.2.1.1 Izolacija plazmidne DNA ...21

3.2.1.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) ...21

3.2.1.3 PCR na osnovi kolonije ...23

3.2.1.4 Preverjanje nukleotidnega zaporedja ...25

3.2.1.5 Ločevanje in analiza DNA z agarozno gelsko elektroforezo...25

3.2.1.6 Izolacija DNA iz gela ...25

3.2.1.7 Metoda SLiCE ...26

3.2.2 Delo z bakterijami ...26

3.2.2.1 Transformacija bakterijskih celic ...26

3.2.2.2 Priprava prekonočnih kultur bakterijskih celic ...27

3.2.3 Delo s sesalskimi celičnimi linijami ...27

3.2.3.1 Gojenje in precepljanje celic Flp-In™-CHO ter Flp-In™-293 ...27

3.2.3.2 Prehodna in stabilna transfekcija v sesalske celice ...27

3.2.4 Delo s proteini ...29

3.2.4.1 Obarjanje proteinov s trikloroocetno kislino (TCA) ...29

3.2.4.2 Analiza proteinov z NaDS-PAGE ...29

3.2.4.3 Analiza proteinov s prenosom western ...29

3.2.4.4 Imunodetekcija ...30

3.2.4.5 Detektiranje s protitelesi proti His6-oznaki ...30

4 REZULTATI ...31

4.1.1 Priprava vektorskih konstruktov s pomočjo PCR ...31

4.1.2 Priprava konstruktov EGFR-Ex ...35

4.1.3 Priprava končnih konstruktov ...36

4.1.4 Analiza izražanja EGFR-Ex ter AS-EGFR-Ex ...38

5 DISKUSIJA ...40

5.1 Priprava vektorskih konstruktov ter insertov ...40

5.2 Izražanje zunajceličnega dela EGFR v sesalskih celičnih linijah ...41

6 ZAKLJUČEK ...42

7 LITERATURA ...43

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

a. e. arbitrarna enota

ak aminokislina

ATP adenozin trifosfat

AS-EGFR-Ex zunajcelični del proteina EGFR brez zapisa za nativni signalni peptid

bp bazni par

CHO celična linija, pridobljena iz ovarijev kitajskega hrčka dH2O deionizirana voda

DMSO dimetilsulfoksid

dNTP deoksiribonukleotid trifosfat

DTT ditiotreitol

EDTA etilendiaminotetraetanojska kislina EGF epidermalni rastni factor

EGFR receptor za epidermalni rastni faktor

EGFR-Ex zunajcelični del proteina EGFR za zapisom za nativni signalni peptid EpCAM

EpEX zunajcelični del proteina EpCAM ErbB eritrioblastom onkogena B

HB-EGF EGF-podoben rastni faktor, ki veže heparin

HEK celična linija, pridobljena iz človeških embrionalnih ledvičnih celic His6 heksahistidinska oznaka

FLIM mikroskopija s slikanjem življenjskih časov fluorescence HEPES 1-piperazinetansulfonska kislina

IPTG izopropil-β-D tiogalaktopiranozid kbp/s kilobazni par na sekundo

kDa kilodalton

LB lizogeno gojišče

MW molekulska masa

NaDS natrijev dodecilsulfat ori mesto začetka replikacije

PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza

PCR verižna reakcija s polimerazo PVDF polivinilfluoridna membrana SLiCE kloniranje z brezspojno ligacijo

TCA trikloretanojska kislina (trivialno: triklorocetna kislina) TEMED N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin

TGFα transformirajoči rastni faktor α TNFα dejavnik tumorske nekroze alfa

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol

U encimska enota

Nika Vegelj: Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega

zunajceličnega dela človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah

1

1 UVOD

1.1 Celično signaliziranje

Celična signalizacija je del kompleksnega sistema komunikacije, ki je odgovorna za ključne aktivnosti celice^1,2. Sposobnost celice, da sprejme in se pravilno odzove na mikrookolje ima velik pomen pri razvoju, popravljalnih mehanizmih ter imunskem sistemu celice. S pomočjo dinamične signalne transdukcije se molekule med seboj povezujejo in interagirajo, s tem pa omogočijo normalno harmonično delovanje celotnega sistema.

Ena izmed večjih skupin transmembranskih receptorjev so tirozin kinazni receptorji. Le- ti imajo pomembno vlogo pri osnovnih funkcijah celice, kot so celični cikel, migracija celic, celični metabolizem ter proliferacija in diferenciacija celice. Receptor za epidermalni rastni faktor oz. EGFR je eden izmed najbolj pomembnih predstavnikov poddružine eritrioblastoma onkogena B (ErbB) in spada v družino tirozin kinaznih receptorjev, hkrati pa je protein, ki sodeluje pri razvoju, diferenciaciji ter homeostazi celic. V družino tirozin kinaznih receptorjev spadajo tudi receptorji ErbB2, ErbB3 in ErbB4^3,4.

1.2 Receptor za epidermalni rastni faktor

EGFR je 170 kDa velik transmembranski protein, ki se sintetizira kot prekurzor iz 1210 aminokislinskih ostankov. Sestavljajo ga zunajcelična ligand vezavna domena z dimerizacijsko roko, hidrofobna transmembranska domena ter znotrajcelična tirozin kinazna domena in C-končni rep.

Zunajcelična domena EGFR je sestavljena iz 621 aminokislinskih ostankov ter je razdeljena na štiri subdomene imenovane od I–IV oz. L1, CR1, L2 in CR2 (slika 1.1).

Domeni I in III sta z levcinom bogati ter sodelujeta pri vezavi liganda. Domena II tvori homo/hetero-dimere z analognimi domenami sorodnih molekul iz družine. Domena IV tvori disulfidne vezi z domeno II ter se povezuje s transmembransko vijačnico, hkrati pa slednji domeni ne tvorita kontakta z ligandom⁵.

UVOD

2

Slika 1.1: Struktura proteina EGFR. Zunajcelična ligand vezavna domena je sestavljena iz štirih subdomen, EGF vezavna domena 1 (L1), s cisteini bogata domena 1 (CR1 oz. II), EGF vezavna domena 2 (CR2 oz. IV) ter s cisteini bogata domena 2 (CR2 oz III). Znotrajcelična tirozin kinazna domena je razdeljena na N in C-ploskev. Zunajcelični ter znotrajcelični del je povezan s transmembransko domeno (TM). Transmembranska domena (TM) je z znotrajcelično tirozin kinazno domeno povezana preko obmembranske domene(PDB 4NQL, 2M0B in 1M14).

Znotrajcelična domena je sestavljena iz 542 aminokislinskih ostankov ter vključuje obmembranski segment (ak ~40), tirozin kinazno domeno (ak 690– do 953) ter C-končni rep (ak 954 – 1136). Tirozin kinazna domena je na N- koncu sestavljena pretežno iz beta verig, medtem ko je na C-koncu struktura pretežno alfa vijačna z ATP vezavnim motivom (slika 1.1).

Trans-avtofosforilacija temelji pretežno na interakciji med N- ter C-delom ploskve.

Tirozin-kinazna domena je bogata z lizinskimi aminokislinskimi ostanki, ki pa predstavljajo primarno mesto za ubikvitinacijo receptorja. C-končni rep je bogat z

UVOD

3

različnih tirozinskimi ostanki, ki so lahko podvrženi fosforilaciji, kar posledično lahko sproži različne signalne poti⁶.

