Rosana HUDEJ
VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŽIVETJE TUMORSKIH CELIČNIH LINIJ B16F1 IN CHO
in vitro
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
Ljubljana, 2008
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA BIOLOGIJO
Rosana HUDEJ
VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŽIVETJE TUMORSKIH CELIČNIH LINIJ B16F1 IN CHO in vitro
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
THE INFLUENCE OF THE RUTHENIUM COMPOUND KP1019 AND ELECTROPORATION ON THE VIABILITY OF TUMOUR CELL
LINES B16F1 AND CHO in vitro
GRADUATION THESIS University studies
Ljubljana, 2008
POSVETILO
Svoje dosedanje in nadaljnje delo na področju odkrivanja boljših in učinkovitejših načinov zdravljenja raka posvečam svojemu pokojnemu očetu Joţetu Hudeju, ki mi je dal teţko, a dragoceno izkušnjo, zaradi katere vidim smisel svojega dela v drugačni luči.
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija biologije. Opravljeno je bilo v Laboratoriju za biokibernetiko na Fakulteti za elektrotehniko Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija Oddelka za biologijo je za mentorja diplomskega dela imenovala prof.
dr. Damijana Miklavčiča.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mihael J. TOMAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Damijan MIKLAVČIČ
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko Član: prof. dr. Gregor ANDERLUH
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora: 10. 9. 2008
Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjiţnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Rosana Hudej
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dn
DK 577.352(043.2)=163.6
KG Elektrokemoterapija/elektroporacija/kemoterapevtik/KP1019/testi za določanje preţivetja celic/test MTT/metoda barvanja s kristal vijoličnim/test klonogenosti
AV HUDEJ, Rosana
SA MIKLAVČIČ, Damijan (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
LI 2008
IN VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŢIVETJE CELIČNIH LINIJ B16F1 IN CHO in vitro
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij) OP VII, 42 str., 14 sl.
IJ Sl
JI sl/en
AI Elektroporacija je biofizikalni pojav, pri katerem pride zaradi kratkotrajne izpostavitve celice električnemu polju dovolj visoke jakosti do izrazitega povečanja prepustnosti njene membrane. V kombinaciji s kemoterapevtikom, ki slabo prehaja celično membrano, lahko povzroči znatno povečanje citotoksičnega učinka takega kemoterapevtika. V tej diplomski nalogi smo se najprej osredotočili na primerjavo testov za določanje preţivetja celic z namenom, da izberemo najprimernejšega za nadaljnje delo. V poizkusih, ki so sledili, smo na dveh celičnih linijah (B16F1, CHO) primerjali citotoksični učinek rutenijeve spojine KP1019 s citotoksičnim učinkom KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo. Pri primerjavi različnih testov za določanje preţivetja celičnih linij (test MTT, metoda barvanja s kristal vijoličnim, test klonogenosti) smo primerjali preţivetje celic enega poizkusa, izmerjeno z vsemi tremi testi. Poleg tega smo rezultate primerjali tudi glede na dva različna inkubacijska časa. Primerjava je temeljila na vrednosti percentilnega ranga statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t-testa. Citotoksični učinek KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo ali brez nje smo ovrednotili s primerjavo deleţev preţivelih celic po različnih tretmajih glede na kontrolo, ki so jo predstavljale netretirane celice.
Deleţ preţivelih celic je bil izračunan na podlagi spektrofotometričnih meritev gostote celic v celični suspenziji. Ugotovili smo, da so rezultati preţivetja celičnih linij, določeni s testom MTT in metodo barvanja s kristal vijoličnim, kljub veliki razpršenosti posameznih meritev med seboj primerljivi. Podobno smo ugotovili, da so ne glede na čas inkubacije celic rezultati preţivetja celičnih linij med seboj primerljivi. V nadaljnjih poizkusih smo preučevali citotoksični učinek kemoterapevtika KP1019 in vpliv elektroporacije na citotoksični učinek KP1019. Zaradi nekontrolirane hidrolize kemoterapevtika KP1019 nam je delavna koncentracija, eden izmed ključnih dejavnikov citotoksičnosti, ostala neznana. Na podlagi rezultatov smo zaključili, da sta test MTT in metoda barvanja s kristal vijoličnim med seboj primerljiva. Tudi rezultati, izmerjeni po različnih inkubacijskih časih, so med seboj primerljivi. Vpliva elektroporacije na citotoksični učinek KP1019 nismo opazili, vendar menimo, da bi bilo smiselno poizkuse ponoviti, pri čemer bi bilo nujno upoštevati hitro hidrolizo KP1019 in ga zato raztopiti v pufru šele tik pred uporabo v poizkusu. Zaradi kompleksnosti fizikalno-kemijskih lastnosti in mehanizma delovanja KP1019 pa predlagamo ločeno preučevanje transmembranskega transporta KP1019 in njegovega citotoksičnega delovanja.
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Dn
DC 577.352(043.2)=163.6
CX Electrochemotherapy/electroporation/chemotherapeutic/KP1019/cell viability assays/MTT assay/ crystal violet staining /clonogenic assay
AU HUDEJ, Rosana
AA MIKLAVČIČ, Damijan (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111
PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Department of Biology
PY 2008
TI THE INFLUENCE OF THE RUTHENIUM COMPOUND KP1019 AND
ELECTROPORATION ON THE VIABILITY OF TUMOUR CELL LINES B16F1 AND CHO in vitro
DT Graduation Thesis (University studies) NO VII, 42 p., 14 fig.
LA Sl
AL sl/en
AB Electroporation is a biophysical process at which a short-term cell exposure to a high- voltage electric field causes a prominent increase in a cell’s membrane permeability.
Together with a chemotherapeutic that can hardly pass the cell’s membrane, electroporation can lead to a considerable increase in the cytotoxic effect of the chemotherapeutic. For the purpose of this diploma thesis we first focussed on the comparison of cell viability tests in order to find the most suitable one for our future work. During further experiments on two cell lines (B16F1, CHO) we compared the cytotoxic effect of ruthenium compound KP1019 with the cytotoxic effect of KP1019 in combination with electroporation. In order to compare different cell lines viability tests (MTT assay, crystal violet staining, clonogenic assay) we performed one experiment and compared its results of cell viability within all three tests. Besides, the results were also compared considering two different incubation times. The comparison was based on the percentile grade value of the Student t-test, a statistics test for two-parameters comparison. The cytotoxic effect of KP1019 with or without electroporation was evaluated on the basis of the percentage of the survived cells that underwent different treatments in comparison with the untreated cells. The percentage of the survived cells was calculated on the basis of spectrophotometric measurements of cell density in cell suspension. We found out that the results of the cell lines viability determined by the MTT assay and the crystal violet staining are comparable despite big differences among individual measurements. Furthermore, we discovered that regardless of the cell incubation time the results of the cell lines viability are comparable as well. In further experiments we studied the cytotoxic effect of KP1019 and the effect of electroporation on the cytotoxic effect of KP1019. Due to uncontrolled hydrolysis of KP1019 the working concentration – one of the key factors of cytotoxicity – remained unknown. Based on the results we came to the conclusion that the MTT assay and the crystal violet staining are comparable, and so are the results considering different incubation times. We did not notice any effect that electroporation could have on the cytotoxic effect KP1019. However, we consider it reasonable to repeat the experiments taking into consideration the rapid hydrolysis of KP1019 and therefore dissolving it in buffer just before its use in an experiment. Due to complexity of physico-chemical properties and mechanism of action of KP1019 we suggest separate studies of transmembrane transport of KP1019 and its cytotoxic mechanism of action.
