UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Teja NUSDORFER
ZDRAVLJENJE AKUTNE MIELOIČNE LEVKEMIJE S KRVOTVORNIMI MATIČNIMI CELICAMI
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Teja NUSDORFER
ZDRAVLJENJE AKUTNE MIELOIČNE LEVKEMIJE S KRVOTVORNIMI MATIČNIMI CELICAMI
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala doc. dr. Jerneja Ogorevca
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Minja ZORC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum predstavitve: 3.9.2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 606:616.155.392:602.9:611.018(043.2)
KG transplantacija, matične celice, akutna mieloična levkemija, zdravljenje, HLA AV NUSDORFER, Teja
SA OGOREVC, Jernej (mentor),
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN ZDRAVLJENJE AKUTNE MIELOIČNE LEVKEMIJE S KRVOTVORNIMI MATIČNIMI CELICAMI
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 21 str., 2 pregl., 2 sl., 71 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Akutna mieloična levkemija (AML) je maligna bolezen, ki nastane kot posledica mutacij in sproži nenadzorovano rast multipotentnih krvotvornih matičnih celic, ki izgubijo sposobnost diferenciacije. Ker je potek bolezni zelo hiter, zahteva takojšnje zdravljenje. AML navadno zdravimo z intenzivno kemoterapijo, ki ji sledi presaditev krvotvornih matičnih celic. Najbolj razširjen tip presaditve predstavlja alogenična presaditev KMC. Zaradi visoke smrtnosti in hitrega poslabšanja bolezni, bi morali to terapijo uporabiti predvsem pri bolnikih z visoko stopnjo tveganja ponovitve bolezni.
Alogenična presaditev KMC in terapija s CAR-T sta dve glavni celični imunoterapiji, ki se uporabljata v klinični praksi. Celična terapija lahko sproži imunski odziv bolnikov in možne zaplete po presaditvi. Velik problem predstavlja neskladje v HLA antigenih, ki lahko povzročajo akutno in/ali kronično bolezen presadka proti gostitelju ali pa zavrnitev presadka. Darovalca KMC sprva iščemo v družini. Če ne najdemo skladnega darovalca, iščemo naprej v registru prostovoljnih darovalcev. Zadnje študije so dokazale, da so primerni darovalci KMC tudi nesorodni haploidnetični darovalci, saj so rezultati transplantacij primerljivi z ujemajoči sorodnimi darovalci. Tudi uporaba mezenhimskih matičnih celice (MSC) in induciranih pluripotentnih matičnih celice (iPSC) obetata napredek pri celičnih terapijah za AML.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 606:616.155.392:602.9:611.018(043.2)
CX transplantation, stem cells, acute myeloid leukemia, treatment, HLA AU NUSDORFER, Teja
AA OGOREVC, Jernej (supervisor), PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH HEMATOPOIETIC
STEM CELL TRANSPLANTATION DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 21 p., 2 tab., 2 fig., 71 ref.
LA sl AL sl/en
AB Acute myeloid leukaemia (AML) is a malignant disorder characterized by abnormal growth and differentiation of haematopoietic stem cells (HSCs), in which immature myeloid precursors (myeloblasts) accumulate in the bone marrow and peripheral blood.
Due to its rapid progress it requires immediate treatment. AML treatment usually begins with intense chemotherapy, followed by hematopoietic stem cell transplantation.
Allogeneic HSCT provides the most powerful antileukemic effect in the treatment of AML. Due to its significant mortality and rapid progress it should be used in first remission patients with high relapse rates. Although allotransplantation is the only curative treatment available for patients with advanced disease, the chances for remission are low. Cell therapies can lead to strong immune response and possible post- transplant complications. Reduced HLA matching between recipient and donor increases the risks of graft rejection and graft versus host disease (GvHD). An HLA identical or fully HLA matched sibling is considered the optimal and first choice graft for allogeneic HCT. If that's not possible, they start searching for it in large international volunteer donor registries. Recent studies have documented that the haploidentica l donors are also a possible solution, as they give comparable results as fully-matched donors. Mesenchymal stem cells and induced pluripotent stem cells are promising therapeutic targets for future directions in transplantation of stem cells.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VI KAZALO SLIK VI
1 UVOD 1
2 AKUTNA MIELOIČNA LEVKEMIJA 1
2.1 SIMPTOMI IN VZROKI ZA NASTANEK AML 2
2.2 KANDIDATNE MUTACIJE IN NJIHOV POMEN 2
2.3 CELIČNI MODEL BOLEZNI 3
2.4 ZDRAVLJENJE 4
3 KRVOTVORNE MATIČNE CELICE 4
3.1 PRIDOBIVANJE KMC 4
3.1.1 Uporaba iPSC in MSC 5
3.2 GENSKE MODIFIKACIJE KMC 6
3.2.1 Strategije genskega spreminjanja celic 7
3.3 KMC Z MODIFICIRANIM TCR 9
3.4 KMC Z MODIFICIRANIM CAR 9
4 TRANSPLANTACIJA KMC 10
4.1 DAROVALEC IN UJEMANJE V HLA ANTIGENIH 11
4.2 PRIPRAVA BOLNIKOV NA PRESADITEV KMC 12
4.3 TIP PRESADITVE (alogenična vs. avtologna) 12
5 ZAKLJUČEK 15
6 VIRI 15
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Možni viri pridobivanja KMC (prirejeno po Dessie in sod., 2020) 6 Slika 2: Slika prikazuje sosledje korakov pri genski terapiji (prirejeno po Sagoo in Gaspar,
2021). 7
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Prednosti in slabosti metod genske modifikacije KMC (prirejeno po
Alessandrini in sod., 2019) 8
Preglednica 2: Primerjava alogenične in avtologne presaditve – njune prednosti in slabosti (prirejeno po Saraceni in sod., 2016; Cornelissen in Blaise, 2015; Zver in Košnik in sod.,
2011; Champlin, 2017) 13
1 1 UVOD
Akutna mieloična levkemija (AML) je bolezen krvotvornih matičnih in predniških celic (HSPC) in je posledica pridobljenih in/ali podedovanih genetskih nepravilnosti (Kirtonia in sod., 2020). Bolezen se pojavlja v vseh starostnih obdobjih, vendar je pogostejša pri starejših od 60 let. Je najpogostejša oblika akutne levkemije pri odraslih, saj je 3 – 4 krat bolj pogosta pri odraslih kot akutna limfatična levkemija (Khwaja in sod., 2016).
AML primarno zdravimo s kemoterapijo. Najpogostejši vzrok smrti ali zaplet pri bolnikih z diagnosticirano AML je ponovitev bolezni po zdravljenju s kemoterapijo. Prav zato je najpogostejša in najbolj učinkovita opcija za bolnike s to boleznijo alogenična presaditev krvotvornih matičnih celic, saj se lahko na ta način znebimo preostalih levkemičnih celic (Mardiana in Gill, 2020). Vendar pa veliko transplantacij še vedno ni mogoče izvesti zaradi starosti, pridruženih bolezni, toksičnosti predhodnega zdravljenja, zgodnje ponovitve bolezni itd. Pri ponovitvi bolezni so možnosti zdravljenja zelo omejene, zato je ponovitev bolezni glavni vzrok za smrt bolnikov z AML, saj le manjšina doseže dolgoročno remisijo; skupno preživetje po dveh letih je pogosto manjše od 20 % (Thanarajasingam in sod., 2013).
V preteklosti je bila uporaba alogenične transplantacije krvotvornih matičnih celic omejena, saj ima malo bolnikov sorodnike z zadostno ujemajočimi se humanimi levkocitnimi antigeni (HLA). Presaditve celic nesorodnih darovalcev so bile zaradi velike toksičnosti, odpovedi presadka, oportunističnih okužb po presaditvi, bolezni presadka proti gostitelju in posledično smrti, izrazito slabši. Napredek pri tipizaciji HLA, preventivnih pristopih in v podporni oskrbi so uspešno rešili naštete probleme (Kanakry in sod., 2015). Tako se je preživetje bolnikov z AML mlajših od 60 let v zadnjih 30 letih znatno izboljšalo. V starejših starostnih skupinah napredka ni bilo (Derolf in sod., 2009).
2 AKUTNA MIELOIČNA LEVKEMIJA
Akutna mieloična levkemija je izredno heterogena bolezen, ki jo opredeljuje klonska rast mieloblastov/promielocitov, ne samo v kostnem mozgu, ampak tudi v periferni krvi in/ali tkivih. Nastane zaradi pridobljenih in/ali podedovanih genetskih nepravilnosti. Genske mutacije in kromosomske nepravilnosti so po navadi povezane z nepravilno proliferacijo in/ali blokiranjem normalne diferenciacije hematopoetskih celic (Kirtonia in sod., 2020).
Translacijske raziskave so pokazale, da je za razvoj AML potrebnih več somatskih mutacij, bolezen pa se postopoma razvija po darvinističnem modelu levkemogeneze (Grove in Vassiliou, 2014). Spoznanje ima pomembne posledice za zdravljenje, saj je malo verjetno, da bi bila tarčna monoterapija, usmerjena na en sam onkogen AML, lahko uspešna (Engen in sod., 2014).
