BIOTEHNOLOŠKI PRISTOPI ZA POVEČANJE FOTOSINTEZNE UČINKOVITOSTI RASTLIN

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Mateja ŠOBAR

BIOTEHNOLOŠKI PRISTOPI ZA POVEČANJE FOTOSINTEZNE UČINKOVITOSTI RASTLIN

DIPLOMSKO DELO

Univerzitetni študij

^–

1. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE

Mateja ŠOBAR

BIOTEHNOLOŠKI PRISTOPI ZA POVEČANJE FOTOSINTEZNE UČINKOVITOSTI RASTLIN

DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij – 1. stopnja

BIOTECHNOLOGICAL APPROACHES TO INCREASE PLANT PHOTOSYNTHESIS EFFICIENCY

B. SC. THESIS Academic Study Programmes

Ljubljana, 2021

(3)

Šobar M. Biotehnološki pristopi za povečanje fotosintezne učinkovitosti rastlin.

Dipl. delo (UN). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, 2021

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.

Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Jerneja Jakšeta.

Komisija za oceno in predstavitev:

Predsednik: prof. dr. Polona JAMNIK

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Jernej JAKŠE

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Minja ZORC

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko

Datum predstavitve: 3.9.2021

(4)

III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1

DK UDK 602.6:582.5/.9:581.132(043.2)

KG fotosinteza, fotorespiracija, Calvinov cikel, biotehnološki pristopi AV ŠOBAR, Mateja

SA JAKŠE, Jernej (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija

LI 2021

IN BIOTEHNOLOŠKI PRISTOPI ZA POVEČANJE FOTOSINTEZNE UČINKOVITOSTI RASTLIN

TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij – 1. stopnja) OP VIII, 17 str., 7 sl., 40 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Zaradi vse večjega naraščanja svetovne populacije, so potrebe po hrani vse večje.

Povpraševanje po hrani presega donos, kar se zgodi, ko produktivnost pridelkov stagnira ali pa se upočasnjuje. Kaže se velik potencial za pomanjkanje primarnih živil do sredine stoletja. Velika uporaba pesticidov, gnojil in namakanje, kar je že povzročilo povečanje produktivnosti, so za zadaj v veliki meri optimizirani in verjetno ne bodo ustvarili zadostnega donosa, da bi zadovoljili povpraševanje po več. Učinkovitost fotosinteze pa ostaja odločilen potencial za izboljšave in podvojitev produktivnosti. Fotosinteza, ki se je pri pridelkih že nekoliko izboljšala, je ključna pot za povečanje donosa. Zato je potrebno pravočasno pospešiti razumevanje fotosinteznega procesa, da bi omogočili izboljšave vodene z genskim inženiringom. Diplomsko delo obsega znanstveno podprte ugotovitve možnih biotehnoloških pristopov, ki bi izboljšali fotosintezno učinkovitost rastlin, kot je CCM mehanizem, povečano izražanje nekaterih encimov, kot sta SBPaza in FBPaza, vgradnja C4 fotosintezne poti v C3 rastline in dodajanje glikolatnega metabolizma.

(5)

IV

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1

DC UDC 602.6:582.5/.9:581.132(043.2)

CX photosynthesis, photorespiration, Calvin cycle, biotechnological approaches AU ŠOBAR, Mateja

AA JAKŠE, Jernej (supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology

PY 2021

TI BIOTECHNOLOGICAL APPROACHES TO INCREASE PLANT PHOTOSYNTHESIS EFFICIENCY

DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VIII, 17 p., 7 fig., 40 ref.

LA sl AL sl/en

AB Due to the growing global population, food needs are increasing. Demand for food exceeds return, which happens when crop productivity stagnates or slows down. There’s a great potential for primary food shortages by the middle of the century. High use of pesticides, fertilizers and irrigation, which has already led to increased productivity, are largely optimized and are unlikely to generate sufficient returns to meet the demand for more. However, the efficiency of photosynthesis remains a decisive potential for improvements and doubling productivity. Photosynthesis, which has already improved slightly in crops, is a key approach to increase returns. Therefore, it is necessary to accelerate the understanding of the photosynthetic process in a timely manner to allow genetically engineered improvements. The thesis includes scientifically supported findings of possible biotechnological approaches that would improve the photosynthetic efficiency of plants, such as CCM mechanism, increased expression of certain enzymes such as SBP and FBP, incorporation of C4 photosynthetic pathway into C3 plants and adding of glycolate metabolism.

(6)

V

KAZALO VSEBINE

Str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ...III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... VII

1 UVOD ...1

2 O FOTOSINTEZI ... 1

2.1 SVETLOBNE REAKCIJE ... 2

2.2 TEMOTNE REAKCIJE (CALVINOV CIKEL) ... 2

3 FOTORESPIRACIJA ... 2

3.1 TOKSIČNI UČINKI FOTORESPIRATORNIH PRODUKTOV ... 3

4 PRISTOPI ZA POVEČANJE FOTOSINTEZNE UČINKOVITOSTI ... 3

4.1 POVEČANA AKTIVNOST SBP in FBP ... 4

4.1.1 Povečana aktivnost SBPaze in FBPaze v tobaku ... 4

4.1.2 Povečana aktivnost SBPaze v paradižniku ... 5

4.2 POVEČANA AKTIVNOST ictB ... 6

4.3 CCM MEHANIZEM ... 7

4.4 VGRADNJA FOTOSINTETSKE POTI C4 V C3 RASTLINE ... 8

4.4.1 C3 fotosinteza ... 8

4.4.2 C4 fotosinteza ... 8

4.5 DODAJANJE GLIKOLATNEGA METABOLIZMA ... 11

4.5.1 Dodajanje glikolatnega metabolizma v tobak ... 11

4.5.2 Vnos katabolne poti glikolata E. coli v Arabidopsis thaliana ... 13

4.5.3 Vnos katabolne poti glikolata E. coli v krompir ... 13

5 ZAKLJUČEK ... 14

6 VIRI ... 14

(7)

VI

KAZALO SLIK

Str.

Slika 1:Shematski prikaz fotorespiracije in Calvinovega cikla (prirejeno po Raines, 2006). ... 3 Slika 2: Fenotip divjega tipa in transgenih rastlin tobaka. (A) cele rastline, (B) četrti list z vrha, (C) korenine. Rastline gojene 12 tednov. TpS- transgene rastline tobaka, ki imajo izraženo SBPazo zelenih alg Chlamydomonas v kloroplastih. TpF-transgene rastline tobaka, ki imajo izraženo cianobakterijsko FBPazo v kloroplastih (prirejeno po Tamoi in sod., 2006). ... 5 Slika 3: Pristop za namestitev cianobakterijskih bikarbonatnih transporterjev, kodiranih z jedrskim genomom, v IEM kloroplastov v kopenskih rastlinah (Povzeto po Uehara in sod., 2016)... 8 Slika 4: Fotosinteza C4 (prirejeno po Kajala in sod., 2011) ... 9 Slika 5: Fotorespiratorne alternativne poti 1. rdeča,, 2. temno modra, 3. svetlo modra, ki so bile vnesene v kloroplaste tobaka za učinkovitejše recikliranje glikolata. RNAi konstrukt za znižano izražanje PLGG1 transporterja za zmanjšan transport glikolata iz alternativne v naravno pot-siva (prirejeno po South in sod., 2019). ... 11 Slika 6: (A) Fenotip 6 tednov starih rastlin AP3 in WT, gojenih v rastlinjaku. (B) Odstotna razlika v skupni masi suhe biomase navedenih linij (prirejeno po South in sod., 2019). ... 12 Slika 7: Vpliv DEFp na fenotip krompirja: (a) fenotip 8 tednov stare rastline divjega tipa in dveh transgenih linij z izraženim DEFp, (b) fenotip gomoljev rastline divjega tipa in dveh transgenih linij z izraženim DEFp (prirejeno po Nölke in sod., 2014). ... 13