KAZALO VSEBINE
POSVETILO
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA II
KEY WORDS DOCUMENTATION III
KAZALO VSEBINE IV
KAZALO SLIK VI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VIII
1 UVOD 1
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA 1
1.2 NAMEN IN HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 ELEKTROPORACIJA 3
2.2 KEMOTERAPIJA 6
2.3 ELEKTROKEMOTERAPIJA 7
2.3.1 Bleomicin 8
2.3.2 Cisplatin 8
2.3.3 NAMI-A in KP1019 8
3 MATERIALI IN METODE 11
3.1 PRIPRAVA CELIČNE KULTURE 11
3.2 PRIMERJAVA TESTOV ZA DOLOČANJE PREŽIVETJA CELIC: TEST MTT, METODA BARVANJA S KRISTAL VIJOLIČNIM IN TEST KLONOGENOSTI 11
3.2.1 Preţivetje celic glede na čas inkubacije po opravljenem poizkusu 11
3.2.1.1 Preţivetje celic po testu MTT 12
3.2.1.2 Preţivetje celic po metodi barvanja s kristal vijoličnim 13 3.2.2 Preţivetje celic glede na uporabljeni test: test MTT, metoda barvanja s kristal vijoličnim in test
klonogenosti 14
3.3 VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŽIVETJE CELIC 14
3.3.1 Vpliv rutenijeve spojine KP1019 na preţivetje celic 14
3.3.2 Vpliv rutenijeve spojine KP1019 in elektroporacije na preţivetje celic 15
4 REZULTATI 19
4.1 PRIMERJAVA TESTOV ZA DOLOČANJE PREŽIVETJA CELIC 19 4.1.1 Preţivetje celic glede na čas inkubacije po opravljenem poizkusu 19
4.1.1.1 Rezultati testa MTT 19
4.1.1.2 Rezultati barvanja s kristal vijoličnim (CV) 20
4.1.2 Rezultati primerjave metod testa MTT, metode barvanja s kristal vijoličnim (CV) in testa
klonogenosti 21
4.2 VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŽIVETJE
CELIČNIH LINIJ B16F1 IN CHO 22
4.2.1 Rezultati citotoksičnega vpliva rutenijeve spojine KP1019 22
4.2.2 Rezultati citotoksičnega vpliva rutenijeve spojine KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo 23
5 RAZPRAVA IN SKLEPI 26
5.1 RAZPRAVA 26
5.1.1 Primerjava testov za določanje preţivetja celic 27
5.1.2 Vpliv rutenijeve spojine KP1019 in elektroporacije na preţivetje celičnih linij B16F1 in CHO 29
5.2 SKLEPI 33
7 VIRI 35
7.1 Tiskani viri 35
7.2 Elektronski viri 39
KAZALO SLIK
Sl.: 2.1 Proces nastanka pore z elektroporacijo v odvisnosti od jakosti električnega polja.
Slike od vrha navzdol prikazujejo posamezne stopnje nastanka pore pri naraščajoči jakosti električnega polja: neporirana membrana, nastanek hidrofobne pore, nastanek hidrofilne pore (reverzibilna elektroporacija), povečanje pore (ireverzibilna
elektroporacija) (Miklavčič in Kotnik, 2004: 642). 4
Sl.: 2.2 Izpostavitev celice zunanjemu električnemu polju vodi v spremembe prepustnosti celične membrane. Usoda celice je odvisna od parametrov električnega polja, ki lahko povzročijo insercijo proteinov v celično membrano, vstop manjših molekul v celico, vstop večjim molekulam v celico, fuzijo celic ali plazmolizo (Miklavčič in Puc, 2006:
2). 6
Sl.: 2.3 Strukturne formule rutenijevih (III) spojin: KP1019, NAMI-A, KP1339, KP418
(Hartinger in sod., 2006: 892). 10
Sl.: 3.1 Elektroporator Cliniporator (Igea, Carpi, Italy). 16 Sl.: 3.2 Elektrode, ki omogočajo generiranje homogenega električnega polja. 17 Sl.: 3.3 Slika prikazuje zapis na zaslonu računalnika, ki je povezan z elektoporatorjem, po generiranju elektroporacijskih pulzev z elektroporatorjem Cliniporator (pulzi 8 × 100
µs, amplituda 160 V, frekvenca 1 Hz). 17
Sl.: 4.1 Deleţ preţivetja celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnih pulzov in inkubacijskega časa, po katerem je bil izveden test MTT. Temni simboli predstavljajo preţivetje 24 h po poizkusu, svetli pa 48 h po poizkusu. Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija. 20 Sl.: 4.2 Deleţ preţivetja celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnih pulzov in inkubacijskega časa, po katerem je bil izveden test z barvanjem s kristal vijoličnim.
Temni simboli predstavljajo preţivetje 24 h po poizkusu, svetli pa 48 h po poizkusu.
Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija. 21 Sl.: 4.3 Deleţ preţivetja celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnih pulzov, uporabljenega testa za določanje preţivetja celic in inkubacijskega časa, po katerem je bil test izveden. Temni simboli predstavljajo test z barvanjem s kristal vijoličnim, svetli test MTT, črtice pa test klonogenosti. Trikotniki predstavljajo preţivetje 24 h po poizkusu, kvadratki pa 48 h po poizkusu. Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje
treh poizkusov ± standardna deviacija. 22
Sl.: 4.4 Deleţ preţivetja celic B16F1 in CHO v odvisnosti od časa inkubacije celic v KP1019. Bela stolpca predstavljata preţivetje po 40 min inkubacije, siva pa po 24 h.
Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija. 23
Sl.: 4.5 Deleţ preţivetja celic B16F1 in cho v odvisnosti od različnih tretmajev celic. Siva stolpca predstavljata preţivetje pri 40 min inkubacije celic v KP1019, bela stolpca predstavljata preţivetje po elektroporaciji celic v pufru brez KP1019, črna pa po elektroporaciji celic v pufru s KP1019. Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh
poizkusov ± standardna deviacija. 24
Sl.: 4.6 deleţ preţivetja celic B16F1 in CHO v odvisnosti od različnih tretmajev celic.
Bela stolpca predstavljata preţivetje po elektroporaciji celic v pufru brez KP1019, črna pa po elektroporaciji celic v pufru s KP1019. Vsaka točka na sliki predstavlja
povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija. 25
Sl.: 5.1 Področje reverzibilno elektroporiranih celic. Neprekinjena črta predstavlja deleţ reverzibilno elektroporiranih celic, črtkana črta pa deleţ odmrlih celic. Osenčeno področje predstavlja področje reverzibilne elektroporacije (Kotnik in sod., 2000: 921).
27 Sl.: 5.2 Privzem KP1019, KP1339 in KP 418 v tumorske celice SW480 (Hartinger, 2006:
896). 32
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
CV test Test, ki temelji na barvanju s kristal
vijoličnim
B16F1 Tumorska celična linija metastazirajočih
celic mišjega melanoma
CHO Celična linija jajčnih celic kitajskega hrčka
(Chinese hamster ovary cells)
cisplatin cis-PtCl2(NH3)2
EMEM Gojišče za B16F1 (Eagle's minimum
essential medium)
F12 HAM Gojišče za CHO
FCS Fetalni telečji serum (fetal cow serum)
KP1019 Indazolium trans-RuCl4(1H-indazole)
ruthenate(III)
KP1339 Natrijeva sol KP1019 – natrijev trans-
(tetrachlorobis(1H-indazole) ruthenate(III))
KP418 Imidazolium trans-(tetrachlorobis(1H-
indazole) ruthenate(III))
MTT test Test, ki temelji na določanju celične rasti
kot funkcije mitohondrijske aktivnosti
NAMI-A Imidazolium trans- tetrachlorobis (DMSO-
S)Imidazol
SMEM Bogato gojišče, ki ga dodamo celicam
takoj po elektroporaciji (Spinner's minimum essential medium)
1 UVOD
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Rak je skupina teţkih bolezni, ki so poleg infekcijskih bolezni, podhranjenosti, vojn in srčnih obolenj najpogostejši vzrok smrti ljudi na svetu. Po podatkih statističnega informacijskega sistema Svetovne zdravstvene organizacije (WHOSIS) umre zaradi raka vsako leto 7.9 milijonov ljudi, v Sloveniji 5000. Danes umre zaradi raka vsak osmi Zemljan. Te številke so se in se še vedno vztrajno večajo in po raziskavah in izračunih WHOSIS bo do leta 2015 za rakom umrl ţe vsak 6.6 Zemljan. V letu 2030 pa bo zaradi raka umrlo ţe 11.3 milijonov ljudi (Future trends …, 2008). Ţe leta 1971, ko so bile te številke še precej manjše, a vseeno velike, je ameriški predsednik Richard M. Nixon sproţil tako imenovano vojno proti raku (»War on Cancer«). Od takrat so raziskave namenjene razumevanju mehanizmov raka in raziskovanju novih ter uspešnejših načinov zdravljenja ene izmed najbolj aktualnih in finančno podprtih.