Zaenkrat kombinacija citogenetskega profiliranja, molekularnih in genskih analiz ostaja pomembno orodje za klasifikacijo, diagnozo, prognozo in zdravljenje AML (Kirtonia in sod., 2020). Poleg tega imajo prej omenjene analize ključno vlogo za razlikovanje AML od drugih levkemij in opredelitve podtipa (Khwaja in sod., 2016). AML razvrščamo v skladu s klasifikacijo tumorjev hematopoetskih in limfoidnih tkiv Svetovne zdravstvene organizacije (WHO), ki je leta 2017, definirala 6 kategorij (Hwang, 2020) na podlagi genetskih kriterijev - kromosomske translokacije skupaj z morfološkimi in citokemičnimi značilnostmi bolezni (Khwaja in sod., 2016). In sicer: AML s ponavljajočimi genetskimi nepravilnostmi, AML s
2
spremembami povezanimi z mielodisplazijo, AML povezana s terapijo, AML, ki ni drugače opredeljena, mieloični sarkom in mieloične proliferacije, povezane z Downovim sindromom (Hwang, 2020). Genetski podtipi zagotavljajo pomembne napovedne informacije in se uporabljajo za usmerjanje odločitev pri zdravljenju, zlasti o tem, ali naj se pri prvi remisiji izvede alogenična presaditev KMC (Khwaja in sod., 2016). Evropska mreža za levkemijo (ELN) je nedavno ponovno opredelila kategorije tveganja za AML v tri skupine: ugodne, vmesne in neugodne glede na kariotip in somatske mutacije, ki imajo prognostični pomen (Herold in sod., 2020).
2.1 SIMPTOMI IN VZROKI ZA NASTANEK AML
Poleg nespecifičnih simptomov, kot sta utrujenost in izguba apetita, so za AML značilne tipične značilnosti odpovedi kostnega mozga: utrujenost in zadihanost ob naporu zaradi anemije, ponavljajoče se okužbe zaradi nevtropenije ter povečana nagnjenost k modricam in krvavitvam zaradi trombocitopenije (Khwaja in sod., 2016).
Pri veliki večini posameznikov z diagnozo AML vzrokov za nastanek bolezni ne poznamo.
Prav tako ni mogoče ugotoviti nobenega genetskega dejavnika tveganja. Se pa tveganje za nastanek AML poveča v primeru izpostavljenosti mutagenim snovem, kot so: benzen, cigaretni dim, ionizirajoče sevanje – eksplozije atomskih bomb in citotoksične kemoterapije. Akutna levkemija lahko nastane tudi po presaditvi krvotvornih matičnih celic. Citotoksičnost alkilirajočih snovi (npr. klorambucil in ciklofosfamid) in zaviralci topoizomeraze II (npr.
antraciklini) so še posebej povezani z razvojem s terapijo povezane AML (Zver in Košnik in sod., 2011). Poleg tega nekatere dedne motnje pomenijo zelo veliko tveganje za razvoj AML, npr. za levkemijo so bolj dovzetni posamezniki z: Downovim sindromom, Fanconijevo anemijo, Bloomovim sindromom, Diamond-Blackfan anemijo itd. (Khwaja in sod., 2016).
2.2 KANDIDATNE MUTACIJE IN NJIHOV POMEN
Mutacije v genih, ki so vključeni v epigenetsko regulacijo, so pogoste in so zgodnji dogodki v levkemogenezi (Khwaja in sod., 2016). Eksperimentalni podatki mišjih modelov levkemogeneze kažejo, da je za razvoj AML potrebnih več mutacij, ki jih lahko razvrstimo v funkcionalne skupine in vplivajo na različne celične aktivnosti (Schessl in sod., 2005). Do nedavnega so bile opisane tri kategorije (Ley in sod., 2013):
● mutacije v genih, ki kodirajo transkripcijske dejavnike, vključene v regulacijo celične diferenciacije in samoobnove,
● mutacije v genih za celične signalne proteine (tirozin kinaze, serin – treonin kinaze, tirozin fosfataze), ki regulirajo celično proliferacijo in preživetveno sposobnost,
● epigenetske modifikacije, ki vplivajo na izražanje različnih genov.
V študiji sekvenciranja celotnega genoma in eksoma bolnikov z AML so identificirali 2315 somatskih točkovnih mutacij in 270 manjših insercij in delecij v kodirajočih regijah. V povprečju so našli 13 mutacij na vzorec, kar je manj kot pri večini drugih oblik rakov.
Identificirali so 23 genov z višjo stopnjo mutacij od pričakovanih, vključno z geni, ki so že bili povezani s patogenezo raka: DNMT3A, FLT3, NPM1, IDH1/2, CEBPα… S tarčnim sekvenciranjem so odkrili ponavljajoče se mutacije v genih za epigenetsko regulacijo, vključno z geni vpletenimi v regulacijo DNA metilacije in posttranslacijskih modifikacij. Pri analizi
3
celotnega genoma so odkrili tudi variacije v nekodirajočih regijah. Povprečno število nekodirajočih mutacij je bilo 394. Korelacija med številom kodirajočih in nekodirajočih mutacij je bila visoka, kar kaže na to, da je večina mutacij naključno porazdeljenih po genomu.
Na splošno so kombinacije mutacij zelo variabilne, vendar obstaja nekaj kombinacij, ki se pogosteje pojavijo pri AML, npr. mutacije GATA2 in CEBPα Nekatere mutacije se običajno izključujejo, na primer TPS3 in RUNX1 z FLT3 in NPM1 (Ley in sod., 2013)
Eden od pomembnejših genov, ki sodeluje pri patogenezi AML je FMS podobna tirozin kinaza 3 (FLT3), ki se nahaja na kromosomu 13q12 in kodira receptor tirozin kinaze, ki uravnava hematopoezo. Receptor se aktivira z vezavo liganda na njegovo zunajcelično domeno, kar povzroči nastanek homodimera v plazemski membrani in avto-fosforilacijo. Aktiviran receptor fosforilira več citoplazemskih efektorskih molekul, vključenih v apoptozo, proliferacijo in diferenciacijo hematopoetskih celic (Rivera-Torres in sod., 2020).
NPM1 mutacije so ene najbolj pogostih mutacij, saj se pojavijo pri 25-35 % posameznikih z AML. Mutacije v NPM1 genu so odgovorne za lokalizacijo mutiranega proteina NPM1 (NPM1c) v celični citoplazmi. NPM1 pogosto deluje skupaj s p14 (ARF) proteinom in proteinom p53. p14 ščiti p53 pred izgubo funkcije. p53 ima tumor supresorsko funkcijo in je nujen za regulacijo celic, staranje in apoptozo. S ščitenjem p53 tako p14 pomaga preprečiti nastanek tumorjev. Ta mutirani protein (NPM1c) povzroči delokalizacijo in zaviranje p14, kar vodi do levkemogeneze. NPM1 mutacije so občutljive na visoke doze kemoterapije, kar pomeni boljši izid zdravljenja. Bolniki z mutacijama NPM1 in FLT3, imajo slabšo prognozo in slabše preživetje (Bolli in sod., 2009; Thiede in sod., 2006).
CEBPα je nujen linijsko specifičen transkripcijski dejavnik, ki usmerja izražanje genov, potrebnih za razvoj in diferenciacijo mieloidnih predniških celic v nevtrofilce. Mutacije CEBPα so opažene pri približno 10 – 15 % vseh bolnikov z AML (Schlenk in sod., 2008).
Gen DNMT3A kodira DNA metiltransferazo, encim, ki katalizira adicijo metilne skupine na citozinski ostanek dinukleotidov CpG. Mutacija DNMT3A korelira z neugodnim potekom bolezni oz. s hitro ponovitvijo (Kirtonia in sod., 2020). TET2 (metilcitozin dioksigenaza) katalizira konverzijo 5-metilcitozina v 5-hidroksi-metil citozina v DNA in vodi do demetilacije DNA. TET2 mutacije torej lahko vodijo do povišane DNA metilacije (Schlenk in sod., 2008).
Mutacije na genu WT1, ki je lociran v regiji 11q13, pogosto povzročijo Wilmsov tumor (ledvični rak) zaradi zmanjšane sposobnosti vezave proteina WT1 na DNA, kar povzroči nekontrolirano rast in delitev celic. WT1 ima tumor supresorsko funkcijo in je pomemben za celično delitev in diferenciacijo. Mutacije WT1 se medsebojno izključujejo z DNMT3A, TET2 in IDH1/2 mutacijami (Wang Yiping in sod., 2015). Chapuis in sodelavci so v raziskavi dokazali, da zdravljenje z modificiranimi T celicami, ki izražajo receptor (za WT1), pomaga pri preprečevanju ponovitve bolezni pri bolnikih z AML, ki so predhodno prejeli alogenično presaditev KMC (Chapuis in sod., 2019).
2.3 CELIČNI MODEL BOLEZNI
Wang in sodelavci so vzpostavili prvi celični model bolezni, ki prikazuje razvoj akutne mieloične levkemije od zgodnjih do poznih faz. Združili so tehnologije induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC) in CRISPR-Cas9 ter razvili model klonske evolucije
4
AML. S postopnim uvajanjem treh ključnih mutacij so ustvarili linije iPSC, ki po hematopoetski diferenciaciji zajamejo različne predmaligne stopnje, vključno s klonsko hematopoezo in mielodisplastičnim sindromom. S kartiranjem sprememb v transkriptomih in kromatinu so opisali transkripcijske programe, ki označujejo prehode med fazami bolezni.