(8)

VII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ATP - adenozin trifosfat (angl. adenosine triphosphate)

NADPH - nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (angl. nicotinamide adenine dinucleotide) PSI - fotosistem I (angl. photosystem I)

PSII - fotosistem II (angl. photosystem II)

RuBP - ribuloza-1,5-bifosfat (angl. ribulose-1,5-bisphosphate)

SBP - sedoheptuloza-1,7-bifosfataza (angl. sedoheptulose-1,7-bisphosphatase) FBP - fruktoza-1,6-bifosfataza (angl. fructose-1,6-bisphosphatase)

3-PGA - 3-fosfoglicerinska kislina (angl. 3-phosphoglyceric acid) 2-PG - 2-fosfoglikolat (angl. 2-phospoglycolate)

DHAP - dihidroksiaceton fosfat (angl. dihydroxyacetone phosphate) CA - ogljikova anhidraza (angl. carbonic anhydrase)

CCM - mehanizem za koncentriranje ogljika (angl. CO2 concentrating mechanisms) PEP - fosfoenolpiruvat (angl. phospoenolpyruvate)

PEPC - fosfoenolpiruvat karboksilaza (angl. phospofenolpyruvate carboxylase) NADP-ME - od NADP odvisni malični encim (angl. NADP-malic enzyme)

PEPCK - fosfoenolpiruvat karboksikinaza (angl. phospoenolpyruvate carboxykinase) MDH - malat dehidrogenaza (angl. malate dehydrogenase)

PPDK - ortofosfat dikinaza (angl. orthophospate dikinase) M - celice mezofila (angl. mesophyll cells)

BS - specializirane celice okoli listnih žil (angl. bundle sheath cells)

Rubisco - ribuloza-1,5-bifosfat karboksilaza/oksigenaza (angl. ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase

CaMV35S - promotor iz virus cvetačnega mozaika 35S (angl. cauliflower mosaic virus promotor) PCR - verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction)

qRT-PCR - kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (angl. quantittive real-time polymerase chain reaction)

ictB - bikarbonatni transporterski gen (angl. bicarbonate transporter gene) Ci - anorganski ogljik (angl. inorganic carbon)

BCT1 - od ATP odvisni HCO3- transporter (angl. ATP-dependent HCO3- transporter) SbtA - od natrija odvisenHCO3- simporter (angl. sodium-dependent HCO3- symporter) BicA - od natrija odvisen HCO3- transporter (angl. sodium dependent HCO3 transporter) IEM - membrana notranje ovojnice (angl. inner envelope membrane)

RNAi - RNA interferenca (angl. RNA interference)

(9)

VIII

(10)

Šobar M. Biotehnološki pristopi za povečanje fotosintezne učinkovitosti rastlin

1 1 UVOD

Število svetovnega prebivalstva, ki je leta 1950 znašalo približno 2,5 milijarde, naj bi se do leta 2050 povečalo na 10,5 milijarde, kar pomeni, da bo z naraščanjem človeške populacije, rasla tudi potreba po hrani. Če naj bi se kmetijska proizvodnja do leta 2050 podvojila, bo treba vsaj podvojiti produktivnost na hektar, saj se obdelovalne površine krčijo, produktivnost pridelkov pa stagnira (Ray in sod., 2013).

Povečana uporaba pesticidov, gnojil, namakanje in izboljšanje sort, kar je povzročilo izjemno globalno povečanje produktivnosti, so za zadaj v veliki meri optimizirani in verjetno ne bodo ustvarili zadostnega donosa, da bi zadovoljili povpraševanje po več. Učinkovitost fotosinteze pa ostaja odločilen potencial za izboljšave in podvojitev produktivnosti (Zhu in sod., 2010).

Fotosinteza C3 rastlin je neučinkovit proces, saj je osrednji encim Calvinovega cikla, ribuloza 1,5-bifosfat karboksilaza-oksigenaza (Rubisco) evolucijsko neučinkovit encim. Oksigenazna aktivnost Rubisca, kjer encim ne razlikuje med ogljikovim dioksidom in kisikom, je neizogibna reakcija, kjer nastaja toksični ko-produkt imenovan glikolat. Slednje se zgodi v kar 25 do 30 % primerov. Proces, pri katerem pride do odstranjevanja oz. recikliranja glikolata, imenujemo fotorespiracija. Fotorespiracija je energetsko potraten proces pri katerem pride do izgube četrtine ogljika, ki je sicer prisoten v glikolatu. Prihaja do močnega selekcijskega pritiska na rastline, da zmanjšajo stopnjo fotorespiracije in posledično povečajo pridobivanje ogljika. S tem se poveča tudi učinkovitost rabe vode in dušika. Možni pristopi za izboljšanje učinkovitosti fotosinteze z manjšo fotorespiracijo vključujejo uvedbo izboljšanega Rubisca iz drugih vrst, uvedbo mehanizmov za koncentriranje ogljika, kot so anorganski prenašalci ogljika, karboksisomi ali pirenoidi ali pa inženiring celotne poti C4 v rastline s C3 tipom fotosinteze (Peterhansel in sod.

2010).

Številne raziskave so zato usmerjene k cilju povečanja učinkovitosti fotosinteze, kar bi se lahko odrazilo v večjem pridelku. Izboljšave fotosinteze rastlin z genskim inženiringom kažejo velik potencial za dosego tega cilja.

Namen diplomskega dela je pregled literature o dosedanjih dogajanjih na področju izboljšave učinkovitosti fotosinteze s pomočjo številnih biotehnoloških pristopov.

2 O FOTOSINTEZI

V splošnem je fotosinteza proces, pri katerem modro-zelena snov, imenovana klorofil A in rumeno-zelena snov, imenovana klorofil B, s pomočjo svetlobne energije spremeni ogljikov dioksid in vodo v sladkor (ogljikove hidrate) in kisik v zelenih delih rastline. Količina fotosinteze na dan je omejena s trajanjem in intenzivnostjo sončne svetlobe ter sposobnostjo zelenih delov rastlin, da jo ujamejo (Casem, 2016).

(11)

2 2.1 SVETLOBNE REAKCIJE

Med fotosintezo se svetlobna energija uporabi za cepitev vode, pri čemer nastaja kisik in elektroni, ki se nato uporabljajo za tvorbo ATP in NADPH, potrebnih za fiksacijo ogljika. Fotosistem II (PSII) deluje tako, da zajema svetlobno energijo in jo prenese v plastokinon, ki je prva molekula v elektronski transportni verigi, ki vodi do proizvodnje ATP. Svetlobno energijo je prav tako sposoben absorbirati fotosistem I (PSI). Elektroni iz njegovega reakcijskega centra se prenesejo v protein feredoksin, ki lahko elektrone odda bodisi NADP+ elektronskemu nosilcu, da tvori NADPH ali elektronski transportni verigi, kar pa povzroči nastanek še enega ATP. Svetlobne reakcije potekajo v tilakoidnih membranah, znotraj kloroplasta (Casem, 2016).