1.2.1 Signalizacija EGFR

Do aktivacije receptorja EGFR pride preko vezave liganda na zunajcelični del. Pri človeku poznamo sedem proteinskih ligandov, ki se vežejo na EGFR in ga aktivirajo. To so EGF, betacelulin, heparin vezavni EGF-podoben rastni faktor (HB-EGF), transformirajoči rastni faktor α (TGFα), epigen, epiregulin in amfiregulin⁸. Vsak od zrelih peptidnih rastnih faktorjev je okarakteriziran z značilnim zaporedjem šestih cisteinskih ostankov, ki tvorijo intramolekularne disulfidne vezi ter tako stabilizirajo vezavo na receptor⁹.

V odsotnosti liganda je EGFR v monomerni, neaktivni in tetrahedralni strukturi. Vezava liganda pa povzroči interkacijo med domenama I in III, kar povzroči konformacijski prehod v odprto obliko. Nato se izpostavi dimerizacijska roka v domeni II, preko katere poteče dimerizacija EGFR. Po dimerizaciji se aktivirajo tirozin kinazne domene, kar vodi v fosforilacijo C-končnega repa, podenoti dimera pa se medsebojno fosforilirata (slika 1.2). Fosforilacija tirozinskih ostankov tako vodi do vezave različnih ligandov, kar pa povzroči aktivacijo različnih signalnih poti¹⁰. Najpomembnejši med njima sta MAPK/ERK in PI3K/Akt-signalna pot, ki vodita v povečano proliferacijo, migracijo in diferenciacijo celic ¹¹.

UVOD

4

Slika 1.2: Mehanizem aktivacije EGFR. Struktura EGFR je prikazana shematsko, pri čemer so z zeleno in modro barvo označene posamezne domene v zunajcelični regiji, transmembranska vijačnica je svetlo zelene barve, tirozin kinazna domena je obarvana v oranžno in C-končni rep s sivo barvo. EGFR po vezavi liganda (rumen lik), preide iz zaprte v odprto obliko, kar vodi do njegove dimerizacije in avtofosforilacije. Fosforilirana mesta so prikazana kot pobarvani krogi v C- končnem repu.

1.2.2 Post-translacijske modifikacije

Glikozilacija ima velik vpliv na lastnosti proteina EGFR, saj vpliva na njegovo sposobnost zvijanja, na aktivnost ter na sposobnost interakcije z drugimi proteini^12,13. Zunajcelična domena EGFR ima v strukturi 10 asparaginov, ki so del glikozilacijskega motiva (Asn-X-Ser/Thr). Asparagini, ki se lahko glikozilirajo so na mestih: Asn104, Asn151, Asn172, Asn328, Asn337, Asn420, Asn504, Asn544, Asn579 and Asn599¹⁴ (slika 1.3).

N-glikozilacije EGFR omogoča receptorju tvorbo številnih nekovalentnih vezi z glikani.

Takšne interakcije stablizirajo receptorjevo vezavno mesto, posledično pa se tvorijo močnejše elektrostatske interakcije med ligandom in receptorjem¹⁵.

UVOD

5

Slika 1.3: Prikaz potencialnih glikozilacijskih mest zunajceličnega dela proteina EGFR. Z rumeno barvo so označeno glikozilacijska mesta (PDB 1NQL).

1.3 Izražanje v sesalskih celicah

1.3.1 Prehodno in stabilno izražanje

Transfekcija je metoda pri kateri pride do prenosa genetskega materiala v evkariontske celice s pomočjo kemijskih ali fizikalnih metod. Pozanmo dve vrsti transfekcij, stabilno in prehodno transfekcijo¹⁶.

Pri prehodni transfekciji se s pomočjo vektorja tuji geni prenesejo v gostiteljsko celico.

Ko tuja DNA vstopi v gostiteljsko celico, pride do začasnega izražanja genov, ne da bi se tuja DNA vključila v genom. Protein, zapisan na vektorju, se lahko izraža vse dokler ne pride do delitve celice, saj se takrat zaradi nezmožnosti integracije v genom ne more več uspešno prenašati v naslednje generacije. Prehodna transfekcija torej traja kratek čas, saj kmalu pride do delitve celic, ali pa do same razgradnje nukleinske kisline¹⁷.

Pri stabilni transfekciji pa pride do vključitve tujih genov v genom gostiteljske celice. Ko pride do vstopa nukleinske kisline v celico, se del DNA interagira v gostiteljski genom.

Posledično se integrirana DNA prenaša na potomce z delitvijo genoma¹⁸.

UVOD

6

1.3.2 Flp-In

sistem

Sistem Flp-In^TM omogoča integracijo in ekspresijo tarčnega gena v sesalske celične linije na točno določeno mesto. Tarčni gen, ki je vstavljen v ekspresijski vektor, se nato integrira v genom s pomočjo Flp rekombinaze, ki posreduje pri rekombinaciji DNA v FRT (angl. Flp Recombination Target) območje (slika 1.4)¹⁹.

Flp-in sistem omogoči nastanek stabilne celične linije s pomočjo rekombinacijskega sistema, ki so ga pridobili iz kvasovke Saccharomyces cerevisiae. S pomočjo tega sistema lahko vgradimo željeni gen na točno določeno mesto v genomu sesalske celične linije tako, da uporabimo mestno specifično rekombinacijo ter rekombinazo Flp ²⁰.

Sistem temelji na uporabi treh različnih vektorjev. Prva komponenta sistema je vektor pFRT/lacZeo, ki se uporablja za pripravo celične linije Flp-In^TM. Vektor vsebuje pFRT/lacZeo fuzijski gen, katerega ekspresija je kontrolirana preko promotorja SV40.

FRT del je vstavljen navzdol od začetnega kodona ATG in služi kot vezavno in cepitveno mesto za rekombinazo Flp. Sesalsko celično linijo transficirano z vektorjem pFRT/lacZeo, čemur sledi selekcija na podlagi rezistence na antibiotik zeocin.

Druga komponenta sistema Flp-In^TM je ekspresijski vektor pcDNA5/FRT, v katerega vnesemo željeni gen. Njegova ekspresija je pod kontrolo promotorja CMV, sam vektor pa vsebuje rezistenco na higromicin B z delom FRT na 5' koncu kodirajoče regije. Gen za rezistenco na higromicin nima promotorja in začetnega kodona ATG.

Tretja ključna komponenta sistema je vektor pOG44, ki vsebuje gen za rekombinazo Flp, ki se konstitutitvno izraža pod kontrolo promotorja CMV.

UVOD

7

Slika 1.4: Shematska ilustracija glavnih komponent Flp-In^TM sistema. Preko pFRT/lacZeo poteče stabilna transfekcija, da se ustvari Flp-In^TM celična linija, ki ima rezistenco na antibiotik zeocin. Nato je pcDNA5/FRT ekspresijski vektor, ki vsebuje tarčni gen, kotransfeciran s plazmidom pOG44 in ustvari Flp-In^TM celično linijo. Rekombinaza Flp, izražena iz plazmida pOG44, katalizira homologno rekombinacijo med mesti FRT celične linije in ekspresijskim vektorjem pcDNA5/FRT. Integracija ekspresijskega konstrukta omogoči transkripcijo tarčnega gena ter posreduje rezistenco na higromicin in občutljivost na zeocin.