Rak je v osnovi genetska bolezen, ki se razvije v eni sami somatski celici kot posledica akumulacije mutacij ključnih genov, vključenih v kontrolo celičnega cikla, apoptoze in popravljalnih mehanizmov DNA. Posledica teh mutacij je transformacija celice v dolgoţivo tumorsko celico z nekontrolirano celično rastjo, nekatere od njih pridobijo tudi sposobnost metastaziranja v drugih tkivih. Ker ima vsak tip rakave bolezni svojevrstne lastnosti, zahteva svojevrstno zdravljenje. Poleg tega je prav vsako rakavo obolenje edinstveno zaradi različnih naključnih kombinacij vsaj šestih naključnih mutacij, in ker imajo tumorske celice poleg neomejenega hitrega pomnoţevanja tudi visoko stopnjo mutabilnosti ter posledično sposobnosti hitrega razvoja rezistence, je razvijanje uspešnih metod zdravljenja izredno teţavno (Serša in sod., 2003a; Štrukelj in sod., 2007).
Onkologija, veda o novotvorbah ali tumorjih (SSKJ ..., 1998), je zaradi kompleksnosti problema, s katerim se ukvarja, postala danes ena izmed vej medicine, kjer je sodelovanje različnih bazičnih naravoslovnih ved, kot so biologija, fizika in kemija, še posebej izrazito.
Ena izmed metod zdravljenja, ki je nastala kot plod takšnega sodelovanja, je tudi elektrokemoterapija. Sestavlja jo smiselna kombinacija kemoterapije in elektroporacije.
Vse klinične študije so potrdile, da je elektrokemoterapija učinkovita metoda za lokalno kontrolo tumorjev pri pacientih z različnimi tipi rakavih obolenj. Zaenkrat se v klinični praksi humane medicine uporablja le za zdravljenje kutanih in subkutanih melanomov, v veterini pa jo uspešno uporabljajo pri zdravljenju cele vrste različnih rakavih obolenj (Serša in sod., 2003a).
Za uspešno elektrokemoterapijo je seveda potreben ustrezen kemoterapevtik. Zaenkrat sta v klinični uporabi le dva: bleomicin in cisplatin, preizkušajo pa se tudi nove spojine, med
katerimi zavzemajo posebno mesto rutenijeve spojine. Eden izmed najbolj perspektivnih kemoterapevtikov za klasično kemoterapijo je rutenijeva (III) spojina KP1019, njegova učinkovitost v elektrokemoterapiji pa še ni bila preverjena (Hartinger in sod., 2006).
1.2 NAMEN IN HIPOTEZE
Namen diplomske naloge je bil spoznati različne metode za določanje preţivetja celičnih linij ter na podlagi njihove primerjave izbrati najustreznejšo za naše nadaljnje delo. V poizkusih, ki so sledili, smo ţeleli določiti in primerjati citotoksični vpliv same rutenijeve spojine KP1019 s citotoksičnim vplivom rutenijeve spojine KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo na preţivetje dveh celičnih linij, ene tumorske in ene normalne trajne celične linije.
Naša hipoteza je bila, da je citotoksični vpliv rutenijeve spojine KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo na obe celični liniji večji kot citotoksični vpliv same rutenijeve spojine KP1019. Predpostavljamo, da je KP1019 potencialni kemoterapevtik tudi v elektrokemoterapiji.
2 PREGLED OBJAV 2.1 ELEKTROPORACIJA
Elektroporacija ali elektropermeabilizacija je biofizikalni pojav, pri katerem pride zaradi kratkotrajne izpostavitve celice električnemu polju dovolj visoke jakosti do izrazitega povečanja prepustnosti membrane (Neumann in Rosenheck, 1972; Neumann, 1989, 1999;
Lebar in sod., 1998; Kotnik in sod., 2005).
Sprememba prepustnosti je posledica znatnih sprememb v strukturi membrane, katerih molekularni mehanizmi še vedno niso dobro poznani. Obstaja sicer vrsta modelov, ki opisujejo te mehanizme (Jacobs, 1975; Taupin, 1975; Sugar, 1979; Glaser, 1988; Tsong, 1991; Weaver, 1996; Lebar, 1998; Kotnik, 2005; Teissie, 2005), toda rezultati poskusov niso še nobenega povsem potrdili (Mir, 2000).
Najbolj uveljavljena razlaga pravi, da pride zaradi povišanja membranske napetosti, ki nastopi ob izpostavitvi celice zunanjemu električnemu polju, do nastanka nanometerskih hidrofilnih por v lipidnem dvosloju – od tu izraz elektroporacija (Taupin, 1975; Glaser, 1988; Chang, 1990; Lebar, 1998; Kotnik, 2005).
Strukturne spremembe v celični membrani, ki nastanejo v prisotnosti električnega polja, se pojavijo ob pragovni transmembranski napetosti, ki seveda zahteva pragovno vrednost jakosti zunanjega električnega polja. Strukturne spremembe se med prisotnostjo zunanjega električnega polja večajo oziroma mnoţijo. To so kratkotrajne spremembe v strukturi celične membrane, ki so prisotne nekaj mikrosekund. Ko zunanje električno polje izključimo, se lahko kratkotrajne strukturne spremembe preuredijo v osnovno stanje ali pa v nekaj mikrosekundah zavzamejo stabilno konfiguracijo. Tako nastale spremembe imenujemo dolgotrajne, saj lahko traja tudi nekaj 10 minut, da se preuredijo nazaj v izhodiščno stanje (Slika 2.1) (Chernomordik, 1992; Lebar in sod., 1998; Miklavčič in Kotnik, 2004).
Slika 2.1: Proces nastanka pore z elektroporacijo v odvisnosti od jakosti električnega polja. Slike od vrha navzdol prikazujejo posamezne stopnje nastanka pore pri naraščajoči jakosti električnega polja: neporirana membrana, nastanek hidrofobne pore, nastanek hidrofilne pore (reverzibilna elektroporacija), povečanje pore (ireverzibilna elektroporacija) (Miklavčič in Kotnik, 2004: 642).
Če so vrednosti parametrov zunanjega električnega polja, kot so amplituda pulzov, trajanje pulzov, število pulzov in ponavljalna frekvenca, optimalne, se po koncu izpostavitve prepustnost membrane postopoma vrne na začetno raven, celice pa ohranijo svoje fiziološko delovanje. V tem primeru je proces elektroporacije reverzibilen (Rols in Teissie, 1990).
V nasprotnem primeru pride do ireverzibilne elektroporacije, katere posledica je plazmoliza celic. V celični membrani pride do nepopravljivih poškodb in zato trajno povečane prepustnosti membrane. Zaradi osmotskega pritiska v celice vdira voda in celica nabreka dokler nazadnje ne poči (Hamilton in Sale, 1967; Danfelter in sod., 1998).
Z električnim poljem, ki ga ustvarimo med dvema elektrodama, na kateri dovedemo visokonapetostne električne pulze, lahko povečamo prepustnost celične membrane vsaki celici. To lahko doseţemo tako na celicah, ki rastejo v celični suspenziji, kot tudi na tistih, ki rastejo v plasti, pritrjene na steno posode; ex vivo na tkivih in celicah in in vivo na tkivih (Lebar in sod., 1998).
Dokazano je bilo, da se zaradi različnih fizikalno-kemijskih in bioloških lastnosti različne celične linije razlikujejo v svojih odzivih na enake parametre zunanjega električnega polja (Čemaţar in sod., 1998).
V času povišane prepustnosti celične membrane poteka neselektiven transport snovi med intra- in ekstracelularnim prostorom. Hidrofilnim snovem, za katere predstavlja membrana sicer neprehodno bariero, je tako omogočen vstop v citosol preko nastalih hidrofilnih por.
Manjše molekule vstopajo v celice z difuzijo. K pretoku večjih električno nabitih molekul, kot so DNA in proteini, pa v času delovanja električnega polja in povečane prepustnosti pomembno prispeva tudi elektroforetska sila – vlečna sila, ki jo ustvarja električno polje na nabite delce (Lebar, 1998; Mir, 2000; Kotnik, 2005; Rols, 2006).
Zaradi zgoraj opisanih lastnosti je postala elektroporacija v zadnjem času standardna laboratorijska metoda. Permeabilizacija, povzročena z električnim poljem, ima namreč nekaj prednosti pred drugimi biokemičnimi metodami:
lahko jo uporabimo na vsaki celici, ne prizadene celičnega preţivetja,
je specifična za celično membrano in ne prizadene membran celičnih organelov, povzroči le minimalne motnje membranskih funkcij (Lebar in sod., 1998).