2.2 TEMOTNE REAKCIJE (CALVINOV CIKEL)

Calvinov cikel je glavna pot za fiksacijo ogljika, ki poteka v stromi kloroplasta. Nadzirajo ga svetlobno odvisne redoks reakcije, ki ciljajo na specifične encime. Calvinov cikel je sestavljen iz treh korakov: karboksilacije ribuloze-1,5-bfosfata, redukcije 3-fosfoglicerata in regeneracije sprejemnika CO2, RuBP. En celoten cikel vključuje tri molekule ogljikovega dioksida in tvori eno molekulo gliceraldehid-3-fosfata. Ta spojina zapusti kloroplast ali pa se pretvori v škrob znotraj kloroplasta (Gütle in sod. 2016).

3 FOTORESPIRACIJA

Ključni problem, ki ovira optimalno fotosintetsko učinkovitost rastlin, se vrti okoli katalitične omejitve encima Rubisco za fiksacijo CO2. Encim lahko fiksira bodisi kisik, bodisi ogljikov dioksid, ker sta oba substrata izjemno podobne oblike (Whitney in sod., 2011). Ko encim Rubisco fiksira kisik, je proces, ki se odvija, znan kot fotorespiracija (Slika 1).

Pri tem pride do katalize fiksacije kisika na RuBP, pri čemer nastaneta 3-PGA ter 2-PG, ki je toksičen presnovek, zato ga more rastlina reciklirati v uporabno obliko, kar pa se zgodi preko glikolatne presnovne poti. Vsaka tretja do četrta molekula RuBP je oksigenirana. Posledično večina kopenskih rastlin vsak dan proizvede ogromne količine 2-PG (Timm in sod., 2008).

(12)

3

Slika 1:Shematski prikaz fotorespiracije in Calvinovega cikla (prirejeno po Raines, 2006).

Fotorespiracija poteka v treh organelih (kloroplast, peroksisom in mitohondrij) in v citosolu. Ta pot lahko pridobi 75 % ogljika, preostalih 25 % pa se sprosti kot CO2 v mitohondrijih. 2-PG se v stromi kloroplasta pretvori v glikolat, se nato prenese v peroksisom in se tam oksidira v glioksilat, ki se nato porabi za tvorbo glicina. Ta potuje do matriksa mitohondrija, kjer se pretvori v serin, pri čemer se sprosti CO2. V končnem, zadnjem koraku pa nastane 3-PGA (Timm in sod., 2008).

3.1 TOKSIČNI UČINKI FOTORESPIRATORNIH PRODUKTOV

Za organizme, ki izvajajo fotosintezo, so lahko strupene že izredno majhne količine fotorespiratornih vmesnih produktov 2-PG, glikolata in glioksilata. 2-PG zavira encim Calvinovega cikla trioza fosfat izomerazo, odgovorno za regeneracijo ribuloze-1,5-bifosfata (Anderson, 1971). Glikolat vodi do slabše fiksacije CO2 in do zaviranja metabolnih procesov, (González-Moro in sod., 1997) glioksilat pa zavira aktivacijo Rubisca v izoliranih kloroplastih.

Zato je nujna prisotnost učinkovite poti presnove 2-PG, glikolata in glioksilata, da bi dosegli čim večji izkoristek fotosinteze (Campbell in Ogren, 1990).

4 PRISTOPI ZA POVEČANJE FOTOSINTEZNE UČINKOVITOSTI

Trije glavni pristopi, uporabljeni za znižanje stroškov fotorespiracije, ki so uporabljeni s ciljem produktivnosti rastlin in posledično povečanja donosa, so zmanjšanje oksigenacije RuBP s povečanjem učinkovitosi Rubisca ali z gensko manipulacijo encima ali s koncentracijo CO2 okoli Rubisca z uvajanjem encimov fotosinteze C4 (Raines, 2006), manipulacija z nativno fotorespiratorno potjo z gensko mutacijo ali prekomernim izražanjem, da se poveča stopnja recikliranja toksičnih stranskih produktov in predelava ogljika (Peterhansel in sod. 2012). Zadnji pristop pa je namestitev altrenativnih presnovnih poti za zmanjšanje energijskih stroškov fotorespiracije (South in sod., 2019).

(13)

4 4.1 POVEČANA AKTIVNOST SBP IN FBP

Nekateri encimi Calvinovega cikla so prisotni na ravni, ki presegajo tiste, ki so potrebne za vzdrževanje stalne fiksacije CO2. Raven encimov fruktoza-1,6-bifosfataze in (FBPaze) in sedoheptuloza-1,7-bifosfataze (SBPaze) pa sta izjemno nizki, kar se je izkazalo kot negativen dejavnik učinkovitosti fotosinteze (Ding in sod., 2016).

SBPaza je encim Calvinovega cikla, ki sodeluje na vejni točki med regeneracijo RuBP, kjer lahko asimilirani ogljik preide v regenerativno fazo, da v ciklu tvori sprejemno molekulo CO2 RuBP, ali pa ga iz cikla izvozi za saharozo ali prehodne škrobne biosinteze. FBPaza pa je encim, ki katalizira reakcijo, pri kateri nastane fruktoza-6-fosfat. Ta korak je tudi vejna točka za metabolite, ki zapustijo Calvinov cikel in se s pretvorbo v glukoza-6-fosfat premaknejo k biosintezi škroba, fosforilirani intermediati pa se pretvorijo v saharozo in izločijo iz listov ali shranijo kot škrob (Koßmann in sod., 1994). Dokazano je bilo, da povečana aktivnost teh dveh encimov, poveča učinkovitost fotosinteze. Za razliko od drugih encimov v Calvinovem ciklu je SBPaza edinstvena za fotosintetske organizme, kjer katalizira defosforilacijo sedoheptuloze-1,7-bisfosfata v sedoheptulozo-7-fosfat, ki se nato porabi za regeneracijo Rubisca. Ta dva encima sta dobra kandidata za genski inženiring. Pri cianobakterijski FBP/SBPazi so odkrili, da nimata homologije z geni FBPaze in SBPaze iz višjih rastlin in je zato manj verjetno, da bo vključitev katerega koli od teh dveh genov nagnjena k utišanju transgenov (Miyagawa in sod., 2001).

4.1.1 Povečana aktivnost SBPaze in FBPaze v tobaku

Gena fbp-II in sbp iz cianobakterije sta bila spojena s promotorjem in tranzitnim peptidom paradižnikovega gena rbcS3C in nato klonirana v pBI101 ekspresijski vektor. Konstrukta sta bila nato vnesena v liste N. tabacum var. Xanthi z uporabo agrobakterijsko posredovane transformacije (Miyagawa in sod., 2001).

Transgene rastline tobaka, ki izražajo cianobakterijsko sedoheptulozo-1,7- bifosfatazo, usmerjeno v kloroplaste, kažejo povečano fotosintezno učinkovitost. V študiji so dokazali, da je bila končna suha snov transgenih rastlin 1,5-krat in fotosintezna vezava CO2 1,24-krat višja kot v divjih rastlinah. Transgeni tobak je prav tako pokazal 1,2-kratno povečanje začetne aktivnosti encima Rubisco. Natančneje, transgene rastline so pokazale več biomase in izboljšano fiksiranje ogljikovega dioksida ter povečanje aktivnosti encima Rubisco. Rastline so rasle bistveno hitreje kot rastline divjega tipa, z večjo vsebnostjo saharoze in škroba (Slika 2) (Miyagawa in sod., 2001).

