BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Gloria KRAPEŽ
UČINEK ANTAGONISTA KEMOKINSKEGA RECEPTORJA CXCR4 NA VIABILNOST IN INVAZIJO ORGANOIDOV GLIOBLASTOMA
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ MOLEKULSKE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE
Gloria KRAPEŽ
UČINEK ANTAGONISTA KEMOKINSKEGA RECEPTORJA CXCR4 NA VIABILNOST IN INVAZIJO ORGANOIDOV GLIOBLASTOMA
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
THE EFFECT OF CXCR4 RECEPTOR ANTAGONIST ON VIABILITY AND INVASION OF GLIOBLASTOMA ORGANOIDS
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Molekulske in funkcionalne biologije na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani. Delo je bilo opravljeno na Oddelku za genetsko toksikologijo in biologijo raka na Nacionalnem inštitutu za Biologijo.
Študijska komisija je za mentorico magistrskega dela imenovala doc. dr. Barbaro Breznik, za somentorico asist. dr. Metko Novak, za recenzenta prof. dr. Marka Krefta.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: doc. dr. Miloš VITTORI
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Član: doc. dr. Barbara BREZNIK
Nacionalni inštitut za Biologijo, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka
Član: asist. dr. Metka NOVAK
Nacionalni inštitut za Biologijo, Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka
Član: prof. dr. Marko KREFT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora: 6. 9. 2021
Gloria Krapež
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 616-006.04:577.2(043.2)
KG glioblastom, glioblastomski organoid, invazija, viabilnost, mikrookolje tumorja, pleriksafor, CXCR4, SDF-1α
AV KRAPEŽ, Gloria, prof. bio. in gos. (UN)
SA BREZNIK, Barbara (mentorica), METKA Novak (somentorica), KREFT, Marko (recenzent)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij molekulske in funkcionalne biologije
LI 2021
IN UČINEK ANTAGONISTA KEMOKINSKEGA RECEPTORJA CXCR4 NA VIABILNOST IN INVAZIJO ORGANOIDOV GLIOBLASTOMA
TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja) OP X, 67 str., 11 pregl., 23 sl., 97 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Glioblastom (GBM) je najpogostejši in najagresivnejši primarni možganski tumor pri odraslem človeku. Heterogenost in mikrookolje GBM sta ključna za razvoj in odpornost GBM na klasično zdravljenje. Pomembne komponente mikrookolja tumorja so topne signalne molekule kemokini. Iz stromalnih celic pridobljen faktor 1 α (SDF-1α) je kemokin, ki z vezavo na receptor CXCR4 pospeši angiogenezo tumorja ter migracijo, invazijo in proliferacijo tumorskih celic. Poleg tega vezava SDF-1α na receptor CXCR4 sproži infiltracijo imunskih celic v tumorsko maso.
Sintetski antagonist receptorja CXCR4 pleriksafor se tako že uporablja za zdravljenje različnih rakavih obolenj. Da bi raziskali učinek pleriksaforja na GBM, smo vzpostavili organoidni model iz tumorskih biopsij. Model vključuje mikrookolje tumorja, ki je zelo podobno mikrookolju tumorja v bolnikih z GBM.
Potrdili smo prisotnost in kolokalizacijo receptorja CXCR4 in njegovega liganda SDF-1α v tumorjih in organoidih GBM na proteinskem nivoju. V vzpostavljenem organoidnem modelu smo z ligacijskim testom bližine dokazali, da pleriksafor v organoidih GBM zmanjša interakcije med CXCR4 in SDF-1α tako sam, kot v kombinaciji s temozolomidom. Pokazali smo, da pleriksafor in pleriksafor v kombinaciji s temozolomidom nima statistično pomembnega učinka na viabilnost in invazijo organoidov GBM. Razlog je lahko v kompleksnosti mikrookolja in aktivaciji drugih signalnih poti, ki so še slabo raziskane. Prihodnje raziskave bomo usmerili v analizo večjega števila tumorskih vzorcev.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 616-006.04:577.2(043.2)
CX glioblastoma, organoid glioblastoma model, invasion, viability, tumor microenvironment, plerixafor, CXCR4, SDF-1α
AU KRAPEŽ, Gloria
AA BREZNIK, Barbara (supervisor), METKA Novak (co-advisor), KREFT, Marko (reviewer)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Molecular and functional biology
PY 2021
TI THE EFFECT OF CXCR4 RECEPTOR ANTAGONIST ON VIABILITY AND INVASION OF GLIOBLASTOMA ORGANOIDS
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO X, 67 p., 11 tab., 23 fig., 97 ref.
LA sl AL sl/en
AB Glioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumour in adult humans. Heterogeneity and tumour microenvironment of GBM are crucial for progression and therapeutic resistance of GBM. Key tumour microenvironment components are soluble signalling molecules chemokines. Stromal cell-derived factor 1α (SDF-1α) is a chemokine, which after binding to CXCR4 receptor accelerates tumour angiogenesis, migration, invasion, and proliferation of tumour cells. The binding of SDF-1α and CXCR4 also induces infiltration of immune cells into the tumour mass. The antagonist of CXCR4 receptor plerixafor is currently already in clinical use for treating different cancers. To analyse the effect of plerixafor on GBM, we established an organoid model from tumour biopsies of patients with GBM. GBM organoid includes the tumour microenvironment, which is similar to the tumour microenvironment in the patient. We confirmed the presence and colocalization of the CXCR4 receptor and SDF-1α ligand in the tumour and GBM organoids at protein level. Using Proximity ligation assay we showed, that plerixafor alone and in combination with temozolomide decreases interactions between CXCR4 receptor and SDF-1α in GBM organoids. We also showed that plerixafor alone and in combination with temozolomide doesn’t have a statistically significant effect on viability and invasion of GBM organoids. The cause could be in the complexity of the tumour microenvironment and activation of alternative signalling pathways. A future studies are directed towards analyses of higher number of tumour samples.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... IX
1 UVOD ... 1
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA ... 1
1.2 NAMEN RAZISKAVE ... 1
1.3 DELOVNE HIPOTEZE ... 2
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 GLIOBLASTOM ... 3
2.2 MIKROOKOLJE MOŽGANSKIH TUMORJEV ... 5
2.2.1 Glioblastomske matične celice v mikrookolju tumorja ... 6
2.2.2 Kemokini ... 7
2.3 ZDRAVLJENJE GLIOBLASTOMA ... 11
2.3.1 Temozolomid... 11
2.3.2 Pleriksafor ... 12
2.4 EKSPERIMENTALNI MODELI ZA PREUČEVANJE GLIOBLASTOMA... 14
2.4.1 Organoidi glioblastoma ... 15
3 MATERIAL IN METODE ... 17
3.1 MATERIAL ... 17
3.1.1 Laboratorijska oprema ... 17
3.1.2 Kemikalije ... 17
3.1.3 Protitelesa in sonde ... 18
3.1.4 Mediji ... 19
3.1.5 Priprava pufrov ... 20
3.2 METODE ... 21
3.2.1 Transport in prejem vzorca glioblastoma ... 21
3.2.2 Priprava organoidov glioblastoma... 22
3.2.3 Tretiranje organoidov glioblastoma s pleriksaforjem in temozolomidom ... 23
3.2.4 Merjenje viabilnosti organoidov glioblastoma ob dodatku pleriksaforja in temozolomida ... 24
3.2.5 Merjenje invazije organoidov glioblastoma ob dodatku pleriksaforja in
temozolomida ... 24
3.2.6 Imunofluorescentno barvanjebioloških označevalcev na parafinskih tkivnih rezinah glioblastoma in organoidih glioblastoma ... 25
3.2.7 Detekcija interakcij med CXCR4 in SDF-1α ob dodatku pleriksaforja in temozolomida ... 28
3.2.8 Ligacijski test bližine na rezinah organoidov glioblastoma pred in po tretiranju s pleriksaforjem in temozolomidom ... 28
3.2.9 Mikroskopiranje ... 30
3.2.10 Izračuni in statistična obdelava podatkov ... 31
4 REZULTATI ... 33
4.1 VZPOSTAVITEV ORGANOIDOV GLIOBLASTOMA IZ TUMORJEV BOLNIKOV.. 33
4.1.1 Vzpostavitev organoida glioblastoma NIB231 ... 34
4.1.2 Rast organoida glioblastoma NIB232 ... 35
4.2 ANALIZA MIKROOKOLJA TUMORJA V ORGANOIDIH GLIOBLASTOMA ... 36
4.2.1 Prisotnost celic glioblastoma v organoidih glioblastoma in tkivu glioblastoma 37 4.2.2 Prisotnost endotelijskih celic in mezenhimskih matičnih celic v organoidih glioblastoma in tkivu glioblastoma ... 40
4.2.3 Prisotnost makrofagov in celic mikroglije v organoidih glioblastoma in tkivu glioblastoma ... 43
4.2.4 Izražanje CXCR4 in SDF-1α v organoidih glioblastoma in tkivu glioblastoma46 4.3 Učinek TEMOZOLOMIDA IN PLERIKSAFORJA v orgnoidih glioblastoma ... 48
