U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJODIPLOMSKO DELO
Kim Glavič
Ljubljana, 2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOUNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA
Bioinformacijska analiza parov toksin-antitoksin cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 in molekulsko kloniranje antitoksinov Bh695_0426 in
Bh695_0430
DIPLOMSKO DELO
Kim Glavič
M
ENTOR: izr. prof. dr. Marko Dolinar
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega dela
Spodaj podpisana Kim Glavič sem avtorica diplomskega dela z naslovom Bioinformacijska analiza parov toksin-antitoksin cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 in molekulsko kloniranje antitoksinov Bh695_0426 in Bh695_0430.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr.
prof. dr. Marka Dolinarja;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje
predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, 30. 8. 2021 Podpis avtorice
Iskreno se zahvaljujem mentorju prof. dr. Marku Dolinarju za številne nasvete, vzpodbudo in pomoč pri načrtovanju ter pisanju diplomskega dela in temeljit pregled diplomskega dela.
Prav tako se zahvaljujem doc. dr. Marini Klemenčič za pomoč in nasvete pri laboratorijskem delu ter hiter pregled diplomskega dela. Za pomoč in prijetno vzdušje se zahvaljujem tudi ostalim zaposlenim in študentom na Katedri za biokemijo. Še posebej pa se zahvaljujem mag. Katarini Petri van Midden za vse napotke pri laboratorijskem delu.
Navsezadnje pa se zahvaljujem tudi družini, prijateljem in fantu za vso podporo in spodbudo tekom študija.
Bioinformacijska analiza parov toksin-antitoksin cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 in molekulsko kloniranje antitoksinov Bh695_0426 in Bh695_0430
Povzetek:
Sistemi toksin-antitoksin (TA) so genetski elementi, ki zapisujejo za relativno stabilen proteinski toksin, ki onemogoči rast celice, in nestabilen antitoksin, ki zavre škodljivi učinek kompatibilnega toksina. Njihova biološka vloga še ni povsem razumljena, znano pa je, da sodelujejo pri mnogih bioloških procesih, izmed katerih izstopajo postsegregacijska smrt, abortivna infekcija in bakterijska persistenca. Najdemo jih na številnih plazmidih in kromosomih mnogih arhej ter bakterij, med katere sodi tudi cianobakterija Microcystis aeruginosa PCC 7806.
Kljub številčnosti sistemov TA v genomu te cianobakterije jih je bilo do sedaj le nekaj tudi eksperimentalno ovrednotenih, zato smo v sklopu tega diplomskega dela želeli zapisa za dva antitoksina izraziti in izolirati iz celic Escherichia coli.
Z bioinformacijskimi orodji smo zbrali in analizirali predvidene pare TA ter izmed teh izbrali dva, katerih zapisa za antitoksina smo pomnožili. Z metodami molekulskega kloniranja smo gena za antitoksina Bh695_0426 in Bh695_0430 vstavili v klonirni vektor pJET1.2/blunt. Prenos v ekspresijski vektor pET-28b(+) ni bil uspešen.
Uspešno izražanje genov za antitoksina in izolacija proteinskih produktov bi omogočila nadaljnje raziskave njihove strukture in funkcije, pa tudi regulacije izražanja TA. Zaradi tega bi bilo smiselno eksperimentalno delo z manjšimi spremembami ponoviti.
Ključne besede: cianobakterije, Microcystis aeruginosa PCC 7806, sistemi toksin-antitoksin, antitoksin
Bioinformatic analysis of toxin-antitoxin pairs in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa PCC 7806 and molecular cloning of antitoxins Bh695_0426 and Bh695_0430
Abstract:
Toxin-antitoxin (TA) systems are genetic elements that encode a relatively stable protein toxin that inhibits cell growth and an unstable antitoxin that inhibits the deleterious effect of the cognate toxin. Their biological function is not yet fully understood. However, they are known to participate in many biological processes, most important being postsegregational killing, abortive infection and bacterial persistence. They can be found on plasmids as well as chromosomes of numerous archaea and bacteria, including cyanobacterium Microcystis aeruginosa PPC 7806.
Despite the abundance of TA systems in the genome of this cyanobacterium, only a few have been experimentally characterised so far. Therefore, our goal has been to express two antitoxins and isolate the protein products from Escherichia coli cells.
Using bioinformatics tools, we collected and analysed the predicted TA pairs. From these, we selected two and amplified their antitoxin sequences. Using molecular cloning methods, we inserted the genes for the antitoxins Bh695_0426 and Bh695_0430 into the cloning vector pJET1.2/blunt. However, transfer of the antitoxins into the expression vector pET-28b(+) was unsuccessful.
Successful expression of antitoxin genes and the isolation of protein products would enable further research of antitoxin function, structure and regulation of TA gene expression. It would therefore be reasonable to repeat experiments with a few adjustments.
Keywords: cyanobacteria, Microcystis aeruginosa PCC 7806, toxin-antitoxin systems, antitoxin
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Cianobakterije ... 1
1.2 Sistemi toksin-antitoksin ... 1
1.2.1 Vloga sistemov toksin-antitoksin ... 2
1.2.2 Tipi sistemov toksin-antitoksin ... 3
1.2.3 Številčnost sistemov toksin-antitoksin ... 4
1.3 Orodja za analizo sistemov toksin-antitoksin ... 4
1.3.1 TAfinder ... 4
1.3.2 TASmania ... 5
2 Namen dela in hipoteza ... 7
3 Materiali ... 9
3.1 Materiali, uporabljeni pri molekulskem kloniranju ... 9
3.1.1 Zapisa za antitoksina ... 9
3.1.2 Oligonukleotidi ... 10
3.1.3 Vektorja ... 14
3.1.4 Encimi ... 16
3.1.5 Materiali za izvedbo agarozne gelske elektroforeze... 17
3.1.6 Kompleti reagentov ... 18
3.1.7 Ostala laboratorijska oprema ... 18
3.2 Materiali pri delu z bakterijskimi celicami ... 18
3.2.1 Bakterijske celične linije ... 18
3.2.2 Gojišča ... 19
3.2.3 Ostala laboratorijska oprema ... 19
4 Metode ... 21
4.1 Bioinformacijska analiza ... 21
4.2 Delo z nukleinskimi kislinami ... 22
4.2.1 Verižna reakcija s polimerazo ... 22
4.2.2 Agarozna gelska elektroforeza in detekcija DNA ... 24
4.2.3 Izolacija DNA iz agaroznega gela ... 24
4.2.4 Ligacija ... 25
4.2.5 Izolacija plazmidne DNA ... 26
4.2.6 PCR na osnovi kolonije ... 26
4.2.7 Rezanje z restriktazami ... 27
4.2.8 Analiza nukleotidnega zaporedja... 29
4.3 Delo z bakterijami ... 29
4.3.1 Priprava gojišč ... 29
4.3.2 Priprava prekonočnih kultur ... 29
4.3.3 Transformacija ... 30
5 Rezultati ... 31
5.1 Bioinformacijska analiza sistemov TA in izbira dveh parov TA ... 31
5.2 Rezultati pomnoževanja širših genomskih segmentov ... 31
5.3 Rezultati pomnoževanja zapisov za antitoksina ... 33
5.4 Analiza plazmidne DNA transformant klonirnega seva ... 34
5.5 Rezultati preparativnih restrikcijskih reakcij ... 35
5.6 Analiza plazmidne DNA transformant ekspresijskega seva ... 36
5.7 Določitev nukleotidnega zaporedja vključkov ... 37
6 Razprava ... 41
7 Zaključek ... 45
8 Literatura ... 47
9 Priloge ... 51
9.1 Rezultati določanja nukleotidnega zaporedja ... 51
9.1.1 Izpis določenega nukleotidnega zaporedja ... 51
9.1.2 Elektroferogram ... 52
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
AGE agarozna gelska elektroforeza
ak aminokislina
ATP adenozintrifosfat
BLASTP orodje za osnovno lokalno poravnavo proteinskih zaporedij
bp bazni par
DELTA-BLAST orodje za osnovno, časovno pospešeno lokalno poravnavo proteinskih zaporedij z boljšim zaznavanjem homologije proteinov dH2O deionizirana voda
DNA deoksiribonukleinska kislina dNTP deoksiribonukleozidtrifosfati EDTA etilendiamintetraocetna kislina E. coli Escherichia coli
HMM skriti modeli Markova
IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid
LB lizogeno gojišče
LBA lizogeno gojišče z ampicilinom LBK lizogeno gojišče s kanamicinom
MCS poliklonsko mesto
mRNA informacijska RNA
ori mesto začetka podvojevanja
PCR verižna reakcija s polimerazo RNA ribonukleinska kislina
RNaza ribonukleaza
PSK postsegregacijska smrt
TA toksin-antitoksin
TAE pufer Tris – acetat - EDTA
Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol
Tm temperatura tališča
U encimska enota
UV ultravijoličen
1
1 Uvod
1.1 Cianobakterije
Cianobakterije so morfološko raznolika skupina po Gramu negativnih bakterij, prisotnih v najrazličnejših življenjskih okoljih [1]. Kot fototrofni prokarionti so imele pomembno vlogo pri nastanku oksigene atmosfere na Zemlji [2], nepogrešljive pa so tudi pri kroženju ogljika in dušika v biosferi [1]. Kljub temu so danes najbolj poznane kot povzročiteljice škodljivega cvetenja voda, pri čemer gre za hitro rastoče populacije enega ali več različnih rodov cianobakterij, med katerimi običajno prevladujejo Anabena, Aphanizomenon in Microcystis [3]. Predvsem prenaseljenost Microcystis aeruginosa povzroča resne okoljske ter zdravstvene probleme [3]. Mnogi sevi namreč proizvajajo cianobakterijske hepatoksine, imenovane mikrocistini, ki so odgovorni za zastrupitve številnih vodnih organizmov in okvare jeter višjih živali [4].