Trenutno razpoložljive informacije raziskav kažejo, da povišana aktivnost FBPaze in SBPaze v kloroplastih lahko povzroči povečano raven RuBP, čemur sledi aktiviranje Rubisca in posledično učinkovitejšo fotosintezo (Miyagawa in sod., 2011). Znano je še, da je SBPaza najpomembnejši dejavnik za regeneracijo RuBP v Calvinovem ciklu, in da >1,6-kratno povečanje aktivnosti SBPaze povzroči prehod na FBPazo kot zadnji korak fiksacije ogljika. Rahlo povečanje aktivnosti FBPaze prispeva k sintezi škroba in ne k regeneraciji RuBP v kloroplastih, kar kaže, da raven izražanja FBPaze strogo nadzoruje regeneracijo RuBP v Calvinovem ciklu in sintezo škroba.

(14)

5

Slika 2: Fenotip divjega tipa in transgenih rastlin tobaka. (A) cele rastline, (B) četrti list z vrha, (C) korenine. Rastline gojene 12 tednov. TpS- transgene rastline tobaka, ki imajo izraženo SBPazo zelenih alg Chlamydomonas v kloroplastih. TpF-transgene rastline tobaka, ki imajo izraženo cianobakterijsko FBPazo v kloroplastih (prirejeno po Tamoi in sod., 2006).

V primeru TpS-2 (transgene rastline tobaka, ki imajo izraženo SBPazo zelenih alg Chlamydomonas v kloroplastih), je aktivnost SBPaze povečana 1,3-krat, kar ni pospešilo fotosinteze ali rasti. Rahlo povečana aktivnost SBPaze deluje kot katalizator defosforilacije SBP v sedoheptulozo-7-fosfat. Ta je nato uporabljen za regeneracijo RuBP. Ta fosforilirani intermediat je bil takoj spremenjen v dihidroksiaceton fosfat (DHAP), nato pa je bil DHAP prenesen v citosol in uporabljen za biosintezo saharoze. Posledično se je koncentracija SBP zmanjšala, kar je povzročilo nestabilnost endogene SBPaze v kloroplastih rastlin TpS-2 (Tamoi in sod., 2006).

4.1.2 Povečana aktivnost SBPaze v paradižniku

Celotno kodirano zaporedje in 563 bp dolg fragment DNA SBPaze so pomnožili z uporabo primerjev SBP-ORF-F(R) in SBP-An-F (R). Fragment, ki vsebuje zaporedje odprtega bralnega okvirja, so klonirali v ekspresijski vektor pBI121 pod nadzorom promotorja CaMV35S, da so ustvarili smiselne konstrukte, fragment DNA s 563 bp pa so uporabili za tvorbo antisense konstruktov. Nato so konstrukte vnesli v Agrobacterium tumerfaciens in nato transformirali v paradižnik. Po transformaciji so dobili 29 transformantov s SBPaza antisense konstrukti. Nastala semena primarnih transformantov so posejali in rastline potomcev T1 generacije uporabili za nadaljnje analize. T1 transgene rastline z različnimi stopnjami ekspresije SBPaze so bile izbrane za qRT-PCR in Western-blot analizo (Ding in sod., 2016).

(15)

6

Prvi cilj študije je bil raziskati vzorec izražanja SBPaze v paradižniku s qRT-PCR. Rezultati so pokazali, da je SBPaza izražena v listih, steblih in plodovih, torej v zelenih tkivih, kar kaže, da je izražena v skladu s svojo biološko funkcijo v kloroplastu (Ding in sod., 2016).

Preverjali so tudi ekspresijo SBPaze glede na dnevno dinamiko in ugotovili, da je vrh dosegla okoli 12:00, ponoči pa je bila aktivnost SBPaze minimalna. Stopnjo fotosinteze so izmerili na popolnoma razvitih listih ob sončnem dnevu (Ding in sod., 2016).

Vpliv aktivnosti SBPaze na kopičenje ogljikovih hidratov, so preučili tako, da so na koncu dneva v divjih in transgenih rastlinah preverili vsebnost saharoze in škroba. Transgena linija z najvišjo aktivnostjo SBPaze je vsebovala 28 % več saharoze in 47 % več škroba kot rastlina divjega tipa, medtem ko je transgena linija z najnižjo aktivnostjo SBPaze vsebovala bistveno manj saharoze in škroba kot divja rastlina. Povečana raven ogljikovih hidratov, kot odziv na povečano aktivnost SBPaze, lahko prispeva k boljši rasti rastlin paradižnika. V podporo tem meritvam pa so izmerili še biomaso poganjkov in korenin ter ugotovili, da sta bili tako biomasa poganjkov kot biomasa korenin povečani v rastlinah, ki so kopičile več ogljikovih hidratov (Ding in sod., 2016).

Pri sense in antisense konstruktih se je pojavilo nekaj razlik. Pri sense konstruktih se je skupna masa in površina listov povečala, medtem ko se je pri antisense konstruktih slednje zmanjšalo v primerjavi z rastlinami paradižnika divjega tipa. Tudi analiza kopičenja ogljikovih hidratov je pokazala, da je raven saharoze in škroba višja v sense konstruktih kakor v antisense konstruktih v primerjavi z rastlinami divjega tipa. Stopnja regeneracije RuBP je višja v sense kostruktih kakor v antisense konstruktih. Vpliv aktivnosti SBPaze so raziskali tudi pri cvetenju transgenih rastlin in rastlinah divjega tipa. Transgeni paradižnik z antisense konstrukti je začel cveteti 4-6 dni kasneje kot paradižnik divjega tipa, medtem ko je paradižnik s sense konstruktom začel cveteti 4- 7 dni prej kakor paradižnik divjega tipa (Ding in sod., 2016).

4.2 POVEČANA AKTIVNOST ICTB

Pri nizkih koncentracijah CO2, cianobakterije uporabljajo bikarbonatne transporterje za črpanje bikarbonata kot glavnega vira ogljika. S tem mehanizmom se cianobakterije prilagodijo, da preživijo neugodne pogoje rasti. Yang in sod. (2008) so v rižu izrazili visoko afinitetni bikarbonatni transporterski gen, ictB iz cianobakterije in s tem dokazali, da ima izražanje ictB v transgenih rastlinah ključno vlogo pri izboljšani fotosintezi in donosu. Transgene rastline so imele 10-30 % višjo stopnjo fotosinteze in 15-20 % večjo učinkovitost karboksilacije. Izkazalo se je, da je tudi aktivnost Rubisca in PEP karboksilaze pri transgenem rižu višja kot v divjem tipu (Yang in sod., 2008)

V pCAMBIA1300 so vnesli bikarbonanti transporterski gen cianobakterije (slr1515) za transfekcijo seva Agrobacterium AGLI, nato so ta konstrukt s transformacijo, posredovano z Agrobacterium, vnesli v riž. S Southern blot hibridizacijo so potrdili vključitev ictB v genom riža, z Northern blot analizo, pa pri katerih linijah se je ictB izrazil (Yang in sod., 2008).