Identificirali so celično avtonomno disregulacijo vnetnih signalov kot zgodnji dogodek v levkemogenezi, ki lahko predstavlja obetaven terapevtski cilj (Wang in sod., 2021).
2.4 ZDRAVLJENJE
AML primarno zdravimo s kemoterapijo, ki je razdeljena na dve fazi: indukcijska terapija in konsolidacijska terapija. Glavni namen indukcijske terapije je doseči morfološko popolno remisijo z zmanjšanjem števila levkemičnih blastnih celic na nezaznavno raven. Pri konsolidacijskem zdravljenju pa se želimo znebiti rezidualne bolezni za preprečevanje ponovitve bolezni (Kirtonia in sod., 2020; Döhner in sod., 2017).
Presaditev KMC se običajno uporablja pri bolnikih z neučinkovitim ali neuspešnim indukcijskim zdravljenjem. Priporoča se jo bolnikom z visokim tveganjem ponovitve bolezni (Cornelissen in Blaise, 2015). Namenjena je obnovitvi hematopoeze in vzpostavitvi imunskega sistema (Patel in Rameshwar, 2011). KMC se vgnezdijo v bolnikovo krvotvorno mikrookolje , tako da migrirajo skozi kri in žile v različne organe in na koncu v kostni mozeg (KM), kjer se prirastejo v niše KM. Ta večstopenjski proces imenujemo »homing« in je prvi in najpomembnejši korak pri klinični presaditvi KMC (Poon in sod., 2019). V optimalnih okoliščinah prejemnikov imunski sistem tolerira priraščanje darovalčevih celic, ne da bi prišlo do odpovedi presadka. Darovalčeve imunske efektorske celice sodelujejo z imunskimi celicami prejemnika in se trajno priraščajo, ne da bi povzročile usodno bolezen presadka proti gostitelju (GvHD). Sčasoma prevlada stabilno himerno stanje z obnovo funkcionalnih limfocitov B, limfocitov T in naravnih celic ubijalk ter trajnim učinkom presadka proti tumorju (GvT).
Čeprav je HSCT prvotno veljala za način reševanja bolnikov pred aplazijo kostnega mozga, ki jo povzroča zdravljenje, zdaj velja, da aloreaktivne darovalčeve celice dajejo pomemben učinek GvT, ki prispeva k izkoreninjenju raka (Hatzimichael in Tuthill, 2010).
3 KRVOTVORNE MATIČNE CELICE
KMC so izvorne celice, ki imajo sposobnost diferenciacije v specializirane krvne celice, vključno z limfociti, rdečimi krvničkami in trombociti. Uporabljajo se v protokolih kliničnih presaditev za zdravljenje različnih bolezni, vključno z levkemijo, prirojenimi anomalijami krvi in imunskega sistema aplastično anemijo in hemoglobinopatije. Za KMC je značilna asimetrična delitev, kjer ena od hčerinskih celic ostane matična celica, druga pa postane HPC (krvotvorna predniška celica). Slednja izgubi sposobnost samoobnove, se pa lahko diferencira v krvne celice. Mehanizem asimetrične delitve je ključen za ohranjanje konstantnega števila matičnih celic (Bujko in Ratajczak, 2019).
3.1 PRIDOBIVANJE KMC
KMC za transplantacijo lahko pridobimo na več načinov. Iz kostnega mozga ustreznega darovalca, z levkoferezo periferne krvi po mobilizaciji KMC s citokinom G-CSF, ali pa iz popkovnične krvi (UCB) po porodu. Kostni mozeg lahko presadimo brez obdelave, lahko pa
5
KMC obogatimo z imunsko selekcijo z monoklonskimi protitelesi proti površinskemu antigenu CD34 (Mazurier in sod., 2003).
Matične celice periferne krvi ostajajo najprimernejši vir izvornih celic za številne vrste alogenskih presaditev, pri katerih so na voljo ujemajoči sorodni ali nesorodni darovalci.
(Körbling in Freireich, 2011). Trenutno so prevladujoči klinični vir KMC, ki se uporabljajo za alogenične in avtologne presaditve (Morgan in sod., 2017).
V zadnjem desetletju so se KMC, pridobljene iz popkovnične krvi veliko uporabljale za alogenično presaditev. Zaradi manjšega števila pridobljenih matičnih celic iz popkovnične krvi, je bila uporaba usmerjena predvsem v pediatrične terapije. Ta alternativni vir KMC lahko ponudi rešitev za bolnike, ki potrebujejo presaditev, vendar nimajo ustreznega odraslega darovalca (Körbling in Freireich, 2011). Prednosti presaditve matičnih celic iz popkovnične krvi so hitra razpoložljivost celic, nizko tveganje prenosa okužb, odsotnost tveganja za darovalce, ohranitev učinka presadka proti levkemiji ter manjše tveganje bolezni presadka proti gostitelju. Pomanjkljivosti tovrstne presaditve pa so omejen odmerek celic in posledično kasnejša vgnezditev celic ter pomanjkanje imunskih celic, če so potrebni limfociti darovalca (Haspel in Ballen, 2006). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da je problematična reaktivacija virusov, kot sta CMV in HHV (Schuster in sod., 2012). Raziskave presaditev KMC popkovnične krvi so osredotočene na razširitvi dostopa, zagotavljanju kakovosti, pospešitvi presaditve in pregledu rezultatov za posamezne podskupine bolnikov (Haspel in Ballen, 2006).
3.1.1 Uporaba iPSC in MSC
Mezenhimske matične celice (MSC) in inducirane pluripotentne matične celice (iPSC) prav tako obetajo napredek pri presaditvi matičnih celic. iPSC imajo terapevtski potencial, vendar so zaradi potencialnega nastanka teratomov varnostno problematične (Bhartiya in sod., 2018).
iPSC predstavljajo vir za pridobivanje KMC in vitro z omejeno imunogenostjo. To predstavlja veliko prednost v primerjavi s kostnim mozgom, ker avtologna transplantacija iz iPSC ne sproži bolezni presadka proti gostitelju (Dessie in sod., 2020). Krvne celice darovalca reprogramiramo v iPSC in tako ustvarimo za bolnika specifične matične celice. Diferenciacijo iPSC v hemato-endotelijske predniške celice sprožimo s specifičnimi protokoli. Lange in sodelavci so dokazali možnost pridobivanja hematopoetskih predniških celic s kombinira nim izražanjem transkripcijskih dejavnikov SCL, LMO2, GATA2 in ETV2 (Lange in sod., 2020).
MSC, pridobljene iz kostnega mozga, so pomembne za regeneracijo poškodovanega tkiva. Z izločanjem in zaviranjem DKK1- oz. Wnt-signalne poti zavirajo proliferacijo rakavih celic.
MSC podpirajo vgnezditev avtologno ali alogenično presajenih KMC z imunomodulatornimi učinki. Zato lahko GvHD, ki se pojavi po presaditvi KMC, zdravimo s sočasno infuzijo MSC.
MSC, pridobljene iz kostnega mozga, so sestavni del hematopoetske niše. Poleg tega lahko uravnavajo proces hematopoeze z interakcijo in komunikacijo s KMC in predniškimi celicami (Petinati in sod., 2018).
6
Slika 1: Možni viri pridobivanja KMC (prirejeno po Dessie in sod., 2020)
3.2 GENSKE MODIFIKACIJE KMC
Hematopoetski sistem je idealna tarča za gensko terapijo, saj je dostop do krvotvornih celic za gensko manipulacijo ex vivo enostaven. Poleg tega je genska modifikacija krvnih celic dokaj učinkovita (Morgan in sod., 2017). Uspešnost genske terapije s KMC je odvisna od tega, ali vnesemo ustrezno število gensko spremenjenih KMC, ki bodo dolgotrajno vztrajale in izražale terapevtske gene v vse linije krvnih celic. Postopek zdravljenja je zapleten zaradi zbiranja velikega št. KMC, varne in učinkovite obdelave celic ter optimizacije protokola presaditve (Alessandrini in sod., 2019).
Začetna obdelava bolnikovih celic vključuje separacijo populacije celic CD34+ z uporabo anti- CD34 protiteles, ki so vezani na magnetne kroglice (imunomagnetno ločevanje (Morgan in sod., 2017)). Gojišče za obogatitev CD34+ T-celične frakcije vsebuje mešanico rekombinantnih humanih citokinov (c-kit ligand, flt-3 ligand in thrombopoietin), ki aktivirajo oz. stimulirajo KMC. V KMC nato vnesejo transgene. Z uporabo optimiziranih metod, lahko vstavimo 1 - 3 kopije transgena v večino KMC (Gschweng in sod., 2014). Uspeh in varnost genske modifikacije KMC sta odvisna od učinkovitost transdukcije in sprejemljivega števila vektorjev v eni celici (tj. število kopij vektorja) (Hauber in sod., 2018). Kljub temu, da je vnos genov v KMC oziroma njihova korekcija idealna strategija za zdravljenje prirojenih in pridobljenih motenj, uporabo metode omejuje morebitna imunološka zavrnitev modificiranih celic (Drysdale in sod., 2019).