Microcystis aeruginosa so ene izmed najbolj razširjenih cianobakterij, ki jih zaznamuje velika genetska raznolikost [5]. Neobičajno velika redundančnost njihovih genomov predstavlja le eno od evolucijskih strategij, ki jim omogoča naselitev in preživetje v dinamičnih okoljih [6], kot so sladkovodni ter estuarijski ekosistemi [7]. Vsi sevi Microcystis aeruginosa izkazujejo veliko plastičnost genoma, imajo značilno visok delež ponavljajočih se zaporedij in zmožnost vključitve novih genov s horizontalnim prenosom [6].
Sev Microcystis aeruginosa PCC 7806 vsebuje 5.139.339 bp dolg genom [8].
Zaznamujeta ga izjemna plastičnost ter veliko število netipičnih genov, najverjetneje pridobljenih preko lateralnih prenosov [9].
1.2 Sistemi toksin-antitoksin
Sistemi toksin-antitoksin (TA) so genetski elementi, ki zapisujejo za relativno stabilen toksin in nestabilen antitoksin. Vsi znani toksini so proteinske molekule. Antitoksini pa so proteini ali nekodirajoče RNA [10]. Prvi sistem TA so odkrili na plazmidu F bakterije Escherichia coli. Danes vemo, da so sistemi TA prisotni na številnih plazmidih in kromosomih mnogih bakterij ter arhej [11].
Antitoksini pri normalnih pogojih za rast celic preprečujejo aktivnost proteinskih toksinov oziroma prevajanje njihove mRNA. Pri različnih stresnih pogojih se manj stabilni antitoksini hitreje razgradijo, kar omogoči nemoteno delovanje toksinov. Ti ovirajo delovanje najrazličnejših celičnih procesov, med katere spadajo podvajanje DNA, prevajanje mRNA, ohranjanje integritete membrane ter sinteza ATP, citoskeleta in celične stene [11].
2
1.2.1 Vloga sistemov toksin-antitoksin
Kljub veliki številčnosti in dolgoletnim raziskavam delovanja sistemov TA je njihova biološka vloga še zmeraj slabo razumljena. Literatura ponuja mnogo različnih razlag, izmed katerih so le tri tudi eksperimentalno podprte. To so postsegregacijska smrt, abortivna infekcija in bakterijska persistenca [12].
Efekt postsegregacijske smrti (PSK) omogoča ohranjanje in stabilizacijo plazmidov, profagov ter ostalih mobilnih elementov v celicah [12]. Če ob delitvi celice s plazmidom, ki vsebuje zapis za sistem TA, ne pride do prenosa tega plazmida na hčerinsko celico, se nestabilen antitoksin v njih razgradi. Stabilen toksin se s tem sprosti, aktivira in deluje na tarčne celične procese, kar vodi do smrti celice [10]. Poleg tega PSK omogoča tudi prevlado plazmida s sistemom TA nad plazmidom brez sistema TA v bakterijski populaciji. Konjugacija namreč omogoča nastanek celic s plazmidoma iz iste nekompatibilnostne skupine. Ta sta nezmožna sočasno obstajati v celici v odsotnosti selekcijskega pritiska. Medtem ko bo v primeru izgube plazmida z zapisom za sistem TA prišlo do postsegregacijske smrti hčerinske celice, pa izguba drugega plazmida na hčerinsko celico ne bo vplivala. Posledično plazmid s sistemom TA v bakterijski populaciji prevlada nad drugim plazmidom, ki se sčasoma iz nje tudi izgubi [10].
Abortivna infekcija je eden izmed mehanizmov bakterijske imunosti, katerega namen je preprečitev širjenja bakteriofagov v bakterijski populaciji [12]. Ob okužbi celic z bakteriofagi pride do aktivacije sistemov TA, ki povzročijo altruistično smrt celice še pred replikacijo bakteriofagov in tako preprečijo njihovo razširitev v populaciji.
Bakteriofagi so v ta namen razvili več različnih mehanizmov, s katerimi lahko zaobidejo delovanje sistemov TA. Bakteriofag T4 recimo vsebuje zapis za univerzalni antitoksin, ki lahko nevtralizira več različnih toksinov in tako prepreči abortivno infekcijo [12].
Poznani so tudi primeri bakteriofagov z inhibitorji proteaz, ki preprečijo razgradnjo proteinskih antitoksinov [12].
Sistemi TA imajo pomembno vlogo tudi pri nastanku persistentnih celic. Persistentne celice predstavljajo podskupino genetsko identičnih, počasi rastočih celic z visoko toleranco na antibiotike in ostale okoljske stresorje [13]. Visoka toleranca na antibiotike je posledica neaktivnosti tarčnih celičnih procesov [12]. Persistentne celice se tvorijo pod stresnimi pogoji, kot sta pomankanje hranil in izpostavljenost subletalnim koncentracijam antibiotikov. Takrat namreč pride do aktivacije proteaze Lon, ki cepi antitoksin. Razmerje med molekulami toksina in antitoksina se zviša, kar omogoči obstoj prostega toksina, ki se aktivira in zavre specifične celične procese. Večina celic ob tem umre, nekatere pa preidejo v stanje bakterijske persistence. Ob ugodnih pogojih se persistentne celice povrnejo v stanje aktivne rasti in obnovijo izvorno populacijo [13].
3
1.2.2 Tipi sistemov toksin-antitoksin
Sistemi TA se delijo na sedem tipov, v katere so pari TA razvrščeni glede na biokemijsko naravo antitoksina in način njegove interakcije s toksinom. Antitoksini tipov I in III so nekodirajoče RNA, antitoksini tipov II, IV, V, VI in VII pa proteini [10].
Tip I: Antitoksini tipa I so nestabilne protismerne RNA [10], toksini pa običajno 20–85 aminokislin dolgi hidrofobni proteini [11]. Pri normalnih rastnih pogojih se antitoksin veže na mRNA toksina. Ta interakcija prepreči vezavo toksinske mRNA na ribosom in s tem tudi njeno prevajanje [10]. Nastali RNA dupleks nato razgradi RNaza III. Pri stresnih pogojih se število protismernih RNA zmanjša, kar omogoči prevajanje prostih mRNA toksina [13].
Tip II: Za sisteme TA tipa II je značilno, da sta tako toksin kot antitoksin proteinski molekuli. Antitoksine običajno sestavljata N-končna DNA-vezavna domena, pomembna za avtoregulacijo prepisovanja, in C-končna domena, preko katere vežejo ter nevtralizirajo toksin [12]. Ob interakciji antitoksina s toksinom pride do steričnih sprememb v strukturi toksina ali pa do prekritja njegovega aktivnega mesta [11]. Za aktivacijo toksina je potrebna razgradnja antitoksina s proteazami družine Clp ali s proteazo Lon [10]. Običajen operon sistema TA tipa II sestavljata dva zaporedna gena za antitoksin in toksin, ki se pogosto delno prekrivata. Prepisovanje je avtoregulirano z vezavo antitoksina ali kompleksa toksin-antitoksin na lasten promotor [11].
Tip III: Antitoksini so kratke nekodirajoče RNA, ki se direktno vežejo na proteinske toksine in jih nevtralizirajo. Vsi znani toksini so endonukleaze, ki režejo mRNA. Geni za antitoksine vsebujejo več ponovitev, ki jih po prepisovanju toksini cepijo do posameznih aktivnih RNA [12].
Tip IV: Pri sistemih tipa IV ne pride do direktne interakcije med toksinom in antitoksinom, kot je to značilno za ostale klasificirane tipe. Toksin in antitoksin se namreč vežeta na isto tarčo, na katero pa delujeta ravno nasprotno. Primer je sistem YeeUV iz genoma bakterije Escherichia coli. Toksin YeeV se veže na bakterijske proteine citoskeleta in tako prepreči njihovo polimerizacijo. Proteinski antitoksin YeeU deluje ravno nasprotno in te proteine stabilizira, kar omogoči nastanek normalne strukture citoskeleta [10].
Tip V: Sistem GhoST iz genoma bakterije Escherichia coli je trenutno edini znan primer sistema TA tipa V. Ob povečanem izražanju gena za toksin GhoT ta povzroči poškodbe membrane, ki vodijo do lize celice [11]. Proteinski antitoksin GhoS je endoribonukleaza, ki specifično cepi mRNA toksina GhoT in tako prepreči njeno prevajanje [10]. Za razliko od antitoksinov tipa II je antitoksin GhoS stabilen protein, ki ne nadzoruje prepisovanja lastnega operona [11].