(16)

7 4.3 CCM MEHANIZEM

Nekatere fotosintetske alge, bakterije in rastline so razvile mehanizme za zmanjšanje reakcije oksigenacije prek mehanizmov za koncentracijo ogljika (CCM). To je tudi eden izmed pristopov za povečanje fotosintezne učinkovitosti, prav tako pa tudi mehanizem za zvišanje koncentracije CO2 v kloroplastu (CCM), ki je prisoten v cianobakterijah (modro-zelenih algah). Študije kažejo, da bi lahko uspešna uvedba CCM v glavne kmetijske rastline kot so riž, pšenica in soja, povzročila do 60-odstotno povečanje fiksacije ogljika, hkrati pa izboljšala učinkovitost porabe vode in dušika (Long in sod., 2015).

Za aktivnost CCM so potrebni trije elementi: transporterji anorganskega ogljika (Ci) na plazemski membrani in ovojnica kloroplasta (Spalding, 2008), karboanhidrze, ki olajšajo medsebojno pretvorbo CO2 in HCO3- in delujejo vzporedno znotraj vsakega celičnega predela (Moroney in sod., 2011) in lokalizacija Rubisca v mikropredelku s kloroplastom, imenovanem pirenoid, da se zmanjša uhajanje CO2 (Ma in sod., 2011; Meyer in sod., 2012).

CCM mehanizem deluje tako, da aktivno prenaša in kopiči anorganski ogljik (Ci; HCO3- in CO2) znotraj celice, kjer se Ci bazen uporablja za povišanje koncentracije CO2 okoli primarnega encima Rubisco. Pri cianobakterijah so znani trije bikarbonatni prenašalci: večproteinski kompleks BCT1 in dva od Na⁺ odvisna prenašalca BicA in SbtA. Ker BicA in SbtA kodirata posamezna gena, sta bolj idealna kandidata za prenos v višje rastline.

Predlog znanstvenikov, da je namestitev CCM v kloroplaste obetaven pristop k izboljšanju fotosinteze, se je izkazal, kot upravičen. Predpostavili so, da namestitev jedrsko kodiranih cianobakterijskih bikarbonatnih transporterjev BicA in SbtA v membrano notranje ovojnice kloroplasta (IEM), z uporabo usmerjevalnega signala kloroplastnega IEM (Cor413IM1) s tranzitnim peptidom, izboljša stopnjo fiksacije fotosintetičnega CO2. V Arabidopsis so vnesli transporterje cianobakterijskih bikarbonatov. Uporabili so pristop himernega izražanja z uporabo proteina IEM kloroplasta kot fuzijskega partnerja. Ustvarili so 7 himernih konstruktov. Med sedmimi preizkušenimi konstrukti himernega bikarbonatnega prenašalca so potrdili izražanje štirih himerniih proteinov: BicAI, BicAII, SbtAII in SbtAIII. Rezultati raziskave kažejo, da usmerjevalni signal kloroplastne IEM s tranzitnim peptidom služi kot potencialno ogrodje za vgradnjo CCM-jev v kloroplaste kopenskih rastlin. Ko so himerni proteini usmerjeni na kloroplastno IEM, jih je treba aktivirati, kar omogoča aktivno vključitev bikarbonata v kloroplaste. Ker naj bi usmerjevalni signal IEM zaviral aktivnost bikarbonatnega transporterja, so le tega odstranili z uporabo proteaze. Tudi po odstranitvi usmerjevalnega signala IEM s TEV proteazo, bikarbonatni transporterji ostanejo vgrajeni v IEM kloroplasta (Slika 3) (Uehara in sod., 2016).

(17)

8

Slika 3: Pristop za namestitev cianobakterijskih bikarbonatnih transporterjev, kodiranih z jedrskim genomom, v IEM kloroplastov v kopenskih rastlinah (prirejeno po Uehara in sod., 2016).

4.4 VGRADNJA FOTOSINTETSKE POTI C4 V C3 RASTLINE 4.4.1 C3 fotosinteza

Fotosintetski organizmi, ki so podvrženi C3 fotosintezi, začnejo postopek pretvorbe energije znan kot Calvinov cikel, s proizvodnjo spojine s tremi ogljiki, imenovane 3-fosfoglicerinska kislina, iz česar izvira tudi ime »C3« fotosinteza. Fotosinteza C3 je enostopenjski proces, ki poteka znotraj organelov kloroplasta, ki delujejo kot centri za shranjevanje energije sončne svetlobe. Rastlina to energijo uporablja za združevanje ATP in NADPH v urejene molekule sladkorja. Približno 85 odstotkov rastlin na zemlji uporablja fotosintezo C3 (Raghavendra, 2003).

4.4.2 C4 fotosinteza

C4 fotosinteza je dvostopenjski proces, ki tvori intermediat s štirimi ogljikovimi atomi, kar nam pove že samo poimenovanje fotosinteze. Pri tej vrsti fotosinteze sta svetlobno odvisne reakcije in Calvinov cikel ločene. Svetlobno odvisne reakcije potekajo v celicah mezofila, Calvinov cikel pa v posebnih specializiranih celicah okoli listnih žil (angl. Bundle sheath cell). V mezofilnih celicah se CO2 veže s fosfoenolpiruvatom (PEP) v oksaloacetat, produkt s štirimi ogljikovimi atomi.

Reakcijo katalizira PEPC, ta pa ima visoko afiniteto do bikarbonatnih anionov (HCO3-). Nato pride do oksidacije malata, ki se pretvori v piruvat. Sprosti se CO2.. Piruvat se v celici mezofila

(18)

9

zopet pretvori v fosfoenolpiruvat in tako sklene krog. Potem, ko se CO2 sprosti, se vključi v Calvinov cikel, ki poteka tako kot pri C3 rastlinah (Slika 4).

C4 fotosinteza je sicer energijsko nekoliko bolj potratna kot običajna C3 fotosinteza, kar zadeva fiksacijo ogljika, zaradi večje porabe ATP, vendar je iz finančnega vidika veliko ugodnejša od fotorespiracije (Edwards in sod., 2004).

Fotosinteza C4 rastlin zagotavlja povečano učinkovitost fotosinteze ter visoko učinkovitost porabe dušika in vode glede na rastline C3, hkrati pa zmanjšuje fotorespiracijo na minimum v vročih in sušnih podnebjih (Zhu in sod., 2010; Ghannoum in sod., 2011).

Velika večina C4 rastlin ima specializirano anatomijo listov, imenovana »anatomija Kranz«, ki predstavlja strukturno podlago z učinkovito asimilacijo CO2. Ime izvira iz vencem podobne organizacije celic BS in celic mezofila M, ki tvorijo koncentrične pasove okoli žil (Brown, 1975).

Študije so pokazale, da številni regulativni elementi, ki usmerajajo izražanje genov BS rastlin C4, že obstajajo pri vrstah C3. Prizadevanja za kodiranje fotosinteze C4 se osredotočajo na identifikacijo cis-regulativnih elementov, ki regulirajo izražanje, specifično za BS ali M celice.

Rastline C3 vsebujejo glavne encime presnove C4, kot je PEPC, znano pa je tudi, da prenašajo ogljik iz žilnega predela v okoliške celice na podoben način kot rastline C4, kar zagotavlja trdno podlago za genski inženiring.

Genski inženiring C4 fotosinteze je eden izmed najbolj zahtevnih pristopov zaradi kompleksnih lastnosti in števila genov, ki jih je potrebno prenesti v rastline C4.

Slika 4: Fotosinteza C4 (prirejeno po Kajala in sod., 2011)

4.4.2.1 Vgradnja C4 fotosinteze v riž

Ker je riž ena izmed najbolj uporabljenih rastlin na svetu poleg koruze in sladkornega trsa in ker ga na splošno gojijo v vročem in sušnem podnebju Azije in Afrike, kjer so izgube zaradi

(19)

10

fotorespiracije velike, je največja korist vgradnja fotosintezne poti C4 prav v omenjeno žito (Burnell, 2011).