7
Stabilno presaditev gensko modificiranih KMC omogoča visoka doza obsevanja celotnega telesa (TBI total body irradiation), ki deluje mielo- in imunosupresivno. Mielosupresija omogoča odprtje niše kostnega mozga za vgnezditev presajenih celic, imunosupresija pa prepreči zavrnitev presadka (Uchida in sod., 2016). V prvih kliničnih poskusih niso uporabljali nobenih mielosupresivnih ali imunosupresivnih sredstev, vendar pri teh poskusih niso dosegli fenotipske korekcije zaradi odsotnosti ali izjemno nizke učinkovitosti presadka modificiranih celic (Dunbar in sod., 1998).
3.2.1 Strategije genskega spreminjanja celic
Direktna transdukcija KMC v kostnem mozgu ni mogoča zaradi fizične ovire, ki jo tvori stroma kostnega mozga. Mobilizacijo in prisilni izstop krvotvornih matičnih in predniških celic iz KM je mogoče doseči z različnimi pristopi. Kombinacija G-CFS (dejavnik, ki stimulira rast granulocitov v kolonijah) in CXCR4 ali AMD31000 učinkovito mobilizira predniške celice v živalskih modelih in pri ljudeh (Fruehauf in sod., 2009). Problem in vivo transdukcije je nizko število KMC v kostnem mozgu, saj KMC predstavljajo le eno od 10^8 celic. Večina celic v kostnem mozgu so predniške celice različnih linij krvnih celic (Richter in sod., 2016).
Večinoma se uporabljata dve strategiji za gensko spreminjanje KMC, in sicer virusna in nevirusna (Alessandrini in sod., 2019). Stabilna retrovirusna ali lentivirusna uvedba antigen- specifičnih TCR ali CAR v KMC lahko zaradi regenerativne narave KMC zagotovi stalen (potencialno vseživljenjski) vir efektorskih T celic (Gschweng in sod., 2014).
Za klinično uporabo virusnih vektorjev je bilo več elementov virusnega genoma prilagojenih tako, da so inaktivirani, kar preprečuje širjenje virusa. Za gensko modifikacijo celic hematopoetskega sistema se večinoma uporabljajo lentivirusni vektorji. Po transdukciji bolnikovih celic se virusna RNA z reverzno transkriptazo pretvori v DNA in nato naključno integrira v celični genom z encimom integrazo. Glavna skrb uporabe virusnih vektorjev je varnost, zlasti insercijska mutageneza, saj se integrirajo v genom na naključnih mestih. To lahko privede do mutageneze in spremenjenega izražanja transgena (Alessandrini in sod., 2019; Howe in sod., 2008).
Slika 2: Slika prikazuje sosledje korakov pri genski terapiji (prirejeno po Sagoo in Gaspar, 2021).
8
Lentivirusni vektorji so povezani z nizko imunogenostjo. Dodatne prednosti lentivirusov so, da lahko okužijo tudi celice, ki se ne delijo. Slednje je še posebej pomembno pri KMC, ki se v primerjavi z drugi celicami krvotvornega sistema običajno slabše transducirajo (Alessandrini in sod., 2019). Razvitih je bilo več metod in sredstev za povečanje hitrosti prenosa lentivirusnih genov (npr. dodatek kationskih liposomov). Inaktivirajoči lentivirusni vektorji, ki vsebujejo delecijo v U3 regiji 3`LTR, so bolj varni in so zato postali standardna izbira vektorjev za vnos genskih informacij v KMC (Hauber in sod., 2018). Transdukcijo z lentivirusi je potrebno še optimizirati, pri čemer je treba omejiti integracijo vektorja na največ 1-3 kopije na celico in skrbno oceniti proliferacijo gensko spremenjenih celic, genotoksičnost in morebitni razvoj maligne transformacije (Larson in sod., 2017). Pomembno je, da transducirane KMC ohranijo svoje matične lastnosti (Hauber in sod., 2018).
Nevirusne tehnologije urejanja genoma, kot so ZFN (zinc finger nucleases), TALENs (transcription activator-like effector nucleases) in CRISPR-Cas9, omogočajo spremembe na vnaprej določene mestu. To lahko zmanjša tveganje mutageneze in omogoča ohranjanje endogenih vzorcev izražanja genov. Njihovo usmerjeno delovanje omogoča korekcijo genov na mestu mutacije ali izničenje oziroma aktivacijo terapevtsko pomembnih genov (Kim in sod., 2014).
Poleg omenjenih pristopov urejanja genoma KMC, obstajajo tudi obetavne tehnologije, ki temeljijo na transpozonih. Slednji so naravni mobilni elementi DNA, ki lahko spremenijo svoj položaj v genomu. V svoji strukturi imajo domeno za prepoznavanje encimov transpozaz, ki imajo funkcijo “izreži - prilepi”. Po izrezu se transpozon naključno vgradi v genom bolnikovi celic. Trenutno je transpozonsko posredovana genska modifikacija še vedno razmeroma neučinkovita (Alessandrini in sod., 2019).
Preglednica 1: Prednosti in slabosti metod genske modifikacije KMC (prirejeno po Alessandrini in sod., 2019)
SISTEM PREDNOSTI SLABOSTI
VIRUSNI VEKTORJI Dobro uveljavljena tehnologija, lentivirusi so splošno sprejeti, visoka učinkovitost genske modifikacije KMC
Tveganje insercijske mutageneze
PREUREJANJE
GENOMA ZFN, TALENs, CRISPR-Cas9:
Usmerjeno delovanje, široka uporaba, manjše tveganje mutageneze
Nova tehnologija s še ne razširjeno klinično uporabo, tveganje netarčnih učinkov in celične toksičnosti, nizka učinkovitost genskih modifikacij KMC TRANSPOZONI:
nizka imunogenost, cenovno ugodni
Genske modifikacije KMC so trenutno klinično odobrene le za modifikacije genov ex vivo, ki pa so zapleteni in tvegani. Za namnožitev KMC celic ex vivo se uporabljajo različne metode:
citokinski koktajli, bakreni kelatorji, izpostavljenost signalnim molekulam, prekomerno izražanje transkripcijskih dejavnikov itd. (Schuster in sod., 2012). Problem predstavlja časovno obdobje ekspanzije KMC v kulturi, saj je pri daljšem obdobju gojenja večja verjetnost spontanih mutacij ali citogenetskih nepravilnosti (Horn in sod., 2002). Poleg tega lahko gojenje KMC ex-vivo vpliva na njihovo potentnost in zmožnost vgnezditve. Večina protokolov vključuje mieloablacijo, ki povzroča izčrpanost krvnih celic ter dovzetnost za okužbe in poškodbe sluznice. Zato je za optimizacijo terapij pomemben razvoj protokolov za
9
transdukcijo in vivo, s čimer bi se izognili kondicioniranju in transplantaciji (Richter in sod., 2016).
3.3 KMC Z MODIFICIRANIM TCR
T celice z modificiranim TCR (T-celični receptor) so nova terapija za zdravljenje napredovalih malignih bolezni. TCR gene kloniramo v retrovirusne vektorje in transduciramo v avtologne T celice. Tako pripravljene celice T imajo protitumorski učinek (Hansrivijit in sod., 2019).
Problem pri modifikaciji T celic za izražanje eksogenega TCR predstavlja napačno združevanje bolnikovih endogenih TCR z modificiranimi TCR, kar bi lahko povzročilo usmerjenost na netarčne antigene in potencialno avtoimunost (Bendle in sod., 2010).
Proliferacija in ekspanzija T celic in vivo lahko privedeta do nastanka imunskega spomina.
TCR so za prepoznavo antigena odvisni od HLA. TCR lahko prepoznajo znotrajcelične proteine, kar razširi nabor tumorskih antigenov, ki so primerni za zdravljenje s celicami T, saj za razliko od CAR-T celic ni potrebno, da so le-ti izraženi na celični površini (Larson in De Oliveira, 2014).
3.4 KMC Z MODIFICIRANIM CAR
CAR-T celice so gensko spremenjene T celice, specifične za antigene izražene na malignih celicah. CAR (himerni antigenski receptorji) nastanejo s fuzijo antigen vezavne domene monoklonskega protitelesa z intracelularno signalno domeno, ki lahko aktivira imunske celice.
Slednje usmerijo svojo citotoksično delovanje proti malignim celicam s tarčno domeno, ki jo prepozna CAR. KMC z modificiranim CAR se normalno diferencirajo in delijo (Larson in sod., 2017). Omogočajo tudi dolgoročno proizvodnjo imunskih efektorskih celic ter ciljanje na več različnih tarč za isto bolezen (Larson in De Oliveira, 2014). Ena glavnih prednosti CAR je, da se CAR lahko izrazi na več hematopoetskih linijah (npr. T, NK in mieloidne celice). S tem se poveča aktivnost presadka proti levkemiji (Gschweng in sod., 2014). Prepoznavanje CAR je omejeno na celične strukture (Morris in Stauss, 2016).
