KOMPATIBILNOST ENTOMOPATOGENE GLIVE Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. Z ANTAGONISTIČNIMI GLIVAMI IZ RODU Trichoderma

(1)

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO

Jernej KENK

KOMPATIBILNOST ENTOMOPATOGENE GLIVE Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. Z

ANTAGONISTIČNIMI GLIVAMI IZ RODU Trichoderma

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO

Jernej KENK

KOMPATIBILNOST ENTOMOPATOGENE GLIVE Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. Z ANTAGONISTIČNIMI GLIVAMI IZ

RODU Trichoderma

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja

COMPATIBILTY OF ENHOMOPATHOGENIC FUNGUS Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. WITH ANTAGONISTIC FUNGI

Trichoderma spp.

M. SC. THESIS Master Study Programmes

Ljubljana, 2021

(3)

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Hortikultura.

Delo je bilo opravljeno na Katedri za fitomedicino, kmetijsko tehniko, poljedelstvo, pašništvo in travništvo Oddelka za agronomijo Biotehniške fakultete.

Študijska komisija je za mentorico magistrskega dela imenovala doc. dr. Katarino Kos.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: doc. dr. Darja KOCJAN AČKO

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo

Član: doc. dr. Katarina KOS

Član: izr. prof. dr. Franci Aco CELAR

Datum zagovora:

(4)

Kenk J. Kompatibilnost entomopatogene glive… z antagonističnimi glivami iz rodu Trichoderma.

Mag. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, 2021

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK UDK 632.937:632.95:582.28:632.95.025.4(043.2)

KG biotično varstvo, entomopatogena gliva, Beauveria bassiana, antagonistične glive, Trichoderma spp., mikoparazitizem, kompeticija

AV KENK, Jernej

SA KOS, Katarina (mentor)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Magistrski študijski program 2. stopnje Hortikultura

LI 2021

IN KOMPATIBILNOST ENTOMOPATOGENE GLIVE Beauveria bassiana (Bals.- Criv.) Vuill. Z ANTAGONISTIČNIMI GLIVAMI IZ RODU Trichoderma TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja)

OP X, 42 str., 20 pregl., 15 sl., 25 vir.

IJ sl JI sl/en

AI Biotično varstvo rastlin v zadnjem obdobju dobiva vse večji pomen, saj predstavlja alternativo kemičnim fitofarmacevtskim sredstvom. V biotičnem varstvu se uporablja žive organizme, ki zatirajo škodljive organizme in obenem ne škodujejo ljudem. Mednje se uvršča tudi entomopatogeno glivo Beauveria bassiana in antagonistične glive iz rodu Trichoderma, ki so uporabljene v raziskavi. Izbrani so bili izolati dveh vrst antagonističnih gliv, in sicer T. asperellum in T. gamsii iz pripravkov Pannon Starter® Perfect Pro, Remedier® ter Trifender® Pro, ter entomopatogeno glivo B. bassiana iz pripravka Naturalis®. V raziskavi smo potrdili, da je temperatura 25 °C bolj optimalna za rast micelija vseh obravnavanih vrst, kot pa 15 °C. Ugotovili smo, da gliva T. gamsii dobro raste pri obeh temperaturah. Med glivami smo inhibicijo rasti opazili šele ob stiku micelijev entomopatogene in antagonistične glive. Izrazito inhibicijo rasti glive B. bassiana, s strani gliv iz rodu Trichoderma, smo ugotovili pri temperaturi 15 °C, a nasprotno pri temperaturi 25 °C, kjer je bila rast, do stika micelija gliv, nekoliko pospešena. Zaradi goste prepletenosti micelija ob stiku gliv nismo mogli potrditi inhibirane sporulacije ali parazitizma entomopatogene glive s strani antagonističnih gliv Trichoderma, vendar smo potencialen parazitizem opazili med glivo T. gamsii in B. bassiana pri temperaturi 15 °C.

(5)

KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2

DC UDC 632.937:632.95:582.28:632.95.025.4(043.2)

CX biological control, entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, antagonistic fungi, Trichoderma spp., mycoparasitism, competition

AU KENK, Jernej

AA KOS, Katarina (supervisor)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Horticulture

PY 2021

TI COMPATIBILTY OF ENHOMOPATHOGENIC FUNGUS Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. WITH ANTAGONISTIC FUNGI Trichoderma spp.

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO X, 42 p., 20 tab., 15 fig., 25 ref.

LA sl AL sl/en

AB Biological pest control is becoming increasingly important as an alternative to pesticides used in agriculture. Living organisms and natural enemies are used in biological control to control pests or pathogens while being harmless to humans. The entomopathogenic fungus Beauvera bassiana and the antagonistic fungus Trichoderma spp. are biological agents used in our research. More specifically, two species of antagonistic fungi, T. asperellum and T. gamsii, isolated from the biostimulants Pannon Starter® Perfect Pro and Trifender® Pro and from a biological fungicide Remedier® were used. The entomopathogen B. bassiana was isolated from Naturalis®. Our experiment was conducted at two different temperatures, 15°C and 25°C. The results showed that temperature is an important factor for mycelial growth.

At 25°C, mycelia of all fungi grew faster than at 15°C. Of all the fungi, T. gamsii was most successful at both temperatures. Strong inhibition of the growth of the fungus B. bassiana by Trichoderma fungi was observed at 15°C, while at 25°C the fungal growth of B. bassiana was accelerated until two mycelia came into contact.

Growth inhibition between antagonistic and entomopathogenic fungi was observed only when different mycelia were in contact. The two associated mycelia were too intertwined to detect differences in sporulation or mycoparasitism by Trichoderma fungi. Potential parasitism was observed between T. gamsii and B. bassiana at 15°C.

(6)

KAZALO VSEBINE

Str.