4.3.1 Učinek temozolomida in pleriksaforja na interakcije med CXCR4 in SDF-1α 48 4.3.2 Učinek temozlomida in pleriksaforja na viabilnost organoidov glioblastoma .. 50
4.3.3 Učinek temozolomida in pleriksaforja na invazijo organoidov glioblastoma ... 51
5 RAZPRAVA ... 54
5.1 VZPOSTAVITEV IN RAST ORGANOIDOV GLIOBLASTOMA ... 54
5.2 SESTAVA IN ANALIZA MIKROOKOLJA TUMORJA V ORGANOIDIH GLIOBLASTOMA ... 55
5.3 NOVI PRISTOPI ZDRAVLJENJA GLIOBLASTOMA, KI CILJAJO MIKROOKOLJE TUMORJA ... 56
6 SKLEPI ... 59
7 VIRI ... 60
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Podtipi GBM in njihove molekularne značilnosti ... 4
Preglednica 2: Seznam uporabljene laboratorijske opreme s proizvajalci ... 17
Preglednica 3: Seznam uporabljenih kemikalij z proizvajalci... 17
Preglednica 4: Seznam uporabljenih primarnih protiteles za imunofluorescentno barvanje označevalcev na parafinskih rezinah in za ligacijski test bližine ... 18
Preglednica 5: Seznam uporabljenih sekundarnih protiteles za imunofluorescentno barvanje na parafinskih rezinah ... 19
Preglednica 6: Seznam uporabljenih Duolink PLUS in MINUS sond za metodo ligacijski test bližine ... 19
Preglednica 7: Medij za transport tumorskih biopsij (Transportni medij) ... 20
Preglednica 8: Medij za pripravo organoidov glioblastoma (medij GBO). ... 20
Preglednica 9: Redčitev β-merkaptoetanola za medij GBO. ... 20
Preglecnica 10: Pufer za redčenje protiteles (1 % BSA v 1x DPBS). ... 21
Preglednica 11: Pufer za blokiranje nespecifične vezave protiteles. ... 21
KAZALO SLIK
Slika 1: Pregled mikrookolja tumorja z različnimi komponentami in njihov pozitivnimi (+) in negativnimi (-) vplivi na glioblastom. ... 6 Slika 2: Tridimenzionalna zgradba receptorja CXCR4 in liganda SDF-1α. ... 8 Slika 3: Pregled signalnih poti po interakciji SDF-1α z receptorjema CXCR4 in CXCR7 .. 9 Slika 4: Ključni popravljalni mehanizmi in odziv celice na temozolomid... 12 Slika 5: Dvodimenzionalna struktura pleriksaforja. ... 13 Slika 6: Shematski prikaz poteka vzpostavitve organoidov glioblastoma iz vzorca
glioblastoma. ... 34 Slika 7: Zaokroževanje organoidov glioblastoma v prvih 12. dneh inkubacije iz vzorca NIB 231. ... 35 Slika 8: Rast organoida glioblastoma v obdobju 4 tednov po procesiranju glioblastoma vzorca NIB 232. ... 36 Slika 9: Odstotek rasti organoida glioblastoma NIB232, zabeleženo v obdobju 4 tednov.. 36 Slika 10: Izražanje označevalcev GFAP in SOX2 na rezinah tkiv glioblastoma in
organoidih glioblastoma vzorca NIB219. ... 38 Slika 11: Izražanje označevalcev GFAP in SOX2 na rezinah tkiv glioblastoma in
organoidih glioblastoma. ... 39 Slika 12: Izražanje označevalcev CD31 in CD105 na rezinah tkiv glioblastoma in
organoidih glioblastoma vzorca NIB218. ... 41 Slika 13: Izražanje označevalcev CD31 in CD105 na rezinah tkiv glioblastoma in
organoidih glioblastoma. ... 42 Slika 14: Izražanje označevalcev Iba1 in CD68 na rezinah tkiv glioblastoma in organoidih glioblastoma pri vzorcu NIB218. ... 44 Slika 15: Izražanje označevalcev Iba1 in CD68 na rezinah tkiv glioblastoma in organoidih glioblastoma. ... 45 Slika 16: Izražanje CXCR4 in SDF-1α na rezinah tkiv glioblastoma in organoidih
glioblastoma. ... 47 Slika 17: Kolokalizacije proteinov CXCR4 in SDF-1α v tkivnih rezinah glioblastoma (vzorec NIB218). ... 48 Slika 18: Interakcije med CXCR4 in SDF-1α po tretiranju s temozolomidom in
pleriksaforjem v organoidih glioblastoma. ... 49 Slika 19: Število interakcij med CXCR4 in SDF-1α v organoidih glioblastoma vzorca NIB232 po tretiranju s temozolomidom in pleriksaforjem.. ... 50 Slika 20: Viabilnost organoidov glioblastoma NIB216 in NIB232 po tretiranju s
temozolomidom in pleriksafojem. ... 51 Slika 21: Invazija organoida glioblastoma NIB232 po tretiranju s temozolomidom in pleriksaforjem, merjena po 24 h in 48 h. ... 52 Slika 22: Primerjava invazije celic iz organoidov glioblastoma vzorca NIB232 24 ur in 48 ur po tretiranju s temozolomidom in pleriksaforjem.. ... 53
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A. E. arbitrarna enota
AIC 5-aminoimidazol-4-karboksamid Akt proteinska kinaza B
ANOVA enofaktorska analiza variance ATP adenozin-5-trifosfat
BBB krvno-možganska pregrada (angl. blood brain barrier)
BER mehanizem popravljanja z izcepom baze (angl. base excision repair) BSA goveji serumski albumin
CRISPR gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (angl.
clustered regularly interspaced short palindromic repeats)
CXCL2 kemokin, vsebujoč motiv C-X-C 2 (angl. chemokine (C-X-C motif) ligand 2) CXCR4 C-X-C kemokinski receptor tipa 4 (angl. C-X-C chemokine receptor type 4) CXCR7 C-X-C kemokinski receptor tipa 7 (angl. C-X-C chemokine receptor type 7) DAPI 4, 6-diamidino-2-fenilindol
DMSO dimetilsulfoksid DNK
DPBS
deoksiribonukleinska kislina
Dulbecov fosfatni pufer s soljo (angl. Dulbecco's phosphate-buffered saline) ECM zunajcelični matriks (angl. extracellular matrix)
EGFR receptor za epidermalni rastni dejavnik (angl. epidermal growth factor receptor)
Erk 1/2 zunajcelično signalno regulirana kinaza 1/2 FBS fetusni serum goveda
GBM glioblastom
GBO organoid glioblastoma
GLICO cerebralni organoid glioblastoma
GSC glioblastomske matične celice (angl. glioblastoma stem cells) HIF-1α ob hipoksiji inducirani faktor 1α
HIV humani imunodeficientni virus IDH izocitrat dehidrogenaza
MAPK z mitogenom aktivirana proteinska kinaza MGMT metilgvanin-DNK metiltransferaza
MMR popravljanja neujemanja (angl. mismatch repair) MTIC 5-(3-metil)-1-triazen-1il-imidazol-4-karboksimid NBE nevrobazalno gojišče
NEAA neesencialne aminokisline
neoCOR neoplastični cerebralni organoidi (angl. neoplastic cerebral organoids) NF1 nevrofibromin 1
NO dušikov oksid
P/S penicilin-streptomicin
PDGFRA receptor trombocitnega rastnega faktorja α (angl. platelet-derived growth factor receptor α)
PI3K fosfatidilinozitol-3-kinaza PTK tirozin kinaza
RB retinoblastoma
RBC pufer za lizo eritrocitov (angl. red blood cell lysis buffer) rpm vrtljaji na minuto (angl. revolutions per minute)
SDF-1α iz stromalnih celic pridobljen faktor 1 α
TAM s tumorjem povezani makrofagi (angl. tumor-associated macrophages) TCGA Atlas genoma raka (angl. The Cancer Genome Atlas)
TME mikrookolje tumorjev (angl. tumor microenvironment) TMZ temozolomid
TNF dejavnik tumorske nekroze
VEGF vaskularni endotelijski rastni faktor (angl. vascular endothelial growth factor)
WHO Svetovna zdravstvena organizacija (angl. World Health Organization) WIF1 WNT inhibitorni dejavnik 1
1 UVOD
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Glioblastom (GBM) je najpogostejši in najagresivnejši primarni možganski tumor pri človeku. Zaradi odpornosti na zdravljenje imajo bolniki s to obliko raka zelo kratko preživetje, povprečna življenjska doba po diagnozi je le okoli 15 mesecev (Alexander in Cloughesy, 2017). Heterogenost in tumorsko mikrookolje GBM sta ključna za razvoj in odpornost GBM na klasično zdravljenje (Hira in sod., 2020). Kljub številnim napredkom na področju poznavanja bioloških mehanizmov napredovanja GBM ostaja zdravljenje bolnikov z GBM neučinkovito.
Mikrookolje tumorja sestavljajo tako rakave kot ne rakave celice, kot so stromalne in imunske celice. Poleg tega se v mikrookolju tumorja nahajajo različne signalne molekule, kot so kemokini (Schiffer in sod., 2019). Kemokini so nizkomolekularni proteini, ki sodelujejo v različnih procesih napredovanja raka, vključno z angiogenezo tumorja, migracijo, invazijo in proliferacijo tumorskih celic ter so odgovorni za infiltracijo imunskih celic v tumorsko maso. Kemokini zato predstavljajo tarčo za zdravljenje raka (Furusato in Rhim, 2009). Kemokin SDF-1α (iz stromalnih celic pridobljen faktor 1 α) se izraža in izloča v GBM, kjer preko vezave na receptor CXCR4 pospeši angiogenezo tumorja, proliferacijo in invazijo tumorskih celic v okoliško tkivo (Kenig in sod., 2010). Imunske, endotelijske in različne stromalne celice izločajo SDF-1α v mikrookolje tumorja, ki inducira izražanje CXCR4 na tumorskih celicah, kar vodi v povečano odpornost na zdravljenje (Wang in sod., 2020).