Odobritev anti-19 CAR-T celične terapije s strani ameriške Agencije za hrano in zdravila in Evropske agencije za zdravila za recidivno akutno limfoblastno levkemijo B linije (B-ALL) je bil pomemben dogodek pri zdravljenju akutne levkemije. Razlog, da se uspehi CAR-T celic pri zdravljenju B-ALL, še niso prenesli na zdravljenje AML je pomanjkanje ustreznega ciljnega površinskega antigena, saj je ta pogosto so-izražen na zdravih krvotvornih matičnih in predniških celicah, kar vodi v ablacijo vseh mieloidnih potomcev (Cummins in Gill, 2019).
Ritchie in sodelavci so dokazali biološko aktivnost CAR-T pri AML. Ocenjevali so drugo generacijo retrovirusno transducirane anti-Lewis Y-CAR T-celice. Najboljši odzivi, doseženi pri vsakem bolniku, so bili: stabilna bolezen pri dveh bolnikih, zmanjšanje blastov pri enem bolniku in citogenetska remisija pri četrtem bolniku (Ritchie in sod., 2013).
Uporabo CAR-T celic, usmerjenih na mieloidne površinske antigene (kot npr. CD33, CD123), ovira izražanje enakih antigenov na normalnih hematopoetskih celicah (Hansrivijit in sod., 2019). Zato je za generiranje CAR-T celične terapije ključnega pomena izbira tarčnih antigenov (Kirtonia in sod., 2020). Antigena CD33 kot CD123 sta privlačni tarči, saj sta oba izražena in prisotna na vseh AML celicah, ampak sta prav tako prisotna na zdravih belih krvnih celicah. Zdravljenje s CAR-T33 (CD33 specifični CAR) je pokazalo močno citotoksičnost,
10
visoko produkcijo citokinov proti celičnim linijam AML in izkoreninjenje levkemije (Kenderian in sod., 2015).
CLL1, poznan tudi pod imenom CLEC12A, je zaradi svoje prisotnosti pri AML celicah in odsotnosti na zdravih krvotvornih celicah privlačna tarča za poskuse. Kenderian in sodelavci so dokazali, da je CLEC12A CAR-T celice mogoče uporabiti kot konsolidacijsko terapijo po indukcijski kemoterapiji (Kenderian in sod., 2016). Liu in sodelavci so na dveh bolnikih, uporabili dvojno specifične CAR-T celice (ciljajo na 2 ločena antigena: CLL1 in CD33). Oba bolnika sta dosegla popolno remisijo in okrevala (Liu in sod., 2018).
Nova strategija, ki omogoča dolgoročno obstojnost celic CAR-T brez neželenega podaljšanega učinka mieloablacije, je odstranitev tarčnega antigena CAR; na primer CD33 iz darovalčevih presajenih celic. Zamisel je presaditi CD33-/- HSPC v bolnika. Po presaditvi se bolniku aplicira CAR-T celice, ki delujejo proti CD33. Tako se omogoči normalna hematopoeza presadka (alografta), kljub prisotnosti celic CD33 CAR-T. Pomembno je, da takšno brisanje CD33 ni poslabšalo hematopoetske in imunološke funkcije presajenih HSPC (Kim in sod., 2018).
Za večjo varnost modifikacije KMC lahko v vektor za prenos genov vstavimo samomorilski gen, ki v primeru toksičnosti uniči modificirane celic. Najpogosteje uporabljen samomorilski gen je timin kinaza virusa herpes simpleksa, ki ne poslabša izražanja CAR (Larson in sod., 2017).
Klinična uporaba terapije TCR ali CAR preko transplantacije KMC predstavlja številne izzive;
KMC odraslih so na splošno manj aktivne kot pri mlajših, kar lahko močno omeji število T celic, ki jih je mogoče proizvesti iz presajenih modificiranih KMC. Predhodna zdravljenja, kot sta kemoterapija ali radioterapija, lahko prav tako zmanjšata delovanje timusa. Neoptimalen izid zdravljenja z modificiranimi KMC je povezan z omejenim preživetjem celic in vivo. Zaradi izgube označevalcev CD45RA, CD62L, CCR7 imajo celice KMC z modificiranim CAR ali TCR veliko citotoksično sposobnost, vendar tudi močno znižan regenerativni potencial (Gschweng in sod., 2014). Ostaja vprašanje, kako bo post-transplantacijska imunosupresija vplivala na obstojnost in učinkovitost darovalčevih CAR-T (Goldsmith in sod., 2020).
4 TRANSPLANTACIJA KMC
Transplantacija KMC se izvaja v obliki intravenske infuzije krvotvornih matičnih in predniških celic, ki je namenjena vzpostavljanju imunskega delovanja pri bolniki z različnimi pridobljenimi in podedovanimi malignimi ali nemalignimi boleznimi. Uporablja se za nadomestitev imunskega sistema bolnikov in obnovitvi hematopoeze (Patel in Rameshwar, 2011). Posebnosti alogenične presaditve KMC so, da presadek ne vsebuje malignih celic in vsebuje imunološko kompetentne limfocite, ki lahko delujejo proti tujim antigenom (Giralt in Bishop, 2009).
Če je imunološki odziv usmerjen proti malignim celicam se imenuje učinek presadka proti levkemiji (GvL) ali presadka proti tumorju (GvT), s čimer se potencialno izkorenini bolezen in zmanjša možnost ponovitve bolezni (Giralt in Bishop, 2009). Imunoterapevtski učinek presadka proti levkemiji izvajajo darovalčeve T celic in naravne celice ubijalke. Citotoksični kloni darovalčevih T celic, lahko odstranijo AML matične celice skupaj z drugimi levkemičnimi celicami, na podlagi neujemanja manjših histokompatibilnostnih antigenov med
11
darovalcem in prejemnikom, ali pa na podlagi nenormalno izraženih proteinov na levkemičnih celicah (Khwaja in sod., 2016).
Če pa je imunski odziv usmerjen proti antigenom, ki so prisotni na normalnih tkivih, lahko to privede do uničenja zdravih organov, kar imenujemo bolezen presadka proti gostitelju (GvHD). GvHD je reakcija, pri kateri darovalčeve T celice, delujejo proti tkivu prejemnika na podlagi neujemanja MHC. Tveganje za zavrnitev presadka in GvHD narašča z neskladje m HLA (Giralt in Bishop, 2009). Vendar pa je lahko določena stopnja neskladnosti koristna pri pojavu GvL (Patel in Rameshwar, 2011).
4.1 DAROVALEC IN UJEMANJE V HLA ANTIGENIH
Vsak posameznik ima na celični površini izražene različne antigene HLA (humani levkocitni antigen): HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, ki so zapisani na 6.
kromosomu. Geni MHC, ki delujejo kot transplantacijski antigeni, so klasični geni HLA.
Znano je, da je kompleks HLA zelo polimorfen, saj je sestavljen iz številnih genov. HLA, izraženi na celični površini imajo pomembno vlogo pri aloimunosti. HLA lahko razdelimo na HLA-A, B in C, ki so kodirani na lokusu MHC I in so izraženi na vseh vrstah celic in prisotnih peptidih, ki izvirajo iz citoplazme in jih prepoznajo celice T (CD8+). Zgrajeni so iz transmembranske verige α in β2-mikroglobulina. Drugo vrsto HLA (HLA-DP, DQ in DR) kodira lokus MHC II. Najdemo jih na APC, prepoznajo jih celice CD4+ T, sestavljeni pa so iz dveh, med seboj nekovalentno povezanih transmembranskih verig α in β (Tumer in sod., 2020).
V primeru, da poznamo tipe HLA staršev in potomcev, lahko določimo vzorec dedovanja HLA. Če vzorec dedovanja kaže na rekombinacijo, novi haplotip prepoznamo kot rekombinanten in določimo točko rekombinacije. Ker je dedovanje genov HLA kodominantno, ima vsak posameznik izražena oba antigena iz vsakega lokusa. Na uspeh transplantacije KMC ključno vpliva (ne)ujemanje v tkivnih antigenih HLA, saj imajo odločilno vlogo na pojav GvHD ter preživetje bolnika po presaditvi (Kemperle in sod., 2012). Neskladnost alelov prvega razreda HLA (A, B, C) povzroči znatno večjo incidenco zavrnitve presadka kot v primeru, da sta bolnik in darovalec skladna v HLA alelih. Neskladnost alelov drugega razreda HLA (DR, DQ in DP) ima manjši vpliv na preživetje. Večkratno neskladje lokusov HLA ima najslabši delež preživetja in najvišjo umrljivost zaradi ponovitve bolezni (Morishima in sod., 2002).
Najprej iščemo ustreznega darovalca v bolnikovi družini, nadaljujemo pa v registrih nesorodnih darovalcev. Razvoj velikih mednarodnih registrov prostovoljnih darovalcev in bank popkovične krvi je olajšal dostop do vira matičnih celic za skoraj vse bolnike brez ustreznega sorodnega darovalca (Howard in sod., 2015). Idealni darovalec je HLA identični monozigotni dvojček. Dober darovalec je HLA identični sorojenec, naslednja izbira pa je HLA skladni nesorodni darovalec (Kemperle in sod., 2012).