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III

KEY WORDS DOCUMENTATION IV

KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VIII KAZALO SLIK XI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XIII

1 UVOD 1

1.1 NAMEN RAZISKAVE 1

1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2

2 PREGLED LITERATURE 3

2.1 ROD Trichoderma 3

2.1.1 Taksonomija 3

2.1.2 Opis gliv iz rodu Trichoderma 3

2.1.3 Mehanizmi antagonizma 4

2.1.3.1 Tekmovanje 4

2.1.3.2 Antibioza 4

2.1.3.3 Mikoparazitizem 5

2.2 ENTOMOPATOGENA GLIVA Beauveria bassaina 5

2.2.1 Taksonomija 5

2.2.2 Opis glive Beauveria bassiana 6

2.3 UPORABLJENI PRIPRAVKI NA PODLAGI KORISTNIH GLIV 7

2.3.1 Pripravek na podlagi glive Beauveria bassiana 7

2.3.2 Pripravki na podlagi gliv Trichoderma spp. 8

2.3.2.1 Biotično sredstvo Remedier® (T. asprellum, T. gamsii) 8 2.3.2.2 Biotično sredstvo Trifender® Pro WP (T. asperellum) 8 2.3.2.3 Biotično sredstvo Pannon Starter® Perfect Pro (T. asperellum) 8

3 MATERIAL IN METODE 9

3.1 ZASNOVA POSKUSA 9

3.2 GOJIŠČE 9

3.3 INOKULACIJA GLIV 9

3.4 MERITVE 10

(7)

4 REZULTATI 11 4.1 RAST MICELIJA GLIV Trichoderma spp. IN B. bassiana PRI

TEMPERATURI 15 °C IN 25 °C.

11 4.2 VPLIV GLIVE B. bassiana NA RAST GLIV Trichoderma spp. PRI

TEMPERATURI 15 °C. 12

4.2.1 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaPSP) pri 15 °C 12 4.2.2 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaREM) pri 15 °C 12 4.2.3 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. gamsii (TgREM) pri 15 °C 13 4.2.4 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaTRI) pri 15 °C 14 4.3 VPLIV GLIVE Beauveria bassiana NA RAST GLIV Trichoderma spp.

PRI TEMPERATURI 25 °C.

15 4.3.1 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaPSP) pri 25 °C 15 4.3.2 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaREM) pri 25 °C 15 4.3.3 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. gamsii (TgREM) pri 25 °C 17 4.3.4 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaTRI) pri 25 °C 17 4.4 PRIMERJAVA RASTI MICELIJA GLIV Trichoderma spp. V DVOJNI

KULTURI Z ENTOMOPATOGENO GLIVO B. bassiana IZ PRVEGA TERMINA (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) PRI 15 °C

18

4.4.1 Rast gliv Trichoderma spp. pri 15 °C 18

4.4.2 Rast gliv Trichoderma spp. pri 25 °C 19

4.5 VPLIV GLIV Trichoderma spp. NA RAST ENTOMOPATOGENE

GLIVE B. bassiana PRI 15 °C 21

4.5.1 Vpliv glive T. asperellum (TaPSP) na rast micelija glive B. bassiana pri 15 °C

21 4.5.2 Vpliv glive T. asperellum (TaREM) na rast micelija glive B. bassiana

pri 15 °C

22 4.5.3 Vpliv glive T. gamsii (TgREM) na rast micelija glive B. bassiana pri

15 °C

23 4.5.4 Vpliv glive T. asperellum (TaTRI) na rast micelija glive B. bassiana

pri 15 °C

25 4.6 VPLIV GLIV Trichoderma spp. NA RAST ENTOMOPATOGENE

GLIVE B. bassiana PRI 25 °C 26

4.6.1 Vpliv glive T. asperellum (TaPSP) na rast micelija glive B. bassiana pri 25 °C

26 4.6.2 Vpliv glive T. asperellum (TaREM) na rast micelija glive B. bassiana

pri 25 °C 28

(8)

4.6.3 Vpliv glive T. gamsii (TgREM) na rast micelija glive B. bassiana pri

25 °C 29

4.6.4 Vpliv glive T. asperellum (TaTRI) na rast micelija glive B. bassiana pri 25 °C

31 4.7 PRIMERJAVA RASTI MICELIJA GLIVE B. bassiana IZ

OBRAVNAVANJ PRVEGA TERMINA IN KONTROLNEGA OBRAVNAVANJA

32

4.7.1 Rast glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivami Trichoderma spp. pri 15 °C

32 4.7.2 Rast glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih

skupaj z glivami Trichoderma spp. pri 25 °C

34

5 RAZPRAVA 36

5.1 VPLIV TEMPERATURE NA RAST GLIV Trichoderma spp 36

5.2 INTERAKCIJE MED ENTOMOPATOGENO IN ANTAGONISTIČNO

GLIVO 37

6 SKLEPI 39

7 POVZETEK 40

8 VIRI 41

ZAHVALA

(9)

KAZALO PREGLEDNIC

Str.

Pregl. 1: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaPSP) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

12

Pregl. 2: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B.

bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

13

Pregl. 3: Površine micelija glive T. gamsii (TgREM) (cm²) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

13

Pregl. 4: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaTRI) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

14

Pregl. 5: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaPSP) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

15

Pregl. 6: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C, nacepljenih v prvem drugem (3 dni stara B.

bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

15

Pregl. 7: Površine micelija (cm²) glive T. gamsii (TgREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

17

Pregl. 8: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaTRI) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

17

(10)

Pregl. 9: Površine micelija gliv (cm²) Trichoderma spp. iz posameznih obravnavanj (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI), iz prvega termina (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

18

Pregl. 10: Površine micelija gliv (cm²) Trichoderma spp. iz posameznih obravnavanj (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI), iz prvega termina (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

19

Pregl. 11: Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. asperellum (TaPSP) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

21

Pregl. 12: Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. asperellum (TaREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

22

Pregl. 13: Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. gamsii (TgREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

24

Pregl. 14: Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. asperellum (TaTRI) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

25

Pregl. 15: Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. asperellum (TaPSP) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

27

Pregl. 16: Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. asperellum (TaREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

28

Pregl. 17 Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. gamsii (TgREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

29

Pregl. 18 Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj skupaj z glivo T. asperellum (TaTRI) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv ponazarjajo različne male tiskane črke.