Ključen razlog za slabše razumevanje vpliva tumorskega mikrookolja na GBM je v pomanjkanju dobrih tumorskih modelov, ki bi omogočali natančnejše študije mikrookolja GBM. Biološki mehanizmi znotraj mikrookolja tumorja na molekularni ravni še niso dobro poznani. Za razumevanje mikrookolja tumorjev in s tem boljši razvoj tarčnih zdravil, je potrebno vzpostaviti tumorske modele, ki čim bolje posnemajo značilnosti tumorja v bolnikih. Tumorski organoidi za različne vrste raka so že razviti, vključno z GBM. V laboratoriju na Nacionalnem inštitutu za biologijo smo vzpostavili organoide GBM, pridobljene iz svežih tumorjev bolnikov, ki zajemajo kompleksno mikrookolje v tumorju ter imajo enak genetski zapis ter histološke lastnosti kot primarni tumor v bolniku (Jacob in sod., 2020).
1.2 NAMEN RAZISKAVE
V okviru magistrskega dela smo želeli raziskati vpliv antagonista kemokinskega receptorja CXCR4 pleriksaforja na viabilnost in invazijo organoidov GBM v kombinaciji s kemoterapijo. Za doseg tega cilja smo najprej vzpostavili model organoidov GBM iz
tumorskih biopsij in v njem preverili prisotnost celic tumorskega mikrookolja, receptorja CXCR4 ter kemokina SDF-1α. Nato smo preverili učinek antagonista CXCR4, temozolomida ter kombinacijo obeh na viabilnost in invazijo organoidov GBM. Na koncu smo analizirali učinek antagonista CXCR4 na interakcije med SDF-1α in CXCR4 v organoidih GBM.
1.3 DELOVNE HIPOTEZE
H1: Proteina receptor CXCR4 in kemokin SDF-1α sta izražena tako v tumorjih kot v organoidih GBM.
H2: Število interakcij med receptorjem CXCR4 in kemokinom SDF-1α se zmanjša v prisotnosti antagonista CXCR4, kar povzroči zmanjšanje viabilnosti in invazije celic v organoidih GBM.
H3: Kombinacija antagonista CXCR4 s kemoterapijo poveča inhibitorni učinek na viabilnost in invazijo celic v organoidih GBM.
2 PREGLED OBJAV
2.1 GLIOBLASTOM
GBM je najpogostejši in najagresivnejši primarni maligni tumor osrednjega centralnega živčnega sistema. Kljub številnim napredkom na področju medicine ostaja preživetje bolnikov po diagnozi zelo kratko, v povprečju 15 mesecev. Zgolj 4–5 % bolnikov z GBM preživi 5 let ali več po diagnozi (Batash in sod., 2017). Zelo slaba prognoza bolnikov je povezana s heterogenostjo tumorja, invazijo celic GBM in prisotnostjo glioblastomskih matičnih celic (angl. glioblastoma stem cell, GSC), kar vse onemogoča učinkovito zdravljenje GBM s konvencionalnim pristopom zdravljenja in različen odziv bolnikov na zdravljenje (Hira in sod., 2020).
Poleg tega je razlog za slabšo pričakovano življenjsko dobo po postavljeni diagnozi dejstvo, da GBM pogosteje prizadene starejšo populacijo. Povprečna incidenca pojavnosti tumorja za celotno populacijo Združenih držav Amerike znaša 3,2 osebe na 100.000 prebivalcev. Vrednost se drastično poviša pri populaciji, stari med 75 in 84 let, kjer incidenca znaša 15,24 oseb na 100.000 prebivalcev. Povprečna starost oseb z GBM zato znaša 64 let (Alexander in Cloughesy, 2017). Kljub temu se tumor lahko pojavi tudi pri otrocih, kjer je zabeležena incidenca 1,1–3,6 na 100.000 otrok. Tako pri otroški, kot pri odrasli obliki se GBM pogosteje pojavlja pri moških (Batash in sod., 2017).
Gliomi predstavljajo 80% vseh malignih primarnih možganskih tumorjev in 28 % vseh možganskih tumorjev. GBM je astrocitom in ga uvrščamo v skupino odraslih difuznih gliomov (angl. adult-type diffuse gliomas). GBM uvrščamo v stopnjo IV po lestvici malignosti Svetovne zdravstvene organizacije (angl. World health organization, WHO) , saj predstavljajo najbolj invazivno in maligno obliko možganskega tumorja. GBM se po novi klasifikaciji iz leta 2021 razlikuje od ostalih astrocitomov IV. stopnje po tem, da ne vsebuje mutacije gena izocitrat dehidrogenaze (IDH) (Louis in sod., 2021).
Razvoj GBM je povezan z genetskimi spremembami in spremembami v številnih signalih poteh. Verhaak in sod. so iz podatkovne baze Atlasa genoma raka (angl. The Cancer Genome Atlas, TCGA) opredelili ključne mutacije v genih PDGFRA, IDH1, EGFR, TP53 in NF1 in na podlagi tega leta 2010 GBM ločili v 4 podtipe (Preglednica 1) (Verhaak in sod., 2010). Gen PDGFRA gen kodira informacijo za receptor trombocitnega rastnega faktorja α (angl. platelet-derived growth factor receptor α), ki sodeluje pri aktivaciji receptorja tirozin-kinaze. PDGFRA sodeluje pri proliferaciji in preživetju celic. Gen IDH1 kodira zapis za protein izocitrat dehidrogenazo, ki je pomemben za celični metabolizem, saj razgrajuje maščobne molekule za energijo in ščiti celico pred škodljivimi molekulami.
Gen EGFR kodira informacijo za receptor epidermalnega rastnega dejavnika, ki je vpleten v rast in preživetju celic. Gen NF1 kodira zapis za nevrofibromin 1, ki regulira celično rast.
Ob zmanjšanem izražanju NF1 se celice nenadzorovano delijo (Parker in sod., 2015). Vse te genetske mutacije vodijo do sprememb v eni ali več izmed treh signalnih poti, ki so ključne za nastanek GBM. Protein tirozin kinaza (PTK)/RAS/ fosfoinozidin kinaza 3 (PI3K) je signalna pot, ki je spremenjena v 88 % vseh GBM, p53 signalna pot je spremenjena v 87 % GBM in retinoblastomska signalna pot (RB), ki je spremenjena v 78
% vseh GBM (Hanif in sod., 2017).
Iz spodnje preglednice (Preglednica 1) je razvidna velika pestrost v nastanku GBM. Meje med podtipi niso strogo zastavljene, saj se lahko molekularne spremembe posameznih podtipov med seboj prekrivajo. To vodi v inter-tumorsko heterogenost, saj se tumorji GBM med bolniki zelo razlikujejo, kar otežuje zdravljenje. Poleg tega je GBM znotraj posameznega tumorja zelo heterogen, tako na celičnem kot genetskem nivoju. Intra- tumorska heterogenost vodi do odpornosti na zdravljenje in ponovitve bolezni po zdravljenju (Parker in sod., 2015).
Preglednica 1: Podtipi GBM in njihove molekularne značilnosti (Verhaak in sod., 2010).
Podtip GBM Molekularne značilnosti Mezenhimalni
podtip
- Mutiran gen NF1
- Izraženi mezenhimalni označevalci - Izraženi astrocitni označevalci
- Izraženi geni super-družine dejavnikov tumorske nekroze (angl. tumor necrosis factor TNF)
- Višja stopnja nekroze in infiltracija vnetnih celic v okolico GBM Klasični
podtip
- Duplikacije na kromosomu 7 in delecije na kromosomu 10 - Višje izražanje gena EGFR
- Gen TP53 ni mutiran
- Izguba gena CDKN2A, ki vpliva na signalno pot RB
- Višje izraženi nevralni prekurzorji in označevalci matičnih celic - Višje izraženi NOTCH in aktivacija signalne poti Sonic hedgehog Pronevralni
podtip
- Mutiran gen PDGFRA
- Točkovne mutacije gena IDH1 - Mutiran gen TP53
- Višje izražanje oligodendrocitnih razvojnih genov - Višje izražanje OLIG2 (zniža izražanje p21) - Višje izraženi pronevralni razvojni geni Nevralni
podtip
- Višje izražanje nevralnih označevalcev
Etiologija GBM je še zelo slabo raziskana. V 1 % primerov je prisotna družinska oblika, ki ima značilen genetski in molekulski vzorec, kateri je zato pogostejši med sorodniki s podobno genetsko zasnovo. Pogosteje se GBM razvije pri osebah, ki imajo ali so preboleli Turcotov sindrom, tuberozno sklerozo ali nevrofibromatozo tipa I. Nekateri virusi, kot je človeški citomegalovirus, prav tako predstavljajo rizični dejavnik za nastanek GBM, saj
vplivajo na ključne signalne poti in s tem vplivajo na številne procese v celicah in tkivih, kot so mitogeneza, mutageneza, apoptoza, vnetje in angiogneza (Batash in sod., 2017).