4
Tip VI: Tip VI temelji na edinem znanem predstavniku, imenovanem SocAB. Toksin SocB z vezavo na drsno vponko holoencima DNA-polimeraze III prepreči fazo elongacije podvajanja DNA. Ob prisotnosti antitoksina SocA je podvajanje ponovno omogočeno, saj ta deluje kot proteolitični adapter in tako spodbudi razgradnjo toksina SocB s proteazo ClpXP [14].
Tip VII: Tip VII je nedavno definiran tip sistema TA, v katerega so trenutno uvrščeni trije pari TA. Zanje je značilno, da antitoksin nevtralizira toksin s posttranslacijsko kemijsko modifikacijo [15].
1.2.3 Številčnost sistemov toksin-antitoksin
Število sistemov TA, zapisanih na kromosomih, se precej razlikuje tako med različnimi vrstami bakterij kot tudi med zelo sorodnimi organizmi [10]. Vzrok za take razlike predstavlja življenjsko okolje. Visoko število sistemov TA je namreč značilno za organizme, ki živijo v dinamičnih oziroma stresnih okoljih, nasprotno pa so ti redki ali povsem odsotni pri obligatno znotrajceličnih organizmih, ki naseljujejo stabilna okolja [16].
1.3 Orodja za analizo sistemov toksin-antitoksin
1.3.1 TAfinder
TAfinder je orodje za napovedovanje domnevnih sistemov TA tipa II v bakterijskih genomih. Vključen je v podatkovno bazo TADB2.0 [17].
Deluje na podlagi enote za zaznavanje strukture operonov ter enote za iskanje glede na homologijo. TAfinder z uporabo NCBI BLASTP in HMMER3 poišče vse toksinom in antitoksinom homologne proteine. Rezultate nato filtrira glede na velikost in kot kandidatne proteine obdrži le tiste z dolžino 30–200 ak. Sledi urejanje toksinskih in antitoksinskih genov v operone, ki jih program predvidi kot domnevni sistem TA tipa II le pod pogojema, da sta oba gena zapisana na isti verigi DNA in njuna medgenska razdalja znaša med –20 in 150 bp [17].
5
1.3.2 TASmania
Orodje TASmania omogoča obsežno in silico določitev sistemov TA tipov I–IV v bakterijskih genomih in na plazmidih [18]. Osnovna uporabljena baza podatkov je neredundančna podatkovna zbirka EnsemblBacteria, ki vsebuje 31.332 genomov bakterij ter arhej [19]. Program temelji na skritih modelih Markova (HMM), zgrajenih iz začetnega niza proteinov, določenih z InterPro [18].
Ena izmed prednosti programa TASmania je neodvisna določitev komponent sistemov TA. Trenutna nomenklatura sistemov TA namreč temelji na identifikaciji družine toksinske komponente, po kateri se nato poimenuje tudi s toksinom povezani antitoksin.
Problem takšnega načina klasifikacije se kaže v neupoštevanju modularnosti antitoksinov. Program TASmania ta problem reši z določitvijo toksinov in antitoksinov na podlagi identifikatorjev skupkov, kar zagotavlja bolj objektivno in sistematično določitev. Poleg tega TASmania ne omejuje načina ureditve operona in pri napovedi vključuje tudi osamele gene z zapisi za toksine oziroma antitoksine. Smiselno je omeniti tudi, da program pri iskanju domnevnih proteinskih toksinov oziroma antitoksinov rezultatov ne filtrira glede na dolžino proteinov, kot je to pri programu TAfinder. To omogoča odkritje večjega števila domnevnih sistemov TA, a je hkrati večja tudi verjetnost lažno pozitivnih rezultatov. Program je primeren za določitev sistemov TA, prisotnih v bakterijskih genomih, na plazmidih in profagih, omejuje pa ga nezmožnost analize fagnih genomov [18].
Primerjava domnevnih sistemov TA, ki jih najdeta programa TASmania in TAfinder pri organizmih Mycobacterium tuberculosis H37Rv, Mycobacterium smegmatis MC2155, Caulobacter crescentus CB15 in Staphylococcus aureus NCTC8325 je pokazala, da program TASmania, poleg večine zadetkov programa TAfinder, predvidi še mnoge druge kandidate. Rezultati, predvideni samo s programom TAfinder, vključujejo proteine brez določitve InterPro, transkripcijske regulatorje, transpozaze in nekarakterizirane proteine.
Ni gotovo, ali TASmania te sisteme TA spregleda ali pa gre le za lažno pozitivne rezultate programa TAfinder [18].
7
2 Namen dela in hipoteza
Pri številnih cianobakterijah najdemo nenavadno veliko sistemov toksin-antitoksin, a so natančneje opisani le redki. Od tega ne odstopa niti cianobakterija Microcystis aeruginosa PCC 7806. Za boljše razumevanje sistemov toksin-antitoksin te cianobakterije smo iz njenega genoma želeli pomnožiti zapisa za dva antitoksina, ju klonirati in izraziti v bakteriji Escherichia coli.
Postavili smo hipotezo, da je v bakteriji Escherichia coli mogoče izraziti in izolirati antitoksina Bh695_0426 in Bh695_0430 cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806.
9
3 Materiali
3.1 Materiali, uporabljeni pri molekulskem kloniranju
3.1.1 Zapisa za antitoksina
Genom cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 nam je služil kot matrica za pomnožitev zapisov dveh antitoksinov. Za PCR-reakcije smo uporabili prekuhane lizate celic te cianobakterije.
Za analizo in določanje genomske lokacije zapisov smo uporabili celotno zaporedje genoma iz podatkovne baze GenBank [20]. Zaporedje ima dostopno kodo CP020771 (Microcystis aeruginosa PCC 7806SL, complete genome) [8].
Gen bh695_0426
Gen bh695_0426 je dolg 207 bp. Na + verigi DNA zapisuje za hipotetični protein Bh695_0426 z dolžino 68 aminokislin. Zaporedje je predstavljeno na sliki 3.1.
Slika 3.1: Nukleotidno zaporedje gena bh695_0426 in prevedeno aminokislinsko zaporedje. Ustvarjeno s programom ApE na podlagi nukleotidnega zaporedja, pridobljenega iz podatkovne baze GenBank [20].
Gen bh695_0430
Gen bh695_0430 je dolg 285 bp. Na + verigi DNA zapisuje za hipotetični protein Bh695_0430 z dolžino 94 aminokislin. Zaporedje je predstavljeno na sliki 3.2.
10
Slika 3.2: Nukleotidno zaporedje gena bh695_0430 in prevedeno aminokislinsko zaporedje. Ustvarjeno s programom ApE na podlagi nukleotidnega zaporedja, pridobljenega iz podatkovne baze GenBank [20].
3.1.2 Oligonukleotidi
Za pomnoževanje genov iz genoma cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 smo načrtali šest oligonukleotidov. Poleg dveh oligonukleotidov za vsakega izmed genov smo načrtali še po dva smerna oligonukleotida za predpripravo matric DNA. V genomu se namreč nahajajo tudi zaporedja z > 90-odstotno identičnostjo tarčnima zaporedjema, na katera se prilegata smerna oligonukleotida. Za nadaljnje raziskave smo načrtali še dva dodatna protismerna oligonukleotida, ki omogočata pomnoževanje izbranih antitoksinov skupaj s pripadajočima toksinoma. Možnosti nastanka lasničnih zank, dimerov in komplementarnost na 3'-regiji oligonukleotidov smo preverili s programom OligoCalc [21]. Kot pozitivno kontrolo pri začetnih pomnoževanjih smo uporabili dva oligonukleotida, s katerima smo pomnožili gen ipf_1067, ki zapisuje za antitoksin Ipf_1067 cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806.
Za preverjanje uspešnosti nastanka željenih rekombinantnih konstruktov smo uporabili štiri predhodno pripravljene oligonukleotide, ki so se prilegali na klonirni oziroma ekspresijski vektor.
Zaporedja oligonukleotidov so prikazana spodaj. Z zeleno barvo so označena prepoznavna zaporedja za restrikcijske endonukleaze, podčrtani deli zaporedja pa se prilegajo na matrico.
11
MazE_FW (Sigma-Aldrich)
5'-CCGCGCCATGGGCAAACAAGTTATCAAAAATATTAAGGT-3' Tm = 64,5 °C
Smerni oligonukleotid se prilega na 5'-regijo gena bh695_0426. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo NcoI.
MazE_RV (Sigma-Aldrich)
5'-CGCGCTCGAGGGATTCATCTACTAATACTTCTG-3' Tm = 62 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na 3'-regijo gena bh695_0426. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo XhoI.
MazE_FW_E (Sigma-Aldrich)
5'-AATCGTGATTACTTCCCCTAAC-3' Tm = 62 °C
Smerni oligonukleotid se v celoti prilega na del zaporedja genoma Microcystis aeruginosa PCC 7806 282 nukleotidov navzgor od gena bh695_0426. V kombinaciji z oligonukleotidom MazE_RV smo ga uporabili pri pripravi matrice DNA, iz katere smo nato pomnožili gen bh695_0426.