Vgradnja fotosintetske poti C4 v C3 rastline je eden izmed mehanizmov, uporabljenih za izboljšanje fotosintezne učinkovitosti rastlin. Modularne tehnologije kloniranja, kot je Golden Gate, ponujajo priložnost za uvedbo celotne zbirke encimov riža na enem samem konstruktu, kar poenostavi generiranje linij in zmanjša možnost škodljivih učinkov, ki jih povzroči vstavljanje transgena (Engler in sod., 2014).

Z vnosom enega samega konstrukta koruze, ki vsebuje kodirajoče regije petih encimov- karboanhidraze (CA), fosfoenolpiruvat karboksilaze (PEPC), NADP-malat dehidrogenaze, piruvat ortofosfat dikinaze in NADP-maličnega encima, lahko dosežemo kar 50 % višji donos v rižu (Oryza sativa spp.japonica). Za vgradnjo fotosintezne poti C4 v C3 rastline so zahtevane pomembne spremembe na kloroplastih, proteomih mezofila (M) in na BS celicah (Hernández‐

Prieto in sod., 2019; Majeran in van Wijk, 2009). Ogljikova anhidraza (CA) in PEP karboksilaza (PEPC) v citosolu M celic pretvarjata CO2 v bikarbonat in ga fiksirata v oksaloacetat. NADP- malat dehidrogenaza (MDH) znotraj mezofilnih kloroplastov pretvori oksaloacetat v malat z uporabo NADPH, proizvedenega z fotosintetskim prenosom elektronov. Ko malat difundira v BS celice, se dekarboksilira v kloroplastu z od NADP odvisnim maličnim encimom (NADP-ME).

Sproščeni CO2 fiksira ribuloza-1,5-bifosfat karboksilaza oksigenaza (Rubisco), preostali piruvat pa se vrne v celice M, da se s pomočjo ortofosfat dikinaze (PPDK) v kloroplastu preoblikuje v PEP. Ekspresija teh encimov posamično ne vpliva na fotosintetsko funkcijo, bi pa sprememba v celotnem ciklu povzročila višjo koncentracijo CO2 okoli Rubisca v celicah BS (Karki in sod., 2020). Izražanje multigenega konstrukta v rižu je izvedljivo in predstavlja osnovo za vzpostavitev cikla C4 pri rastlinah C3.

En sam konstrukt za ekspresijo petih encimskih transgenov C4

Kodirajoča zaporedja petih genov koruze, ki kodirajo jedrne encime cikla C4, so sestavili v enem samem konstruktu z uporabo Golden Gate sistema za kloniranje (Engler in sod., 2014). Za spodbujanje ekspresije M-preferencialnih so bili uporabljeni promotorji PEPC iz štirih različnih vrst trav s tipom fotosinteze C4, za preferenčno ekspresijo BS pa promotor glicin dekarboksilaze P-protein (GLDP) iz Flaveria trinervia (Engelmann in sod., 2008; Gupta in sod., 2020).

Konstrukti so bili vstavljeni v riž (O. sativa spp. Japonica) sorta Kitaake z uporabo stabilne z agrobakterijo posredovane transformacije in bodisi higromicina ali bialaphosa za selekcijo (Ermakova in sod., 2020).

Transgene rastline riža, ki izražajo PEPC in PPDK koruze, kažejo večjo fotosintetsko sposobnost kot netransformirane rastline za kar do 35 %. Višja fotosintezna učinkovitost teh rastlin je v glavnem povezana z večjo stomatalno prevodnostjo in višjo koncentracijo CO2. Rezultati kažejo, da imata PEPC in PPDK ključno vlogo pri metabolizmu organske kisline, kot je malat (shranjen v vakuoli) v varovalnih celicah za regulacijo odpiranja stomate, kar se zgodi tako, da anorganske snovi, kot je kalij potujejo iz epidermalnih celic v varovalne celice za ravnotežje naboja.

Kopičenje ionov v vakuoli zmanjša vodni potencial varovalnih celic, kar spodbudi osmotski

(20)

11

privzem vode in poveča turgor za odpiranje stomate. Študije kažejo, da je donos transgenega riža 10-20 % višji pri PEPC in 30-35 % višji pri PPDK transgenih rastlinah (Ku in sod., 2007). Genske študije transgenov kažejo, da so geni koruze dedovani na Mendelski način, vstavljeni na enem ali dveh mestih v genomu. Študije imunolokalizacije kažejo, da je PEPC koruze izražen v citosolu, PPDK in NADP-ME pa v kloroplastu. Encimi koruze ostanejo aktivni v transgenih rastlinah riža.

Ti rezultati kažejo, da so regulatorni mehanizmi koruze C4 izraženi tudi v rižu. Poleg tega je količina karboanhidraze (CA) pri transgeniih rastlinah skoraj trikrat višja (Ermakova in sod.

2020).

4.5 DODAJANJE GLIKOLATNEGA METABOLIZMA

Pri fotosintezi, kjer namesto karboksilacije RuBP poteče oksigenacija RuBP z encimom Rubisco, pravimo, da poteče fotorespiracija, kar zahteva veliko energije in stroškov za predelavo strupenih stranskih produktov, kot je glikolat. V predstavljeni študiji so identificirali potrebne gene, ki bi jih lahko vstavili v rastline, da bi ustvarili učinkovitejši postopek presnavljanja toksičnega glikolata (South in sod., 2019).

4.5.1 Dodajanje glikolatnega metabolizma v tobak

Slika 5: Fotorespiratorne alternativne poti 1. rdeča,, 2. temno modra, 3. svetlo modra, ki so bile vnesene v kloroplaste tobaka za učinkovitejše recikliranje glikolata. RNAi konstrukt za znižano izražanje PLGG1 transporterja za zmanjšan transport glikolata iz alternativne v naravno pot-siva (prirejeno po South in sod., 2019).

(21)

12

Večjo fotosintetsko učinkovitost so dosegli tudi z namestitvijo sintetične glikolatne presnovne poti v rastlino, kar je uspelo z gensko transformacijo rastline s tremi različnimi modeli fotorespiratornih alternativnih poti z uporabo seva bakterije Agrobacterium tumefaciens (Slika 5).

Da bi ugotovili, ali bi fotorespiratorne alternativne poti lahko učinkovito izboljšale produktivnost C3 poljščin, so le-te testirali v tobaku. Ustvarili so 17 konstruktov treh alternativnih poti z in brez RNAi. Pretok skozi sintetične poti je bil maksimiziran z zaviranjem izvoza glikolata iz kloroplasta. Pri prvi poti (AP1) so uporabili pet genov iz poti glikolatne oksidacije bakterije E.

coli, pri drugi alternativni poti (AP2) so uporabili glikolat oksidazo in malat sintazo iz rastlin in katalazo iz E.coli. pri tretji alternativni poti (AP3) pa malat sintazo (MS) iz rastlin in glikolat dehidrogenazo (CrGDH) zelenih alg za preprečitev nastanka vodikovega peroksida pri pretvorbi glikolata v glioksilat. Vsi encimi alternativnih poti so bili usmerjeni v kloroplast. Poleg izražanja genov AP so oblikovali RNAi konstrukt in ga dodali v knjižnico večgenskih konstruktov za zmanjšano izražanje kloroplastnega nativnega transporterja glikolata PLGG1, da bi zmanjšali tok glikolata iz kloroplasta v naravno pot. Večji pretok glikolata skozi alternativno pot z zaviranjem transporta glikolata iz kloroplasta skozi PLGG1 v naravno fotorespiratorno pot, povzroči stimulacijo rasti pridelka za več kot 40 % pri rastlinah tretje alternativne poti z RNAi (South in sod., 2019).