Ena ključnih lastnosti GBM, ki preprečuje popolno kirurško odstranitev in s tem ponovitev bolezni, je invazija posameznih celic v okoliško zdravo možganovino. Celice GBM migrirajo od prvotne tumorske mase tudi 4 do 7 cm stran in se zbirajo pod notranjo možgansko ovojnico, okrog nevronov in krvnih žil. Pogosto migrirajo v regije, ki so ključne za preživetje bolnika (Holland, 2000). Možganski zunajcelični matriks (angl.
extracellular matrix, ECM) je sestavljen iz kolagena, lamininov in fibronektina, ki se nahajajo pretežno ob BBB. Pomemben je za ohranjanje diferenciacijskega potenciala nevronskih matičnih celic, hkrati pa ohranja in ščiti tudi rakave matične celice (Quail in Joyce, 2017). Celice GBM z izločanjem proteoliznih encimov cepijo komponente ECM, kar pospeši vaskulogenezo in invazijo celic GBM v okoliško tkivo (Mentlein in sod., 2012).
2.2 MIKROOKOLJE MOŽGANSKIH TUMORJEV
Mikrookolje tumorja (angl. tumor microenvironment, TME) sestavljajo tako rakave kot nerakave celice, kot so stromalne in imunske celice. Poleg tega se v mikrookolju tumorja nahajajo krvne žile, zunajcelični matriks ter različne signalne molekule (Mbeunkui in Johann, 2008). Pregled sestave TME je prikazan na Sliki 1. TME predstavlja ključno komponento visoke odpornosti na standardne oblike zdravljenja in preživetje GBM.
Možgansko tkivo je ločeno od ostalih delov telesa. Poleg tega pa krvno-možganska pregrada (angl. blood brain barrier, BBB) uravnava prepustnost toksinov, patogenov, vnetnih celic iz periferije ter protirakavih učinkovin (Abbott, 2013). Ključne razlike TME možganskih tumorjev od ostalih tumorjev predstavlja prisotnost celic centralnega živčnega sistema, kot so nevroni, astrociti, celice mikroglije in oligodendrociti. Poleg teh so v TME možganskih tumorjev prisotne tudi celice imunskega sistema, kot so monociti, T limfociti, bazofilci, nevtrofilci in makrofagi. Pomembni elementi TME so endotelijske celice in komponente ECM (Broekman in sod., 2018). K TME prištevamo tudi topne proteinske in ne proteinske molekule, kot so polisaharidi, hormoni in dušikov oksid (NO), ki jih celice TME proizvajajo in izločajo v okolico (Schiffer in sod., 2015). Celice TME med seboj komunicirajo neposredno preko presledkovnih stikov in nanocevk ter posredno preko topnih molekul in zunajceličnih veziklov (Quail in Joyce, 2017). S tem vplivajo na razvoj tumorja. V magistrskem delu se bomo posvetili majhnim topnim proteinskim molekulam – citokinom.
Slika 1: Pregled mikrookolja tumorja z različnimi komponentami in njihov pozitivnimi (+) in negativnimi (-) vplivi na glioblastom. Okrajšave: (ECM) zunajcelični matriks, GBM (glioblastom), GSC (glioblastomske matične celice), TME (mikrookolje tumorja), WIF1 (WNT inhibitorni dejavnik 1), (Prirejeno po Broekman in sod., 2018, narejeno s programom Biorender.com).
2.2.1 Glioblastomske matične celice v mikrookolju tumorja
GSC so nediferencirane celice, ki imajo sposobnost tvorjenja tumorja, samoobnavljanja, diferenciacijo v številne bolj specializirane celične podtipe in asimetrične delitve, pri čemer tvorijo nove GSC in diferencirane celice GBM (Vescoti in sod., 2006). Pogosto se nahajajo v specializiranih hipoksičnih področjih GBM ob žilah, ki jih imenujemo hipoksične perivaskularne niše. Te regije omogočajo vse potrebne signale, da GSC vzdržujejo matičnost in preprečujejo diferenciacijo teh celic. GSC se v teh nišah počasneje delijo ali pa sploh ne, kar jim omogoča preživetje med zdravljenjem s kemoterapijo in obsevanjem. Preživele GSC po končani terapiji ponovno vzpostavijo populacijo celic GBM (Aderetti in sod., 2018; Hira in sod., 2020). GSC so odporne na terapijo tudi zaradi izražanja številnih mehanizmov popravljanja DNK in transporterjev, ki odstranjujejo citotoksične molekule iz celice (Bao in sod, 2006).
2.2.2 Kemokini
Kemokini so kemotaktični proteini iz skupine citokinov z majhno molekulsko maso (7–
15 kDa), ki uravnavajo angiogenezo tumorjev, promovirajo apoptozo, migracijo, invazijo in proliferacijo celic, sodelujejo pri adheziji celic ter privlačijo imunske celice v tumorje (Janssens in sod., 2018). Poznamo preko 50 človeških kemokinov in 20 specifičnih kemokinskih receptorjev (Mantovani in sod., 2006). Kemokine razvrščamo v 4 skupine glede na položaj ohranjenega cisteinskega ostanka. Največja skupina, imenovana CC, ima ohranjena 2 cisteinska ostanka, skupina C ima ohranjen samo 1 cisteinski ostanek, skupini CXC in CX3C imata poleg cisteinskega ostanka pripete še 1 do 3 aminokisline. Kemokine lahko delimo tudi glede na njihovo funkcijo v telesu na vnetne in homeostatske (Janssens in sod., 2018). Kemokini se vežejo na transmembranski z G proteinom vezan receptor, kar v celicah sproži signalno transdukcijo, spremembe v nivoju kalcija in aktivaciji transkripcijskih dejavnikov. Sproži se prepis genov, udeleženih v procesih celične adhezije, migracije in invazije, kot so komponente ECM in proteolizni encimi. Vse to vodi v migracijo in invazijo celic proti višjim koncentracijam kemokinov. Ta proces imenujemo kemotaksa. Poleg tega vezava kemokinov na receptorje sproži številne druge celične procese, ki vplivajo na proliferacijo celic in samoobnavljanje matičnih celic (Zlotnik in Yoshie, 2000).
Celice GBM izražajo kemokinske receptorje, kar vodi v njihovo večjo proliferacijo, migracijo in angiogenezo tumorja. Za našo raziskavo je ključen kemokin iz stromalnih celic pridobljen faktor 1 α (SDF-1α), imenovan tudi CXCL12, in njegov receptor CXC kemokinski receptor tipa 4 (angl. C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4), ki predstavljata potencialno tarčo za zdravljenje GBM (Domanska in sod., 2011).
2.2.2.1 Kemokin SDF-1α in kemokinski receptor CXCR4
SDF-1α sodi v CXC skupino kemokinov in se izraža v celicah imunskega sistema, centralnega živčnega sistema, stromalnih celicah, fibroblastih, endotelijskih celicah, osteoblastih in tumorskih celicah pri višjih vretenčarjih (Gomperts in Strieter, 2006). SDF- 1α se veže na receptorja CXCR4 in CXCR7 (Levoye in sod., 2009). Opis in slika 3D strukture CXCR4 in SDF-1α je prikazana na Sliki 2. Receptor CXCR4 se izraža v celicah imunskega sistema, hematopoetskih in endotelijskih celicah, nevronih in matičnih celicah.
Izražanje CXCR4 je povišani v tumorskih celicah, kot so celice GBM (Bianchi in Mezzapelle, 2020). Po aktivaciji receptorja CXCR4 z SDF-1α se sproži homo- ali heterodimerizacija z receptorjem CXCR7 (Slika 3), ki vpliva na proliferacijo, diferenciacijo, migracijo, preživetje in odgovor na stres v tarčnih celicah. Kemokin SDF- 1α se z višjo afiniteto veže tudi na receptor CXCR7, kar vodi do odstranjevanju odvečnega SDF-1α iz okolice in vzpostavitve koncentracijskega gradienta (Levoye in sod., 2009) Ob homodimerizaciji receptorja CXCR4 se v GBM preko G-proteina sprožijo signalne poti: z
mitogenom aktivirana proteinska kinaza (MAPK), adenilat ciklaza, PI3K, proteinska kinaza B (Akt) in fosfolipaza C. Pri hetero-dimerizaciji receptorja CXCR4 in CXCR7 se aktivira β-arestina, ki sproži odgovor na stres preko p38 in c-jun n-terminalne kinaze. SDF- 1α se lahko veže tudi na glikozaminoglikane ECM in tvori kemokinski gradient, ki je potreben za migracijo celic (Giordano in sod., 2019).
Aktivacija receptorja ključno vpliva na razvoj centralnega živčnega sistema, zaščito in modulacijo nevronov ter sodeluje pri interakciji med nevroni, celicami mikroglije in astrociti. SDF-1α sodi v skupino homeostatskih citokinov, ki so vpleteni v migracije hematopoetskih celic in njihove adhezije pri nadzoru imunskega sistema (Würth in sod., 2014). Prav tako je pomemben za ohranjanje diferenciacijskega potenciala tkivnih matičnih celic (Janssens in sod., 2018). Izražen je v številnih organih, kot so kostni mozeg, srce, jetra, pljuča, limfni vozli, v ledvicah in možganih. Številne študije so potrdile vpletenost SDF-1α pri patoloških procesih, kot so vnetja, srčna popuščanja in poškodbe organov po obsevanju, saj se izrazito izloča v hipoksičnih in ožiljenih področjih (Li in Ransohoff, 2009).