MazEF_RV (Sigma-Aldrich)
5'-CGGCCTCGAGAAAAATTCTCAGGGACACTAGAA-3' Tm = 64,4 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na 3'-regijo gena bh695_0427. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo XhoI. V kombinaciji z oligonukleotidom MazE_FW omogoča pomnoževanje genov bh695_0426 in bh695_0427.
YefM_FW (Sigma-Aldrich)
5'-ACGCCATGGCGTTAAGCAAAGAAACCACCTACTC-3' Tm = 64 °C
Smerni oligonukleotid se prilega na 5'-regijo gena bh695_0430. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo NcoI.
12
YefM_RV (Sigma-Aldrich)
5'-GCAGCTCGAGGGACTCAATTCCTAACTCCCC-3' Tm = 64 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na 3'-regijo gena bh695_0430. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo XhoI.
YefM_FW_E (Sigma-Aldrich)
5'-TTGGTAGCCATCTGAAAAATCC-3' Tm = 62 °C
Smerni oligonukleotid se v celoti prilega na del zaporedja genoma Microcystis aeruginosa PCC 7806 269 nukleotidov navzgor od gena bh695_0430. V kombinaciji z oligonukleotidom YefM_RV smo ga uporabili pri pripravi matrice DNA, iz katere smo nato pomnožili gen bh695_0430.
YefYoe_RV (Sigma-Aldrich)
5'-GGCACTCGAGGCCTGATTGATAATGATAGCGA-3' Tm = 64,4 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na 3'-regijo gena bh695_0431. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo XhoI. V kombinaciji z oligonukleotidom YefM_FW omogoča pomnoževanje genov bh695_0430 in bh695_0431.
Ipf_1067_F (Sigma-Aldrich)
5'-TACTCGAGTGGCTCAATCAGTCGTC-3' Tm = 69,5 °C
Smerni oligonukleotid se prilega na 5'-regijo gena ipf_1067. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo XhoI. V kombinaciji z oligonukleotidom Ipf_1067_R smo ga uporabili za pomnoževanje gena ipf_1067, ki nam je služil kot pozitivna kontrola.
Ipf_1067_R (Sigma-Aldrich)
5'-GACCATGGGATCAATTGAGCAACTGA-3' Tm = 72,5 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na 3'-regijo gena ipf_1067. Vsebuje prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo NcoI. V kombinaciji z oligonukleotidom Ipf_1067_F smo ga uporabili za pomnoževanje gena ipf_1067, ki nam je služil kot pozitivna kontrola.
13
pJET1.2_FW (Thermo Scientific)
5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' Tm = 74 °C
Smerni oligonukleotid se prilega na del zaporedja vektorja pJET1.2/blunt v območju gena eco47IR. V kombinaciji z oligonukleotidom pJET1.2_RV smo ga uporabili pri preverjanju uspešnosti vnosa zapisov za antitoksina v vektor pJET1.2/blunt.
pJET1.2_RV (Thermo Scientific)
5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' Tm = 68 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na del zaporedja vektorja pJET1.2/blunt v območju gena eco47IR. V kombinaciji z oligonukleotidom pJET1.2_FW smo ga uporabili pri preverjanju uspešnosti vnosa zapisov za antitoksina v vektor pJET1.2/blunt.
preT7 (Thermo Scientific)
5'-CAGCAACCGCACCTGTG-3' Tm = 58 °C
Smerni oligonukleotid se prilega na del zaporedja vektorja pET-28b(+). V kombinaciji z oligonukleotidom T7_term smo ga uporabili pri preverjanju uspešnosti vnosa zapisov za antitoksina v vektor pET-28b(+).
T7_term (Thermo Scientific)
5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3' Tm = 57 °C
Protismerni oligonukleotid se prilega na del zaporedja vektorja pET-28b(+). V kombinaciji z oligonukleotidom preT7 smo ga uporabili pri preverjanju uspešnosti vnosa zapisov za antitoksina v vektor pET-28b(+).
14
3.1.3 Vektorja
Pri delu smo uporabljali dva vektorja, in sicer klonirni vektor pJET1.2/blunt ter ekspresijski vektor pET-28b(+).
pJET1.2/blunt
pJET1.2/blunt je 2974 bp dolg klonirni vektor z velikim številom kopij na celico. Vsebuje zapis za β-laktamazo, kar zagotavlja odpornost celic s pJET1.2/blunt na antibiotik ampicilin. Podvojevanje plazmida omogoča mesto začetka podvojevanja iz plazmida pMB1. Pozitivna selekcija celic, ki plazmid sprejmejo, je zagotovljena s prisotnostjo gena eco47IR. Ta zapisuje za restrikcijsko endonukleazo Eco47I, ki DNA reže znotraj prepoznavnega zaporedja GGWCC. Prepisovanje eco47IR uravnavata laktozni promotor PlacUV5 in laktozni operator z vezavnim mestom za represor LacI. Na plazmidu je prisoten še promotor T7 za bakteriofagno DNA-polimerazo T7, ki omogoča prepisovanje vključka in vitro. Znotraj multiplega klonirnega mesta so prepoznavna mesta za restrikcijske endonukleaze, s katerimi lahko vektor pripravimo za vnos željenega vključka. Tega pa lahko vnesemo tudi z ligacijo preko topih koncev linearnega vektorja pJET1.2/blunt.
Glavni elementi vektorja pJET1.2/blunt so shematsko prikazani na sliki 3.3.
Slika 3.3: Plazmidna karta pJET1.2/blunt. Vektor vsebuje mesto začetka podvojevanja (ori), multiplo klonirno mesto (MCS), operator lac, promotor lac UV5, promotor T7, promotor AmpR, zapis za restrikcijsko endonukleazo Eco47I (eco47IR) in zapis za β- laktamazo (AmpR). Ustvarjeno s programom SnapGene [22] na podlagi vektorskega zaporedja [23].
15
pET-28b(+)
pET-28b(+) je 5368 bp dolg ekspresijski fagmid. Vsebuje zapis za odpornost proti antibiotiku kanamicinu. Prisotno je mesto začetka podvojevanja fagmida in mesto začetka podvojevanja iz nitastega faga f1, ki omogoča sintezo enoverižne DNA. Gen rop zapisuje protein Rop, ki deluje kot modulator RNA I in tako sodeluje pri ohranjanju nizkega števila kopij plazmida na celico [24]. Na vektorju sta zapisani tudi N-končna in C-končna histidinska oznaka, ki omogočata lažjo izolacijo rekombinantnega proteina. Prepoznavno mesto za trombin omogoča odstranitev N-končne histidinske oznake. Vključek smo v vektor vstavili preko prepoznavnih zaporedij za restrikcijski endonukleazi NcoI in XhoI.
Za izražanje vključenega gena je ključnega pomena promotor iz bakteriofaga T7, na katerega se veže RNA-polimeraza T7. Uravnavanje izražanja omogoča represor LacI, ki se veže na laktozni operator. Ob dodatku induktorja, kot je IPTG, se LacI sprosti z operatorja in prepisovanje steče. Glavni elementi vektorja pET-28b(+) so shematsko prikazani na sliki 3.4.
Slika 3.4: Vektorska karta pET-28b(+). Vektor vsebuje bakterijsko mesto začetka podvojevanja (ori), mesto začetka podvojevanja iz nitastega faga f1 (f1 ori), multiplo klonirno mesto (MCS), mesto vezave ribosoma (RBS), operator lac, promotor T7, promotor lacI, terminator T7, zapise za prepoznavno mesto za trombin, dve histidinski oznaki in za protein Rop, represor LacI ter odpornost proti antibiotiku kanamicinu (KanR). Prikazani sta tudi lokaciji prepoznavnih zaporedij za restrikcijski endonukleazi NcoI in XhoI. Ustvarjeno s programom SnapGene [22] na podlagi vektorskega zaporedja [25].
16
3.1.4 Encimi DNA-polimeraze
Pri pripravi vključkov z zapisoma za antitoksina smo uporabljali termostabilno DNA-polimerazo Phusion (Thermo Scientific). Ta ima poleg DNA-polimerazne aktivnosti 5'-3' tudi eksonukleazno aktivnost 3'-5', ki omogoča kontrolno branje. Hitrost pomnoževanja pri 72 °C je do 4000 nukleotidov na minuto. Amplikoni imajo po koncu pomnoževanja tope konce [26]. Reakcijske mešanice za PCR so poleg DNA-polimeraze Phusion vsebovale še kompatibilni pufer 5× Phusion High Fidelity s 7,5 mM MgCl2
(Thermo Scientific), 10 mM mešanico dNTP (Thermo Scientific), matrico DNA in smerni ter protismerni oligonukleotid.
Rekombinantno DNA-polimerazo Taq (Thermo Scientific) smo uporabili pri izvedbi PCR na osnovi kolonije. Je termostabilna DNA-polimeraza z neaktivno eksonukleazno domeno 3'-5'. Hitrost pomnoževanja pri 72 °C je do 1000 nukleotidov na minuto.