Slika 6: (A) Fenotip 6 tednov starih rastlin AP3 in WT, gojenih v rastlinjaku. (B) Odstotna razlika v skupni masi suhe biomase navedenih linij (prirejeno po South in sod., 2019).

(22)

13

Številne homozigotne transgene linije so povečale produktivnost biomase za več kot 40 %, kar kaže, da alternativne poti glikolatnega metabolizma kloroplastov ob hkratnem zaviranju izvoza glikolata v naravno pot povzročijo povečanje pridelka C3 (South in sod., 2019).

Alternativna pot AP1 je sicer izboljšala produktivnost, vendar je z dodatkom RNAi učinkovitost pojenjala (Slika 6).

Odprava izboljšave AP1 po modulu PLGG1 RNAi pomeni, da kinetična zmogljivost pod visokimi stopnjami oksigenacije Rubisca ni zadostovala za obdelavo celotnega glikolatnega toka (South in sod., 2019).

4.5.2 Vnos katabolne poti glikolata E. coli v Arabidopsis thaliana

V eni izmed študij so v kloroplast Arabidopsis thaliana vnesli katabolno pot glikolata E. Coli, da bi zmanjšali izgubo fiksiranega ogljika in dušika, ki nastaja v C3 rastlinah, ko se v procesu fotorespiracije reciklira neizogiben stranski produkt fosfoglikolat. Z uporabo postopne jedrske transformacije s petimi bakterijskimi geni, usmerjenimi na kloroplast, ki kodirajo tri podenote glikolat-dehidrogenaze (D, E, F), glioksilat-karboligaze (G) in tartronske semialdehid-reduktaze (T), so ustvarili rastline, v katerih se kloroplastični glikolat pretvori neposredno v glicerat. Te transgene rastline dokazano rastejo hitreje, proizvedejo več biomase poganjkov in korenin in vsebujejo bolj topne sladkorje, kar odraža zmanjšano fotorespiracijo in posledično učinkovitejšo fotosintezo (Keibish in sod., 2007).

4.5.3 Vnos katabolne poti glikolata E. coli v krompir

Učinkovitost glikolatne dehidrogenaze E. coli so potrdili tudi pri povečanju biomase v krompirju z izboljšanjem fiksacije fotosinteznega ogljika z zasnovo rekombinantnega poliproteina glikolat dehidrogenaze (DEFp), ki je bil ustvarjen tako, da so bili združeni trije ustrezni geni (glcD, glcE in glcF) z vmesnimi prožnimi povezovalci. Spremembe fotosintetske sposobnosti rastlin so se neposredno odražale v fenotipu, to je več listov, debelejše steblo in 2 do 3-krat večji pridelek gomoljev (Slika 7) (Nölke in sod., 2014).

Slika 7: Vpliv DEFp na fenotip krompirja: (a) fenotip 8 tednov stare rastline divjega tipa in dveh transgenih linij z izraženim DEFp, (b) fenotip gomoljev rastline divjega tipa in dveh transgenih linij z izraženim DEFp (prirejeno po Nölke in sod., 2014).

(23)

14 5 ZAKLJUČEK

Potreba po hrani se z naraščajočo svetovno populacijo povečuje. Genski inženiring nam daje možnosti, da bomo le-te potrebe v prihodnosti lahko zadostili. V tej smeri lahko pričakujemo nove kmetijske rastline, ki bodo uspešneje koristile energijo sonca.

Brez dvoma lahko trdimo, da obstaja nekaj biotehnoloških pristopov in idej, ki že uspešno povečujejo fotosintezno učinkovitost rastlin in jo z nekaj optimizacije postopkov še bodo. Med uspešnimi so se do zdaj izkazale CCM mehanizem, povečano izražanje nekaterih encimov, kot sta FBPaza in SBPaza, vgradnja C4 fotosinteze v C3 rastline in dodajanje glikolatnega metabolizma.

6 VIRI

Anderson L. E. 1971. Chloroplast and cytoplasmic enzymes. II. Pea leaf triose phosphate isomerases. Biochimica et Biophysica Acta, 235: 237–244

Brown, W. V. 1975. Variations in anatomy, associations, and origins of Kranz tissue. American Journal of Botany, 62: 395–402

Burnell J. 2011. Hurdles to engineering greater photosynthetic rates in crop plants: C4 rice. V: C4 photosynthesis and related CO2 concentrating mechanisms. Raghavendra R.F., Sage A.S. (ur.).

Dordrecht, Springer: 361–378

Campbell W. J., Ogren W. L. 1990. Glyoxylate inhibition of ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenase activation in intact, lysed, and reconstituted chloroplasts.

Photosynthesis Research, 23: 257–268

Casem M. L. 2016. Cell metabolism. V: Case studies in cell biology. Casem M. L. (ur.).

California, Elsevier: 263-281

Ding F., Wang M., Zhang A. X. 2016. Changes in SBPase activity influence photosynthetic capacity, growth, and tolerance to chilling stress in transgenic tomato plants. Scientific Reports, 6: 32741, doi: 10.1038/srep32741: 14 str.

Edwards G. E., Franceschi V. R., Voznesenskaya E. V. 2004. Single-cell C4 photosynthesis versus the dual-cell (Kranz) paradigm. Annual Review of Plant Biology, 55: 173–196

Ermakova M., Arrivault S., Giuliani R., Danila F. R., Alonso-Cantabrana H., Vlad D., Ishihara H., Feil R., Guenther M., Borghi G. L., Covshoff S., Ludwig M., Cousins A. B., Kelly S., Lunn J.E., Stitt M., von Caemmerer, S., Furbank, R.T. 2020. Installation of C4 photosynthetic pathway enzymes in rice using a single construct. Plant Biotechnology Journal, 19: 575-588 Engelmann S., Wiludda C., Burscheidt J., Gowik U., Schlue U., Koczor M., Streubel M., Cossu

R., Bauwe H., Westhoff P. 2008. The gene for the P-subunit of glycine decarboxylase from the C4 species Flaveria trinervia: Analysis of transcriptional control in transgenic Flaveria bidentis (C4) and Arabidopsis (C3). Plant Physiology, 146: 1773–1785

Engler C., Youles, M., Gruetzner R., Ehnert T. M., Werner S., Jones J. D. G., Patron N. J., Marillonnet S. 2014. A golden gate modular cloning toolbox for plants. American Chemical Society Synthetic Biology, 3: 839-843

(24)

15

Ghannoum O., Evans J. R., von Caemmerer S. 2011. Nitrogen and water use efficiency of C4 plants. V: C4 photosynthesis and related CO2 Concentrating Mechanisms. Raghavendra A. S., Sage R. F (ur.). Springer: 129-146

González-Moro B., Lacuesta M., Becerril J. M., Gonzálelz-Murua C., Muñoz-Rueda A. 1997.

Glycolate accumulation causes a decrease of photosynthesis by inhibiting RUBISCO activity in maize. Journal of Plant Physiology, 150: 388–394

Gupta S. D., Levey M., Schulze S., Karki S., Emmerling J., Streubel M., Gowik U. Quick W. P.