Slika 2: Tridimenzionalna zgradba receptorja CXCR4 in liganda SDF-1α. (A) kristalna struktura receptorja CXCR4. Receptor je sestavljen iz 352 aminokislin (AK), ki so organizirane v 16 heliksov (modro) (od tega 7 transmembranskih alfa heliksov) in 6 beta ploskev (modro). Po vezavi s SDF-1α se dimerizira. Na sliki je prikazana samo veriga A. (B) kristalna struktura kemokina SDF-1α. Ligand je sestavljen iz 88 AK, ki tvorijo 6 beta ploskev (modro) in 4 helikse (rdeče) (Pawig in sod., 2015). 3D strukture so pridobljene iz spletne strani Uniprot.org ter urejene v programu PyMOL).
Slika 3: Pregled signalnih poti po interakciji SDF-1α z receptorjema CXCR4 in CXCR7 (prirejeno po Giordano in sod., 2019. Slika je izdelana s programom BioRender.com.
2.2.2.2 Vloga signalne poti SDF-1α-CXCR4/7 v raku in glioblastomu
SDF-1α in CXCR4 sta pomembna tudi pri tvorbi in napredovanju številnih tumorjev, kot so tumor trebušne slinavke, debelega črevesa, prostate, dojke, jajčnikov, ledvic, limfoma, melanoma, nevroblastoma in GBM. V skupni na NIB-u so mehanizem delovanja proučevali v so-kulturah endotelijskih in GBM celic (Kenig in sod. 2010). Endotelijske celice, ki izločajo SDF-1α privlačijo GBM celice in znatno pospešijo njihovo invazijo preko vezave kemokina na CXCR4, ki ga izražajo celice U87 GBM. Uporabili so SDF-1 nevtralizirajoče protitelo, ki je invazijo znižalo na nivo samih monokultur. Pospešeno invazijo je spremljalo izločanje proteoliznih encimov, metaloproteaze MMP9 ter katepsinov B in S. Podoben proces so kasneje dokazali v GBM tkivnih nišah, kjer ta signalna os deluje na medsebojno interakcijo med GBM matičnimi celicami (GSC) in endotelijskimi celicami ob artrioloah (Hira in sod., 2020) Verbovšek in sod. (2015) so dokazali, da GBM izloča tudi katepsin K, ki lahko proteolizno inaktivira SDF-1a s cepitvijo N-treminalnega dela, ki se veže na receptor (Hira in sod., 2017).
SDF-1α in CXCR4 signalna os s svojim avtokrinim in parakrinim delovanjem vpliva na invazivnost, preživetje, diferenciacijo in proliferacijo tumorskih celic ter metastaziranje tumorjev (Würth in sod., 2014). Hipoksija v GBM prav tako vpliva na povečano izražanje SDF-1α preko aktivacije od hipoksije odvisnega faktorja 1α (HIF-1α).
Hipoksija pospeši angiogenezo in aktivira migracijo celic GBM stran od nekrotičnih predelov tumorja (Würth in sod., 2014). Visoke koncentracije SDF-1α sprožijo migracijo
CXCR4-pozitivnih krvnih celic iz kostnega mozga in s tem pospešijo rekonstrukcijo tumorskega ožilja po obsevanju ali poškodbah (Li in sod., 2018). SDF-1α v povezavi s CXCR4 vpliva tudi na TME, saj modulira izražanje ostalih citokinov, kot so interlevkin 2 in interlevkin 8, hkrati pa na izražanje receptorja CXCR4 vplivajo tudi dejavniki, ki jih izločajo celice TME. Interakcija med SDF-1α in TME tako vodi do proliferacije, migracije in preživetja celic GBM po radioterapiji in kemoterapiji (Würth in sod., 2014).
Signalna pot SDF-1α-CXCR4 je pomembna tudi za ohranjanje GSC v njihovih perivaskularnih nišah. Kemokin SDF-1α namreč izločajo endotelijske celice v perivaskularnih nišah. SDF-1α se veže na receptor CXCR4 na GSC, kar sproži migracijo GSC v smeri gradienta SDF-1α in zato potujejo v niše (Aderetti in sod., 2018, Verbovšek in sod, 2015). Ko GSC dosežejo hipoksične perivaskularne niše, se aktivirajo številne signalne poti, kot so PI3K in Akt, ki povečajo prepisovanje receptorja CXCR4, kar vodi v ohranitev GSC v nišah (Richardson, 2015). Pomembna značilnost SDF-1α/CXCR4 vezave je tudi, da zavira diferenciacijo in proliferacijo GSC, zato te ohranjajo svojo matičnost (Giordano in sod., 2019). Fareh in sodelavci so to dokazali z inhibicijo receptorja CXCR4 v GSC, kar je posledično inhibiralo signalno pot Hedgehog. Prišlo je do večje proliferacije GSC celic in izgube matičnosti preko signalne poti GLI1-NANOG-p53 (Fareh in sod., 2011).
2.2.2.3 Vloga SDF-1α pri infiltraciji imunskih celic v glioblastom
Centralni živčni sistem se razlikuje od drugih tkiv in delov človeškega telesa tudi po prisotnosti specializiranih imunskih celic. Možgansko tkivo vključuje celice mikroglije, ki imajo vlogo primarnega imunskega sistema v možganih. Celice mikroglije sodijo v skupino celic nevroglije, kamor sodijo tudi ependimske celice, astrociti in oligodendrociti.
So specializirane imunske celice osrednjega živčevja, ki imajo sposobnost migracije in fagocitoze, hkrati pa imajo vlogo antigen predstavitvenih celic in odstranjevanja napačnih živčnih povezav (Broekman in sod., 2018). V periferiji vlogo imunskega sistema opravljajo makrofagi. Makrofagi sodijo v skupino levkocitov, ki s fagocitozo odstranjujejo telesu tuje delce ali delce odmrlih celic. Druga pomembna vloga makrofagov je aktivacija vnetnih odgovorov in sproščanje nekaterih citokinov. Podobno kot celice mikroglije imajo tudi makrofagi vlogo antigen predstavitvenih celic, vendar zaradi BBB v normalnih pogojih ne vstopajo v možgansko tkivo (Shapouri-Moghaddam in sod., 2018). V poznejših fazah razvoja GBM pa se pogosto zgodijo spremembe BBB, zaradi česar v TME vdrejo monociti, ki se diferencirajo v makrofage. Makrofage v tumorjih imenujemo s tumorjem povezani makrofagi (TAM). Rekrutacija TAM poteka preko kemokinov, kot je SDF-1α (Lopez-Gil in sod., 2021). TAM in celice mikroglije lahko predstavljajo do 50 % mase tumorja GBM in pomembno vplivajo na razvoj GBM preko sproščanja citokinov in rastnih dejavnikov (Hambardzumyan in sod., 2015). Poleg makrofagov v TME GBM migrirajo tudi nevtrofilne in bazofilne celice, limfociti T in naravne celice ubijalke, ki jih s citokini
in kemokini privablja GBM. Pogosto se rekrutacija imunskih celic zgodi kot odziv po operaciji tumorja ali zdravljenju s kemoterapijo in obsevanjem. Poleg SDF-1α so pomembni kemokini, ki sodelujejo pri migraciji imunskih celic, interlevkin 8, TNF in kemokin 2, vsebujoč motiv CXC (CXCL2) (Broekman in sod., 2018).
2.3 ZDRAVLJENJE GLIOBLASTOMA
GBM je agresiven tumor, saj je povprečna doba preživetja brez zdravljenja zgolj 3 mesece.
V ospredju zdravljenja stoji maksimalna možna operativna odstranitev tumorja, ki je pomembna tako za diagnozo, kot tudi podaljšanje življenja ob popolni odstranitvi. Za boljšo resekcijo se uporablja 5-aminolevulinsko kislino, ki se po zaužitju akumulira v celicah GBM in pretvori v fluorescenten produkt. Tumorske celice postanejo fluorescentno obarvane in se jih zato lažje loči med operacijo od zdravega možganskega tkiva, ki ne fluorescira. Operativno odstranitev se pogosto kombinira z radioterapijo in kemoterapijo s temozolomidom (TMZ) (Tamimi in Juweid, 2017). Pooperativna radioterapija je zlati standard zdravljenja GBM. Povprečno se bolnikom dodeli dozo 60 Gy v manjših frakcijah (1,8–2,0 Gy), vendar to lahko odstopa glede na starost in stanje bolnika (Batash in sod., 2017). Radioterapija povzroči dvojne prelome v deoksiribonukleinski kislini (DNK) tumorskih celic, kar prekine vstop celic v celični cikel in celično smrt (Schaue in Mcbride, 2015). Kljub temu tovrstno zdravljenje ni dovolj za zaustavitev napredovanja GBM, zato se vedno v terapijo vključi zdravljenje s kemoterapijo. Stupp in sodelavci (2005) so s študijo na 573 bolnikih dokazali statistično signifikantno izboljšanje zdravljenja bolnikov z GBM z radioterapijo in TMZ. Skupina, ki je bila po operativni odstranitvi tumorja zdravljena samo z radioterapijo, je imela povprečno življenjsko dobo 12,1 mesecev, medtem ko je skupina z radioterapijo in TMZ živela v povprečju 14,6 mesecev (Stupp in sod., 2005).
2.3.1 Temozolomid
Bolniki zaužijejo TMZ oralno, saj je stabilen na kislem pH in se zato absorbira nespremenjen. TMZ je derivat imidazola in se v telesu spontano hidrolizira v aktivni metabolit monometil triazen 5-(3-metil)-1-triazen-1il-imidazol-4-karboksimid (MTIC), ki prehaja BBB in vstopa v tumorske celice (Mrugala in sod., 2008). MTIC nato reagira z vodo, pri čemer se cepi na 5-aminoimidazole-4-karboksamid (AIC) in metil diazoniumski kation. Kation nato preferenčno metilira DNK na N7 poziciji gvaninsko bogatih regij ter N3 poziciji adeninskih in O6 gvaninskih ostankih (Darkes in sod., 2002).