Amplikoni imajo po koncu pomnoževanja dodatni timin na 3'-koncih [27]. Reakcijske mešanice za PCR na osnovi kolonije so poleg DNA-polimeraze Taq vsebovale še kompatibilni 10× Taq-polimerazni pufer z (NH4)2SO4 (Thermo Scientific), 25 mM MgCl2
(Thermo Scientific), 10 mM mešanico dNTP (Thermo Scientific), matrico DNA in smerni ter protismerni oligonukleotid.
Reakcije so potekale v aparaturah za PCR GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) in Veriti 96 well thermal cycler (Applied Biosystems).
Restrikcijski endonukleazi
Uporabljeni restrikcijski endonukleazi sta navedeni v tabeli 3.1. Kot reakcijski pufer smo izbrali 2× pufer Tango (Thermo Scientific), saj je kompatibilen z obema restrikcijskima endonukleazama. Restrikcijske mešanice smo inkubirali v suhi kopeli Mini Dry Bath Incubator (Starlab).
Tabela 3.1: Uporabljeni restrikcijski endonukleazi in njune lastnosti. Puščici označujeta mesti cepitve DNA.
Restrikcijska endonukleaza
Koncentracija [U/μl]
Prepoznavno zaporedje z označenim mestom cepitve
NcoI (Thermo Scientific) 10 5'-C↓C A T G G-3' 3'-G G T A C↑C-5' Xhol (Thermo Scientific) 10 5'-C↓T C G A G-3'
3'-G A G C T↑C-5'
17
DNA-ligaza
Pri ligaciji smo uporabili bakteriofagno DNA-ligazo T4 (Thermo Scientific) s priloženim reakcijskim pufrom iz kompleta reagentov CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific).
3.1.5 Materiali za izvedbo agarozne gelske elektroforeze
Za pripravo gelov smo uporabljali agarozo (Sigma-Aldrich), 1× pufer TAE (40 mM pufer Tris, 20 mM ocetna kislina, 1 mM EDTA, pH = 8,0) in etidijev bromid (Sigma-Aldrich).
Pred nanosom vzorcev na gel smo jim dodali nanašalni pufer TriTrack DNA Loading Dye (Thermo Fischer). Elektroforezo smo izvajali v elektroforeznih kadičkah različnih velikosti Owl EasyCast (Thermo Scientific). Napetost smo zagotovili z napajalnikom Biometra Power Pack P25 (Biometra). Agarozne gele smo osvetlili in slikali s transiluminatorjem MiniBIS Pro (DNR Bio-Imaging Systems).
Za določitev velikosti fragmentov DNA smo uporabili dve velikostni lestvici, prikazani na sliki 3.5:
• GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100–1000 bp (Thermo Scientific) in
• GeneRuler 1 kb DNA Ladder, 250–10.000 bp (Thermo Scientific).
Slika 3.5: Velikostni lestvici za AGE. (1) GeneRuler 100 bp DNA Ladder, za ločevanje fragmentov velikosti 100–1000 bp, na 1,7-odstotnem agaroznem gelu [28]. (2) GeneRuler 1 kb DNA Ladder, za ločevanje fragmentov velikosti 250–10.000 bp, na 1-odstotnem agaroznem gelu [29].
18
3.1.6 Kompleti reagentov
Pri delu smo uporabili dva kompleta reagentov, in sicer:
• GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) – za izolacijo plazmidne DNA iz prekonočnih kultur bakterijskih celic in
• E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (Omega Bio-tek) – za izolacijo DNA iz agaroznega gela.
3.1.7 Ostala laboratorijska oprema
Pri pripravi vzorcev so bile nepogrešljive pipete Eppendorf Research (Eppendorf), centrifugi Centrifuge 5424 R (Eppendorf) in Centrifuge 5415 R (Eppendorf) ter vibracijski mešalnik Vibromax 10 (Tehtnica). Deionizirano vodo smo pridobivali z deionizatorjem vode Mili-Q Integral 15 (Millipore). Koncentracije vzorcev DNA smo merili s spektrofotometrom NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).
3.2 Materiali pri delu z bakterijskimi celicami
3.2.1 Bakterijske celične linije
Pri delu smo uporabljali dva različna seva bakterije Escherichia coli, in sicer XL1-Blue ter BL21[DE3].
Escherichia coli XL1-Blue
XL1-Blue je klonirni sev, ki se uporablja pri pripravi večjih količin vektorske DNA za kasnejšo izolacijo. Sev ne vsebuje endonukleaze EndA ter rekombinaze RecA, kar poveča stabilnost vnesene plazmidne DNA [30].
Escherichia coli BL21[DE3]
BL21[DE3] je ekspresijski sev, ki se uporablja pri izražanju rekombinantnih genov.
Vsebuje profag lambda DE3 z genom, ki zapisuje RNA-polimerazo T7. Ta je pod nadzorom laktoznega promotorja lacUV5, kar omogoča indukcijo izražanja ob dodatku IPTG. Sev ne vsebuje proteaz Lon in OmpT, kar zmanjša verjetnost razgradnje rekombinantnih proteinov [31].
19
3.2.2 Gojišča
Pri delu smo uporabljali več različnih tekočih in trdnih gojišč, ki so navedena v tabeli 3.2.
Vsa so temeljila na osnovi lizogenega gojišča (LB), ki ga sestavljajo kazeinski hidrolizat (Sigma-Aldrich), kvasni ekstrakt (Sigma-Aldrich), NaCl (Gram-Mol), agar (Sigma- Aldrich) in dH2O. Pri delu smo uporabili dva antibiotika, in sicer ampicilin (Thermo Scientific) ter kanamicin (Thermo Scientific).
Tabela 3.2: Selekcijska gojišča in končne koncentracije dodanih antibiotikov.
Selekcijsko gojišče Končna koncentracija dodanega
antibiotika
LB (tekoče) /
LBA (tekoče in trdno) 50 μg/ml ampicilina LBK (tekoče in trdno) 50 μg/ml kanamicina
3.2.3 Ostala laboratorijska oprema
Prekonočne kulture smo inkubirali v stresalniku Orbital Incubator (Sanyo). Za inkubacijo trdnih gojišč smo uporabili inkubator BD 115 (Binder).
21
4 Metode
4.1 Bioinformacijska analiza
Sisteme TA v genomu cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 smo poiskali s programoma TAfinder in TASmania. Obstaja še program RASTA-Bacteria, a rezultatov tudi po večkratnih vnosih vhodnih podatkov na spletni portal nismo prejeli. Na spletni strani navajajo, da program ni vzdrževan od oktobra 2010, za morebitna vprašanja pa naj naslovimo soavtorja Emerica W. Sevina. Ker odgovora na poslano vprašanje o delovanju programa nismo prejeli, smo ta program opustili.
TAfinder
Ker program TAfinder zahteva vnos anotiranega zaporedja, smo genom cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806 najprej anotirali s programom CDSeasy. Ta nam omogoča identifikacijo protein kodirajočih genov s Prodigalom in osnovno funkcijsko anotacijo z uporabo BLASTP. Genom smo vnesli v obliki FASTA, program pa nam ga je vrnil v obliki stisnjenega dokumenta GenBank. To datoteko smo nato naložili v program TAfinder, ki je poiskal vse sisteme tipa II in nam rezultate podal v obliki tabele.
Delovanje programa je opisano v poglavju 1.3.1.
TASmania
Genom v obliki FASTA smo naložili v program TASmania, izbrali genetski kod za bakterije in arheje ter kot metodo napovedovanja sistemov TA vzeli Prodigal. Program je poiskal vse sisteme TA tipov I–IV v genomu in nam rezultate podal v obliki tabele.
Podrobnejši opis programa je v poglavju 1.3.2.
Vse pridobljene rezultate smo pregledali in natančneje preučili pare TA tipa II, ki sta jih napovedala oba programa. Z uporabo DELTA-BLAST smo preverili, kakšne so podobnost, identičnost in E-vrednost teh zaporedij z zaporedji toksinov oziroma antitoksinov, prisotnih v drugih bakterijah. Po pregledu literature o podobnih parih TA drugih bakterij, smo za nadaljnje delo izbrali dva para TA tipa II.
22
4.2 Delo z nukleinskimi kislinami
4.2.1 Verižna reakcija s polimerazo
Zaporedji z zapisom za izbrana antitoksina smo pomnožili v dveh korakih. Najprej smo pomnožili širša genomska segmenta, ki sta vsebovala zapisa za antitoksina. Kot matrico smo uporabili genomsko DNA cianobakterije Microcystis aeruginosa PCC 7806.
Pomnožena širša segmenta sta nam pri naslednjem koraku služila kot matrična DNA.
Oligonukleotide smo včrtali tako, da smo po PCR-reakciji na 5'-konca zaporedij antitoksinov uvedli prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo NcoI in na 3'-konca zaporedij antitoksinov prepoznavno mesto za restrikcijsko endonukleazo XhoI.
Pred izvedbo reakcij PCR smo pripravili reakcijske mešanice, katerih komponente so navedene v tabeli 4.1. Razlikovale so se v matrični DNA in uporabljenih oligonukleotidih, ki so navedeni v tabeli 4.2. Za PCR smo uporabljali 3-stopenjski temperaturni program, predstavljen v tabeli 4.3.