Končni rezultat elektroporacije celic je odvisen od parametrov zunanjega električnega polja in lahko povzroči vstop manjših molekul in ionov v celico, vstop večjih in nabitih molekul, vključitev molekul v celično membrano, fuzijo celic ali plazmolizo. Ti učinki se danes izkoriščajo za namene elektrokemoterapije, elektrogenske transfekcije, vnosa zdravilnih učinkovin preko koţe, vključevanja proteinov v celične membrane, elektrofuzije celic in elektrosterilizacije tekoče hrane in vode (Slika 2.2) (Miklavčič in Puc, 2006).
Slika 2.2: Izpostavitev celice zunanjemu električnemu polju vodi v spremembe prepustnosti celične membrane. Usoda celice je odvisna od parametrov električnega polja, ki lahko povzročijo insercijo proteinov v celično membrano, vstop manjših molekul v celico, vstop večjim molekulam v celico, fuzijo celic ali plazmolizo (Miklavčič in Puc, 2006: 2).
Uporaba zgoraj naštetih aplikacij elektroporacije sega od temeljnih raziskav v biokemiji in molekularni biologiji prek uporabnih raziskav v biotehnologiji in farmaciji do predklinične in klinične uporabe v onkologiji in genski terapiji (Čemaţar in sod., 1998; Lebar in sod., 1998; Heller, 1998, 1999; Mir, 2000, 2006; Serša in sod., 2003a, 2008; Kotnik in sod., 2005).
2.2 KEMOTERAPIJA
Kemoterapija je postopek zdravljenja različnih bolezni s kemičnimi sredstvi, ki posredno ali neposredno zavirajo celične delitve ali povzročijo celično smrt. Tak način zdravljenja se je uveljavil v onkologiji in postal eden izmed standardnih postopkov zdravljenja širokega spektra različnih tipov rakavih obolenj, čeprav je splošno znano, da sama metoda povzroča močne negativne stranske učinke. Intenziteta tako glavnih kot stranskih učinkov je v sorazmerju z dozo kemoterapevtika. Problem se pojavi pri tistih protitumorskih zdravilih z intracelularnim mestom delovanja, ki slabo prehajajo celično membrano. Da bi dosegli ţeleni učinek takega kemoterapevtika, bi morali zvišati njegovo koncentracijo v bliţini celice, vendar smo omejeni z močnimi negativnimi stranskimi učinki, ki jih povzročajo visoke koncentracije teh kemoterapevtikov v telesu.
Pri kemoterapiji je, podobno kot pri drugih metodah zdravljenja raka, največji problem zagotoviti zadosten citotoksičen učinek na tumorske celice, obenem pa čimbolj zmanjšati njegovo delovanje na zdrave celice. S tega stališča je elektrokemoterapija sicer uspešna in perspektivna metoda za lokalno kontrolo tumorjev, vendar zaenkrat samo kutanih in subkutanih tumorjev. Elektrode za elektroporacijo globlje leţečih tumorjev namreč še niso bile razvite (Čemaţar in sod., 1998; Heller in sod., 1998; Lebar in sod., 1998).
2.3 ELEKTROKEMOTERAPIJA
Elektrokemoterapija je relativno nova metoda za lokalno zdravljenje nekaterih vrst tumorjev. Temelji na uspešni kombinaciji kemoterapije in lokalne reverzibilne elektroporacije tumorskega tkiva. Vnosu kemoterapevtika v telo po določenem času sledi lokalna aplikacija električnih pulzov določenih parametrov, s katerimi reverzibilno povečamo prepustnost celičnih membran elektroporiranega tkiva in s tem omogočimo oziroma pospešimo transmembranski transport kemoterapevtika v te celice (več o elektroporaciji v podpoglavju 2.1). Posledica večje koncentracije kemoterapevtika v citosolu je tudi njegov večji citotoksični učinek. V praksi to pomeni, da z enakimi dozami kemoterapevtikov v elektrokemoterapiji doseţemo večji protitumorski učinek kot pri klasični kemoterapiji, pri čemer se stranski učinki ne potencirajo, oziroma da za enak protitumorski učinek v elektrokemoterapiji zadostujejo niţje doze kemoterapevtikov s čimer zmanjšamo njihove negativne stranske učinke.
Optimalni protitumorski efekt je doseţen, če dovajamo električne pulze v času, ko je ekstracelularna koncentracija kemoterapevtika v tumorju najvišja in je zato transport preko celične membrane do intracelularnih tarč najboljši. Pospešen transmembranski transport zviša intracelularno koncentracijo kemoterapevtika in s tem poveča njegovo citotoksičnost.
Ker elektroporacija poveča transmembranski transport samo tistih zdravil, za katere je celična membrana zelo slabo ali sploh neprepustna, so najbolj primerni kandidati za kemoterapevtike v elektrokemoterapiji kemične snovi, ki so hidrofilne in za katere ne obstaja učinkovit transportni sistem v membrani, njihovo tarčno mesto delovanja pa je v intracelularju.
Kar nekaj kemoterapevtikov je ţe bilo testiranih v kombinaciji z elektroporacijo in vitro, med njimi pa sta v klinično uporabo prišla zaenkrat le bleomicin in cisplatin (Serša in sod., 2008).
2.3.1 Bleomicin
Kemoterapevtik bleomicin je hidrofilen glikopeptidni antibiotik z močno omejenim transmembranskim transportom. Z difuzijo preko membrane ne more prehajati, transport z receptorsko posredovano endocitozo pa je omejen z majhnim številom transportnih proteinov, izpostavljenih na celični površini, in z dodatnim izključevanjem teh proteinov iz membrane v procesu endocitoze. V kombinaciji z elektroporacijo celic pa bleomicin skoraj prosto preide v citosol. Njegova citotoksičnost se tako poveča okrog 700-krat. Intrinzična citotoksičnost bleomicina je izredno visoka, saj je ţe nekaj sto molekul v notranjosti celice dovolj, da jo ubijejo. Molekule bleomicina povzročajo enojne in dvojne prelome dvojne vijačnice DNA, ki jih celica ne more popraviti. Do celične smrti, ki je posledica takih poškodb DNA in posledično fragmentiranih kromosomov, pride šele med procesom mitoze. Mitotična celična smrt je do neke mere selektivna za tumorske celice, saj se te veliko hitreje delijo kot celice normalnih tkiv (Čemaţar, 1996; Mir, 2000, 2006).
Bleomicin se sicer uporablja tudi v klinični praksi, vendar njegovo uporabo omejuje dejstvo, da preseţek kumulativne doze v telesu povzroča hude stranske učinke, pri čemer je pljučna fibroza na prvem mestu. Izmed mnogih ostalih stranskih učinkov naj omenim še kardiovaskularne motnje, vročino, slabost in bruhanje, hiperpigmentacijo koţe in oslabljen imunski sistem (Drugdex drug evaluations ..., 2008).
2.3.2 Cisplatin
V primeru cisplatina (cis-PtCl2(NH3)2) je transmembranski transport le delno oviran.
Pasivna difuzija predstavlja 50 % transporta, ostalih 50 % pa omogočajo transportni proteini. Njegovo tarčno mesto delovanja je DNA, kjer povzroča znotrajveriţne in medveriţne navzkriţne povezave in tako zavira sintezo DNK, v manjši meri pa tudi sintezo RNK in beljakovin. Elektroporacija celic poviša njegovo citotoksičnost za več kot 80-krat (Serša in sod., 1998; Mir, 2006). Tudi ta kemoterapevtik ima v klinični uporabi svoje omejitve, saj pogosto povzroča hude stranske učinke: močno slabost in bruhanje, nefrotoksičnost, ototoksičnost, hemotoksičnost in mielosupresijo, v manjši meri tudi nevrotoksičnost, anafilaktoidne reakcije, motnje elektrolitskega ravnoteţja, očesno toksičnost in druge (Temeljne značilnosti zdravila ..., 2001). Poleg tega deluje samo na določen spekter rakavih obolenj, pri čemer so tumorske celice po daljši izpostavljenosti cisplatinu sposobne razviti rezistenco nanj (Mir, 2006).