Citotoksično delovanje TMZ (Slika 4) temelji predvsem na metilaciji O6 gvaninov. Ob tem se vklopijo celični popravljalni mehanizmi z encimom metilgvanin-DNK metiltransferaza (MGMT) in metilacijo odpravijo, pri čemer ponovno vzpostavijo gvanin.
Popravljalni mehanizem z MGMT je v GBM pogosto okvarjen, saj je promotor MGMT metiliran. Tako metilacija gvaninov vodi v napačno parjenje gvanina s timinom (namesto
citozinom) pri replikaciji DNK. Napaka v neujemanju baz aktivira mehanizem popravljanja neujemanja (angl. mismatch repair, MMR), ki na novi verigi odstrani timin ter ga poskuša zamenjati s pravilno bazo. Ker se na to mesto vedno znova veže timin, se celični cikel dlje časa zadrži v fazi G2/M celičnega cikla, kar posledično vodi v apoptozo celice (Zhang in sod., 2011). Metiliran promotor MGMT je dober prognostični označevalec odziva na zdravljenje s TMZ. Bolniki z GBM, ki imajo metiliran promotor za MGMT, se na zdravljenje s TMZ veliko bolje odzivajo in imajo v povprečju 6,4 mesece daljšo življenjsko dobo po kemoterapiji s TMZ in obsevanju kot bolniki z brez metilacije promotorja MGMT (Parker in sod., 2015). Kemoterapija s TMZ je po navadi uspešna samo nekaj mesecev, potem GBM pridobijo nove mehanizme, ki zaobidejo apoptotične učinke TMZ in se bolezen ponovi. Zato je pomembno, da se v načrt zdravljenja vključi nove pristope z novimi tarčami, ki bi povečale preživetje bolnikov z GBM.
Slika 4: Ključni popravljalni mehanizmi in odziv celice na temozolomid. Po vstopu TMZ v celice se metilirajo O6 gvanini (O6-Me-G), ki v primeru neutišanega gena metilgvanin-DNK metiltransferaza (MGMT+) vodi v preživetje celice. Če je MGMT utišan (metiliran, MGMT-) in mehanizem popravljanja neujemanja neutišan (MMR+), pride do citotoksičnega delovanja. Pri utišanem mehanizmu popravljanja neujemanj (MMR-) se mutacijo tolerira, kar vodi v preživetje. Druga pot delovanja TMZ v celicah je N7 metilacija gvaninov in N3 metilacija adeninov (N7-, N3-Me-Purin), kar aktivira mehanizem popravljanja z izcepom baze (BER) in preživetje celice (povzeto po Zhang in sod., 2011). Slika je izdelana v programu BioRender.com.
2.3.2 Pleriksafor
Pleriksafor ali AMD3100 (kot zdravilo imenovan Mozobil) je sintetski nizkomolekularni antagonist receptorja CXCR4 in zato prepreči vezavo SDF-1α na receptor CXCR4 (Slika 5). Kemijska zgradba pleriksaforja predstavlja 2 ciklamska obroča, ki sta med seboj povezana z aromatskim mostom. Pleriksafor se specifično veže na receptor CXCR4.
Pleriksafor za bolnika ni citotoksičen (> 500 µg/ml) (De Clercq, 2003).
Slika 5: Dvodimenzionalna struktura pleriksaforja (pridobljeno iz pubchem.ncbi.nlm.nih.gov).
Pleriksafor že uporabljajo v klinične namene pri zdravljenju krvnih rakov, kot so ne- Hodgkinov limfom, multipli mielom in mielom za mobilizacijo tumorskih hematopoetskih matičnih celic (CD34+ celic) iz niš v kostnem mozgu. Stromalne celice kostnega mozga izločajo povečane količine SDF-1α in tako zadržujejo CD34+ celice v kostnem mozgu, vendar s prekinitvijo povezave te celice izplavajo v periferijo, kjer jih izolirajo iz krvi (DiPersio in sod., 2009; Keating, 2011). To je še posebej pomembno pri bolnikih, ki čakajo na transplantacijo kostnega mozga in s standardno metodo izolacije CD34+ celic ne izločijo dovolj celic. Ob dodatku pleriksaforja se statistično signifikantno poveča nivo izoliranih CD34+ celic in skrajša čas, ki ga bolniki čakajo na transplantacijo kostnega mozga (Abhyankar in sod., 2012; Uy in sod., 2008). Poleg krvnih rakov se pleriksafor v kliničnih poskusih uporablja tudi za zdravljenje raka materničnega vratu, trebušne slinavke, jajčnikov, jeter, prostate, dojke, debelega črevesa, mezotelioma in melanoma. V uporabi je tudi pri zdravljenju avtoimunih bolezni, kot so revmatoidni artritis in sistemski lupus eritematozus, ter pri bolnikih z WHIM sindromom (angl. Warts, Hypogammaglobulinemia, Immunodeficiency, and Myelokathexis syndrome), ki imajo povišano občutljivost receptorja CXCR4 na SDF-1α (Wang in sod., 2020).
Pred kratkim so se začele predklinične in klinične študije z namenom ugotovitve učinkovitosti pleriksaforja pri zdravljenju GBM. S prekinitvijo SDF-1α/CXCR4 povezave lahko med drugim preprečimo ponovno vaskularizacijo po obsevanju, invazivnost tumorja in mobilizacijo vnetnih celic na mesto GBM (Thomas in sod., 2019). Prav tako je protitumorski učinek pleriksaforja možen preko zaviranja številnih signalnih poti, ki vodijo do nastanka neoplazm, med katere sodijo zunajcelično signalno regulirana kinaza 1/2 (Erk 1/2) in Akt, ki promovirata celično preživetje (Chetram in sod., 2011; Yi in sod., 2014).
Interakcija med SDF-1α in CXCR4 je pomembna tudi za ponovno tvorbo GBM po odstranitvi tumorja in obsevanju. Pleriksafor prekine kemotakso dendritičnih celic, diferenciranih iz kostnega mozga, ki v nasprotnem primeru vodijo v vaskulogenezo in
hitrejšo razrast GBM po terapiji na mestu odstranitve (Kioi in sod., 2010). Prav tako pleriksafor zmanjša hitrost napredovanja nekroze po obsevanju tumorja preko signalne poti HIF-1/CXCR4 (Yang in sod., 2018). Pred kratkim je bil prav tako dokazan vpliv pleriksaforja na zmanjšano izražanje vaskularnega endotelijskega kadherina in inhibicijo migracije endotelijskih celic na mesto GBM, kar vodi v zmanjšano vaskulacijo GBM (Li in sod., 2018). Vse to vodi do boljših rezultatov na področju zdravljenja GBM. Thomas in sodelavci (2019) so s svojo študijo dokazali podaljšanje življenjske dobe za bolnike, ki so po kirurški odstranitvi tumorja GBM in radioterapiji prejeli 7–10-dnevno terapijo pleriksaforja in nato še 6-mesečno terapijo s TMZ (Thomas in sod., 2016).
2.4 EKSPERIMENTALNI MODELI ZA PREUČEVANJE GLIOBLASTOMA
Za raziskovanje molekulskih mehanizmov in novih pristopov za zdravljenje GBM je potrebno vzpostaviti dober eksperimentalni model GBM, ki čim bolje odraža stanje v bolniku. Najbolj dostopni in razširjeni modeli so dvodimenzionalni (2D) modeli tumorskih celičnih linij. Kljub razširjenosti so pomanjkljivi, saj ne vključujejo mikrookolja tumorjev, heterogenosti tumorja in interakcij med GBM in mikrookoljem, ki so ključni za odpornost GBM na zdravljenje (Carla Da Hora in sod., 2019). Da bi rešili nekatere probleme 2D modelov celičnih linij, se uporablja tridimenzionalne (3D) sferoidne celične kulture in sokulture z različnimi stromalnimi celicami, ki predstavljajo boljši vpogled v GBM in vivo in njegovo interakcijo z okoljem (Guyon in sod., 2020). Ključna pomanjkljivost obeh modelov je klonska selekcija v celičnih kulturah in mutacije, zaradi katerih se z vsako novo generacijo celični model bolj oddaljuje od primarnega tumorja (Zhang in sod., 2020).
Številne študije potekajo na transgenih živalskih modelih, najpogosteje genetsko spremenjenih mišjih modelih, ki omogočajo raziskovanje razvoja GBM in predstavljajo nepogrešljiv model za raziskovanje novih potencialnih terapij zdravljenja (Misuraca in sod., 2016). Kljub uspešnosti modela je zaradi številnih razlik med poskusnimi živalmi in ljudmi rezultate pogosto težko prenesti na človeka, predvsem zaradi razlik v imunskem sistemu, ki pomembno vpliva na izid bolezni (Zhang in sod., 2020). Mišji modeli z oslabljenim imunskim sistemom, ki jim s ksenotransplantacijo bolnikovih tumorskih celic rastejo človeški tumorji, dajo boljši vpogled v dogajanju pri bolnikih z GBM.