31

(11)

Pregl. 19 Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) iz prvega termina (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

33

Pregl. 20 Površine micelija glive (cm²) B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in obravnavanj (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) iz prvega termina (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

34

(12)

KAZALO SLIK

Str.

Slika 1: Rast micelija glive B. bassiana in gliv Trichoderma spp. iz posameznih kontrolnih obravnavanj (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) v prvem terminu, podana kot povprečna površina (cm²) za vsak dan, pri 15 in 25

°C.

11

Slika 2: Z alkoholnim flomastrom označena rast micelija gliv B. bassiana in T.

asperellum (TaREM) v obdobju 10 dni pri 25 °C. Gliva T. asperellum na spodnji polovici petrijevke, gliva B. bassiana na zgornji polovici petrijevke.

16

Slika 3: Rast micelija gliv Trichoderma spp. v posameznih obravnavanjih (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) v prvem terminu, podana kot povprečna površina (cm²) za vsak dan, pri 15 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

19

Slika 4: Rast micelija gliv Trichoderma spp. v posameznih obravnavanjih (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) v prvem terminu, podana kot povprečna površina (cm²) za vsak dan, pri 25 °C. Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

20

Slika 5: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. asperellum (TaPSP) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 15 °C.

Statistično značilne razlike med površinami micelija glive po dnevih ponazarjajo različne male tiskane črke.

22

Slika 6: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. asperellum (TaREM) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 15 °C.

23

Slika 7: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. gamsii (TgREM) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 15 °C.

24

Slika 8: Vzporedna rast in ovijanje antagonistične glive T. gamsii okoli micelija entomopatogene glive B. bassiana.

25 Slika 9: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in

obravnavanjih skupaj z glivo T. asperellum (TaTRI) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 15 °C.

26

(13)

Slika 10: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. asperellum (TaPSP) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 25 °C.

27

Slika 11: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. asperellum (TaREM) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 25 °C.

29

Slika 12: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. gamsii (TgREM) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 25 °C.

30

Slika 13: Rast micelija glive B. bassiana v kontrolnem obravnavanju in obravnavanjih skupaj z glivo T. asperellum (TaTRI) v treh terminih, podana kot povprečna površina micelija (cm²) za vsak termin pri 25 °C.

32

Slika 14: Rast micelija glive B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in iz obravnavanj dvojnih kultur (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) v prvem terminu, podana kot povprečna površina (cm²) za vsak dan, pri 15 °C.

Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

33

Slika 15: Rast micelija glive B. bassiana iz kontrolnega obravnavanja in iz obravnavanj dvojnih (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) v prvem terminu, podana kot povprečna površina (cm²) za vsak dan, pri 25 °C.

Statistično značilne razlike med površinami micelija gliv, nacepljenih v prvem terminu, ponazarjajo različne male tiskane črke.

35

(14)

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

TaPSP Trichoderma asperellum iz pripravka Pannon Starter® Perfect Pro TaREM Trichoderma asperellum iz pripravka Remedier®

TgREM Trichoderma gamsii iz pripravka Remedier®

TaTRI Trichoderma asperellum iz pripravka Trifender® Pro

(15)

1 UVOD

Biotično varstvo je ena od vej integriranega varstva rastlin in opredeljuje uporabo živih organizmov za namen zatiranja škodljivih organizmov. Zakon o zdravstvenem varstvu rastlin (2007) določa, da je biotično varstvo način obvladovanja škodljivih organizmov v kmetijstvu in gozdarstvu, ki uporablja žive naravne sovražnike, antagoniste ali kompetitorje ali njihove produkte in druge organizme, ki se morejo sami razmnoževati.

Zaradi kmetijstva in drugih dejavnosti se lahko v določenem okolju naravno ravnovesje med organizmi podre. Posledično se lahko nekatere vrste razmnožijo do te mere, da postanejo škodljive. Do porušenega ravnovesja lahko pride tudi pri vnosu tujerodnih organizmov.

Človek si zato želi v tem okolju ponovno vzpostaviti naravno ravnovesje, kar lahko stori s koristnimi organizmi. To so organizmi, ki s svojim načinom življenja človeku koristijo pri obvladovanju škodljivih organizmov, hkrati pa ljudem in gojenim rastlinam ne škodujejo.

Med koristne organizme štejemo žuželke, pršice, entomopatogene ogorčice, glive, bakterije in viruse. Na biotični način pa lahko zatiramo žuželke, pršice, glive, bakterije ter plevele (Urek in sod., 2013).

Biotično varstvo je ena izmed tehnologij varstva rastlin, ki je okolju bolj prijazna. Za razliko od uporabe kemičnih fitofarmacevtskih sredstev pri biotičnem varstvu v okolju ni ostankov FFS. Prav tako biotični pripravki nimajo karence, ne škodijo tretiranim rastlinam in niso nevarni za ljudi. Kljub temu so metode biotičnega varstva dražje in zahtevajo dodatna znanja. Za varstvo lahko uporabljamo samo tiste organizme, za katere je dokazano, da v danem okolju ne bodo povzročali škode ne-ciljnim organizmom. Pomembno je tudi, da se sočasno z njimi ne uporablja kemičnih sredstev, saj lahko raba neprimernih sredstev močno prizadene ali uniči koristne vrste (Urek in sod., 2013).