2.3.3 NAMI-A in KP1019
Tako za kemoterapijo kot za elektrokemoterapijo se iščejo in preizkušajo mnoge nove alternative spojin, ki bi bile bolj učinkovite. Med kemoterapevtiki, ki vsebujejo kovinske ione, so poleg platinastih (II) spojin zelo zanimive tudi rutenijeve (III) spojine. Čeprav
njihov mehanizem delovanja še ni jasen, prevladuje mnenje, da so to necitotoksični prekurzorji aktivnih citotoksičnih substanc. Njihovo biološko aktivnost si zaenkrat razlagamo s teorijo aktivacije-z-redukcijo, po kateri naj bi v reducirajočem okolju potekla biotransformacija rutenija (III) v rutenij (II). Spojine z rutenijem (III) so namreč veliko bolj inertne kot njihovi analogi z rutenijem (II). Aktivne substance z enim ali več tarčnimi mesti v intracelularju so zaenkrat še neidentificirane. Med mnogimi sintetiziranimi rutenijevimi protitumorskimi spojinami sta se zaenkrat dve uspešno prebili do faze kliničnih preizkusov: NAMI-A (Imidazolium trans- tetrachlorobis (DMSO-S)Imidazol) in KP1019 (Indazolium trans- tetrachlorobis (1H-indazole)ruthenate(III)).
NAMI-A se veţe na DNA, kjer povzroča nepopravljive poškodbe, kar vodi do mitotične celične smrti. Zanimiv je zaradi inhibitornega delovanja na metastaze in vivo, čeprav je in vitro kazal le zanemarljivo citotoksičnost. Ker je njegov transport preko membrane omejen, so Biček in sod. (2007) preučili njegovo citotoksičnost v kombinaciji z elektroporacijo in vitro. Pri 800 V/cm in 10 µM NAMI-A so dosegli kar 80% upad preţivetja celic, in tako pokazali potencialno uporabnost NAMI-A v elektrokemoterapiji.
Nadaljnje predklinične in klinične raziskave so v teku (Biček in sod., 2007).
KP1019 je zanimiva zaradi svojega mehanizma delovanja, saj se to razlikuje od mehanizmov delovanja bleomicina in platinastih kemoterapevtikov. Rezultati raziskav so pokazali, da se večina KP1019 v ekstracelularju veţe na serumske proteine, v prvi vrsti na albumin in transferin. Kompleksi z albuminom delujejo kot rezervoar neaktivnega KP1019, vezava s transferinom pa omogoča transmembranski transport tega kemoterapevtika po transferinski receptorsko posredovani endocitozi. V reducirajočem kislem okolju endosoma in/ali hipoksičnem okolju tumorja se KP1019 reducira in s tem aktivira. Njegov učinek je tako do neke mere selektiven za celice tumorja. Aktivirane molekule kemoterapevtika se v intracelularju veţejo na DNA in povzročijo prelome dvojne vijačnice ter s tem mitotično celično smrt. Poleg tega posredno z induciranjem nastanka reaktivnih kisikovih vrst povzročajo dodatne znotrajcelične poškodbe, katerih posledica je apoptoza. Kapitza (2001) je z meritvami mitohondrijskega membranskega potenciala pokazal, da v primeru KP1019 prevladuje apoptoza aktivirana po intrinzični mitohondrijski poti. Pri tem se aktivirajo proteini na mitohondrijski membrani in povzročijo naluknjanje mitohondrija, kar zaznamo v izgubi mitohondrijskega membranskega potenciala. Iz mitohondrija v citosol izhaja citokrom c, ki aktivira kaspazno kaskado, česar končni rezultat je razgradnja strukturnih proteinov, citoplazme in kromatina, razpad celice na apoptotska telesa ter fagocitoza slednjih (Dovgan in sod., 2007).
Slika 2.3: Strukturne formule rutenijevih (III) spojin: KP1019, NAMI-A, KP1339, KP418 (Hartinger in sod., 2006: 892).
Lastnosti, zaradi katerih je KP1019 tako perspektiven kemoterapevtik, so zdravljenje z malo stranskimi učinki, uspešno delovanje proti različnim tipom tumorjev, za katere se je cisplatin izkazal kot neučinkovit in izredno nizka stopnja pojavljanja rezistence. Tudi v prvi fazi kliničnih poizkusov se je KP1019 izkazal kot uspešen kemoterapevtik, saj se je v kar 5 od 6 pacientov zdravljenih s KP1019 bolezen stabilizirala, opaţeni pa niso bili nikakršni stranski učinki (Kapitza, 2001, 2005; Hartinger in sod., 2006).
3 MATERIALI IN METODE
3.1 PRIPRAVA CELIČNE KULTURE
Za poizkuse smo uporabili dve celični liniji: tumorsko celično linijo metastazirajočih celic mišjega melanoma B16F1 (European Collection of Cell Cultures, Velika Britanija) in celično linijo jajčnih celic kitajskega hrčka CHO (European Collection of Cell Cultures, Velika Britanija). Celice B16F1 smo gojili v gojišču Eagle's minimum essential medium ali EMEM (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK), celice CHO pa v gojišču F-12 HAM (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK). Obema gojiščema smo dodali 10 % fetalnega telečjega seruma (FCS; Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK), antibiotika benzil penicilin (Crystacillin, Pliva d.d., Zagreb, Croatia) in gentamicin sulfat (Gentamicin, Lek farmacevtska druţba d.d., Ljubljana, Slovenija) ter 1 % (za gojišče EMEM) oziroma 0,5 % (za gojišče F-12 HAM) L-glutamina (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK). Celični liniji smo gojili v inkubatorju (Kambič, Slovenija) na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2. V logaritemski fazi rasti, ki so jo dosegle po 3–4 dneh, smo jih najprej sprali z NaCl, nato pa tripsinizirali s Trypsin-EDTA (5 g porcine tripsin/ 2 g EDTA v 0,9 % NaCl) 10-krat redčenim v HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution brez kalcija in magnezija: Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK). Po pribliţno 1,5 min, ko so se celice začele odlepljati s podlage, smo delovanje tripsina ustavili z dodatkom ţe prej opisanega gojišča. Število celic v pripravljeni celični suspenziji smo določili s štetjem v hemocitometru. S centrifugiranjem pri 1225 obratih/min, 4 ºC, 5 min (Sigma, UK) smo celice ločili od gojišča in tripsina.
Supernatant smo odstranili, pelet celic pa resuspendirali v nizkoprevodnem elektroporacijskem mediju (10 mM natrijev fosfatni pufer-PB, Na2HPO4 / NaH2PO4, pH 7.4) z 1 mM MgCl2 in 250 mM saharozo, da smo pripravili celično suspenzijo s koncentracijo 20 X 106 celic/ml.
3.2 PRIMERJAVA TESTOV ZA DOLOČANJE PREŢIVETJA CELIC: TEST MTT, METODA BARVANJA S KRISTAL VIJOLIČNIM IN TEST KLONOGENOSTI 3.2.1 Preživetje celic glede na čas inkubacije po opravljenem poizkusu
Za primerjavo testov za merjenje preţivetja celičnih linij smo celice elektroporirali.
Opazovali smo vpliv jakosti električnega polja na preţivetje celic. Uporabili smo celično linijo B16F1, za katero je bil vpliv električnega polja na preţivetje ţe določen s testom klonogenosti (Kandušer in sod., 2006). Elektroporacijo smo izvedli po protokolu (glej 3.3.2), ki je primerljiv s protokolom, opisanim v članku Kandušer in sod. (2006). Uporabili smo tudi enake parametre elektroporacije: razdalja med elektrodama 2 mm, 8 pulzov, 100
µs, 1 Hz, amplitude električnih pulzov naraščajoče za 40 V od 80 V do 400 V. Celic v kontroli nismo izpostavili električnemu polju.
Po poizkusu smo celice inkubirali v inkubatorju na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2 v osmih paralelkah 24 h in v osmih paralelkah 48 h. Po končani inkubaciji smo izmerili preţivetje celic v štirih paralelkah s testom MTT (glej 3.2.1.1), v štirih paralelkah pa z metodo barvanja s kristal vijoličnim (glej 3.2.1.2). Celoten poskus smo trikrat ponovili. Rezultate smo ovrednotili na podlagi statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t-testa, pri čemer sta bila primerjana parametra različna časa inkubacije celic po opravljenem poizkusu (24 h in 48 h).