1.3.2.1 Sekvence FRT

S Flp-posredovana rekombinacija poteče med specifičnimi odseki FRT, ki so bili originalno izolirani iz kvasovke Saccharomyces cerevisiae, Le-ti služijo kot vezavno mesto za rekombinazo Flp. Minimalna sekvenca FRT je sestavljena iz 34 bp in vsebuje dve 13 bp dolgi nepopolni invertni ponovitvi, ki sta ločeni z 8 bp dolgim vmesnikom, ki vsebuje restrikcijsko mesto XbaI (slika 1.5). Dodatna 13 bp dolga ponovitvena sekvenca je najdena v večini FRT mest, vendar ni nujno potrebna za samo cepitev. Medtem ko se Flp rekombinaza veže na vse tri 13 bp dolge ponovitve, se sama cepitev zgodi na mejah 8 bp dolgega vmesnika²¹.

UVOD

8 Slika 1.5: Prikaz odseka FRT.

1.4 Elementi za povečano količino izločanja rekombinantnega proteina

Pri pripravi rekombinantnih proteinov je ključnega pomena visok izplen pridobljenega proteina. Večina rekombinantnih proteinov, ki se uporabljajo za terapevtske namene se pridobiva s pomočjo sesalskih celičnih linij, saj so edino te zmožne izvesti najbolj podobnih post-translacijske modifikacije. Visok izplen pridobljenega rekombinantnega proteina so opazili pri uporabi albuminskega signalnega peptida in tudi pri uporabi elementa WPRE^22,23.

1.4.1 Albuminski signalni peptid ter element WPRE

Postranskripcijski regulatorni element severnoameriškega gozdnega svizca (angl.

Woodchuck Hepatitis Virus (WHV) Posttranscriptional Regulatory Element oz. WPRE) je zaporedje DNA, ki poveča izplen izraženega rekombinantnega proteina v celični liniji (slika 1.6). Posledica vključitve elementa WPRE v regijo 3'-UTR kodirajoče sekvence je vplivala na povečanje izplena rekombinantnega proteina^24,25.

Albuminski signalni peptid pa je eden izmed bolj primernih signalnih peptidov za delo v sesalskih celičnih linijah. Ugotovili so, da se je ob njegovi uporabi izplen rekombinantnega proteina trikrat do štirikrat povečal²⁶.

UVOD

9

Slika 1.6: Prikaz nukleotidnega zaporedja elementa WPRE.

5'AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTA TGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCT ATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTC TCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGT GTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCT TTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCC TGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTG GTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCT GGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGG ACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCT TCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG3'

Nika Vegelj: Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega

zunajceličnega dela človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah

10

2 NAMEN DELA

Namen diplomskega dela je bil izraziti protein EGFR v sesalski celični liniji CHO in HEK z uporabo Flp-In^TM sistema. Z uporabo različnih signalnih elementov smo želeli preveriti nivo izražanje proteina EGFR v celici in okarakterizirati vpliv signalnih peptidov in elementa WPRE na količino izraženega proteina. Konstrukt EGFR-Ex z zapisom za abuminski signalni peptid in z elemntom WPRE bo imel najvišji nivo izražanja v sesalskih celičnih kulturah.

MATERIALI

11

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Materiali

3.1.1 Materiali pri delu z nukleinskimi kislinami 3.1.1.1 Sesalski ekspresijski vektor pcDNA™FRT⁄TO

Vektor pcDNA™FRT⁄TO (Thermo Scientific, ZDA) (slika 3.1) smo uporabili za namnožitev proteina EGFR v bakterijskih celični kulturi, kasneje pa za ekspresijo v sesalski celični liniji CHO in HEK s sistemom Flp-In.

Slika 3.1: Vektorska karta plazmida pcDNA5-FRT-TO_3FLAGtag. Značilnosti plazmida:

ori – mesto začetka podvojevanja plazmida ColE1; Hyg,gen za rezistenco proti higromicinu; bGH poly(A) signal, terminatorska sekvenca za ekspresijo v sesalskih celicah; 3XFLAG, zapis za sintetični peptid iz 23 aminokislin; promotor CMV, citomegalovirusni promotor; AmpR, gen za rezistenco proti ampicilinu.

MATERIALI

12

3.1.1.2 Izhodiščna DNA

Za pripravo rekombinantnega zunajceličnega dela EGFR (ak 25-645) s C-končno oznako His6 (EGFR-Ex) smo kot izhodiščni material uporabili vektor EGFR-WT (darilo Matthewa Meyersona⁸⁰), kjer je zapis za nativni EGFR vstavljen v plazmid pBABE-puro (slika 3.2).

Slika 3.2: Vektorska karta plazmida EGFR-WT. Značilnosti plazmida: LTR, dolge končne ponovitve Maloneyevega mišjega virusa levkemije (MMLV); MMLV Ψ, pakirni signal MMLV;

gag, skrajšan gen gag iz MMLV; EGFR, zapis za nativni EGFR; SV40 ori, mesto začetka replikacije iz virusa SV40; PuroR, gen za rezistenco proti puromicinu; ori, mesto začetka replikacije za replikacijo v bakterijskih celicah; AmpR,gen za rezistenco proti ampicilinu.

3.1.1.3 Začetni oligonukleotidi

Začetni oligonukleotidi, ki smo jih uporabili za pripravo vektorja pcDNA5/FRT/TO z albuminskim signalnim peptidom in elementom WPRE (tabela 3.1).

MATERIALI

13

Tabela 3.1:Seznam začetnih oligonukleotidov, ki smo jih uporabili za pripravo želenih konstruktov.

Oznaka Zaporedje (5'-proti -3'koncu)

smerni oligonukleotidi

pc5-SLiCE-F CTGGCTAGCGTTTAAAC

AS-linker-F TCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCAGCAGCGCCTACAGCGCTCAG TGCTGTACAGAGCTCGGATG

WPRE-F1 AATCAACCTCTGGATTACAA

EGFR-seq-F ACCCCGAGGGCAAATAC

EGFR-seq-F2 TGTGCCCACTACATTGAC EGFR-seq-F3 AGTGGATGGCATTGGAATC

CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

WPRE-F2 GGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTG protismerni oligonukleotidi

WPRE-R CCATGGAAAGGACGTCAGCTTCCCCGACAACACC

pc5- WPRE-R

GTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCAGGCGGGGAGGC

pc5-SLiCE-R GTTTAAACGGGCCCTC

linker-WPRE -R CTTTCACAAATTTTGTAATCCAGAGGTTGATTCTCGAG GACTAGTTCATCCGAGCTCTGTAC

pc5-AS-R ACAGCAGGCTGATGAAGGTCACCCACTTCATGGTGGCAA GCTTAAGTTTAAACGCTAGCCAG

MATERIALI

14

Za PCR na osnovi kolonije smo uporabili oligonukleotide prikazane v tabeli 3.2.

Tabela 3.2:Začetni oligonukleotidi, uporabljeni pri metodi PCR na osnovi kolonije.

Oznaka Zaporedje (5'- proti 3'-koncu) smerni oligonukleotidi

CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG protismerni oligonukleotidi

BGH-R TAGAAGGCACAGTCGAGG

3.1.1.4 Materiali pri verižni reakciji s polimerazo (PCR)

Pri izvedbi verižne reakcije s polimerazo smo uporabljali napravi Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, ZDA) in GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems, ZDA). Izvedli smo dve različni metodi PCR, kjer smo za izvedbo klasične metode PCR uporabili polimerazo Phusion, za izvedbo PCR na osnovi ene kolonije pa polimerazo Taq (tabela 3.3).