Glede na način delovanja ločimo štiri skupine koristnih organizmov: plenilci ali predatorji, parazitoidi, koristne parazitske glive, antagonisti (Urek in sod., 2013).

Koristne parazitske glive delujejo na principu parazitiranja svojih gostiteljev (gliv), kar pomeni, da prodrejo v gostiteljevo notranjost, povzročijo njegovo slabljenje in lahko tudi smrt. Organizme, ki okužujejo žuželke, imenujemo tudi entomopatogeni organizmi. Med koristne parazitske glive uvrščamo tudi glive Trichoderma spp. in glivo Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. (Urek in sod., 2013).

Antagonisti so organizmi, ki ne plenijo drugih organizmov, temveč na njih vplivajo s tekmovanjem za hrano in prostor ali pa z izločanjem različnih snovi oziroma antibiozo, včasih pa jih tudi parazitirajo. Najbolj proučen in uporabljen antagonist so glive Trichoderma spp. (Urek in sod., 2013).

1.1 NAMEN RAZISKAVE

Cilj magistrskega dela je ugotoviti, ali med antagonističnimi glivami Trichoderma spp. in entomopatogeno glivo B. bassiana prihaja do inhibicije rasti ter ali ob preraščanju micelija pride do parazitizma in hkrati zmanjšane sporulacije entomopatogena.

(16)

1.2 DELOVNE HIPOTEZE

Predpostavljali smo, da bo zaradi hitrejše rasti micelija gliv Trichoderma spp., le-te inhibirale rast glive B. bassiana ter, da bo temperatura pomembno vplivala na rast in interakcije med glivami. Predvidevali smo, da bo ob preraščanju gliv Trichoderma spp. čez kolonijo B. bassiana inhibirana sporulacija glive B. bassiana ter, da jo bodo antagonistične glive sčasoma uspele tudi parazitirati.

(17)

2 PREGLED LITERATURE 2.1 ROD Trichoderma

Prvi zapisi o obstoju gliv iz rodu Trichoderma segajo že v konec 18. stoletja. V drugi polovici 19. stoletja sta brata Tulasne ugotovila, da je Hypocrea rufa (Pers.) Fr. spolna oblika nespolnega stadija glive Trichoderma viride (Pers.). Do leta 1969 je veljalo, da v rod Trichoderma spada samo vrsta T. viride, vendar je bilo še istega leta dokazanih 9 vrst, ki spadajo v ta rod. Do leta 2006 je bilo opisanih že preko sto vrst gliv iz rodu Trichoderma, vendar te identifikacije niso bile zanesljive zaradi pomanjkljivih metod. Danes se uporabljajo natančne metode identificiranja vrst, pri katerih se poslužujemo uporabe sekvencioniranja nukleotidnih zaporedij. Podatkovni baza za vrste iz rodu Trichoderma

»International Commission on Trichoderma Taxonomy« navaja 370 imen vrst, ki so bile prepoznane in opisane v letu 2020 (Celar, 2019; Taxonomy 2020)

2.1.1 Taksonomija

Taksonomijo povzemamo po viru Trichoderma (2019):

DOMENA: Eukaryota - evkarionti KRALJESTVO: Fungi - glive

DEBLO: Ascomycota - zaprtotrosnice PODDEBLO: Pezizomycotina

RAZRED: Sordariomycetes

PODRAZRED: Hypocreomycetidae RED: Hypocreales

DRUŽINA: Hypocreaceae ROD: Trichoderma

VRSTA: - Trichoderma asperellum (Samuels, Lieckf. & Nirenberg), - Trichoderma gamsii (Samuels & Druzhin)

2.1.2 Opis gliv iz rodu Trichoderma

Glive Trichoderma spp. so prostoživeči talni antagonistični organizmi in so razširjeni po celem svetu. Prisotne so v različnih tipih tal, ekosistemih in podnebjih. V gramu tal je lahko med sto in tisoč primerkov. So saprofitske glive in jih najdemo v rizosferi rastlin, kot tudi v rastlinskem materialu v razkrajanju. Najpogosteje jih najdemo v talnem horizontu tipa A, kjer se nahaja veliko organske mase. V gozdnih tleh predstavljajo okoli 3 %, na travinju pa okoli 1,5 % talnih gliv. Najdene so bile celo v nekaterih žuželkah in mehkužcih. Kot najpogosteje uporabljene vrste v biotičnem varstvu poznamo T. harzianum (Rifai), T.

asperellum (Samuels, Lieckf. & Nirenberg), T. viride (Pers.), T. atroviride (Karst.), T. virens (Mill., Giddens & Foster Arx), in T. reesei (Simons). Kolonije so zeleno-rumene do rdečkasto obarvane ali celo brezbarvne. So hitro rastoči organizmi, z intenzivno zeleno obarvanimi konidiji in razvejanimi konidiofori. Optimalna temperatura za rast je med 25 in 30 °C. Vloga gliv Trichoderma spp. je v tleh različna. S pomočjo metabolitov lahko preprečujejo kalitev spor fitopatogenih gliv, ki bi lahko okužila semena. Prav tako pa lahko inhibirajo ali razgrajujejo različne encime, ki bi patogenom (druge glive, bakterije, oomicete, virusi) omogočali vstop v rastlino. Lahko so tudi mikoparaziti oziroma hiperparaziti, kar

(18)

pomeni, da parazitirajo druge glive. Zaradi teh sposobnosti so zato zelo prilagodljive v različnih okoljih. Velika genetska raznolikost med sevi omogoča velik spekter uporabe teh gliv za tržne in ekološke namene (Zimand in sod., 1996; Schuster in Schmoll, 2010; Sharma in Sharma, 2020; Harman, 2006).