3.2.1.1 Preţivetje celic po testu MTT
MTT test temelji na spektrofotometričnem določanju celične rasti kot funkcije mitohondrijske aktivnosti v ţivih celicah. Z njim merimo sposobnost ţivih celic, da z mitohondrijsko sukcinat dehidrogenazo reducirajo topno rumeno tetrazolijevo sol (3-[4,5- dimetiltiaol-2-il]-2,5-difenil tetrazolijev bromid), raztopljeno v MTT raztopini v netopne škrlatne formazanske kristale. Te kristale nato raztopimo v MTT topilu in izmerimo absorbanco pri 570 nm. Iz absorpcije lahko direktno sklepamo na preţivetje celic, saj je absorpcija v linearni odvisnosti od mitohondrijske encimske aktivnosti, ta pa v linearni odvisnosti od števila preţivelih celic.
Test smo izvedli po navodilih proizvajalca (Cell growth determination kit, MTT based. For spectrophotometric determination of viable cell number. Sigma - Aldrich, USA) po postopku za celice, pritrjene na podlago, s to razliko, da smo v začetku gojišče najprej odstranili in celicam nato dodali manjši volumen 10 % MTT raztopine (MTT SOLUTION) v sveţem gojišču (220 µl). Po 4 h inkubacije celic v inkubatorju na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2 smo raztopino odstranili, celicam pa dodali 200 µl MTT topila (MTT SOLVENT). V roku ene ure smo izmerili absorbanco pri 570 nm in 690 nm s čitalcem mikrotiterskih plošč Tecan (Tecan infinite M200; Tecan Austria GmbH) in programom Magellan (Tecan Austria GmbH). Z absorbanco pri 690 nm smo izmerili vrednost absorpcije ozadja, ki smo jo nato odšteli od absorpcije pri 570 nm in tako dobili končno vrednost. Na podlagi dobljenih vrednosti smo izračunali deleţ preţivetja celic glede na kontrolo za vsako amplitudo električnih pulzov posebej po formuli:
Deleţ preţivelih celic = (abs. elektroporiranih celic / abs. kontrole) X 100 [%]
Končno vrednost deleţa preţivelih celic pri določeni amplitudi električnih pulzov predstavlja povprečna vrednost deleţev preţivelih celic treh neodvisnih poskusov ±
standardna deviacija. Rezultate preţivetja celic smo predstavili s krivuljami preţivetja celic v odvisnosti od amplitude električnih pulzov.
Primerjavo končnih vrednosti preţivetja celic, ki so bile po poizkusu inkubirane 24 h, in celic, ki so bile inkubirane 48 h, smo ovrednotili na podlagi statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t-testa. Med seboj smo primerjali preţivetje celic po elektroporaciji pri določeni amplitudi električnega pulza. Za vsako amplitudo električnega pulza smo primerjali preţivetje celic, dobljeno pri omenjenih dveh različnih časih inkubacije.
3.2.1.2 Preţivetje celic po metodi barvanja s kristal vijoličnim
Protokol določanja preţivetja celic z metodo barvanja s kristal vijoličnim smo povzeli po Golzio, 1999.
Metoda barvanja s kristal vijoličnim temelji na prepustnosti celične membrane za to barvilo in vezavi barvila kristal vijolično na molekule DNA. Po inkubaciji celic v barvilu se vijolično obarvajo molekule DNA tako ţivih kot mrtvih celic, vendar se pri nadaljnjem večkratnem spiranju vzorca s pufrom sperejo tudi vse odmrle celice, ki so se odlepile od podlage. Preţivele, na podlago pritrjene celice nazadnje liziramo z ocetno kislino, da dobimo homogeno vijolično obarvano raztopino, ki ji izmerimo absorbanco pri 595 nm.
Izmerjeni absorpciji moramo odšteti absorpcijo ozadja, ki jo predstavlja absorpcija negativne kontrole (brez celic).
Pripravili smo 0,1 % koncentracijo barvila kristal vijolično (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK) v natrijevem fosfatnem pufru (10 mM natrijev fosfatni pufer-PB, Na2HPO4 / NaH2PO4, pH 7.4).
Celicam v mikrotiterskih ploščah s 24 razdelki smo odsesali gojišče in jih sprali z 1 ml natrijevega fosfatnega pufra ter jim v vsak razdelek dodali 200 µl raztopine kristal vijoličnega. Po končani inkubaciji 30 min na sobni temperaturi smo barvilo previdno odpipetirali in celice trikrat sprali s pufrom: prvič z 200 µl, drugič s 500 µl, tretjič z 1 ml. S postopnim večanjem volumna pufra smo se izognili robu zasušenega barvila na steni vsakega razdelka, ki bi sicer bistveno povečal absorbanco. Nazadnje smo celice lizirali z 1 ml 10 % ocetne kisline na razdelek. Celoten postopek barvanja smo izvedli tudi na vzorcu brez celic in izmerjeno vrednost uporabili kot ozadje.
V roku ene ure smo izmerili absorpcijo pri 595 nm s čitalcem mikrotiterskih plošč Tecan (Tecan infinite M200; Tecan Austria GmbH) s programom Magellan (Tecan Austria
GmbH). Na podlagi dobljenih vrednosti smo izračunali deleţ preţivetja celic glede na kontrolo za vsako amplitudo električnih pulzov posebej po formuli:
Deleţ preţivelih celic = (abs. elektroporiranih celic – abs. ozadja) / (abs. kontrole – abs.
ozadja) X 100 [%]
Končno vrednost deleţa preţivelih celic pri določeni amplitudi električnih pulzov predstavlja povprečna vrednost deleţev preţivelih celic treh neodvisnih poskusov ± standardna deviacija. Rezultate preţivetja celic smo predstavili s krivuljami preţivetja celic v odvisnosti od amplitude električnih pulzov.
Primerjavo končnih vrednosti preţivetja celic, ki so bile po poizkusu inkubirane 24 h, in celic, ki so bile inkubirane 48 h, smo ovrednotili na podlagi statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t-testa. Med seboj smo primerjali preţivetje celic po elektroporaciji pri določeni amplitudi električnega pulza. Za vsako amplitudo električnega pulza smo primerjali preţivetje celic, dobljeno pri omenjenih dveh različnih časih inkubacije.
3.2.2 Preživetje celic glede na uporabljeni test: test MTT, metoda barvanja s kristal vijoličnim in test klonogenosti
Rezultate preţivetja celic, ki smo jih dobili s testom MTT in z metodo barvanja s kristal vijoličnim, ter preţivetje celic, določeno s testom klonogenosti (Kandušer in sod., 2006), smo primerjali na podlagi statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t-testa. Med seboj smo primerjali deleţe preţivetja celic po elektroporaciji pri določeni amplitudi električnega pulza. Za vsako amplitudo električnega pulza smo primerjali preţivetje celic, dobljeno po omenjenih treh različnih metodah, po principu vsakega z vsakim.
3.3 VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŢIVETJE CELIC
3.3.1 Vpliv rutenijeve spojine KP1019 na preživetje celic
Rutenijevo spojino KP1019 v prahu (prof. dr. dr. B. K. Keppler, Univerza na Dunaju), skladiščeno v zamrzovalniku, smo raztopili v natrijevem fosfatnem pufru (pH 7.4). Zaradi slabe topnosti spojine smo po 10 min mešanju na vorteksu pripravili kar nasičeno, to je 300 µM KP1019 raztopino. V plastičnih epruvetkah smo pripravljeni celični suspenziji (glej 3.1) dodali prefiltrirano raztopino KP1019, tako da smo dobili končno delovno koncentracijo 30 µM KP1019 v celični suspenziji. Kontroli smo namesto KP1019
raztopine dodali enak volumen natrijevega fosfatnega pufra (10 mM natrijev fosfatni pufer-PB, Na2HPO4 / NaH2PO4, pH 7.4).
Celice smo izpostavili delovanju KP1019 za 40 min in 24 h. Za 40 minutno izpostavljenost celic smo pripravljeno celično suspenzijo s 30 µM KP1019 inkubirali 40 min v plastičnih epruvetkah na sobni temperaturi. Nato smo na mikrotitersko ploščo s 24 razdelki odpipetirali ustrezno gojišče in suspenzijo inkubiranih celic s KP1019, da smo dobili v vsakem razdelku 105 celic. Celice smo v ustreznem gojišču s hranili inkubirali 24 h v inkubatorju na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2.