Tabela 4.1: Komponente mešanice za PCR s pripadajočimi volumni.
Komponenta Volumen [μl]
matrica DNA 0,5
10 mM mešanica dNTP 0,4
5× pufer Phusion High Fidelity s 7,5 mM MgCl2 4,0
10 μM smerni oligonukleotid 1,0
10 μM protismerni oligonukleotid 1,0
DNA-polimeraza Phusion 0,2
dH2O 19,6
Σ 20,0
23
Tabela 4.2: Oligonukleotidi, uporabljeni pri pomnoževanju širših genomskih segmentov, genov za antitoksina in gena ipf_1067.
Oligonukleotidi za pomnoževanje širših genomskih segmentov Smerni
oligonukleotid
Protismerni oligonukleotid
segment z genom bh695_0426 MazE_FW_E MazE_RV
segment z genom bh695_0430 YefM_FW_E YefM_RV
Oligonukleotidi za pomnoževanje genov za antitoksina Smerni
oligonukleotid
Protismerni oligonukleotid
gen bh695_0426 MazE_FW MazE_RV
gen bh695_0430 YefM_FW YefM_RV
Oligonukleotida za pomnoževanje gena pozitivne kontrole Smerni
oligonukleotid Protismerni oligonukleotid
gen ipf_1067 Ipf_1067_F Ipf_1067_R
Tabela 4.3: Temperaturni in časovni program PCR.
Stopnja Temperatura [°C] Čas [min] Število ciklov
začetna denaturacija 98 5:00 1
denaturacija 98 0:30
prileganje 50 0:30 30
podaljševanje 72 1:30
končno podaljševanje 72 5:00 1
shranjevanje 15 ∞
24
4.2.2 Agarozna gelska elektroforeza in detekcija DNA
Glede na pričakovano velikost molekul DNA smo najprej določili željeno zamreženost agaroznega gela. Nato smo izračunali in zatehtali potrebno količino agaroze. To smo raztopili v ustrezni količini 1× pufra TAE s segrevanjem v mikrovalovni pečici.
Raztopino smo ohladili pod tekočo vodo do približno 50 °C in dodali 3 μl etidijevega bromida z masno koncentracijo 10 mg/ml. Celotno raztopino smo vlili v predhodno sestavljen model za vlivanje gelov z vstavljenim plastičnim glavničkom in počakali, da se je gel strdil. Strjen agarozni gel smo prelili z 1× pufrom TAE, vzorce nanesli v žepke in kadičko priključili na vir električne napetosti (7-8 V/cm razdalje med elektrodama). Po končani elektroforezi smo gel opazovali pod UV-svetlobo s transiluminatorjem.
Vzorcem smo pred nanosom na gel dodali ustrezen volumen 6× nanašalnega pufra. Poleg vzorcev smo na gel vedno nanesli tudi ustrezno velikostno lestvico.
4.2.3 Izolacija DNA iz agaroznega gela
Košček agaroznega gela z DNA ustrezne dolžine smo izrezali iz gela s skalpelom in prenesli v mikrocentrifugirko. DNA smo nato izolirali iz gela s kompletom reagentov E.Z.N.A. Gel Extraction Kit.
Košček gela z DNA smo s segrevanjem v suhi kopeli pri 60 °C raztopili v 300 μl vezavnega pufra. Raztopino smo prenesli na kolono s filtrom in centrifugirali (1 minuta, 10.000× g). Filtrat smo zavrgli, na kolono s filtrom pa nanesli še 300 μl vezavnega pufra in centrifugirali (1 minuta, 23.000× g). Filtrat smo ponovno zavrgli, vezano DNA pa dvakrat sprali s 700 μl pufra za spiranje. Po vsakem spiranju smo vzorec še centrifugirali (1 minuta, 23.000× g) in odstranili filtrat. Po drugem spiranju smo kolono z vezano DNA centrifugirali še enkrat (2 minuti, 23.000× g) in se tako znebili preostanka etanola. DNA smo eluirali z dodatkom 20 μl elucijskega pufra, 2-minutno inkubacijo in centrifugiranjem (1 minuta, 23.000× g).
25
4.2.4 Ligacija
Izvedli smo ligacijo preko topih in ligacijo preko lepljivih koncev. V obeh primerih smo uporabili DNA-ligazo T4, ki je bila del kompleta reagentov CloneJET PCR Cloning Kit, in sledili navodilom proizvajalca. Ligacijske mešanice smo inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi pri ligaciji preko topih koncev in 3 ure pri sobni temperaturi pri ligaciji preko lepljivih koncev.
Ligacijo PCR-produktov v lineariziran vektor pJET1.2/blunt smo izvedli preko topih koncev. Pripravljena ligacijska mešanica je predstavljena v tabeli 4.4.
Tabela 4.4: Komponente mešanice za ligacijo preko topih koncev s pripadajočimi volumni.
Komponenta Volumen [μl]
DNA-ligazni pufer T4 5,0
vektor pJET1.2/blunt 0,5
PCR-produkt 4,0
DNA-ligaza T4 (5 U/μl) 0,5
Σ 10,0
Ligacijo vključkov v vektor pET-28b(+) smo izvedli preko lepljivih koncev. Vektor smo predhodno pripravili, kot je opisano v naslednjih podpoglavjih. Molarno razmerje med plazmidno DNA in vključkom je znašalo 1:8. Sestava pripravljenih ligacijskih mešanic je predstavljena v tabeli 4.5.
Tabela 4.5: Komponente mešanice za ligacijo preko lepljivih koncev s pripadajočimi volumni.
Komponenta Volumen [μl]
DNA-ligazni pufer T4 2,0
vektor pET-28b(+) 9,2
vključek 5,4
DNA-ligaza T4 (5 U/μl) dH2O
1,0 2,4
Σ 20,0
26
4.2.5 Izolacija plazmidne DNA
Plazmidno DNA smo izolirali večkrat. Iz celic E. coli XL1-Blue, transformiranih s klonirnim vektorjem pJET1.2-vključek, iz celic E. coli XL1-Blue, transformiranih s praznim ekspresijskim vektorjem pET-28b(+), in iz celic E. coli BL21[DE3], transformiranih z ekspresijskim vektorjem pET-28b(+)-vključek.
Prekonočne kulture celic smo najprej centrifugirali (3 minute, 3000× g) ter odstranili supernatant. Izolacijo smo izvajali po principu alkalne lize bakterijskih celic s kompletom reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Celice v usedlini smo resuspendirali v 250 μl raztopine za resuspenzijo in celotno raztopino prenesli v mikrocentrifugirko. Dodali smo še 250 μl raztopine za lizo ter 350 μl raztopine za nevtralizacijo. Dodatek nevtralizacijske raztopine je omogočil obarjanje genomske DNA, proteinov ter delov celic. Vzorec smo centrifugirali (5 minut, 15.000× g) in bister superantant prenesli na kolono s filtrom.
Vzorec na koloni smo centrifugirali (1 minuta, 15.000× g) in filtrat zavrgli. Kolono smo dvakrat sprali s 500 μl raztopine za spiranje in centrifugirali (1 minuta, 23.000× g) ter filtrata zavrgli. Da smo iz kolone odstranili še preostanek etanola, smo vzorec ponovno centrifugirali (1 minuta, 15.000× g). Plazmidno DNA smo eluirali s 30 μl pufra za elucijo in centrifugiranjem (2 minuti, 15.000× g).
4.2.6 PCR na osnovi kolonije
Po transformaciji celic E. coli XL1-Blue z vektorjem pJET1.2-vključek oziroma BL21[DE3] z vektorjem pET-28b(+)-vključek so na trdnem selekcijskem gojišču zrasle kolonije celic, ki so vektor sprejele. S PCR na osnovi kolonije smo se želeli prepričati, da ti vektorji vsebujejo tudi željene vključke.
Mešanice za PCR na osnovi kolonije so predstavljene v tabeli 4.6. Pri pripravi smo v 0,2-ml mikrocentrifugirke odpipetirali polimerazo Taq, 10× pufer za polimerazo Taq z (NH4)2SO4, MgCl2, mešanico dNTP, smerni in protismerni oligonukleotid. Uporabljeni oligonukleotidi so se prilegali na vektorsko DNA. Za analizo konstruktov pJET1.2-vključek smo uporabili oligonukleotida pJET_FW in pJET_RV, pri pomnoževanju vključkov v vektorju pET-28b(+)-vključek pa oligonukleotida preT7 in T7_term. Na koncu smo dodali še kolonijo celic, ki smo jo s trdnega gojišča v mešanico za PCR na osnovi kolonije prenesli z nastavkom za pipeto. Če je na gojišču zraslo dovolj kolonij, smo PCR-reakcijo za posamezen konstrukt izvedli za pet kolonij. Uporabljeni temperaturni program je predstavljen v tabeli 4.7.
27
Tabela 4.6: Komponente mešanice za PCR na osnovi kolonije in pripadajoči volumni.