2.1.3 Mehanizmi antagonizma

Pri boju za preživetje v danem okolju glive iz rodu Trichoderma uporabljajo različne mehanizme. Ti mehanizmi so tekmovanje ali kompeticija, antibioza in mikoparazitizem. S tekmovanjem in kompeticijo z različnimi mehanizmi z drugimi glivami tekmujejo za hranilne snovi in prostor. Sintetizirajo hlapne in nehlapne metabolite, ki zaviralno delujejo na druge glive, ter s pomočjo litičnih encimov parazitirajo ostale glive in izrabljajo njihove hranilne snovi (Celar, 2019; Harman in sod., 2004).

2.1.3.1 Tekmovanje

Značilno za naravne talne habitate je, da so dostopna hranila v majhnih omejenih količinah.

Zato med organizmi prihaja do tekmovanja za hranilne snovi in življenjski prostor. Korenine in okolica korenin, oziroma rizosfera, je zelo pomemben habitat za talne organizme. Njihovo število in aktivnost v rizosferi sta odvisna od povečane koncentracije topnih organskih spojin, ki jih rastlina izloča ter povečanega števila odmrlih rastlinskih celic. Koreninski izločki bližnjim mikroorganizmom predstavljajo lahko dostopna hranila, za katere neprestano poteka kompeticija. Antagonistične glive Trichoderma spp. lahko zaradi hitre rasti hitro kolonizirajo življenjski prostor v rizosferi in si tako zagotovijo boljšo dostopnost do hranil. Nekatere vrste so celo odporne proti antimikrobnim spojinam, ki jih tvorijo rastline (Celar, 2019; Harman in sod., 2004).

2.1.3.2 Antibioza

Za glive Trichoderma spp. je značilno, da imajo izredno sposobnost sinteze zunajceličnih beljakovin in encimov za razgradnjo celuloze in hitina. Poleg naštetih encimov sintetizirajo širok spekter hlapnih in nehlapnih sekundarnih metabolitov, ki na fitopatogene delujejo fungicidno in fungistatično. Pri Trichoderma vrstah je opisanih že več kot 180 sekundarnih metabolitov iz različnih skupin. Sinteza in količina metabolitov je močno odvisna od okoljskih dejavnikov. Metabolite lahko na splošno delimo v tri skupine (Celar, 2019;

Contreras-Cornejo in sod., 2016):

- hlapni metaboliti kot so alkil pironi, izocianidne spojine, alkoholi, etil acetati itd., - vodotopni metaboliti kot so oktaketidi, terpenoiti itd.,

- peptaiboli, ki so biotično aktivni peptidi in imajo sposobnost močne interakcije s celičnimi membranami, v katerih oblikujejo ionske kanalčke in tako vplivajo na prepustnost celičnih membran.

(19)

2.1.3.3 Mikoparazitizem

Z izrazom mikoparazitizem označujemo pojav, ko ena gliva parazitira drugo glivo. Je zelo zapleten proces, ki ga v grobem lahko delimo v štiri faze. Prva faza je prepoznavanje gostitelja in rast proti njemu. Prepoznava poteka prek snovi, ki jih gostitelj izloča v okolico.

Druga faza je stik ter pritrditev hife na gostitelja. V tretji fazi se prične mikoparazitska hifa okoli gostitelja ovijati in raste vzdolž njega ter tvori apresorije in kaveljčkom podobne strukture, ki jim pomagajo pri prodoru skozi celično steno. Pri vstopu skozi celično steno sodelujejo tudi hidrolitični encimi, kot so hitinaze, glukanaze, proteaze in celulaze. Nato v četrti fazi poteka razgradnja citoplazme v celicah gostitelja, kar pomeni celično smrt. Ta je posledica antibioze, pri kateri se sproščajo antimikrobne snovi, ki onemogočajo obnovo celične stene na mestu vstopa hif. Nato se v celicah gostitelja pojavijo vakuole, čemur sledi razkroj celične stene (Contreras-Cornejo in sod., 2016; Celar, 2019; Barh in Azevedo, 2018;

Harman in sod., 2004).

Glive Trichoderma spp. lahko z rastlino delujejo tudi sinergistično. V rastlinah lahko sprožijo obrambne reakcije, kar se odraža v inducirani oziroma pridobljeni sistemski odpornosti. Rastline imajo veliko obrambnih mehanizmov s katerimi preprečujejo ali zmanjšujejo učinke patogenov. Ti mehanizmi so sestavljeni iz specifičnih receptorjev, ki se odzovejo na signalne molekule oziroma elicitorje ali efektorje, kar sproži obrambne mehanizme kot so strukturne in kemične spremembe v rastlini. Vrste Trichoderma lahko tvorijo podobne proteine, kot jih sintetizirajo patogeni in delujejo kot signalne molekule na katere se rastlina odzove. Gliva Trichoderma sp. se sprva obnaša kot šibek parazit, ki s svojimi hifami kolonizira medcelični prostor v povrhnjici in skorji korenin. Medtem se sproščajo tudi signalne molekule, ki jih rastlina prepozna, in sproži obrambne mehanizme.

Obrambni odziv rastline prepreči širjenje in parazitiranje glive Trichoderma sp., zato ta postane avirulentna. Hkrati lahko glive Trichoderma spp. tudi vzpodbujajo rast in razvoj korenin, pripomorejo k boljši odpornosti na abiotski stres, kot sta suša ali zasoljenost tal, in izboljšajo vsrkavanje hranil (Contreras-Cornejo in sod., 2016; Munda in sod, 2019; Barh in Azevedo, 2018; Harman in sod., 2004).