Tabela 3.3: Materiali, ki smo jih uporabljali pri izvajanju PCR.

Metoda Komponente

PCR za pripravo novih zapisov Polimeraza Phusion (2 U/µL) (Thermo Scientific, ZDA), 5× pufer Phusion GC (Thermo Scientific, ZDA),

10 mM mešanica dNTP (Fermentas, Latvija)

PCR na osnovi kolonije DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific, ZDA)

3.1.1.5 Restrikcija in ligacija DNA

Za restrikcijo smo uporabljali restriktaze, ki so navedene v tabeli 3.4.

Za ligacijo smo uporabili DNA-ligazo bakteriofaga T4 (Thermo Scientific, ZDA). Pri restrikciji in ligaciji smo uporabljali pufre, ki so jih priložili proizvajalci.

MATERIALI

15

Tabela 3.4: Uporabljene restriktaze in njihova prepoznavna zaporedja z označenimi mesti rezanja.

Restriktaza Prepoznavno zaporedje z označenim mestom cepitve

AflII (Thermo Fischer, ZDA) 5' – C^↓TTAAG – 3'

3' – GAATT^↓C – 5'

BsrgI (Thermo Fischer, ZDA) 5' – CA^↓TATG – 3'

3' – GTAT^↓AC – 5' HindIII (Thermo Fischer, ZDA) 5' – A^↓AGCTT – 3' 3' – TTCGA^↓A – 5' AfeI (Thermo Fischer, ZDA) 5' – AGC↓GCT – 3'

3' – TCG↓CGA – 5'

3.1.1.6 Agarozna gelska elektroforeza (AGE)

Za izvedbo AGE smo uporabljali aparature, materiale in velikostne standarde (slika 3.3) zbrane v tabeli 3.5.

Slika 3.3: Prikaz velikostnih lestvic, ki smo jih uporabili pri AGE. Levo je prikazan Gene ruler 100bp DNA Ladder, desno pa Gene ruler 1kB DNA ladder.

MATERIALI

16

Tabela 3.5: Aparature, materiali in velikostni standardi uporabljeni pri AGE.

Aparature

elektroforezne kadičke različnih velikosti iz linije produktov Owl Separation Systems (Thermo Scientific, ZDA)

MiniBIS Pro (DNR Bio-Imaging Systems, Izrael) Materiali agaroza (Sigma Aldrich, ZDA)

pufer TAE (40 mM Tris, pH 8,0, 20 mM ocetna kislina, 1 mM EDTA) etidijev bromid (Sigma Aldrich, ZDA)

6× nanašalni pufer (0,25-odstotno (w/v) bromfenol modro, 0,25-odstotni (w/v) ksilencianol, 15- odstotni (w/v) fikol tip 4000, 120 mM EDTA)

Velikostni standardi GeneRuler 100 bp Ladder (Thermo Scientific, ZDA) GeneRuler 1 kbp Ladder (Thermo Scientific, ZDA)

3.1.1.7 Materiali pri metodi SLiCE

Za izvedbo metode SLiCE smo uporabili 10× pufer SLiCE (500 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 10 mM DTT), ekstrakt SLiCE (pripravljen iz celic E. coli PPY), lineariziran vector ter vključek DNA.

3.1.1.8 Kompleti reagentov za izolacijo DNA

Komplet reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, ZDA) smo uporabili za izolacijo plazmidne DNA iz prekonočnih kultur bakterijskih celic, komplet reagentov E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (Omega Bio-tek, ZDA) pa smo uporabili za izolacijo DNA iz agaroznega gela.

MATERIALI

17

3.1.2 Materiali pri delu z bakterijskimi celicami 3.1.2.1 Bakterijski sevi

Pri pripravi plazmidov za pomnoževanje smo uporabili genotip seva Escherichia coli DH5α: F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1

3.1.2.2 Gojišča za bakterijske kulture

Za gojenje bakterijskih celic smo uporabili trdna in tekoča gojišča LB. Nekaterim smo dodali potrebne antibiotike in ostale snovi.

LB – tekoče gojišče – 10 g kazeinskega hidrolizata, 5 g kvasnega ekstrakta in 10 g NaCl je raztopljeno v 1 L vode, pH je uravnan na 8.

LB – trdno gojišče – sestava trdnega gojišča LB je enaka sestavi tekočega, le da k 1 L gojišča pred avtoklaviranjem dodamo še 20 g agarja.

3.1.3 Materiali pri delu s proteini

Pri izražanju proteina EGFR smo uporabili dva različna proteinska konstrukta (tabela 3.6).

Tabela 3.6: Seznam proteinskih konstruktov uporabljenih pri izražanju EGFR v sesalskih celičnih linijah CHO in HEK s Flp-In™ sistemom. Analizirali smo vpliv različnih signalnih peptidov na izražanje našega proteina v sesalskih celicah.

Konstrukt Opis Vir

EGFR-Ex (nativni signalni peptid)

zunajcelična regija EGFR (ak- ostanki 25–645), oznaka His6 na C-koncu

Pripravili sami

AS-EGFR-Ex (albuminski signalni peptid)

zunajcelična regija EGFR (ak- ostanki 25–645), oznaka His6 na C-koncu

Pripravili sami

MATERIALI

18

3.1.4 Materiali pri delu s sesalskimi celicami 3.1.4.1 Celične linije

Za izražanje našega proteina smo uporabili celični liniji Flp-In™-293 in Flp-In™-CHO (tabela 3.7).

3.1.4.2 Gojišča za celične linije

Tabela 3.7: Prikaz uporabljenih sesalskih celičnih linij, gojitvenih medijev, antibiotikov ter medijev za zmrzovanje.

Celična linija Medij Antibiotik Medijza za zmrznjenje

Flp-In™-CHO™ Ham’s F12 10% FBS[3]

2 mM L-glutamine 1% Pen-Strep (optional)

100μg/mL Zeocin™

Selection Antibiotic

90% complete medium 10% DMSO

Flp-In™-293 D-MEM™ (high glucose) 10% FBS[1]

2 mM L-glutamine 1% Pen-Strep (optional)

100 μg/mL Zeocin™

Selection Antibiotic

90% complete medium 10% DMSO

3.1.5 Ostala pomembnejša oprema

Pri delu smo uporabljali naprave, ki so podane v tabeli 3.8.

Tabela 3.8:Pomembnejša laboratorijska oprema, ki smo jo uporabljali pri delu.