Komponenta Volumen [μl]
plazmidna DNA 1 kolonija
10 mM mešanica dNTP 0,2
10× pufer za polimerazo Taq z (NH4)2SO4 1,0
25 mM MgCl2 1,0
10 μM smerni oligonukleotid 0,5
10 μM protismerni oligonukleotid 0,5
DNA-polimeraza Taq 0,1
dH2O 6,7
Σ 10,0
Tabela 4.7: Temperaturni in časovni program PCR na osnovi kolonije.
Stopnja Temperatura [°C] Čas [min] Število ciklov
začetna denaturacija 95 2:00 1
denaturacija 95 0:30
prileganje 55 0:30 25
podaljševanje 72 1:00
končno podaljševanje 72 7:00 1
shranjevanje 15 ∞
4.2.7 Rezanje z restriktazami
Pri rezanju smo uporabljali restrikcijski endonukleazi NcoI in XhoI, s katerima smo rezali konstrukta pJET1.2-vključek in vektor pET-28b(+). Reakcijo smo izvedli z obema restrikcijskima endonukleazama naenkrat. Uporabili smo 2× pufer Tango, saj v njegovi prisotnosti optimalno delujeta obe restrikcijski endonukleazi. Restrikcijske mešanice, katerih sestava je navedena v tabeli 4.8, smo inkubirali 3 ure pri 37 °C.
28
Tabela 4.8: Komponente mešanic za rezanje vektorjev z restrikcijskima endonukleazama NcoI in XhoI.
Rezanje pJET1.2-bh695_0426
Komponenta Volumen [μl]
plazmid pJET1.2-bh695_0426 9,0
2× pufer Tango 12,0
NcoI (10 U/μl) 1,2
XhoI (10 U/μl) 4,7
dH2O 33,1
Σ 60,0
Rezanje pJET1.2- bh695_0430
Komponenta Volumen [μl]
plazmid pJET1.2-bh695_0430 54,0
2× pufer Tango 15,4
NcoI (10 U/μl) 1,4
XhoI (10 U/μl) 5,4
dH2O 0,8
Σ 77,0
Rezanje pET-28b(+)
Komponenta Volumen [μl]
plazmid pET-28b(+) 54,0
2× pufer Tango 15,0
NcoI (10 U/μl) 0,6
XhoI (10 U/μl) 2,2
dH2O 3,2
Σ 75,0
29
4.2.8 Analiza nukleotidnega zaporedja
Določitev nukleotidnega zaporedja vektorjev pJET1.2-bh695_0426 in pJET1.2-bh695_0430 je opravilo podjetje Eurofins Genomics. Sestava pripravljenih mešanic za sekvenciranje je opisana v tabeli 4.9. Določeni nukleotidni zaporedji smo pregledali in ju poravnali z zaporedji ustreznih genov s programom EMBOSS Needle.
Tabela 4.9: Komponente mešanice za določevanje nukleotidnega zaporedja.
Komponenta Volumen [μl]
400 ng pJET1.2-vključek 6,2-7,2
smerni oligonukleotid pJET_FW 2,5
dH2O 0,3-1,3
Σ 10,0
4.3 Delo z bakterijami
4.3.1 Priprava gojišč
Pripravili smo tekoča in trdna gojišča, ki so temeljila na osnovi lizogenega gojišča. Za pripravo tekočega gojišča LB smo v 1 l dH2O raztopili 10 g kazeinskega hidrolizata, 5 g kvasnega ekstrakta in 10 g NaCl. Pri pripravi trdnega gojišča LB smo pred avtoklaviranjem dodali še 20 g agarja. Po sterilizaciji gojišča z avtoklaviranjem smo počakali, da se je to ohladilo na temperaturo pod 50 °C, in nato dodali antibiotik do končne koncentracije 50 μg/ml. Pri pripravi gojišča LBA smo dodali antibiotik ampicilin, pri pripravi gojišča LBK pa antibiotik kanamicin.
4.3.2 Priprava prekonočnih kultur
Pripravili smo prekonočne kulture celic E. coli sevov XL1-Blue in BL21[DE3], in sicer XL1-Blue, transformiranega s pJET1.2-vključek, XL1-Blue, transformiranega s pET-28b(+) ter BL21[DE3], transformiranega s pET-28b(+)-vključek.
S sterilno pipeto za enkratno uporabo smo v epruvete odpipetirali 8 ml ustreznega gojišča:
LBA za celice, transformirane s JET1.2-vključek in LBK, za celice transformirane s pET- 28b(+) oziroma pET-28(+)-vključek. Izbrano kolonijo smo s trdnega selekcijskega gojišča v tekoče gojišče prenesli z nastavkom za pipeto. Epruvete smo inkubirali na stresalniku pri 37 °C čez noč.
30
4.3.3 Transformacija
Kompetentne celice E. coli, ki so shranjene pri –80 °C v alikvotih po 50 μl, smo odtalili na ledu in jim dodali 10 μl mešanice po ligaciji ali 1 μl ustreznega izoliranega vektorja.
Celice smo 30 minut inkubirali na ledu, izvedli toplotni šok v suhi kopeli (45 sekund, 42 °C) in jih 1 minuto hladili na ledu. Aseptično smo jim dodali 800 μl tekočega gojišča LB ter jih inkubirali 1 uro pri 37 °C v suhi kopeli. Po inkubaciji smo celice centrifugirali (3 minute, 3000× g), odpipetirali 600 μl supernatanta ter jih v preostanku resuspendirali.
Suspenzijo smo razmazali na selekcijsko gojišče z ustreznim antibiotikom: LBA po transformaciji E. coli XL1-Blue s pJET1.2-vključek oziroma pET-28b(+) in LBK po transformaciji E. coli BL21[DE3] s pET-28b(+)-vključek. Sledila je inkubacija pri 37 °C čez noč.
31
5 Rezultati
5.1 Bioinformacijska analiza sistemov TA in izbira dveh parov TA
Z uporabo spletnih orodij TAfinder in TASmania smo v genomu Microcystis aeruginosa PCC 7806 poiskali sisteme TA. Program TASmania je predvidel sisteme TA tipov I–IV, TAfinder pa le sisteme TA tipa II.
Program TASmania je napovedal 274 genov TA, in sicer 136 za toksine ter 138 za antitoksine. TAfinder je podal 121 parov TA tipa II, izmed katerih je 35 takih, ki jih program TASmania ni predvidel. Izmed rezultatov, ki sta jih predstavila oba programa, smo izbrali dva različna para TA tipa II, ki sta opisana v nadaljevanju.
Gena bh695_0426 in bh695_0427 naj bi zapisovala za antitoksin in toksin. Spadata v naddružino antitoksinov in toksinov MazEF. Antitoksin MazE in toksin MazF pri bakteriji Escherichia coli tvorita linearni heteroheksamer, sestavljen iz izmenjujočih se homodimerov toksina in antitoksina MazF2-MazE2-MazF2 [32]. Ob razgradnji antitoksina MazE s proteazo ClpPA se toksin MazF sprosti iz kompleksa. V prosti obliki izkazuje ribonukleazno aktivnost, katere točen mehanizem delovanja še ni znan [32].
Gena bh695_0430 in bh695_0431 naj bi zapisovala za antitoksin tipa YefM ter toksin tipa YoeB. Omenjena toksin in antitoksin tvorita hibridni sistem TA, saj YefM spada v naddružino Phd in YoeB v naddružino ParE/RelE [33]. Pri bakteriji Escherichia coli se homodimer antitoksina YefM preko enega izmed C-koncev veže na toksin YoeB, kar povzroči nastanek heterotrimera YefM2-YoeB. V tem kompleksu je toksin neaktiven, njegovo aktivacijo pa povzroči razgradnja antitoksina YefM s proteazo Lon. Prost toksin YoeB deluje kot RNaza, ki zavre iniciacijo prevajanja preko vezave na 70 S ribosom in cepitve mRNA na mestu A [34].
5.2 Rezultati pomnoževanja širših genomskih segmentov
Z reakcijo PCR smo najprej pomnožili širša segmenta genoma Microcystis aeruginosa PCC 7806 v bližini genov bh695_0426 in bh695_0430. Tako smo preprečili sintezo več različnih amplikonov, ki bi nastali zaradi nespecifičnosti smernih oligonukleotidov za pomnoževanje antitoksinov. Dovolj specifičnih začetnih oligonukleotidov, ki bi se vezali izključno na 5'-konec genov, namreč ni bilo mogoče načrtati. Velikosti nastalih produktov smo preverili z AGE na 1,2-odstotnem agaroznem gelu, prikazanem na sliki 5.1.
32
Slika 5.1: Pomnožena širša genomska segmenta, ki vključujeta zapis za (A) antitoksin Bh695_0430 oziroma (B) antitoksin Bh695_0426, po elektroforezi na 1,2-odstotnem agaroznem gelu. (A1) in (B1) Lestvica DNA velikosti 250–10.000 bp. (A2) in (B2) Pomnoženi gen ipf_1067, ki predstavlja pozitivno kontrolo. (A3) Pomnoženi genomski segment, ki vsebuje gen bh695_0430. (B3) Pomnoženi genomski segment, ki vsebuje gen bh695_0426.