2.2 ENTOMOPATOGENA GLIVA Beauveria bassiana

Glivo je leta 1835 prvič odkril entomolog Agostino Bassi di Lodi kot bele prevleke micelija na mumijah gosenic sviloprejk in dokazal, da je bolezen povzročila gliva. Še istega leta je glivo opazoval tudi italijanski naravoslovec Giuseppe Gabriel Balsamo-Crivelli in jo poimenoval Botrytis bassiana (Bals.-Criv.). Sredi 19. stoletja je v Združenih državah Amerike že potekal eden prvih poizkusov uporabe glive Beauveria bassiana za zatiranje hrošča Blissus leucopterus (Say). Velja za eno izmed najbolj raziskovanih entomopatogenih gliv na svetu. Danes v rod Beauveria uvrščamo 26 vrst (Bustamante in sod., 2011;

Zimmermann, 2017; Mascarin in Jaronski, 2016).

2.2.1 Taksonomija

Taksonomijo povzemamo po viru Beauveria bassiana (2019):

Domena: Eukaryota - evkarionti KRALJESTVO: Fungi - glive

(20)

DEBLO: Ascomycota - zaprtotrosnice PODDEBLO: Pezizomycotina

RAZRED: Sordariomycetes

PODRAZRED: Hypocreomycetidae RED: Hypocreales

DRUŽINA: Cordycipitaceae ROD: Beauveria

VRSTA: Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) 2.2.2 Opis glive Beauveria bassiana

Entomopatogeno glivo B. bassiana se uporablja v biotičnem varstvu rastlin. Je najpogosteje uporabljena gliva za zatiranje škodljivcev. Kolonije so značilno bele barve, ki s časom porumenijo in so lahko tudi rdečkasto obarvane. Optimalna temperatura za rast je med 25 in 28 °C. Na ovalnih konidioforih se oblikujejo prašnati enocelični konidiji. Konidiji so prozorne barve ter ovalne oblike in se oblikujejo po skupinah, ki jih prepoznamo kot kupčke snežno bele barve. Vrsta B. bassiana je splošno razširjena gliva v različnih talnih tipih in klimatskih razmerah, zato jo lahko najdemo tako na obdelovalnih površinah, kot tudi v naravnih habitatih. Okužuje številne vrste žužek in pršic v razvojnih fazah od ličink do odraslih osebkov. Poznamo več sevov, ki se med seboj razlikujejo v virulentnosti in spektru gostiteljev. Gliva ima širok spekter gostiteljev med katerimi je več kot 700 vrst žuželk in pajkovcev. Velja za okolju varen organizem, saj predstavlja minimalno nevarnost za zdravje ljudi (Zimmermann, 2017; Mascarin in Jaronski, 2016).

Gliva B. bassiana v svoje gostitelje najpogosteje prodre skozi kutikulo, najpogosteje in najlažje tam, kjer je kutikula tanjša, oziroma med členi ali skozi ustno odprtino. Zmožnost okužbe in širjenja glive je močno odvisna od abiotskih in biotskih dejavnikov. Abiotskih, kot so zračna vlaga, temperatura, padavine in sončno sevanje ter biotskih dejavnikov, kot so starost gostitelja, dovzetnosti za okužbo in vedenja gostitelja. Patogeneza se prične z pritrditvijo spor oziroma konidijev na kutikulo gostitelja. Temperatura ima veliko vlogo pri uspešni patogenezi, saj gliva raste med 8 in 35 °C, na nižjih in višjih temperaturah pa se ta zmožnost močno zmanjša. Konidiji po 10 urah uspešno vzkalijo, kalitev pa se zaključi v 20 urah po pritrditvi pri 20 do 25 °C. Kalitev konidijev je odvisna od kutikularnih lipidov na gostitelju. To so različne maščobne kisline, aldehidi, voski, ketoni in alkoholi, ki lahko delujejo antimikrobno. Pri kalenju nastajajo klične cevi in formira se apresorij. Na delu, kjer se gliva stika z kutikulo, izrašča infekcijska hifa, ki jo poimenujemo tudi penetracijski klin, ki predre skozi kutikulo. Pri prodoru kutikule sodelujejo tudi hidrolitičnih encimi, to so proteaze, lipaze in hitinaze. Nato se v notranjost gostitelja hifa razrašča in, ko zraste do hemolimfe, se lahko iz hife zaradi hranil oblikujejo enocelične blastospore. Blastospore so specializirane oblike glive, ki omogočajo njeno hitro širjenje po telesu in izrabo hranil ter vstopajo v tkiva in se hkrati izogibajo imunskem sistemu gostitelja. Gliva med širjenjem po gostitelju tudi sintetizira in sprošča toksične metabolite, protimikrobne peptide, ki delujejo na imunski sistem. Hkrati v telesu gostitelja poteka degradacija tkiv in pomanjkanja hranil, kar vodi v smrt gostitelja. Nato sledi inkubacijska doba, med katero B. bassiana lahko vpliva na prehranjevanje in vedenje gostitelja. Dolžina inkubacijske dobe je odvisna od vrste gostitelja, njegove razvojne stopnje ter tudi od temperature in virulentnosti patogena.

Okuženi osebki v štirih do desetih dneh poginejo, kar je odvisno od vrste in starosti žuželke.

(21)

Blastospore se v odmrlem gostitelju preoblikujejo v micelij, kateri po smrti gostitelja izraste skozi kutikulo navzven in ob ugodnih vremenskih pogoji, predvsem zadostni zračni vlagi, tvori nove konidije. Konidiji se nato lahko prenašajo z vetrom, dežnimi kapljicami ali drugimi abiotskimi in biotskimi vektorji. Ti so za razliko od blastospor hidrofobni (Mascarin in Jaronski, 2016; Munda in sod., 2019).

Vrsta B. basianna med procesom okužbe sprošča razne toksine, ki vplivajo na gostitelja.

Najbolj pomembna spojina je beauvericin. Je ciklični heksapeptid, ki ga tvorijo izmenično tri molekule N-metilfenilalanina in tri molekule 2-hidroksisovalerične kisline. Metabolit deluje insekticidno, antibiotično in citotoksično. Drugi najpomembnejši metabolit je bassianolid in deluje antibiotično na podoben način kot beauvericin. Tvori pa tudi ostale sekundarne metabolite kot so bassianin, tenelin, bassiackidin, beauveriolide, oosporin in oksalno kislino (Zimmermann, 2017).