Naprava Proizvajalec

MiniSpin plus Eppendorf, Nemčija Centrifuge 5810 R Eppendorf, Nemčija

Centrifuga Centrifuge 5415 R Eppendorf, Nemčija

Centrifuge 5702 R Eppendorf, Nemčija Sorval RC6+ Thermo Scientific, ZDA

— nadaljevanje tabele na naslednji strani —

MATERIALI

19

aparatura za odparevanje topila MiVac Duo Concentrator Genevac, Anglija

Incubator Innova 4230 New Brunswick Scientific, ZDA

Stresalnik GyroTwister 3-D Shaker Labnet, ZDA

Termoblok Bio TDB-100 Biosan, Latvija

sterilna komora odsesovalna komora M13 Iskra PIO, Slovenija

laboratorijski vir napetosti Electrophoresis power supply Amersham Biosciences, ZDA Bio Rad model 500 Bio Rad, ZDA

magnetno mešalo FB15045 Fisher Scientific

Rotamix 550 M Tehtnica, Slovenija

pH-meter Seveneasy Mettler Toledo, Švica/ZDA

Sonifikator Labsonic 2000 B. Braun, Nemčija

Spektrofotometer Nanodrop 2000c Thermo Scientific, ZDA

Tehtnica XA 60/220/X RADWAG, Poljska

WLC2/A2 RADWAG, Poljska

3.1.6 Materiali pri delu s proteini

3.1.6.1 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS

Uporabili smo sistem za enodimenzionalno elektroforezo Mini Gel Tank (Invitrogen, ZDA).

Za analizo proteinskih vzorcev smo uporabljali ločitveni gel z 12,5-odstotno zamreženostjo in koncentracijski gel s 5-odstotno zamreženostjo. Sestava obeh gelov je opisana v tabeli 3.9.

Tabela 3.9: Sestava 12,5-odstotnega ločitvenega in 5-odstotnega koncentracijskega gela za NaDS-PAGE.

Komponenta 12,5-odstotni ločitveni gel 5-odstotni

koncentracijski gel

dH2O 2,99 ml 4,31 ml

4× ločevalni pufer (1,5 M Tris, pH 8,8) 1,75 ml /

— nadaljevanje tabele na naslednji strani —

MATERIALI

20

4× koncentracijski pufer (0,5 M Tris, pH 6,8) / 1,75 ml 40-odstotni (w/v) akrilamid-bisakrilamid 2,19 ml 0,875 ml

10-odstotni (w/v) NaDS 70 µl 70 µl

TEMED 10,5 µl 10,5 µl

10-odstotni (w/v) APS 21 µl 21 µl

3.1.6.2 Materiali pri prenosu western in imunodetekciji

Pri prenosu Western smo uporabili aparaturo za prenos western (Bio Rad, ZDA).

Uporabiljali smo polivinilidenfluoridno (PVDF) membrano ROTI-PVDF (Roth, Nemčija), methanol, filtrirni papir in prenašalni pufer Towbin (25 mM Tris, 192 mM glicin, pH 8,4, 20-odstoten (v/v) metanol).

Za izvedbo imunodetekcije smo uporabili pufer PBST (pufer PBS (angl. Phosphate- buffered saline) z dodanim 0,1-odstotnim detergentom Tween-20), blokirni reagent, mišja monoklonska protitelesa proti oznaki His6, konjugirana s hrenovo peroksidazo (založna koncentracija 50 U/ml) (Roche, Švica), primarna zajčja monoklonska protitelesa proti EGFR/Trop1 (Novus Biologicals, ZDA) in sekundarna kozja protitelesa proti mišjim IgG in IgM (založna koncentracija 0,8 mg/ml) (115-035-044, Jackson ImmunoResearch, VB), H2O2 (Belinka, Slovenija) ter 3,3-diaminobenzidin tetrahidroklorid hidrat (DAB) (Sigma Aldrich, ZDA).

METODE

21

3.2 Metode

3.2.1 Delo z nukleinskimi kislinami 3.2.1.1 Izolacija plazmidne DNA

Plazmidno DNA smo izolirali iz prekonočnih bakterijskih kultur s pomočjo kompleta reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, ZDA) po navodilih proizvajalca. Prekonočno kulturo celic E. coli DH5α, smo gojili v tekočem gojišču LBA.

Izolacija plazmida je s pomočjo kompleta temeljila na alkalni lizi celic, plazmidna DNA pa se je vezala na silikatni nosilec,zaradi visoke ionske jakosti, ki je posledica dodanega kalijevega acetata.

Izolirani plazmidni DNA smo izmerili absorbanco pri dolžini 260 nm in ji tako določili koncentracijo. Shranili smo jo pri -20 °C do nadaljne uporabe.

3.2.1.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je splošna metoda, s katero pridobimo točno določen konstrukt na osnovi matrične (tabela 3.10). Temelji na zaporedju treh temperaturno odvisnih reakcij, ki si sledijo v treh korakih. Najprej pride do denaturacije DNA, sledi prileganje začetnih oligonukleotidov, na koncu pa pride do podaljševanja verige s DNA- polimerazo. Običajno se postopek ponovi v 25-35 ciklih (tabela 3.11).

Za pomnoževanje matric in vključkov smo uporabljali polimerazo Phusion, ki je zelo hitra in natančna in ima sposobnost kontrolnega branja pri podaljševanju daljših segmentov. Za analizo vključkov s pomočjo metode PCR na osnovi kolonije pa smo uporabili polimerazo Taq, ki nima kontrolnega branja in je manj natančna, zato se uporablja za analitične namene (tabela 3.12). Temperaturo prileganja smo na osnovi začetnih oligonukleotidov določili s programom Tm calculator proizvajalca Thermo Fisher Scientific (tabela 3.13).

METODE

22

Tabela 3.10:Sestava reakcijske mešanice PCR za pripravo matric in vključkov. Navedene so količine, ki smo jih uporabili pri vseh krogih PCR.

komponenta količina (1. krog) količina (2. krog)

5× pufer GC 4 µl 10 µl

dNTP (2,5 mM) 1,6 µl 4 µl

matrična DNA 1 µl 1 µl

smerni začetni oligonukleotid (10 µM) 1 µl 2,5 µl

protismerni začetni oligonukleotid (10 µM) 1 µl 2,5 µl

dH2O 11,2 29,5 µl

DNA-polimeraza Phusion (2 U/µl) 0,2 µl 0,5 µl

skupni volumen 20 µl 50 µl

Tabela 3.11:Shema poteka PCR s polimerazo Phusion ter prikaz temperaturnega programa za pripravo matrice in vključkov.

korak temperatura Ča

s

začetna denaturacija 98 °C 30 s

denaturacija 98 °C 60 s

35 ciklov prileganje 50-72 °C 30 s

podaljševanje 72 °C 30 s/kbp

končno podaljševanje 72 °C 7 min

ohlajanje 4 °C ∞

Tabela 3.12: Opis korakov reakcije PCR pri pripravi začetnih konstruktov. Pri vsakem produktu so navedene uporabljene matrice, začetni oligonukleotidi, temperatura prileganja (Ta) in dolžina produkta.

Produkt Matrična DNA Začetni oligonukleotid Ta Dolžina

produkta pcDNA5/FRT/TO + alb signalnim peptidom + WPRE

— nadaljevanje tabele na naslednji strani —

METODE

23 prvi krog

alb-signal / pc5-SLiCE-F/AS-linker-

F:pc5-AS-R linker-WPRE-R

55,8 °C 157 bp

WPRE-1 pCDH-PGK WPRE-F1 / WPRE-R 57,5°C 414bp

WPRE-2 pCDH-PGK WPRE-F2 / pc5-WPRE-R 61.0°C 227 bp

drugi krog

AS-WPRE alb-

signal/WPRE- 1/WPRE-2

pc5-SLiCE-F / pc5-SLiCE-R 55,8 °C 743 bp

Tabela 3.13: Opis korakov reakcije PCR pri pripravi posameznih vključkov. Pri vsakem produktu so navedene uporabljene matrice, začetni oligonukleotidi, temperatura prileganja (Ta) in dolžina produkta. Smerni oligonukleotidi imajo na koncu imena oznako -F, protismerni pa -R.