Glede na vrsto darovalca (sorodni ali nesorodni darovalec), se odločimo o načinu tipizacije HLA genov. Nizka stopnja ločljivosti pomeni, da določamo skupino sorodnih genskih različic, na visoki stopnji ločljivosti pa pomeni, da natančno določimo gensko različico oz. alel HLA (ujemanje z visoko ločljivost HLA je opredeljeno kot ekvivalent aminokislinskega zaporedja v antigen prepoznavnem mestu (ARS; antigen recognition site) – eksona 2 in 3 za HLA razreda I in ekson 2 za HLA razreda II (Marsh in sod., 2010)).
12
4.2 PRIPRAVA BOLNIKOV NA PRESADITEV KMC
Pred presaditvijo KMC učinkovito odstranijo skoraj vse normalne in maligne celice KM in povzročijo zadostno imunosupresijo, da preprečijo zavrnitev alogeničnih hematopoetskih celic. Način kondicioniranja je odvisen od stopnje bolezni in bolnikovega zdravstvenega stanja.
Princip temelji na predpostavki o ustvarjanju niše v kostnem mozgu (z izčrpavanjem proliferajočih KMC), kjer se transplantirane KMC lahko vgnezdijo in se delijo. Režimi kondicioniranja so lahko v obliki obsevanja celotnega telesa in/ali citotoksičnih/
kemoterapevtskih sredstev. Dajemo jih lahko v velikih odmerkih - za doseganje največje ablacije (mieloablacije) KM ali v majhnih odmerkih - za namene kondicioniranja z zmanjšano intenzivnostjo (RIC). Pri alogenični presaditvi KMC lahko režimi kondicioniranja vključuje jo tudi imunosupresivna zdravljenja za preprečevanje zavrnitve presadka ali tveganja GvHD. Pri presaditvi avtolognih gensko spremenjenih KMC se skoraj vedno uporabi RIC (Howe in sod., 2008). Kondicioniranje lahko povzroča tudi določene bolezni oz. zaplete; kratkoročno, bolniki utrpijo zaplete kot so: mukozitis, nevtropenija in veliko tveganje za okužbo; dolgoročno pa poškodbe organov in sekundarni tumorji. Tako se razvijajo alternativni režimi predhodnega kondicioniranja brez kemoterapije. Takšni pristopi vključujejo uporabo imunotoksinov in monoklonskih protiteles, usmerjenih v označevalce izražene na KMC (npr. c-Kit, CD47, CD45) (Alessandrini in sod., 2019).
4.3 TIP PRESADITVE (alogenična vs. avtologna)
Pri alogenični presaditvi se darovalčeve zdrave matične celice uporabljajo za nadomestitev bolnikovih celic (Zver in Košnik in sod., 2011). Klinična korist alogenične presaditve KMC temelji na učinku presadka proti tumorju, ki je posledica aloreaktivnosti T celic darovalca do prejemnikovih histokompatibilnih antigenov (Goldsmith in sod., 2020). Je edina kurativna možnost za bolnike s primarno refraktarno boleznijo. Čeprav alogenična presaditev pogosto da boljše rezultate kot kemoterapija, ne odpravlja negativnega učinka genskega zapisa bolnika (Döhner in sod., 2017). Prednost uporabe alogenične presaditve v primerjavi s konvencionalno kemoterapijo je v tem, da obstaja manjše tveganje za ponovni nastanek in večja verjetnost preživetja (Patel in Rameshwar, 2011).
Izbira alogenične presaditve je rezultat postopka odločanja, ki upošteva dejavnike povezane z boleznijo (Leotta in sod., 2020): citogenetske in molekularne genetske značilnosti AML (Döhner in sod., 2017), kategorijo tveganja za AML in stanje bolezni v času presaditve, vrsto darovalca (sorodni/nesorodni), individualno tveganje povezano s postopkom, starost bolnika in spremljajoče bolezni (Zver in Košnik in sod., 2011). V primeru, da pride do zavrnitve presadka, je nujno potrebno obnoviti hematopoezo, da preprečimo zaplete, ki so posledica dolgotrajne pancitopenije (anemija, okužbe in krvavitve) (Morgan in sod., 2017).
Alogenična presaditev matičnih celic je najučinkovitejše zdravljenje za preprečitev ponovitve bolezni, pri bolnikih z ujemajočim sorodnim darovalcem (matched sibling donor, MSD).
Najboljša alternativa MSD je transplantacija celic ujemajočega nesorodnega darovalca (MUD) (Saraceni in sod., 2016). Uporabo alogenične presaditve KMC na splošno omejuje pomanjkanje ujemajočega sorodnega darovalca in težave pri iskanju ujemajočega ne- sorodnega darovalca (Wang Yu in sod., 2015).
13
Avtologna presaditev KMC je bila prvotno zasnovana za utrditev remisije pri bolnikih z AML, ki nimajo ustreznega darovalca ali niso primerni za alogenično presaditev (Saraceni in sod., 2016). Darovalec matičnih celic je bolnik sam. Celice zberemo med remisijo in jih kasneje vrnemo bolniku. Z njimi nadomestimo matične celice, ki so bile poškodovane zaradi visokih odmerkov kemoterapije (Zver in Košnik in sod., 2011). Z uporabo avtolognih celic, genska terapija odpravi tveganje za GvHD in potrebo po iskanju histokompatibilnega darovalca ter dolgotrajni imunosupresiji (Drysdale in sod., 2019). Ker avtologne celice niso imunogene, lahko zmanjšamo intenzivnost kondicioniranja pred presaditvijo (Morgan in sod., 2017).
Vendar je tveganje ta ponovitev bolezni pri avtologni presaditvi KMC večje kot pri alogenični presaditvi KMC (Cornelissen in Blaise, 2015).
Preglednica 2: Primerjava alogenične in avtologne presaditve – njune prednosti in slabosti (prirejeno po:
Saraceni in sod., 2016; Cornelissen in Blaise, 2015; Zver in Koš nik in sod., 2011; Champlin, 2017)
TIP PRESADITVE PREDNOSTI SLABOSTI
ALOGENIČNA reakcija GvL
manjše tveganje ponovitve bolezni
ni kontaminacije presadka z levkemičnimi celicami
večje tveganje GVHD
lahko pride do zavrnitve presadka
pomanjkanje ujemajočega darovalca
čas potreben za identifikacijo skladnega / primernega darovalca
omejena za bolnike do 65 let
potreba po imunosupresiji
večje tveganje za okužbe AVTOLOGNA odsotnost tveganja GvHD
ni zavrnitve presadka
ni potrebno iskati darovalca
manjša pojavnost zapoznelih učinkov
manjše tveganje oportunističnih okužb
boljša kakovost življenja preživelih
hitrejša imunska obnova
starejši bolniki zdravljenje relativno dobro prenašajo
visoka stopnja ponovitve bolezni, saj ni reakcije presadka proti levkemiji
teoretična možnost kontaminacije presadka z levkemičnimi celicami (če ekstrahirane celice niso bile ustrezno očiščene), ki lahko prispevajo k ponovitvi bolezni
večje tveganje ponovitve bolezni
zdrave celice je potrebno zbrati med remisijo / pred razvojem bolezni
Saraceni in sod. (2016) so v multicentrični študiji primerjali izid presaditve KMC skladnega nesorodnega darovalca (10/10 UD-HSC) ali neskladnega nesorodnega darovalca na enem lokusu HLA (9/10 UD-HSC) z avtologno presaditvijo pri bolniki z AML v prvi popolni remisiji. Najboljše preživetje brez ponovitve bolezni je bilo v skupini bolnikov, ki so prejeli KMC skladnega nesorodnega darovalca. Med skupinama avto-HSC in prejemnikom KMC neskladnih nesorodnih darovalcev se preživetje ni bistveno razlikovalo. Pri AML bolnikih z zmernim tveganjem je bila stopnja preživetja (OS, overall survival) bistveno slabša pri neusklajenih nesorodnih darovalcih na enem lokusu, medtem ko se med prejemnikom avto- HSC in HSC usklajenih nesorodnih darovalcev, OS ni razlikovala. Pri bolnikih z majhnim tveganjem je bila pri avto-HSC triletna stopnja LFS (preživetje brez levkemije) 59 % in OS 78
%. LFS so opredelili kot interval od presaditve do ponovitve bolezni ali smrti, OS pa kot čas med datumom presaditve in datumom smrti.
14
Pri bolnikih z zmernim tveganjem, ki so prejeli avto-HSC, je triletna preživelost brez levkemije znašala 45 %, preživetje pa 60 %. Precejšen delež bolnikov, ki se jim je bolezen pojavila, so rešili s poznejšo alogenično presaditvijo HSC, ki je zagotovila približno 50 % 2-letno OS. Prav velika incidenca ponovitve bolezni po avtologni presaditvi ostaja največja težava zdravljenja.
Pri večini bolnikov se je bolezen ponovila v 2 letih. V svetovni populaciji ima avtologen način presaditve HSC 3-letno stopnjo LFS 48 %, kar je bistveno nižje v primerjavi z 10/10 UD- HSCT, vendar se statistično ne razlikuje od 9/10 UD-HSCT. Upoštevati je potrebno tudi kakovost življenja preživelih po presaditvi. Skoraj 40 % preživelih po presaditvi KMC nesorodnega darovalca, doživelo kronični GvHD (Saraceni in sod., 2016).