Tudi rastline lahko s svojo strukturo ter fizikalnimi in kemičnimi lastnostmi vplivajo na interakcije gliva-gostitelj in slabšo učinkovitost biotičnega zatiranja. Take ovire lahko premagujemo z uporabo sredstev na podlagi oljne disperzije in bolj virulentnih sevov.

Sredstva na podlagi oljne disperzije omogočajo uspešnejšo okužbo pri nižji zračni vlagi, višjih temperaturah in povečanem sončnem sevanju ter omogočajo bolj učinkovito aplikacijo biotičnega sredstva na večje površine ob hkratni manjši porabi sredstva. V oljne disperzije se zlahka mešajo konidiji, saj so hidrofobnega značaja (Mascarin in Jaronski, 2016; Munda in sod., 2019).

2.3 UPORABLJENI PRIPRAVKI NA PODLAGI KORISTNIH GLIV 2.3.1 Pripravek na podlagi glive Beauveria bassiana

Glivo smo izolirali iz biotičnega priravka Naturalis® (INTRACHEM Bio Italia S.p.A., distributer za SLO Karsia d.o.o). To je kontaktni insekticid z dvema načinoma delovanja.

Prvi je kontaktni način in deluje kot kontaktni insekticid, pri katerem napaden organizem umre zaradi pomanjkanja hranil in dehidracije. Drugi način delovanja je repelentni oziroma odvračalni in preprečuje ovipozicijo samic sadnih muh. Sredstvo je formulirano v obliki oljne disperzije in ga je mogoče tretirati foliarno v primeru zatiranja sadne muhe (Ceratitis capitata /Wiedemann/), češnjeve muhe (Rhagoletis cerasi /L./), oljčne muhe (Bactrocera oleae /Gmelin/), resarjev (Frankliniella occidentalis /Pergande/, Thrips major /Uzel/, Taeniothrips meridionalis /Priesner/), ščitkarjev (Trialeurodes vaporariorum /Westwood/, Bemisia tabaci /Gennadius/, Aleyrodes proletella /L./), hruševe bolšice (Cacopsylla pyri /L./), navadne pršice (Tetranychus urticae /Koch/), rumene ali gabrove pršice (Eotetranychus carpini /Oudemans/), uši, strun (Agriotes spp.) in lešnikarja (Curculio nucum /L./). Sredstvo se uporablja v začetku pojava škodljivcev ali preden pride do vidnih poškodb. Glede na vremenske razmere in intenzivnosti napada se tretiranje izvaja med 3- in 5-krat, na intervalu od 5 do 7 dni. (Munda in sod., 2019).

(22)

2.3.2 Pripravki na podlagi gliv Trichoderma spp.

Uporabili smo izolate dveh različnih vrst gliv: Trichoderma gamsii in Trichoderma asperellum, iz treh različnih pripravkov:

- Remedier® (v nadaljevanju TaREM, TgREM),

- Trifender® Pro WP (Kwizda Agro GmbH, distributer za SLO Arbolus) (v nadaljevanju TaTRI),

- Pannon Starter® Perfect Pro (Kwizda Agro GmbH, distributer za SLO Arbolus d.o.o.) (v nadaljevanju TaPSP),

2.3.2.1 Biotično sredstvo Remedier® (T. asprellum, T. gamsii)

Biotično sredstvo Remedier® se uporablja kot preventivni fungicid. Vsebuje seve antagonističnih gliv Trichoderma spp. in sicer glivi T. asperellum in T. gamsii. Te glive se po aplikaciji na zemljišču kolonizirajo v prsti in na koreninah tretiranih rastlin ter tekmujejo s patogenimi glivami, oziroma s pomočjo encimov parazitirajo celične stene škodljivih gliv.

Sredstvo se uporablja za zatiranje fitopatogenih gliv Rhizoctonia solani (Kühn), Sclerotinia sclerotium (Lib. De Bary), Verticillium dahliae (Kleb.), Thielaviopsis basicola (Berk. &

Br.), Phytophthora capsici (Leonian) na koreninah in koreninskem vratu okrasnih rastlin in vrtnin. Ker sredstvo deluje preventivno, ga moramo aplicirati 5-7 dni pred setvijo ali presajanjem, da se glive razvijejo. Drugo aplikacijo opravimo v času setve ali presajanja.

Sredstvo je priporočljivo pripraviti 24-36 ur pred aplikacijo tako, da se 500 g sredstva raztopi v 5 litrov vode. Nato se raztopino premeša, da se vzpodbudi kalitev gliv, kar omogoča hitrejšo kolonizacijo v tleh ali substratu. Pred tretiranjem je potrebno suspenzijo potrebno dodatno razredčiti v količini vode, ki je potrebna za pravilno uporabo. S sredstvom se tretira, ko je temperatura tal najmanj 10 °C (Kos in sod., 2011).

2.3.2.2 Biotično sredstvo Trifender® Pro WP (T. asperellum)

Trifender® Pro je mikrobiološki pospeševalec rasti. Vsebuje antagonistično glivo T.

asperellum T34, katera neposredno parazitira patogene glive v tleh (npr. iz rodov Sclerotinia, Pythium, Fusarium, Phytophthora). Vzpodbuja zdrav razvoj koreninskega sistema, kar posredno vpliva na povečanje pridelka. Njegova uporaba vpliva na zmanjševanje obremenitve tal s kemičnimi sredstvi ter na zmanjšanje uporabe pesticidov v kmetijski pridelavi (Trifender Pro, 2021).