EGFR-EX, EGFR-FL prvi krog

EGFR-EX pBABE_puro_EGF

R-WT

pc5-EGFR-F / pc5W- EGFR-EX-R

58,6°C 2010 bp

AS-EGFR-EX pBABE_puro_EGF

R-WT

alb-EGFR-F / pc5W- EGFR-EX-R

58,6°C 1927 bp

EGFR-FL pBABE_puro_EGF

R-WT

pc5-EGFR-F / pc5W- EGFR-FL-R

58,6°C 3705 bp

AS-EGFR-FL pBABE_puro_EGF

R-WT

alb-EGFR-F / pc5W- EGFR-FL-R

59,6°C 3599 bp

3.2.1.3 PCR na osnovi kolonije

Uspešnost metode SLiCE smo preverili s pomočjo metode PCR na osnovi kolonije. V reakcijsko mešanico smo dodali bakterijsko kolonijo, ki je služila kot matrična DNA, saj se po začetni denaturaciji plazmidna DNA sprosti iz bakterij in deluje kot matrica za pomnoževanje (tabela 3.14).

Pri tej metodi ne uporabimo polimeraze Phusion, ampak uporabimo polimerazo Taq, ki nima aktivnosti kontrolnega branja, vendar je vseeno primerna za analizo uspešnosti ligacije ter SLiCE (tabela 3.15).

METODE

24

PCR na osnovi kolonije smo uporabili za preverjanje prisotnosti vključka AS-WPRE v vektorju pcDNA5/FRT/TO in za preverjanje prisotnosti vključkov AS-EGFR-Ex, AS- EGFR-Ex-WPRE, EGFR-Ex in EGFR-Ex-WPRE v vektor pcDNA5/FRT/TO (tabela 3.16).

Tabela 3.14: Reakcijska mešanica za PCR na osnovi kolonije.

Komponenta Količina

DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) 5 µl

smerni začetni oligonukleotid (10 µM) 0,5 µl

protismerni začetni oligonukleotid (10 µM) 0,5 µl

bakterijska kolonija 1 kolonija

dH2O 4 µl

skupni volumen 10 µl

Tabela 3.15: Temperaturni program za PCR na osnovi kolonije. Čas podaljševanja je daljši kot pri PCR za pripravo matric in vključkov, saj Taq polimeraza počasneje sintetizira DNA kot polimeraza Phusion.

Korak Temperatura Čas

začetna denaturacija 94 °C 2 min

denaturacija 94 °C 30 s

35 ciklov prileganje 50-72 °C 30 s

podaljševanje 72 °C 60 s/kbp

končno podaljševanje 72 °C 5 min

Ohlajanje 4 °C ∞

Tabela 3.16: Uporabljeni začetni oligonukleotidi, temperatura prileganja (Ta) in čas podaljševanja za PCR na osnovi kolonije pri analizi uspešnosti metode SLiCE.

vektor smerni začetni

oligonukleotid

protismerni začetni

oligonukleotid Ta

analiza uspešnosti SLiCE

pcDNA5/FRT/TO CMV-F BGH-R 55,8 °C

METODE

25

3.2.1.4 Preverjanje nukleotidnega zaporedja

S pomočjo PCR na osnovi kolonije smo pri bakterijskih kulturah ugotovili prisotnost vključka AS-WPRE v vektorju pcDNA5/FRT/TO ter tudi za analizo prisotnosti vključkov AS-EGFR-Ex, AS-EGFR-Ex-WPRE, EGFR-Ex in EGFR-Ex-WPRE. Izolirali smo plazmid ter s sekvenciranjem po Sangerju (GATC Biotech, Nemčija) preverili pravilnost nukleotidnega zaporedja vključka. Uporabili smo začetne oligonukleotide za CMV-F in BGH-R.

3.2.1.5 Ločevanje in analiza DNA z agarozno gelsko elektroforezo

Agarozna gelska elektroforeza (AGE) je metoda, ki se uporablja za ločevanje molekul DNA po velikosti in temelji na potovanju DNA skozi zamrežen agarozni gel v električnem polju. Krajši segmenti DNA potujejo hitreje, daljši pa počasneje. Za detekcijo položaja DNA v gelu se uporablja etidijev bromid, ki se interkalira v dvojno vijačnico DNA in ob obsevanju z ultravijolično svetlobo fluorescira in emitira svetlobo v oranžnem delu vidnega spektra.

Pri našem delu smo AGE uporabljali za ločevanje in analizo produktov PCR. Agarozni gel smo pripravili tako, da smo agarozo, katere količina je bila odvisna od želene zamreženosti gela, s segrevanjem raztopili v pufru TAE. Nato smo dodali še etidijev bromid (3 µl/100 ml gela), gel vlili v kadičko in vstavili glavniček za nanos vzorcev. Ko se je gel strdil, smo ga potopili v pufer TAE in nanesli vzorce z dodanim 6× nanašalnim pufrom. Elektroforezo smo izvajali pri konstantni napetosti 10 V/cm gela.

3.2.1.6 Izolacija DNA iz gela

Po izvedeni AGE smo iz gela izrezali košček, ki je vseboval želeno DNA in jo izolirali s kompletom reagentov po navodilih proizvajalca. Izolacija vključuje raztapljanje gela, vezavo DNA na silikatni nosilec, spiranje in elucija DNA. Koncentracijo izolirane DNA smo določili z merjenjem absorbance pri valovni dolžini 260 nm.

METODE

26

3.2.1.7 Metoda SLiCE

Metoda SLiCE je metoda restrikcije in ligacije pri kateri pride do rekombinacije med homolognimi konci lineariziranega vektorja in vključka, ki je dolg med 15-52 bp. Gre za alternativno metodo, saj namesto posameznih encimov uporabimo bakterijski celični ekstrakt, ki je v primerjavi z z restriktazami in ligazami cenejši in hitrejši za pripravo. Pri metodi SLiCE smo uporabili ekstrakt celic E. coli seva PPY. Za vstavitev vključkov v vektor smo uporabljali plasmid pcDNA5/FRT/TO, ki je bil predhodno rezan z restriktazama AflII in XhoI. Sestava reakcijske mešanice se nahaja v tabeli 3.17.

Reakcijo SLiCE smo izvajali 30 min pri 37 °C, kateri je sledila transformacija celicE. coli DH5α z reakcijsko mešanico (tabela 3.17).

Tabela 3.17: Reakcijska mešanica za izvedbo metode SLiCE. Sestava pufra SLiCE in vir ekstrakta SLiCE sta navedena v podpoglavju 3.1.1.8.

Komponenta Količina

lineariziran vektor 10 ng

vključek 2,5 × oz. 5 × množina lineariziranega vektorja

10× pufer SLiCE 1 µl

ekstrakt SLiCE 1 µl

dH2O do 10 µl

skupni volumen 10 µl

3.2.2 Delo z bakterijami

3.2.2.1 Transformacija bakterijskih celic

Transformacija je proces, s katerim bakterijska celica sprejme tujo DNA.

Transformacijo smo izvedli s pomočjo kompetentnih celic E. coli DH5α, katere smo gojili na LB gojišču z dodanim antibiotikom ampiclinom.