Za 24 h izpostavljenost celic delovanju KP1019 smo morali celicam zaradi dolgotrajne inkubacije zagotoviti zadostno količino hranil ţe v raztopini s KP1019, zato smo celično suspenzijo s koncentracijo 20 X 106 celic/ml namesto v pufru pripravili v ustreznem gojišču z dodanim FCS (glej 3.1). Prefiltrirano raztopino 300 µM KP1019 smo dodali celični suspenziji, da smo dobili končno 30 µM KP1019 v celični suspenziji z gojiščem.
Celice smo inkubirali 24 h v inkubatorju na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2.
Deleţ preţivelih celic smo določali po 24 h inkubacije celic v inkubatorju na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2 s testom MTT (glej 3.2.1.1). Celoten poskus smo trikrat ponovili, vsakič v štirih paralelkah.
Odstotek preţivelih celic pri vsaki vrednosti parametra v poizkusu smo izrazili kot kvocient med povprečno vrednostjo absorpcij tretirane skupine celic in povprečno vrednostjo absorpcij kontrolne, netretirane skupine celic.
Deleţ preţivelih celic = (abs. tretiranih celic / abs. kontrole ) X 100 [%]
Absorpcija kontrole predstavlja torej 100 % preţivetje.
Končno vrednost deleţa preţivelih celic pri določenem parametru predstavlja povprečna vrednost deleţev preţivelih celic treh neodvisnih poskusov ± standardna deviacija.
Rezultate smo predstavili s histogramom, kjer vsak stolpec predstavlja preţivetje celic pri določenem parametru, torej po določenem času izpostavljenosti 30 µM KP1019 (0 min, 40 min, 24 h). Dobljene rezultate smo primerjali in ovrednotili na podlagi statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t-testa.
3.3.2 Vpliv rutenijeve spojine KP1019 in elektroporacije na preživetje celic
Protokol in parametre elektroporacije smo povzeli po članku Biček in sod. (2007), kjer je bil obravnavan vpliv rutenijeve spojine NAMI-A in elektroporacije na preţivetje celic B16F1. Za določanje preţivetja celic smo izbrali test MTT, ki se v literaturi pojavlja kot
eden izmed najpogosteje uporabljanih testov. Test MTT smo za vsak poizkus, kjer je bilo to mogoče, opravili 24 h in 48 h po opravljenem poizkusu, zato smo vsak poizkus izvedli v dveh paralelkah in celice inkubirali na dveh mikrotiterskih ploščah s 24 razdelki z ustrezno koncentracijo celic za določen čas inkubacije.
Pri poizkusih smo uporabili elektroporator Cliniporator (Igea, Carpi, Italy). 55 µl kapljico pripravljene celične suspenzije z ali brez 30 µM KP1019 (glej 3.3.1) smo s pipeto nanesli med vzporedni ploščati elektrodi iz nerjavečega jekla, razmaknjeni za 2 mm. Celice smo elektroporirali z vlakom osmih električnih pulzov (160 V, 100 µs, 1 Hz). Celic v kontroli nismo izpostavili električnemu polju.
Slika 3.1 Elektroporator Cliniporator (Igea, Carpi, Italy).
Slika 3.2 Elektrode, ki omogočajo generiranje homogenega električnega polja.
Slika 3.3 Slika prikazuje zapis na zaslonu računalnika, ki je povezan z elektoporatorjem, po generiranju elektroporacijskih pulzev z elektroporatorjem Cliniporator (pulzi 8 × 100 µs , amplituda 160 V, frekvenca 1 Hz).
Po končani elektroporaciji smo vsako 50 µl kapljico celične suspenzije, v kateri je bilo 106 celic, odpipetirali v svoj razdelek na mikrotiterski plošči in jih za 10 minut inkubirali na 37 ºC v gojišču Spinner's minimum essential medium brez kalcija (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, ltd Irvine, Ayrshire, UK). Nato smo na novo mikrotitersko ploščo odpipetirali ustrezno razmerje gojišča (EMEM za B16F1 oziroma F12 HAM za CHO) in inkubirane celične suspenzije, da smo dobili v vsakem razdelku 105 celic/ml za 24 h inkubacijo oziroma 104 celic/ml za 48 h inkubacijo.
Celice smo inkubirali 24 h in 48 h v inkubatorju na 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2. Po inkubaciji smo preţivetje celic določili s testom MTT (glej 3.2.1.1). Celoten poskus smo trikrat ponovili, vsakič v štirih paralelkah.
Odstotek preţivelih celic pri vsaki vrednosti parametra v poizkusu smo izrazili kot kvocient med povprečno vrednostjo absorpcij tretirane skupine celic in povprečno vrednostjo absorpcij kontrolne netretirane skupine celic.
Deleţ preţivelih celic = (abs. tretiranih celic / abs. kontrole ) X 100 [%]
Absorpcija kontrole predstavlja torej 100 % preţivetje.
Končno vrednost deleţa preţivelih celic pri določenem parametru predstavlja povprečna vrednost deleţev preţivelih celic treh neodvisnih poskusov ± standardna deviacija.
Rezultate smo predstavili s histogramom, kjer vsak stolpec predstavlja preţivetje celic pri določenem parametru (elektroporacija, elektroporacija v kombinaciji s 30 µM KP1019, 30 µM KP1019). Preţivetje izmerjeno 24 h po inkubaciji smo predstavili na enem histogramu, preţivetje izmerjeno po 48 h pa na drugem. Dobljene rezultate smo primerjali in ovrednotili na podlagi statističnega testa za primerjavo dveh parametrov, Studentovega t- testa.
4 REZULTATI
Vsi poizkusi so bili opravljeni v celičnem laboratoriju Laboratorija za biokibernetiko na Fakulteti za elektrotehniko Univerze v Ljubljani.
V uvodnih poizkusih smo se osredotočili na različne teste za merjenje preţivetja celičnih linij z namenom, da izberemo najprimernejšega za nadaljnje delo. V poizkusih, ki so sledili, smo preučevali vpliv rutenijevega kompleksa KP1019 in elektroporacije na preţivetje celičnih linij B16F1 in CHO.
4.1 PRIMERJAVA TESTOV ZA DOLOČANJE PREŢIVETJA CELIC
Zanimalo nas je, kakšna je primerljivost testov za merjenje preţivetja celic: testa MTT, metode barvanja s kristal vijoličnim in testa klonogenosti. Primerjavo smo izvedli na meritvah deleţa preţivelih celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnega polja.
Preučevali smo, kako se rezultat izmerjenega preţivetja celic, dobljen s testom MTT 24h po končanem poizkusu, razlikuje od rezultata preţivetja dobljenega 48h po končanem poizkusu. Prav tako nas je zanimala razlika v rezultatih, dobljenih po metodi barvanja s kristal vijoličnim 24h in 48h po končanem poizkusu. Rezultate izmerjenega preţivetja smo končno primerjali tudi med testom MTT, metodo barvanja s kristal vijoličnim in testom klonogenosti. Na podlagi statističnega testa Studentov t-test smo primerjali povprečne vrednosti deleţa preţivelih celic iz treh poizkusov ± standardna deviacija. Rezultate primerjav smo podali v obliki vrednosti percentilnega ranga Studentovega t-testa s 95 % intervalom zaupanja.
4.1.1 Preživetje celic glede na čas inkubacije po opravljenem poizkusu 4.1.1.1 Rezultati testa MTT
Rezultati testa MTT kaţejo, da preţivetje celic z amplitudo električnih pulzov ne glede na inkubacijski čas podobno pada. Največjo razliko v izmerjenem preţivetju celic opazimo pri 80 V in 120 V, kjer je preţivetje celic izmerjeno po 48 h celo naraslo in znatno preseglo 100 %, medtem ko je preţivetje izmerjeno 24 h po elektroporaciji glede na kontrolo upadlo. Vseeno se pri nobeni amplitudi električnih pulzov vrednosti preţivetji po 24 h in 48 h inkubacije statistično ne razlikujeta (P>0,1). Zaradi relativno velike standardne deviacije, ki je posledica majhnega števila vzorcev, pa bi bilo dobro poizkus še nekajkrat ponoviti.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 U [V]
preživetje [%]
MTT 24h MTT 48h
Slika 4.1 Deleţ preţivetja celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnih pulzov in inkubacijskega časa, po katerem je bil izveden test MTT. Temni simboli predstavljajo preţivetje 24 h po poizkusu, svetli pa 48 h po poizkusu. Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija.