Humanizirane miši s presajenim človeškim imunskim sistemom omogočijo najboljše raziskovanje zdravljenja GBM, vendar je tak model drag, težko dostopen in časovno potraten. Prav tako razvoj GBM v mišjem modelu pogosto ne sovpada z razvojem GBM v človeku (Ben-David in sod., 2017). V zadnjih letih se prav tako razvija 3D biotiskan model, ki omogoča vzpostavitev GBM in njegove kompleksnosti ex vivo na čipu, vendar je metoda zelo kompleksna (Parra-Cantu in sod., 2020). Zelo perspektivni model za raziskave GBM so organoidi glioblastoma (GBO), ki vključujejo heterogenost tumorja, mikrookolje tumorja z nekrozo in hipoksijo ter so po meri posameznega bolnika (C. Zhang et al., 2020).
2.4.1 Organoidi glioblastoma
GBO so 3D strukture, ki posnemajo tkivo ali organ, iz katerega so pridobljeni. Za vzpostavitev GBO obstajajo številni pristopi. Prve kompleksne GBO s številnimi celičnimi tipi so ustvarili Hubert in njegova skupina. Tumorsko biopsijo bolnika GBM so narezali na drobne kose in jih obdali z Matrigelom. Tako pripravljeni GBO so po določenem času tvorili 3D strukturo, imeli hipoksične predele in pridobili odpornost na obsevanje, kot je bilo značilno tudi za tumor v bolniku. Celice se po dveh mesecih inkubacije organizirajo v kompleksno organotipično strukturo, ki je po zgradbi podobna bolnikovemu GBM in se jih lahko goji do enega leta (Clevers, 2016; Hubert in sod., 2016; Majc in sod., 2021). Model GBO je nadgradil Jacob s sodelavci, ki so objavili protokol za hitrejše in učinkovitejše gojenje GBO. Zaradi hitrejše vzpostavitve GBO se ohrani večje število celic mikrookolja, večja diverziteta celic in molekularni profil, ki so zelo podobni primarnemu tumorju bolnika, iz katerega je bil GBO pripravljen. Da bi ugotovili podobnost med bolnikovim tumorjem in iz njega pripravljenim GBO, so GBO izpostavili enakim metodam pooperativnega zdravljenja kot jih je prejemal bolnik. Ugotovili so, da bolnikov odgovor na zdravljenje sovpada z odzivom GBO, kar omogoča personalizirane pristope pri zdravljenju GBM. GBO so tudi vstavili v možgane miši z imunsko oslabljenim imunskim sistemom in opazili agresivno invazijo GBM v okoliško možgansko tkivo (Jacob in sod., 2020).
Poznamo še druge metode priprave GBO. Genetsko manipulirani cerebralni organoidi (neoCOR) temeljijo na genetski manipulaciji cerebralnih organoidov z genskim urejanjem CRISPR (okrajšava za gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev, angl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats), pri čemer nastane GBM (Ogawa in sod., 2018). Cerebralni organoid glioblastoma (GLICO) so pripravljeni iz sferoidov GSC, ki jih združijo s cerebralnimi organoidi, kar omogoča študije interakcij med tumorjem in zdravimi možgani (da Silva in sod., 2018). Bio-tiskani GBO so najnovejši pristop izdelave GBO, kjer bio-tiskalnik izdela rekonstrukcijo bolnikovega tumorja GBM z vsemi tumorskimi predeli in hipoksičnimi gradienti (Yi in sod., 2019).
Glavne pomanjkljivosti vseh modelov GBM so pomanjkanje normalnega možganskega tkiva, ki vpliva na TME, rast in invazijo GBM, manjša ožiljenost in omejeno število imunskih celic, kar ne odraža kompleksnosti GBM in vivo (Rybin in sod., 2021, Andreatta in sod., 2020). Klub temu predstavlja GBO do sedaj najbolj zanesljiv ex vivo model GBM za reprodukcijo bolniku lastnega tumorja in preko tega omogoča personaliziran pristop zdravljenja (Andreatta in sod., 2020).
Aplikacije GBO so številne. Ključna prednost je ohranjenost bolnikovega TME, kar so raziskovali Pine in sodelavci z metodo hierarhičnega združevanja. Največje ujemanje z bolnikovim transkriptomom so imeli GLICO in bio-tiskani GBO, vendar je bilo ujemanje
opaziti tudi pri iz tumorja pripravljenem GBO modelu (Pine in sod., 2020). Z GBO so dokumentirali potek razvoja podtipov GBM in odkrili nove razvojne poti GBM ter mutacije, ki do vodijo do nastanka GBM (Bhaduri in sod., 2020). Model je uporaben za raziskovanje proliferacije in 3D invazije GBM celic v organoidih in je primeren za predklinične študije potencialnih zdravil (Rybin in sod., 2021). Zdravljenje GBM se zaradi razlik bolnikov z GBM v odzivu na zdravljenje in heterogenosti vse bolj usmerja v personaliziran pristop. Z GBO se tako lahko testira potencialna nova zdravila in spremlja odziv ter načrtuje primeren potek zdravljenja, vendar je za uspešnost pristopa potrebnih še veliko raziskav (Loong in sod., 2020).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 MATERIAL
V naši raziskavi smo uporabili laboratorijsko opremo, navedeno v Preglednici 2, in kemikalije, ki so navedene v Preglednici 3.
3.1.1 Laboratorijska oprema
Preglednica 2: Seznam uporabljene laboratorijske opreme s proizvajalci
Laboratorijska oprema Proizvajalec
Centrifugirka (15ml) Falcon
Skalpel
Vakuumski ročni sesalnik (Vacuboy) Celični laminarij
Disekcijske škarje
Pipete (5 ml, 10, 25 in 50 ml) Stresalnik
Plošče s 6 vdolbinami Plašče s 24 vdolbinami
Bela neprosojna plošča s 96 vdolbinami Nitrilne rokavice
Digestorij
Hidrofobni flomaster Dako Pen Komora za ohranjanje vlažnosti
Hibridizacijske in inkubacijske kamrice Celični inkubator
Svetlobni mikroskop Nikon Eclipse TS100 s programsko opremo Bresser MicroCamLab II
Fluorescentni invertni mikroskop Nikon Eclipse Ti-E s programsko opremo NIS-Elements AR 4.13.04
Konfokalni invertni mikroskop TCS LSI s programsko opremo LAS X 3.7.4.23463
Luminometer Synergy HTX s programsko opremo Gen5 3.10
Sanolabor
Integra Biosciences Iskra PIO
Fine Science Tool
Sartorius, Biohit, Eppendorf Biosan
Costar Costar Merck
LLG Labware Iskra
Dako Simport
Grace Bio-Labs Sanyo
Nikon Nikon Leica Biotek
3.1.2 Kemikalije
Preglednica 3: Seznam uporabljenih kemikalij z proizvajalci
Kemikalija Proizvajalec
Nevrobazalno gojišče (NBE) Invitrogen, ThemroFisher Scientific
Gojišče DMEM z dodano mešanico nutrientov F-12 Thermo Fisher Scientific
Glutamax (100x) Gibco
Dulbekov fosfatni pufer s soljo (DPBS) (10x) Gibco
Neesencialne aminokisline (NEAA) (100x) Sigma-Aldrich
Suplement N2 Gibco
Suplement B27 (50x) brez vitamina A Človeški inzulin
Medij Hibernate A
Penicilin-Streptomicin (P/S) (10000 Ul/ml) UltraGlutamin L (200mM)
Pufer za lizo eritrocitov (RBC) (1x) β-merkaptoetanol
Natrijev citrat (C6H5Na3O7) (Na-citrat) Vodikov klorid (HCl)
Natrijev hidroksid (NaOH) Tween20
Fetusni serum goveda (FBS) Goveji serumski albumin (BSA) Triton X-100
4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) Fiksacijski vklopni medij prolong antifade Lak za nohte
Dimetil sulfoksid topilo (DMSO) CellTiter-Glo
Temozolomid Pleriksafor
Formaldehid (4 %) Matrigel
Duolink raztopina za blokiranje nespecifične vezave Duolink pufer za redčenje protiteles
Pufer za spiranje A Pufer za spiranje B
Ligacijski pufer Duolink (5x) Duolink ligaza
Pufer za ojačanje signala Duolink (5x) Duolink polimeraza
Vklopni medij prolong antifade z DAPI
Thermo Fisher Sigma-Aldrich Gibco
Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Thermo Fisher Promega Merck
Sigma-Aldrich Merck
Merck BioSera Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Invitrogen
Thermo Fisher Scientific Loreal
Honeywell Promega Sigma-Aldrich Merck
Sigma-Aldrich
Corning, Thermo Fisher Scientific
Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich
Thermo Fisher Scientific 3.1.3 Protitelesa in sonde
Za detekcijo označevalcev na parafinskih rezinah tkiv GBM in GBO smo uporabili primarna protitelesa, navedena v Preglednici 4.
Preglednica 4: Seznam uporabljenih primarnih protiteles za imunofluorescentno barvanje označevalcev na parafinskih rezinah in za ligacijski test bližine
Protitelo Proizvajalec Kataloška
oznaka Izvor Redčenje
Primarno protitelo proti R&D Systems MAB172 Mišji 1 : 30
človeškemu CXCR4, klon 44716
Primarno protitelo proti človeškemu SDF-1α
Abcam Ab9797 Kunčji 1 : 200
Primarno protitelo proti
človeškemu SOX2 Abcam Ab171380 Mišji 1 : 50
Primarno protitelo proti človeškemu GFAP
Abcam Ab211271 Kunčji 1 : 1000
Primarno protitelo proti človeškemu Iba1
Abcam Ab15690 Mišji 1 : 200
Primarno protitelo proti človeškemu CD68
Sigma- Aldrich
HPA048982 Kunčji 1 : 2500 Primarno protitelo proti
človeškemu CD31
Cell Signaling Technology
#3528 Mišji 1 : 1000
Primarno protitelo proti človeškemu CD105
Sigma- Aldrich
HPA067440 Kunčji 1 : 1000
Za vezavo in prikaz uspešnosti vezave primarnih protiteles smo uporabili sekundarna protitelesa, navedena v Preglednici 5.