METODE

27

Transformacijo smo izvedli po stanardnem postopku s pomočjo toplotnega šoka. 100 µl kompetentnih celic DH5α, ki so bile predhodno shranjene na -80°C, smo odtalili in dodali 1 µl plazmida oz. 10 µl reakcijske mešanice SLiCE. Celice smo 20 min inkubirali na ledu, nato smo izvedli toplotni šok 40 s pri 42 °C v termobloku in celice ponovno prenesli na led. Po 2 min smo jim dodali 900 μl gojišča LB in celice 1 h stresali pri 37 °C. Po inkubaciji smo celice zbrali s centrifugiranjem (3 min, 3000 × g), jih ponovno resuspendirali v 100 μl gojišča LB in vse celice razmazali na trdo LB gojišče z ustreznim antibiotikom. Inkubirali smo jih čez noč pri 37 °C.

3.2.2.2 Priprava prekonočnih kultur bakterijskih celic

Za pripravo prekonočne kulture smo s sterilnim zobotrebcem aseptično prenesli kolonijo iz trdnega gojišča v 10 ml ustreznega selekcijska tekoča gojišča, ki smo ga nato preko noči stresali pri 37 °C in 150 rpm.

3.2.3 Delo s sesalskimi celičnimi linijami

3.2.3.1 Gojenje in precepljanje celic Flp-In™-CHO ter Flp-In™-293

Gojenje sesalskih celičnih linij je potekalo pod kontroliranimi pogoji v inkubatorju (37°C v atmosferi s 95 % vlažnostjo in 5 % CO2) . Flp-In™-CHO in Flp-In™-293 smo pred transfekcijo redčili 5x in 10x, nato pa so po 3–4 dneh dosegle konfluentno rast. Za uporabo smo celice ohranjali v logaritemski fazi rasti, kjer naj bi bilo ∼90 % celic viabilnih.

Pri precepljanju smo v prvem koraku odstranili medij, celice pa sprali s pufrom dPBS, ki dodatno odstrani tripsinske inhibitorje in preostali medij. Na celični sloj smo nanesli 0,3 ml tripsin in pustili delovati 5 min pri sobni temperaturi, kar je omogočilo, da so se celice odlepile od podlage. Reakcijo tripsinizacije smo ustavili z dodatkom medija in celice resuspendirali v mediju. Nato smo na novo ploščo nanesli določen volumen celic.

3.2.3.2 Prehodna in stabilna transfekcija v sesalske celice

Transfekcijo celic smo izvedli po navodilih proizvajalca transfekcijskega reagenta TurboFeet™ (Thermo Scientific, ZDA).

METODE

28

Transfekcijo smo izvedli, ko je bila konfluentna rast celic 70–90%. Za transfekcijo smo uporabili transfekcijskegi reagent TurboFeet™ (Thermo Scientific, ZDA), kateri vsebuje kationske polimere, ki skupaj z DNA tvorijo stabilne pozitivno nabite strukture. Tako smo zaščitili nukelinsko kislino in ji hkrati omogočili prehod v evkariontsko celico (tabela 3.18).

Tabela 3.18: Prikaz količin, ki smo jih uporabili za transfekcijo celic CHO.

Komponenta Količina (stabilna

transfekcija)

Transfekcijski reagent 4 µl

pOG44 1,8 µl

pcDNA5/FRT/TO 0,2 µl

Medij brez FBS 100 µl

Pripravili smo transfekcijsko mešanico (tabela3.19).

Tabela 3.19: Prikaz količin, ki smo jih uporabili za transfekcijo celic HEK.

Konstrukt Konc.

DNA (ng/µl)

DNA (µl)

Transfekcijski reagent (µl)

Medij (µl)

PcDNA5/FRT/TO-AS-

EGFR-Ex 309 10,36 6,4 296,61

PcDNA5/FRT/TO-AS-AS-

EGFR-Ex 374 8,56 6,4 296,61

PcDNA5/FRT/TO-WPRE-

EGFR-Ex 360 8,89 6,4 296,61

PcDNA5/FRT/TO-AS-

WPRE-EGFR-Ex 324 9,88 6,4 296,61

METODE

29

3.2.4 Delo s proteini

3.2.4.1 Obarjanje proteinov s trikloroocetno kislino (TCA)

Obarjanje proteinov s trikloroocetno kislino (TCA) je metoda za koncentriranje proteinskih vzorcev, ki smo jo pri našem delu uporabili za analizo vzorca.

Vzorcu smo dodali 100 % TCA do končne koncentracije 10 % (v/v), ga inkubirali 15 min na ledu in nato centrifugirali 15 min pri 12 000 g in 4 °C. Supernatant smo odstranili, oborino sprali z 200 µl ledeno hladnega acetona in vzorec centrifugirali 5 min pri 12 000 g in 4 °C. Korak spiranja smo še enkrat ponovili. Oborino smo posušili v vakuumski centrifugi in jo raztopili v 12,5 µl 4× NaDS-nanašalnega pufra z reducentom, 5 µl 1,5 M Tris, pH 8,8 in 32,5 µl dH2O. Po šestminutni inkubaciji pri 95 °C smo vzorec nanesli na poliakrilamidni gel in izvedli NaDS-PAGE.

3.2.4.2 Analiza proteinov z NaDS-PAGE

Z metodo poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS (NaDS-PAGE) uporabljamo za ločevanje proteinov po njihovi velikosti oz. masi ter temelji na potovanju proteinov v električnem polju skozi zamrežen poliakrilamidni gel.

Preden smo nanaesli vzorce smo jim dodali 4 × NaDS-nanašalni pufer z reducentom ali pa brez njega. Elektroforezo smo izvajali pri konstantni napetosti 200V ter po tem izvedli prenos western ter imunodetekcijo AS-EGFR-Ex in EGFR-Ex.

3.2.4.3 Analiza proteinov s prenosom western

Z uporabo metode prenosa western prenesemo ločeno proteine na nitrocelulozno ali polivinilfluoridno (PVDF) membrano in jih specifično označimo s protitelesi. Metoda je kvantitativna in nam omogoči, da identificiramo točno določene proteinev vzorcu. Za prenos western smo uporabljali polivinilfluoridno (PVDF) membrano.

Na začetku smo sestavili kaseto in na eno polovico položili pomočen filtrirni papir v pufru, PVDF membrano, ki pa smo jo predhodno namakali v metanolu. Na membrano

METODE

30

smo nanesli poliakrilamidni gel, tri kose filtrirnega papirja in zaprli kaseto. Prenos smo izvajali v pufru TOWBIN. Hiter prenos smo izvajali 7 min pri konstantnem toku 200 mA in napetosti do 300 V.

3.2.4.4 Imunodetekcija

Po končanem prenosu smo membrano najprej 1 h blokirali v blokirnem pufru (Immobilon® Block - FL (Fluorescent Blocker)), da so se nezasedena mesta na membrani zasedla, nato pa smo membrano inkubirali v raztopini protiteles. Pri delu smo proteinske konstrukte detektirali na dva različna načina. Naši konstrukti imajo na C-koncu heksahistidinsko oznako, zato smo lahko njihovo prisotnost v vzorcu detektirali z mišjimi protitelesi proti His6-oznaki in s primarnimi ter sekundarnimi mišjimi protitelesi proti His6-oznaki.