Pozitivno kontrolo je predstavljal pomnoženi gen ipf_1067, katerega dolžina je ustrezala predvideni vrednosti 240 bp. Na ta način smo se prepričali v ustreznost matrice DNA, pufra, dNTP in v delovanje polimeraze Phusion. Pri dolžini, ki ustreza velikosti pod 250 bp, najverjetneje opazimo dimere začetnih oligonukleotidov. Pri pomnoževanju genomskega segmenta z zapisom za antitoksin Bh695_0430 sta nastala dva produkta.
Močnejša lisa s produktom, dolgim okoli 800 bp, predstavlja segment z zapisom za Bh695_0430. Velikost se namreč sklada s pričakovano dolžino pomnožka, ki znaša 871 bp. Opazna je tudi mnogo šibkejša lisa s produktom, dolgim okoli 400 bp. Velikost pomnoženega genomskega segmenta z zapisom za antitoksin Bh695_0426, ki znaša okoli 1000 bp, ustreza pričakovani dolžini 1017 nt. Razlike v množini produktov na sliki 6 A in B so posledica nanosa enkrat večjega volumna reakcijskih mešanic na agarozni gel v primeru gela na sliki 6 B.
Lisi z vzorcema ustreznih dolžin smo izrezali in DNA izolirali iz agaroznega gela.
Izolirani DNA genomskih segmentov sta nam v nadaljevanju predstavljali matrico za pomnoževanje zapisov za antitoksina.
33
5.3 Rezultati pomnoževanja zapisov za antitoksina
Z reakcijo PCR smo pomnožili zapisa za antitoksina, pri čemer smo kot matrični DNA uporabili prej pomnožena širša genomska segmenta. Velikosti nastalih produktov smo preverili z AGE na 1,5-odstotnem agaroznem gelu, prikazanem na sliki 5.2.
Slika 5.2: Pomnožena zapisa za antitoksin Bh695_0430 in antitoksin Bh695_0426 po elektroforezi na 1,5-odstotnem agaroznem gelu. (1) Lestvica DNA velikosti 100–
1000 bp. (2) Pomnoženi gen ipf_1067, ki predstavlja pozitivno kontrolo. (3) Pomnoženi gen za antitoksin Bh695_0430. (4) Pomnoženi gen za antitoksin Bh695_0426.
Dolžina pomnožene DNA pozitivne kontrole je ustrezala predvideni dolžini 240 bp.
Opazimo lahko še dve šibki lisi in dimere začetnih oligonukleotidov. Velikosti pomnoženih genov za antitoksina se ujemata s pričakovanimi dolžinami, ki znašata 300 bp za gen bh695_0430 in 224 bp za gen bh695_0426.
Lisi s pomnožkoma genov za antitoksina smo izrezali iz agaroznega gela in po izolaciji uporabili v nadaljnjih stopnjah molekulskega kloniranja.
34
5.4 Analiza plazmidne DNA transformant klonirnega seva
PCR-produkta izolirana iz agaroznega gela smo ligirali v vektor pJET1.2-blunt preko topih koncev in z nastalimi konstrukti transformirali celice Escherichia coli XL1-Blue.
Po prekonočni inkubaciji so na ploščah LBA zrasle celice, ki so vektor sprejele. Na vsaki izmed plošč je zraslo približno deset kolonij. Ker smo se želeli prepričati, da te celice vsebujejo vektor z ustreznim vključkom, smo izvedli še PCR na osnovi kolonije. PCR- reakcije smo izvedli za pet kolonij z vsakim od vektorskih konstruktov in pomnožke analizirali z AGE na 1,5-odstotnem agaroznem gelu, prikazanem na sliki 5.3.
Slika 5.3: Pomnoženi del vektorja pJET1.2 z vstavljenim genom za antitoksin Bh695_0430 oziroma antitoksin Bh695_0426 po elektroforezi na 1,5-odstotnem agaroznem gelu. (1) Lestvica DNA velikosti 100–1000 bp. (2-6) Pomnoženi del vektorja pJET1.2 z vstavljenim zapisom za Bh695_0430. (7-11) Pomnoženi del vektorja pJET1.2 z vstavljenim zapisom za Bh695_0426.
Velikosti vseh pomnožkov dela vektorja pJET1.2 z vstavljenim zapisom za Bh695_0430 so bile okoli 400 bp, kar se ujema s pričakovano dolžino 419 bp. Velikosti vseh pomnožkov dela vektorja pJET1.2 z vstavljenim zapisom za Bh695_0426 pa so znašale okoli 325 bp, kar se ujema s pričakovano dolžino 343 bp. Iz teh rezultatov smo predvidevali, da v vseh analiziranih kolonijah celice vsebujejo vektor z ustreznim vključkom. Poleg lis amplikonov na gelu opazimo še širše in manj intenzivne lise z DNA dolžin 100–200 bp. Te lise najverjetneje predstavljajo dimere začetnih oligonukleotidov.
Analizi pomnožkov z AGE je sledila priprava prekonočnih kultur, iz katerih smo naslednji dan izolirali plazmidno DNA. Izolirano DNA smo nato uporabili za rezanje z restrikcijskima endonukleazama in za preverjanje nukleotidnega zaporedja vključkov.
35
5.5 Rezultati preparativnih restrikcijskih reakcij
Z rezanjem smo vektor pET-28b(+) in vključka pripravili za ligacijo preko lepljivih koncev. Pri reakciji smo sočasno uporabili restrikcijski endonukleazi NcoI in XhoI.
Nastale fragmente smo ločili z AGE na 1,4-odstotnem agaroznem gelu, prikazanem na sliki 5.4. Pričakovane dolžine fragmentov po rezanju pa so navedene v tabeli 5.1.
Slika 5.4: Rezanje vektorjev pET-28b(+), pJET1.2-bh695_0426 in pJET1.2- bh695_0430 z NcoI in XhoI po elektroforezi na 1,4-odstotnem agaroznem gelu. (A1) in (B1) Lestvica DNA velikosti 250–10.000 bp. (A2) Rezan vektor pET-28b(+). (A3-A4) Rezan vektor pJET1.2-bh695_0426. (B2-B3) Rezan vektor pJET1.2/blunt-bh695_0430.
Tabela 5.1: Pričakovane dolžine fragmentov po rezanju z NcoI in XhoI za posamezen vektor. Podčrtane vrednosti predstavljajo pričakovane dolžine fragmentov, ki smo jih uporabili pri ligaciji.
Vektor Pričakovane dolžine rezanih
fragmentov [bp]
pET-28b(+) 5231 in 137
pJET1.2-bh695_0426 2918, 209, 46 in 25
pJET1.2-bh695_0430 2918, 287, 46 in 23
36
Dolžina dobljenega fragmenta vektorja pET-28b(+) se načeloma ujema s pričakovano dolžino, a tega ne moramo trditi z gotovostjo, saj je ločba v tem območju velikosti slaba, razlika v dolžini enkrat oziroma dvakrat rezanega vektorja pa znaša le 137 bp. Pri vzorcu rezanega vektorja pJET1.2-bh695_0426 lisa s fragmentom dolžine okoli 3000 bp predstavlja rezan vektor pJET1.2, lisa s fragmentom dolžine okoli 200 bp pa predstavlja izrezan vključek z genom bh695_0426. Poleg lis s fragmenti pričakovanih dolžin, opazimo še dodatno liso velikosti okoli 1700 bp. Pri vzorcu rezanega vektorja pJET1.2- bh695_0430 na gelu opazimo, da se velikost spodnje lise sklada s pričakovanji, velikost fragmenta zgornje lise pa je okoli 3500 bp, kar je več kot bi pričakovali za rezan vektor.
Zaradi zelo slabe intenzitete lise s fragmentom dolžine okoli 300 bp in neujemanja velikosti druge lise s pričakovanji, ne moremo z gotovostjo trditi, da je prišlo do želenega rezanja. Za vse vzorce velja, da fragmentov, krajših od 200 bp, na agaroznem gelu ne opazimo, saj so ti tako kratki, da so že med elektroforezo stekli skozi gel.
Liso z vektorjem pET-28b(+) ter lise z vključkoma bh695_0426 in bh695_0430 smo izrezali in izolirali iz agaroznega gela ter kasneje uporabili pri reakciji ligacije.
5.6 Analiza plazmidne DNA transformant ekspresijskega seva
Vključka z zapisom za antitoksin bh695_0426 oziroma bh695_0430 smo ligirali v rezan vektor pET-28b(+) preko lepljivih koncev. Sledila je transformacija celic Escherichia coli BL21[DE3] z nastalimi konstrukti. Po transformaciji smo suspenziji celic razmazali na plošči LBK. Ti smo najprej dva dni inkubirali pri sobni temperaturi, nato en dan pri 37 °C ter na koncu, ker kolonij še nismo videli, še tri dni pri sobni temperaturi. Na gojišču s celicami, transformiranimi s pET-28b(+)-bh695_0426, sta zrasli dve koloniji. S PCR na osnovi kolonije smo želeli preveriti, ali vsebujeta vektor z vključkom ali samo prazen vektor. Reakcijski mešanici smo po izvedbi PCR nanesli na 1,5-odstoten agarozni gel in izvedli AGE. Rezultat je prikazan na sliki 5.5.