Westhoff P. 2020. The C4Ppc promoters of many C4 grass species share a common regulatory mechanism for gene expression in the mesophyll cell. Plant Journal, 101: 204–216

Gütle D. D., Roret T., Müller S. J., Couturier J., Lemaire S. D., Hecker A., Dhalleine T., Buchanan B. B., Reski R., Einsle O., Jacquot, J. P. 2016. Chloroplast FBPase and SBPase are thioredoxin- linked enzymes with similar architecture but different eLavolutionary histories. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113: 6779–6784

Hernández-Prieto M. A., Foster C., Watson-Lazowski A., Ghannoum O., Chen M. 2019.

Comparative analysis of thylakoid protein complexes in the mesophyll and bundle sheath cells from C3, C4 and C3-C4 Paniceae grasses. Physiologia Plantarum, 166: 134-147

Kajala K., Covshoff S., Karki S., Woodfield H., Tolley B. J., Dionora M. J. A., Mogul R.T., Mabilangan A. E., Danila F. R., Hibberd J. M., Quick, W. P. 2011. Strategies for engineering a two-celled C4 photosynthetic pathway into rice. Journal of Experimental Botany, 62: 3001–

3010

Karki S., Lin H., Danila F. R., Abu-Jamous B., Giuliani R., Emms D. M., Coe R. A., Covshoff S., Woodfield H., Bagunu E., Thakur V., Wanchana S., Slamet-Loedin I., Cousins A. B., Hibberd J. M., Kelly S., Quick W. P. 2020. A role for neutral variation in the evolution of C4 photosynthesis. bioRxiv, doi: 10.1101/2020.05.19.104299: 39 str.

Kebeish R., Niessen M., Thiruveedhi K., Bari R., Hirsch H-J., Rosenkranz R., Stäbler N., Schönfeld B., Kreuzaler F., Peterhänsel, C. 2007. Chloroplastic photorepiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology, 25: 593–599

Koßmann J., Sonnewald U., Willmitzer L. 1994. Reduction of the chloroplastic fructose-1, 6- bisphosphatase in transgenic potato plants impairs photosynthesis and plant growth. Plant Journal, 6: 637–650

Ku M. S. B., Cho D., Li X., Jiao D. M., Pinto M., Miyao M., Matsuoka M. 2007. Introduction of Genes Encoding C4 Photosynthesis Enzymes into Rice Plants: Physiological Consequences.

V: Novartis Foundation Symposium 236 - Rice Biotechnology: Improving Yield, Stress Tolerance and Grain Quality. Goode J. A., Chadwick D. (ur.). Pullman, Wiley Online Library:

100–116

Long S. P., Marshall-Colon A., Zhu X. G.. 2015. Meeting the global food demand of the future by engineering crop photosynthesis and yield potential. Cell, 161: 56–66

Ma Y, Pollock S. V., Xiao Y., Cunnusamy K., Moroney J. V. 2011. Identification of a novel gene, CIA6, required for normal pyrenoid formation in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology, 156: 884–89

Majeran W., van Wijk, K. J. 2009. Cell-type-specific differentiation of chloroplasts in C4 plants.

Trends Plant Science, 14: 100–09

(25)

16

Tamoi M., Nagaoka M., Miyagawa Y., Shigeoka S. 2006. Contribution of Fructose-1,6- bisphosphatase and Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase to the Photosynthetic Rate and Carbon Flow in the Calvin Cycle in Transgenic Plants. Plant and Cell Physiology, 47: 380–390 Meyer M. T., Genkov T., Skepper J. N., Jouhet J., Mitchell M. C., Spreitzer R. J. Griffiths H.

2012. Rubisco small-subunit α-helices control pyrenoid formation in Chlamydomonas.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109:

19474–1947

Miyagawa Y., Tamoi M., Shigeoka S. 2001. Overexpression of a cyanobacterial fructose-1,6- /sedoheptulose-1,7-bisphosphatase in tobacco enhances photosynthesis and growth. Nature Biotechnology, 19: 965–969

Moroney J. V., Ma Y., Frey W. D., Fusilier K. A., Pham T. T., Simms T. A., DiMario R. J., Yang J., Mukherjee B. 2011. The carbonic anhydrase isoforms of Chlamydomonas reinhardtii:

intracellular location, expression, and physiological roles. Photosynthesis Research, 109: 133–

149

Nölke G., Houdelet M., Kreuzaler F., Peterhänsel C, Schillberg S. 2014. The expression of a recombinant glycolate dehydrogenase polyprotein in potato (Solanum tuberosum) plastids strongly enhances photosynthesis and tuber yield. Plant Biotechnology Journal, 12: 734-742 Peterhansel C., Blume C., Offermann S. 2012. Photorespiratory bypasses: how can they work?

Journal of Experimental Botany, 64: 709–715

Peterhansel C., Horst I., Niessen M., Blume C., Kebeish R., Kürkcüoglu S., Kreuzaler F. 2010.

Photorespiration. The Arabidopsis Book, 8: 1-25

Raghavendra A. S. 2003. Photosynthesis and partitioning-C3 Plants. V: Plants. Encyclopedia of Applied Plant Sciences. Thomas B. (ur.). Hyderabad, Elsevier: 673–680

Raines C. A. 2006. Transgenic approaches to manipulate the environmental responses of the C3 carbon fixation cycle. Plant, Cell and Environment, 29: 331–339

Ray D. K., Mueller N. D., West P. C., Foley J. A. 2013. Yield Trends Are Insufficient to Double Global Crop Production by 2050. PLoS ONE, 8: 1-8

South P. F., Cavanagh A. P., Liu H. W., Ort D. R. 2019. Synthetic glycolate metabolism pathways stimulate crop growth and productivity in the field. Plant Science, 363: 1-11

Spalding M. H. 2008 Microalgal carbon dioxide-concentrating mechanisms. Chlamydomonas inorganic carbon transporters. Journal of Experimental Botany, 59: 1463–1473

Timm S., Nunes-Nesi A., Parnik T., Morgenthal K., Wienkoop S., Keerberg O., Weckwerth W., Kleczkowski L. A., Fernie A. R., Bauwe H. 2008. A cytosolic pathway for the conversion of hydroxypyruvate to glycerate during photorespiration in Arabidopsis. The Plant Cell, 20:

2848–2859

Uehara S., Adachi F., Ito-Inaba Y., Inaba T. 2016. Specific and efficient targeting of cyanobacterial bicarbonate transporters to the inner envelope membrane of chloroplasts in Arabidopsis. Front Plant Science, 7: 16

Whitney S. M., Houtz R. L., Alonso H. 2011. Advancing our understanding and capacity to engineer nature’s CO2-sequestering enzyme, Rubisco. Plant Physiology, 155: 27–35

Yang S. M., Chang C. Y., Yanagisawa M., Park I., Tseng T. H., Ku M. S. B. 2008. Transgenic Rice Expressing Cyanobacterial Bicarbonate Transporter Exhibited Enhanced Photosynthesis,

(26)

17

Growth and Grain Yield. V: Photosynthesis. Energy from the Sun Allen J. F., Gantt E., Golbeck J. H., Osmond B, (ur.). Dordrecht, Springer: 1243–1246

Zhu X. G., Long S. P., Ort D. R. 2010. Improving Photosynthetic Efficiency for Greater Yield.

Annual Review of Plant Biology, 61: 235–261