Preglednica 5: Seznam uporabljenih sekundarnih protiteles za imunofluorescentno barvanje na parafinskih rezinah
Protitelo Proizvajalec Kataloška
oznaka
Izvor Redčitev Protimišje sekundarno
protitelo AlexaFluor546
ThermoFisher Scientific
A11003 Kozji 1 : 200 Protikunčjesekundarno
protitelo AlexaFluor488
ThermoFisher Scientific
A11008 Kozji 1 : 200
Preglednica 6: Seznam uporabljenih Duolink PLUS in MINUS sond za metodo ligacijski test bližine
Sonda Orientacija Podjetje Kataloška
oznaka Izvor Redčitev Duolink in situ
PLA (protimišje)
PLUS Sigma-Aldrich DUO92001 Osličje 1 : 5 Duolink in situ
PLA (protikunčje)
MINUS Sigma-Aldrich DUO92005 Osličje 1 : 5
3.1.4 Mediji
V Preglednici 7 je opisan medij za transport tumorskih biopsij GBM iz operacijske sobe do laboratorija (transportni medij) ter medij za gojenje GBO.
Preglednica 7: Medij za transport tumorskih biopsij (Transportni medij)
Sestavine Založna
koncentracija Končna
koncentracija Volumen za 50 ml medija [ml]
Medij Hibernate A / / 49
Pen-Strep 100x 1x -10000 U/ml 0,5
UltraGlutamin L 200 mM 2 mM 0,5
Medij GBO smo uporabili za pripravo in rast GBO. Sestava medija je opisana v Preglednici 8.
Preglednica 8: Medij za pripravo organoidov glioblastoma (medij GBO).
Sestavine Založna
koncentracija
Končna koncentracija
Volumen za 50 ml medija [mL]
Nevrobazalno gojišče (NBE)
/ / 23,5
Gojišče DMEM z dodano mešanico nutrientov F-12
/ / 23,5
Glutamax 100x 1x 0,5
P/S 100x 1x 0,5
NEAA 100x 1x 0,5
N2 100x 1x 0,5
Suplement B27 brez vitamina A
50x 1x 1
β-merkaptoetanol – 55 mM v DPBS
1000x 1x 0,05
Človeški inzulin 10 mg/ml 10,7 µg/ml 0,117
V tako pripravljen medij GBO smo dodali β-merkaptoetanol v razmerju 1 : 1000. Končna koncentracija β-merkaptoetanola v mediju GBO je 55 µM. Priprava redčitve β- merkaptoetanola za medij GBO je prikazana v Preglednici 9.
Preglednica 9: Redčitev β-merkaptoetanola za medij GBO.
Sestavine Založna
koncentracija Končna
koncentracija Volumen za 250 µl raztopine[µl]
β-merkaptoetanol 14,32 M 55 mM 0,96
DPBS 10x 1x 249,04
3.1.5 Priprava pufrov
3.1.5.1 Citratni pufer
V 1l MQ vode smo raztopili 2,94 g Na-citrata. pH raztopine smo umerili na pH 6 s pH metrom z ustreznim dodatkom 30 % HCl oz. 10 M NaOH. Ko smo dobili ustrezno
vrednost pH pufra, smo pufru dodali 0,5 mL Tween20. Končna koncentracija Tween20 v citratnem pufru je bila 0,05 % v/v.
3.1.5.2 Pufer za redčenje protiteles (1 % BSA v 1x DPBS)
Vsa protitelesa smo po navodilih proizvajalca redčili v pufru za redčenje protiteles (Preglednica 10).
Preglecnica 10: Pufer za redčenje protiteles (1 % BSA v 1x DPBS).
Sestavine Založna
koncentracija Končna
koncentracija Volumen za 500 ml pufra
DPBS 10x 1x 500 ml
BSA / 0,01 g/ml 5 g
3.1.5.3 Pufer za blokiranje nespecifične vezave protiteles
Da bi se izognili nespecifični vezavi primarnih protiteles, smo morali vsa nespecifična vezavna mesta pred dodatkom protiteles zamaskirati. Uporabili smo pufer za blokiranje nespecifične vezave protiteles (Preglednica 11).
Preglednica 11: Pufer za blokiranje nespecifične vezave protiteles.
Sestavine Končna koncentracija Volumen za 5 ml pufra
FBS 10 % (v/v) 0,5
1 % BSA v 1x DPBS 90 % (v/v) 4,5
Triton X-100 0,1 % (v/v) 0,005
3.2 METODE
3.2.1 Transport in prejem vzorca glioblastoma
Tumorske biopsije bolnikov z diagnozo GBM smo prejeli iz Kliničnega oddelka za nevrokirurgijo na Univerzitetnem kliničnem centru Ljubljana. Vzorce tumorjev smo na Nacionalni inštitut za Biologijo prenesli v mediju za transportiranje vzorcev v 15 ml centrifugirki na ledu. Vsakemu vzorcu tumorja smo določili okvirno velikost, ožiljenost ter stopnjo nekrotičnosti. Vsak vzorec je vpisan v Gliobanko, ki je fizično locirana na NIB-u in v kateri so zbrani tkivni vzorci GBM, krvna plazma, GBO ter izolirane tumorske celice s pripadajočimi kliničnimi ter histopatološkimi podatki. Vsak vzorec v Gliobanki je označen z ustrezno referenčno številko NIB. Naša študija na GBM in prejemanje tumorskih vzorcev je odobrena s strani Komisije za medicinsko etiko Republike Slovenije pod številko 0120–179,190/2018/4. Prav tako vsi vključeni bolniki podpišejo izjavo, da dovolijo odvzem tkiva za namene raziskave.
3.2.2 Priprava organoidov glioblastoma
Za pripravo GBO potrebujemo vzorec, ki ni pretirano ožiljen in nekrotičen, zato smo tumor prenesli na petrijevko in s skalpelom odstranili nekrotične in ožiljene predele.
Preostanek vzorca smo prenesli v 15 ml centrifugirko in tumor trikrat sprali z 10 ml ledeno hladnega fosfatnega pufra s soljo (DPBS). Med vsakim spiranjem smo bili pozorni, da so se kosi tumorja posedli na dno centrifugirke, preden smo z vakuumskim ročnim sesalnikom odsesali medij. Spran vzorec smo prenesli v novo petrijevko, ki smo ji dodali 1–2 ml ledeno hladnega transportnega medija. S pomočjo disekcijskih škarij smo vzorec narezali na 0,5–1 mm velike koščke. Pri tem smo še dodatno odstranili pretirano ožiljene in nekrotične dele tumorja. Tumor smo rezali iz zunanjega dela vzorca proti sredini, saj tako zagotovimo konsistentne majhne in enako velike koščke. S pomočjo pipete smo prenesli koščke tumorja v 15 ml centrifugirko. Počakali smo, da so se koščki tumorja posedli na dno centrifugirke in odsesali medij z vakuumskim ročnim sesalnikom Vacuboy. Vzorec smo trikrat sprali z 10 ml DPBS pri sobni temperaturi. Med vsakim spiranjem smo ponovno počakali, da so se koščki tumorja posedli na dno centrifugirke in šele nato odsesali medij. Tako obdelan vzorec vsebuje eritrocite, ki lahko motijo nadaljnje poskuse, zato smo koščke tumorja inkubirali 10 min v pufru za lizo eritorcitov (angl. red blood cell lysis buffer, RBC). Celotno inkubacijo smo vzorec stresali na stresalniku. Lizirane eritrocite skupaj s pufrom za lizo smo odsesali in nato vzorec trikrat spirali z 10 ml medija DMEM-F12 na sobni temperaturi. Povprečno smo vzeli 20 koščkov tumorja in jih prenesli v posamezno vdolbino na ploščo s 6 vdolbinami ter jim dodali 4 ml medija GBO na vdolbino. Plošče smo prenesli v celični inkubator (37 °C, 5 % CO2) na orbitalni stresalnik pri 120 rpm, kjer smo inkubirali in spremljali tvorbo GBO. Koščki GBM so se po nekaj dneh inkubacije začeli zaokroževati ter po 1 do 2 tednih tvorili okrogel GBO z gladkim robom. Če po 1,5 mesecu iz koščkov tumorja niso nastali GBO, smo vzorec zavrgli.
3.2.2.1 Menjava medija organoidov glioblastoma
GBO smo medij zamenjali vsak drugi dan, pri tem smo bili pozorni na spremembo barve medija. Rdeča barva medija GBO, ki vsebuje pH indikator fenol rdeče, se namreč zaradi metabolne aktivnosti GBO spremeni v rumeno. Pri menjavi medija smo ploščo z vzorci dvignili pod kot 45° in počakali, da se GBO posedejo na dno vdolbine. S pipeto smo izsesali 75 % medija in ga zamenjali s 4 ml svežega medija GBO, ki smo mu predhodno dodali β-merkaptoetanol. Med vsako menjavo medija smo poleg porabljenega medija odstranili tudi ostanke razpadlih tumorskih in ostalih celic, zaradi česar je postajal vzorec v posamezni vdolbini vedno bolj čist.
3.2.2.2 Rezanje organoidov glioblastoma