3.2.4.5 Detektiranje s protitelesi proti His6-oznaki

Ko se je blokiranje končalo, smo membrano inkubirali 45min s protitelesom anti- His6- HRP. Membrano smo po inkubaciji spirali 3x po 5 min s TBST, nato pa protein na membrane detektirali s kompletom za pripravo kemiluminiscenčnega substrata za hrenovo peroksidazo (Pierce® ECL Western Blotting Substrate). Kemiluminiscenčni substrat smo pripravili tako, da smo komponenti reagenta zmešali v razmerju 1:1 (500 μl:

500 μl) in mešanico nakapljali na membrano. Kemiluminiscenco smo detektirali z aparaturo za slikanje gelov, Chemidoc (BioRad).

Nika Vegelj: Priprava konstruktov za izražanje rekombinantnega

zunajceličnega dela človeškega proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah

31

4 REZULTATI

Raziskovalnega dela smo se lotili v dveh ločenih sklopih. V prvem smo pripravili vse potrebne konstrukte za transfekcijo v sesalske celične linije. Pripravili smo 2 različna inserta: AS-EGFR-Ex in EGFR-Ex ter 4 različne zapise za zunajcelični del EGFR (EGFR-Ex) in sicer z nativnim signalnim peptidom z in brez elementa WPRE ter z albuminskim signalnim peptidom z in brez elementa WPRE. V drugem delu pa smo izvedli transfekcijo in nato s pomočjo imunodetekcije poskušali ugotoviti, ali se protein izraža v stabilnih celičnih linijah oz. v prehodno transficiranih. Obenem smo želeli okarakterizirati vpliv signalnih peptidov na izražanje proteina EGFR v sesalskih celičnih linijah (slika 4.1).

Slika 4.1: Shematski prikaz poteka dela.

4.1.1 Priprava vektorskih konstruktov s pomočjo PCR

Vključek za albuminski signalni peptid ter element WPRE smo pripravili v dveh stopnjah z metodo PCR (3.2.1.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)), pri čemer smo na vsaki stopnji rezultate PCR analizirali z AGE, produkte, ki so bili ustrezni pa smo izolirali iz

REZULTATI

32

gela. Produkt prve stopnje smo uporabili za izvedbo naslednjega kroga PCR, končni konstrukt AS-WPRE (slika 4.2) pa smo z metodo SLiCE vstavili v tarčni vektor pcDNA5/FRT/TO preko mest AflII in XhoI. (3.2.1.7 Metoda SLiCE) (slika 4.3).

Slika 4.2:Analiza produktov 1. in 2. kroga PCR za pripravo vključka AS-WPRE z AGE. A – rezultati prvega kroga PCR, Albuminski signalni peptid (157bp), WPRE 1(414bp) in WPRE2 (277bp), B – rezultati drugega kroga PCR 3x-matrica (798bp). Pri analizi produktov obeh krogov smo uporabili standard velikosti (St.). Z rumeno puščico je označen položaj želenega produkta.

Slika 4.3: Shematski prikaz priprave vključka AS-WPRE. Produkt prvega kroga (AS , WPRE1 ter WPRE2) smo uporabili za pripravo 3x matrice AS-WPRE, ki smo jo s pomočjo SLiCE vstavili v vektor pcDNA/FRT/TO.

Vključek AS-WPRE smo v vektor vstavili preko mest AflII in XhoI, kar pa nam je tudi omogočilo, da smo izrezali zapis za 3xFLAG iz prvotnega vektorja pcDNA5/FRT/TO/3XFLAG (slika 4.4). Zaradi spremembe izvornega vektorja smo po

REZULTATI

33

rezanju z AflII s pomočjo polimeraze dopolnili previsni konec, drugače bi bila homologna regija prekratka in ne bi prišlo do pravilnega poteka SLiCE (slika 4.5).

Slika 4.4: Restrikcija vektorja pcDNA5/FRT/TO/3XFLAG z restriktazama AflII ter XhoI.

Z rumeno puščico je označen produkt restrikcije pcDNA5/FRT/TO (5314 bp). Pri analizi smo uporabili kilobazno velikostno lestvico (St.).

Slika 4.5:Shematski prikaz priprave vektorja pcDNA5/FRT/TO ter izvedba SliCE. Izvorni vektor je imel vključek 3xFLAG, ki smo ga izrezali s pomočjo restriktaz AflII ter XhoI, hkrati pa smo vektor rezali tako, da smo ga direktno uporabili za izvedbo SLiCE, da smo vstavili vključek AS-WPRE v vektor.

REZULTATI

34

Uspešnost vstavitve vključka v vektor smo preverili z uporabo PCR na osnovi kolonije (3.2.1.4 PCR na osnovi kolonije), pri katerem smo uporabili bakterijske kolonije, ki so zrasle na selekcijskem gojišču po transformaciji z reakcijsko mešanico SLiCE. Prisotnost vključka v vektorju smo potrdili (slika 4.6).

Slika 4.6:Analiza po PCR na osnovi kolonije za konstrukt pcDNA5/FRT/TO-AS-WPRE. Z rumeno puščico je označena dolžina produkta, ki nakazuje na prisotnost vključka AS-WPRE v vektorju pcDNA5/FRT/TO. Prisotnost vključka smo tako potrdili pri naši koloniji. Pri analizi smo uporabili bazno velikostno lestvico (St.).

Iz bakterijske kolonije smo izolirali vektor in določili njegovo nukleotidno zaporedje.

Potrdili smo ustreznost zapisa za naš konstrukt pcDNA5/FRT/TO-AS-WPRE.

Vektor z vključkom, ki ima ustrezno nukleotidno zaporedje, smo uporabili za pripravo nadaljnjih konstruktov. Najprej smo izvedli restrikcijo z XhoI in tako izrezali iz vektorja element WPRE, ki pa vseeno vsebuje zaporedje za albuminski signalni peptid, je pa brez WPRE, tako da lahko preverjamo učinek WPRE na nivo izražanja (slika 4.7).

REZULTATI

35

Slika 4.7: Restrikcija vektorja pcDNA5/FRT/TO-AS-WPRE z restriktazo XhoI. Z rumeno puščico je označen produkt restrikcije pcDNA5/FRT/TO-AS (5163bp).Vzorec (rezan plazmid z XhoI) smo zaradi večjega volumna razdelili v dva žepka na gelu. Pri analizi smo uporabili kilobazno velikostno lestvico (St.).

4.1.2 Priprava konstruktov EGFR-Ex

Vključek z zapisom za EGFR-Ex ter AS-EGFR-Ex smo pripravili z metodo PCR (3.2.1.3 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)), pri čemer smo rezultat analizirali z AGE in produkt ustrezne velikosti izrezali in izolirali iz gela. Produkte reakcije PCR smo z metodo SLiCE vstavili v že skonstruirane vektorje (3.2.1.8 Metoda SLiCE) (slika 4.8).

Slika 4.8: Shematski prikaz priprave vključka EGFR-Ex ter AS-EGFR-Ex. Pripravili smo dva različna vključka z zapisom za zunajcelični del EGFR, in sicer vključek AS-EGFR-Ex ni imel zapisa za nativni signalni peptid, saj smo ga vstavili v vektorje z zapisom za albuminski signalni peptid ter vključek EGFR-Ex, ki je imel zapis za nativni signalni peptid in smo ga vstavili v vektorje, ki niso imeli zapisa za albuminski signalni peptid.