Za bolnike, ki nimajo ujemajočega sorodnega darovalca, bi bila lahko možnost transplantacija celic haploidnetičnega darovalca (HID) (Wang Yu in sod., 2015). Haploidentični sorodni darovalci so lahko starši ali sorojenci, ki imajo s prejemnikom enak en HLA haplotip.
Prejemnik in sorodni darovalec se morata ujemati ≥ 4/8 pri HLA-A, -B, -C in -DRB1, pri čemer je lahko na vsakem lokusu le eno neskladje (Howard in sod., 2015).
Ma in sod. (2020) so v študiji presaditve KMC bolnikov z AML z zmernim tveganjem obravnavali 127 bolnikov. Primerjali so izid presaditve haploidentičnega darovalca (HID) s presaditvijo ujemajočih sorodnih darovalcev (MSD). Pri 11 bolniki se je bolezen ponovila po približno enem letu. Druge spremenljivke , vključno z vrsto darovalca, starostjo prejemnika, cikli indukcije, niso bile pomembno povezane s tveganjem ponovitve. Po dveh letih je bila preživelost pri HID skupini 83,1 %, pri MSD skupini pa 88,5 %. Stopnja preživetja se tako med skupinama ni bistveno razlikovala. Pokazali so, da je smiselna tudi transplantacija celic haploidentičnih darovalcev, v kolikor ni ujemajočega se darovalca, lahko bolnik prejme tudi KMC haploidentičnega darovalca (Ma in sod., 2020). Izkazalo se je, da je HID presaditev dobra alternativa za zdravljenje AML z zmernim in visokim tveganjem v primeru prve in druge remisije. Vendar pa velja alogenična sorodna presaditev za standardno (Wang Yu in sod., 2015).
Anasetti in sod. (2012) so primerjali izid presaditve kostnega mozga nesorodnih darovalcev in matičnih celic iz periferne krvi. Skupna stopnja preživetja po 2 letih je bila v skupini s periferno krvjo 51 %, v primerjavi s 46 % v skupini presaditve KM. Incidenca kroničnega GvHD je bila 53 % in 41 %. V raziskavi tako niso zaznali pomembnih razlik v preživetju, incidenci akutnih GvHD ali v ponovitvi bolezni med presaditvijo matičnih celic periferne krvi in kostnega mozga pri nesorodnih darovalcih. Matične celice periferne krvi lahko zmanjšajo tveganje za odpoved presadka, medtem ko lahko kostni mozeg zmanjša tveganje za kronično GvHD. Smrtni primeri zaradi kroničnega GvHD so bili pogostejši v skupini s presajenimi KMC iz periferne krvi, medtem ko so bili zaradi odpovedi presadka pogostejši v skupini s presajenimi KMC iz kostnega mozga. Akutni in kronični GvHD sta bila v raziskavi prevladujoča vzroka smrti.
Matične celice iz periferne krvi priporočajo bolnikom z večjim tveganjem za odpoved presadka. Na primer pri bolnikih z malignimi boleznimi, ki še niso prejeli citotoksične kemoterapije, obstaja večje tveganje za zavrnitev presadka kostnega mozga. Kostni mozeg se priporoča vsem ostalim bolnikom, zlasti tistim, ki so imunosupresirani zaradi predhodne kemoterapije, saj imajo manjše tveganje za zavrnitev presadka.
15 5 ZAKLJUČEK
Nedvomno je zdravljenje akutne mieloične levkemije s presaditvijo krvotvornih matičnih celic učinkovita terapija. Dandanes zaradi velikega napredka tehnologije, metod tipizacije in ugotavljanja skladnosti med darovalcem in prejemnikom ter mednarodne povezanosti veliko lažje in hitreje dobimo skladnega darovalca. Glede na podatke za približno 80 % bolnikom z AML najdemo popolnoma skladnega darovalca. Napredki zdravljenja sicer dajejo razloge za optimizem, vendar smrtnost ostaja visoka. To še posebej velja za bolnike s ponovitvijo bolezni ali pa za tiste, ki nimajo ustreznega darovalca KMC. V zadnjem času poteka veliko raziskav na temo nesorodnih in neujemajočih darovalcev KMC oziroma haploidentičnih darovalcev.
Rezultati teh zdravljenj so primerljivi s presaditvijo KMC skladnih sorodnih darovalcev, kar daje upanje tudi tistim bolnikom, ki nimajo ustreznega darovalca znotraj družine.
Uporaba tehnologije preurejanja genomov v imunoterapiji raka ustvarja obetavne nove terapije, osnovane predvsem na modifikaciji zrelih T-celic (TCR in CAR). Modifikacija KMC z omenjenimi imunoterapijami zagotavlja trajno protirakavo terapijo, ki jo je mogoče nadzorovati s samomorilskimi geni in lahko generira imunološki spomin (Larson in De Oliveira, 2014). Z naraščanjem uspehov CAR-T terapije se mnogi sprašujejo, ali bosta CAR- T in alogenična presaditev KMC še naprej soobstajali in se dopolnjevali, ali pa bo določena terapija v klinični uporabi prevladovala, naj bo to zaradi stroškov, učinkovitosti ali toksičnosti ene ali druge terapije. Trenutno je nemogoče napovedati, katera terapija bo prevladovala, jasno pa je, da sta konkurenčni in tudi komplementarni (Goldsmith in sod., 2020).
6 VIRI
Alessandrini M., Krause K. H., Speck R. F., Pepper M. S. 2019. Transplantation of gene- modified haematopoietic stem cells: Application and clinical considerations. South African Medical Journal, 10, 109(8b): 64-69
Anasetti C., Logan B. R., Lee S. J., Waller E. K., Weisdorf D. J., Wingard R. J., Cutler S. C., Westervelt P., Woolfrey A., Couban S., G., Johnston L., Maziarz R., T., Pulsipher M. A., Porter D. L., Mineishi S., McCarty J. M., Khan S. P., Anderlini P., Bensinger W. I., Leitman S. F., Rowley S. S., Bredeson C., Carter S. L., Horowitz M. M., Confer D. L.
2012. Peripheral-blood stem cells versus bone marrow from unrelated donors. New England Journal of Medicine, 367, 16: 1487–1496
Bendle G. M., Linnemann C., Hooijkaas A. I., Bies L., de Witte M. A., Jorritsma A., Kaiser A.
D., Pouw N., Debets R., Kieback E., Uckert W., Song J. Y., Haanen J. B., Schumacher T.
N. 2010. Lethal graft-versus-host disease in mouse models of T cell receptor gene therapy.
Nature Medicine, 16, 5: 565–570
Bhartiya D. 2018. The need to revisit the definition of mesenchymal and adult stem cells based on their functional attributes. Stem Cell Research & Therapy, 9, 1, 78: doi:10.1186/s13287- 018-0833-1: 3 str.