4.1.1.2 Rezultati barvanja s kristal vijoličnim (CV)
Podobno kot pri testu MTT rezultati z metodo barvanja s kristal vijoličnim kaţejo upad preţivetja celic z naraščanjem amplitude električnih pulzov ne glede na inkubacijski čas.
Preţivetji celic določeni 24 h in 48 h po inkubaciji se pri nobeni amplitudi električnih pulzov statistično ne razlikujeta (P>0,1). Omeniti pa moramo še, da je zaradi majhnega števila vzorcev standardna deviacija relativno velika, zato bi bilo dobro poizkus še nekajkrat ponoviti.
0 20 40 60 80 100 120 140
0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 U [V]
preživetje [%]
CV 24h CV 48h
Slika 4.2 Deleţ preţivetja celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnih pulzov in inkubacijskega časa, po katerem je bil izveden test z barvanjem s kristal vijoličnim. Temni simboli predstavljajo preţivetje 24 h po poizkusu, svetli pa 48 h po poizkusu. Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija.
4.1.2 Rezultati primerjave metod testa MTT, metode barvanja s kristal vijoličnim (CV) in testa klonogenosti
Po statistični primerjavi vseh rezultatov, ki smo jih dobili z obema metodama pri obeh inkubacijskih časih, ugotovimo, da se rezultati statistično med seboj ne razlikujejo (P>0,1).
Med seboj se statistično ne razlikujejo niti vrednosti dobljene po 48 h inkubacije s testom MTT in barvanjem s kristal vijoličnim, ki sicer zavzemajo najbolj različne vrednosti.
Za razliko od tega se vrednosti preţivetja celic, določene s testom klonogenosti (Kandušer in sod., 2006), ki se razlikujejo od naših vrednosti, na intervalu med 160 V in 360 V, tudi statistično razlikujejo od vseh naših rezultatov (P<0,01). Preţivetje celic je pri Kandušer in sod. (2006) padlo pod 60 % pri 320 V, medtem ko je pri nas v vseh štirih primerih ţe pri 160 V. Pri Kandušer in sod. (2006) je bilo preţivetje celic pri 160 V še vedno nespremenjeno (pribliţno 100%).
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 U [V]
preživetje [%]
CV 24h CV 48h MTT 24h MTT 48h
test klonogenosti
Slika 4.3 Deleţ preţivetja celic B16F1 v odvisnosti od jakosti električnih pulzov, uporabljenega testa za določanje preţivetja celic in inkubacijskega časa, po katerem je bil test izveden. Temni simboli predstavljajo test z barvanjem s kristal vijoličnim, svetli test MTT, črtice pa test klonogenosti. Trikotniki predstavljajo preţivetje 24 h po poizkusu, kvadratki pa 48 h po poizkusu. Vsaka točka na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija.
4.2 VPLIV RUTENIJEVE SPOJINE KP1019 IN ELEKTROPORACIJE NA PREŢIVETJE CELIČNIH LINIJ B16F1 IN CHO
Preučevali smo citotoksičen vpliv KP1019 na preţivetje celic pri različnih časih izpostavljenosti celic KP1019 (0 min, 40 min, 24 h). Rezultate smo podali v obliki deleţa preţivelih celic ± standardna deviacija (slika 4.4). Rezultate smo med seboj primerjali na podlagi statističnega testa Studentov t-test.
Raziskali smo tudi, kakšen je citotoksičen vpliv KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo na preţivetje celic in koliko k temu prispeva sama elektroporacija. Rezultate smo podali v obliki deleţa preţivelih celic ± standardna deviacija (slika 4.5 in slika 4.6).
4.2.1 Rezultati citotoksičnega vpliva rutenijeve spojine KP1019
Rezultati kaţejo, da se deleţ preţivelih celic z daljšanjem časa izpostavljenosti celic (do 24 h) 30 µM koncentraciji kemoterapevtika KP1019 statistično ne spremeni (P=0,7 za B16F1 in CHO). Enako lahko ugotovimo pri obeh celičnih linijah (slika 4.4).
0 20 40 60 80 100 120 140
B16F1 CHO
preživetje [%]
40 min 24 h
Slika 4.4 Deleţ preţivetja celic B16F1 in CHO v odvisnosti od časa inkubacije celic v KP1019. Bela stolpca predstavljata preţivetje po 40 min inkubacije, siva pa po 24 h. Vsak stolpec na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija.
4.2.2 Rezultati citotoksičnega vpliva rutenijeve spojine KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo
Rezultati po 24 h inkubaciji celic po poizkusu pri obeh celičnih linijah nakazujejo zmanjšano preţivetje celic tretiranih s KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo, vendar statistična obdelava tega ne potrjuje. Preţivetje celic tretiranih s KP1019 40 min se statistično ne razlikuje od preţivetja celic tretiranih s KP1019 v kombinaciji z elektroporacijo (P=0,2 za B16F1 in P=0,3 za CHO). Poleg tega pri obeh celičnih linijah rezultati pokaţejo, da se preţivetje elektroporiranih celic statistično ne razlikuje od preţivetja celic elektroporiranih ob prisotnosti KP1019 (P=0,6 za B16F1 in P=0,2 za CHO). Tudi primerjava preţivetja med obema celičnima linijama pri posameznem parametru ni pokazala nobenih statističnih razlik (P=0,9 pri EP + KP1019), (slika 4.5).
0 20 40 60 80 100 120 140 160
B16F1 CHO
preživetje [%]
KP1019, 40 min EP
EP + KP1019
Slika 4.5 Deleţ preţivetja celic B16F1 in CHO v odvisnosti od različnih tretmajev celic, izmerjen po 24 h inkubacije. Siva stolpca predstavljata preţivetje pri 40 min inkubacije celic v KP1019, bela stolpca predstavljata preţivetje po elektroporaciji celic v pufru brez KP1019, črna pa po elektroporaciji celic v pufru s KP1019. Vsak stolpec na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija.
Prav tako nam rezultati po 48 h inkubaciji celic po poizkusu pri obeh celičnih linijah kaţejo, da se preţivetje elektroporiranih celic statistično ne razlikuje od preţivetja celic elektroporiranih ob prisotnosti KP1019 (P=0,4 za B16F1 in P=0,2 za CHO), čeprav se kaţe tendenca, da elektroporacija potencira citotoksičen učinek samega KP1019. Primerjava preţivetja med obema celičnima linijama pri posameznem parametru pa tudi pri tem poizkusu ni pokazala nobenih statističnih razlik (P=0,5 pri EP + KP1019), (slika 4.6).
0 20 40 60 80 100 120 140 160
B16F1 CHO
preživetje [%]
EP
EP + KP1019
Slika 4.6 Deleţ preţivetja celic B16F1 in CHO v odvisnosti od različnih tretmajev celic, izmerjen po 48 h inkubacije. Bela stolpca predstavljata preţivetje po elektroporaciji celic v pufru brez KP1019, črna pa po elektroporaciji celic v pufru s KP1019. Vsak stolpec na sliki predstavlja povprečje treh poizkusov ± standardna deviacija.
5 RAZPRAVA IN SKLEPI 5.1 RAZPRAVA
Namen naše naloge je bil raziskati, kako elektroporacija vpliva na citotoksični učinek rutenijeve spojine KP1019. Da bi zajeli širši spekter različnih celic, smo poizkuse izvedli na dveh celičnih linijah, eni tumorski in eni normalni trajni celični liniji. Vpliv elektroporacije na citotoksični učinek KP1019 smo ovrednotili na podlagi rezultatov preţivetja celic po elektroporaciji s prisotnim KP1019 v mediju glede na preţivetje celic po sami elektroporaciji oziroma po podaljšani inkubaciji celic v KP1019.
Preden smo začeli s poskusi, smo morali izbrati enega izmed testov za določanje preţivetja celic in določiti optimalne parametre elektroporacije in inkubacije celic s KP1019. Da bi bil vpliv elektroporacije na citotoksičnost KP1019 jasen, smo morali določiti amplitudo električnih pulzov, pri katerih elektroporacija sama ne bi povzročila upada preţivetja celic, obenem pa bi omogočila čimvečji vnos KP1019 v citosol. Iskali smo torej amplitudo električnih pulzev, pri kateri bi bilo razmerje med reverzibilno in ireverzibilno elektroporiranimi celicami čimvečje oziroma najvišjo amplitudo električnih pulzov, pri kateri preţivetje celic še ne upade (slika 5.1).