Bolli N., De Marco M. F., Martelli M. P., Bigerna B., Pucciarini A., Rossi R., Mannucci R., Manes N., Pettirossi V., Pileri S. A., Nicoletti I., Falini B. 2009. A dose-dependent tug of war involving the NPM1 leukaemic mutant, nucleophosmin, and ARF. Leukemia, 23, 3:
501-509
16
Bujko K., Kucia M., Ratajczak J., Ratajczak M. Z. 2019. Hematopoietic stem and progenitor Cells (HSPCs). V: Stem Cells, Advances in Experimental Medicine and biology. Ratajczak M. Z. (ur.). University of Louisville. Springer: 49-77
Champlin R. 2017. Hematopoietic cell transplantation. V: Cancer Medicine. 9. ed. Bast R. C., Croce M. C., Hait W. N., Hong W. K., Kufe D. W., Piccard-Gebhart M., Pollock R. E., Weichselbaum R. R., Wang H., Holland J. F. (ur.). New Jersey, John Wiley & Sons: 833- 834
Chapuis A. G., Egan D. N., Bar M., Schmitt T. M., McAfee M. S., Paulson K. G., Voillet V., Gottardo R., Ragnarsson G. B., Bleakley M., Yeung C. C., Muhlhauser P., Nguyen H. N., Kropp L. A., Castelli L., Wagener F., Hunter D., Lindberg M., Cohen K., Seese A., McElrath M. J., Duerkopp N., Gooley T. A., Greenberg P. D. 2019. T cell receptor gene therapy targeting WT1 prevents acute myeloid leukemia relapse post-transplant. Nature Medicine, 25, 7: 1064-1072
Cornelissen J. J., Blaise, D. 2015. Hematopoietic stem cell transplantation for patients with AML in first complete remission. Blood, 127, 1: 62–70
Cummins K. D., Gill S. 2019. Will CAR T cell therapy have a role in AML? Promises and pitfalls. Seminars in Hematology, 56, 2: 155–163
Derolf A. R., Kristinsson S. Y., Andersson T. M.-L., Landgren O., W. Dickman P., Björkholm M. 2009. Improved patient survival for acute myeloid leukemia: a population-based study of 9729 patients diagnosed in Sweden between 1973 and 2005. Blood, 113, 16: 3666–3672 Dessie G., Derbew Molla M., Shibabaw T., Ayelign B. 2020. Role of stem-cell transplantation
in leukemia treatment. Stem Cells Cloning, 13: 67-77
Döhner H., Estey E., Grimwade D., Amadori S., R. Appelbaum F., Büchner T., Dombret H., L. Ebert B., Fenaux P., A. Larson R., L. Levine R., Lo-Coco F., Naoe T., Niederwieser D., J. Ossenkoppele G., Sanz M., Sierra G., S. Tallman M., Tien H., H. Wei A., Löwenberg B., D. Bloomfield C. 2017. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood, 129, 4: 424-447
Drysdale C. M., Tisdale J. F., Uchida, N. 2019. Immunoresponse to gene-modified hematopoietic stem cells. Molecular therapy - Methods & Clinical Development, 16, 42- 49
Dunbar C. E., Kohn D. B., Schiffmann R., Barton N. W., Nolta J. A., Esplin J. A., Pensiero M., Long Z,. Lockey C., Emmons R. V., Csik S., Leitman S., Krebs C. B., Carter C., Brady R. O., Karlsson S. 1998. Retroviral transfer of the glucocerebrosidase gene into CD34+
cells from patients with Gaucher disease: in vivo detection of transduced cells without myeloablation. Human Gene Therapy, 9, 17: 2629-2640
Engen C. B., Wergeland L., Skavland J., Gjertsen B. T. 2014. Targeted therapy of FLT3 in treatment of AML-current status and future directions. Journal of clinical medicine, 3, 4:
1466-1489
Fruehauf S., Veldwijk M. R., Seeger T., Schubert M., Laufs S., Topaly J., Wuchter P., Dillmann F., Eckstein V., Wenz F., Goldschmidt H., Dick A. H., Calandra, G. 2009. A combination of granulocyte-colony-stimulating factor (G-CSF) and plerixafor mobilizes more primitive peripheral blood progenitor cells than G-CSF alone: results of a European phase II study. Cytotherapy, 11, 8: 992–1001
17
Giralt S., Bishop M. R. 2009. Principles and overview of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. V: Hematopoietic stem cell transplantation. Bishop M. R. (ur.). Boston, MA, Springer: 1–21
Goldsmith S. R., Ghobadi A., DiPersio J. F. 2020. Hematopoeitic cell transplantation and car t-cell therapy: complements or competitors? Frontiers in Oncology, 10:608916, doi:
10.3389/fonc.2020.608916: 16 str.
Grove C. S., Vassiliou G. S. 2014. Acute myeloid leukaemia: a paradigm for the clonal evolution of cancer?. Disease Models & Mechanisms, 7, 8: 941-951
Gschweng E., De Oliveira S., Kohn D. B. 2014. Hematopoietic stem cells for cancer immunotherapy. Immunological reviews, 257, 1: 237-249
Hansrivijit P., Gale R. P., Barrett J., Ciurea S. O. 2019. Cellular therapy for acute myeloid Leukemia - Current status and future prospects. Blood Reviews, 37: 100578, doi:
10.1016/j.blre.2019.05.002: 12 str.
Haspel R. L., Ballen K. K. 2006. Double cord blood transplants filling a niche? Stem Cell Reviews, 2, 2: 81-86
Hatzimichael E., Tuthill, M. 2010. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications, 3: 105–117
Hauber I., Beschorner N., Schrödel S., Chemnitz J., Kröger N., Hauber J., Thirion C. 2018.
Improving lentiviral transduction of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.
Human Gene Therapy Methods, 29, 2: 104-113
Herold T., Rothenberg-Thurley M., Grunwald V. V., Janke H., Konstandin N. P., Dufour A., Schneider S., Neusser M., Ksienzky B., Greif P. A., Subklewe M., Hiddeman W., Spiekermann K., Metzeler K. H. 2020. Validation and refinement of the revised 2017 European Leukemia Net genetic risk stratification of acute myeloid leukemia. Leukemia , 34: 3161-3172
Horn P., Morris J., Bukovsky A. A., Andrews R.G., Naldini L., Kurre P., Kiem H. P. 2002.
Lentivirus-mediated gene transfer into hematopoietic repopulating cells in baboons. Gene Therapy, 9: 1464-1471
Howard C. A., Fernandez-Vina M. A., Appelbaum F. R., Confer D. L., Devine S. M., Horowitz M. M., Mendizabal A., Laport G. G., Pasquini M. C., Spellman S. R. 2015.
Recommendations for donor human leukocyte antigen assessment and matching for allogeneic stem cell transplantation: consensus opinion of the Blood and Marrow Transplant Clinical Trials Network (BMT CTN). Biology of Blood and Marrow Transplantation, 21, 1: 4-7
Howe S. J., Mansour M. R., Schwarzwaelder K., Bartholomae C., Hubank M., Kempski H., Brugman M. H., Pike-Overzet K., Chatters S. J., de Ridder D., Gilmour K. C., Adams S., Thornhill S. I., Parsley K. L., Staal F. J., Gale R. E., Linch D. C., Bayford J., Brown L., Quaye M., Kinnon C., Ancliff P., Webb D. K., Schmidt M., von Kalle C., Gaspar H. B., Thrasher A. J. 2008. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. The Journal of Clinical Investigation, 118, 9: 3143-3150
Hwang S. M. 2020. Classification of acute myeloid leukemia. Blood research, 55, S1: S1-S4, doi: 10.5045/br.2020.S001: 4 str.
18
Kanakry C. G., de Lima, M. J., Luznik, L. 2015. Alternative donor allogeneic hematopoietic cell transplantation for acute myeloid leukemia. Seminars in Hematology, 52, 3: 232-242 Kemperle I., Montanič S., Jazbec J., Pretnar J., Vidan-Jeras B. 2012. Vpliv polimorfizma in
rekombinacij v regiji HLA na izbiro darovalca krvotvornih matičnih celic za presaditev.
Zdravniški vestnik, 81: 361-372
Kenderian S. S., Ruella M., Shestova O., Klichinsky M., Aikawa V., Morrissette J. J., Scholler J., Song D., Porter D. L., Carroll M., June C. H., Gill S. 2015. CD33-specific chimeric antigen receptor T cells exhibit potent preclinical activity against human acute myeloid leukemia. Leukemia, 29, 8: 1637-1647
Kenderian S. S., Ruella M., Shestova O., Klichinsky M., Kim M. Y., Soderquist C., Bagg A., Singh R., Richardson C., Young R. M., June C. H., Saar I. G. 2016. Leukemia stem cells are characterized by CLEC12A expression and chemotherapy refractoriness that can be overcome by targeting with chimeric antigen receptor T cells. Blood, 128, 22: 766.
https://ashpublications.org/blood/article/128/22/766/98969/Leukemia-Stem-Cells-Are- Characterized-By-CLEC12A (17. avg. 2021)
Khwaja A., Bjorkholm M., Gale R. E., Levine R. L., Jordan C. T., Ehninger G., Bloomfield C.
D., Estey E., Burnett A., Cornelissen J. J., Scheinberg D. A., Bouscary D., Linch D. C.
2016. Acute myeloid leukaemia. Nature reviews. Disease primers, 2: 16010, doi:
10.1038/nrdp.2016.10: 22 str.
Kim J. M., Kim D., Kim S., Kim J. S. 2014. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA- guided endonucleases. Nature Communications, 5: 3157, doi: 10.1038/ncomms4157: 7 str.
Kim M. Y., Yu K.-R., Kenderian S. S., Ruella M., Chen S., Shin T.-H., Aljanahi A. A., Schreeder D., Klichinsky M., Shestova O., Kozlowski M.S., Cummins K. D., Shan X., Shestov M., Bagg A., Morrissette J. J. D., Sekhri P., Lazzarotto C. R., Calvo K. R., Kuhns D. B., Donahue R. E., Behbehani G. K., Tsai S. Q., Dunbar C. E., Gill S. 2018. Genetic inactivation of CD33 in hematopoietic stem cells to enable CAR T cell immunotherapy for acute myeloid leukemia. Cell, 173, 6: 1439–1453.e1419, doi: 10.1016/j.cell.2018.05.013 : 37 str.
Kirtonia A., Pandya G., Sethi G., Pandey A. K., Das B. C., Garg M. 2020. A comprehensive review of genetic alterations and molecular targeted therapies for the implementation of personalized medicine in acute myeloid leukemia. Journal of Molecular Medicine, 98, 8:
1069-1091
Körbling M., Freireich J. 2011. Twenty-five years of peripheral blood stem cell transplantation.
Blood, 117, 24: 6411-6416
Lange L., Hoffmann D., Schwarzer A., Ha T. C., Philipp F., Lenz D., Morgan M., Schambach A. 2020. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato- endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem cell reports, 14, 1: 122-137
Larson S., De Oliveira S. N. 2014. Gene-modified hematopoietic stem cells for cancer immunotherapy. Human Vaccines & Immunotherapeutics, 10, 4: 982-985
Larson S. M., Truscott L. C., Chiou T. T., Patel A., Kao R., Tu A., Tyagi T., Lu X., Elashoff D., De Oliveira S. N. 2017. Pre-clinical development of gene modification of