2.3.2.3 Biotično sredstvo Pannon Starter® Perfect Pro (T. asperellum)

Pannon Starter® Perfect Pro je prav tako mikrobiološki pospeševalec rasti. Vsebuje antagonistično glivo T. asperellum T34. Gliva deluje antagonistično na patogene glive in z rastlino deluje v simbiozi, saj vzpodbuja rast in razvoj rastline. Sredstvo pripomore k aktivaciji fosforja v tleh, kar se odraža v boljši mobilnosti fosforja v tleh ter boljšo dostopnost le-tega rastlinam (Pannon Starter Perfect Pro, 2021).

(23)

3 MATERIAL IN METODE 3.1 ZASNOVA POSKUSA

Poskus je potekal v fitopatološkem laboratoriju na Oddelku za agronomijo Biotehniške fakultete. V laboratorijskem poskusu je bila uporabljena entomopatogena gliva B. bassiana, katero smo izolirali v čisti kulturi s standardno metodo redčenja iz biotičnega pripravka Naturalis®. Pripravek vsebuje izolat ATCC 74040 glive B. bassiana. Antagonistični glivi T.

asperellum in T. gamsii pa sta bili na enak način izolirani iz pripravkov Remedier® (T.

asperellum in T. gamsii), Trifender® Pro (T. asperellum) ter Pannon Starter® Perfect Pro (T. asperellum).

Poskus smo zasnovali v 4 obravnavanjih s 6 ponovitvami za tri termine, pri dveh različnih temperaturah (15 °C, 25 °C), ter kontrolnim obravnavanjem s 5 ponovitvami za vsako izmed njih. Obravnavanja so predstavljala:

- B. bassiana in Trichoderma asperellum (Pannon Starter® Perfect Pro) (TaPSP) (15 °C, 25

°C),

- B. bassiana in Trichoderma asperellum (Remedier®) (TaRTA) (15 °C, 25 °C), - B. bassiana in Trichoderma gamsii (Remedier®) (TgRTG) (15 °C, 25 °C),

- B. bassiana in Trichoderma asperellum (Trifender® Pro) (TaTRI) (15 °C, 25 °C).

3.2 GOJIŠČE

Za gojišče smo uporabili kombinacijo krompirjevega dekstroznega (PDA – Biolife; 14 g/l) in tehničnega agarja (Biolife; 10 g/l). Gojišče in krovna stekla za mikroskopiranje smo avtoklavirali 15 min pri 120 °C in tlaku 1,2 atm. Po avtoklaviranju smo v ohlajeno gojišče (40-50 °C) dodali tudi antibiotika streptomicin (0,0542 g/L) in penicilin (0,0121 g/L).

Gojišče smo razlili v sterilne petrijevke (premer 8,5 cm). V po eno petrijevko izmed ponovitev za vsako obravnavanje smo na trdo gojišče položili krovno stekelce za lažje opazovanje micelija pod mikroskopom. Stekelce smo nato prelili s tanko plastjo gojišča, da se je micelij gliv razrasel čez stekelce.

3.3 INOKULACIJA GLIV

Iz petrijevk s 14 dni staro kulturo glive B. bassiana in 3 dni starih kultur gliv Trichoderma spp., gojenih na PDA gojišču, v temi pri temperaturi 25 °C, smo s pomočjo plutovrta (premer 4 mm) izrezali koščke micelija. Te smo nato s sterilnim skalpelom prenesli v petrijevke z gojiščem (premer 8,5 cm) in jih s pomočjo šablone položili na eno polovico, 1,5 cm od roba.

S tem smo zagotovili, da so bile glive v dvojnem gojišču enako oddaljene. Koščke micelija smo obrnili z micelijem navzdol, da je bil zagotovljen dober stik z gojiščem. Vsako obravnavanje z dvojnimi kulturami je imelo 6 ponovitev, kontrolna obravnavanja z enojnimi kulturami pa 5 ponovitev. Zaradi počasnejše rasti smo glivo B. bassiana nacepili na vsa gojišča obravnavanj že prvi dan poskusa, glive Trichoderma spp. pa smo na tretjino gojišč

(24)

(48 petrijevk) nacepili 1. (isti) dan (1. termin), na drugo tretjino 3. dan (2. termin) in na zadnjo tretjino 7. dan (3. termin) po začetku poskusa. Tako so bile kulture glive B. bassiana ob dodajanju gliv Trichoderma spp. različno stare in velike (1 dan, 3 in 7 dni). V vsakem terminu smo na enak način za vsako glivo Trichoderma sp. naredili tudi kontrolna obravnavanja za obe temperaturi. Petrijevke smo zatesnili s parafilmom z namenom preprečevanja izhlapevanja vode in kontaminacije. Inokulirane agarne plošče smo inkubirali v popolni temi, v rastni komori, pri 15 in 25 °C ter pri 60 % r.v.z.

3.4 MERITVE

Prirast micelija gliv Trichoderma spp. in B. bassiana smo označevali dnevno (10 zaporednih dni), na spodnji strani petrijevke z alkoholnim flomastrom. Površinsko prirast micelija smo določevali po 10 dneh s pomočjo analizatorja slike (Nikon NIS Elements BR 2.30). Zbrane podatke smo nato vnesli v program Microsoft Excel in jih uredili v preglednice in ovrednotili z opisno statistiko. Za statistično analizo smo uporabili program R (v. 4.0.5), enosmerna ANOVA. Podatki so podani kot povprečne vrednosti s standardno napako.

(25)

4 REZULTATI

4.1 RAST MICELIJA GLIV Trichoderma spp. IN B. bassiana PRI TEMPERATURI 15

°C IN 25 °C.

Iz slike 1 je razvidno, da so glive Trichoderma spp. pri temperaturi 25 °C rasle hitreje kot tiste na 15 °C. Najhitreje je rasla gliva T. gamsii (TgREM), najpočasneje pa gliva T.

asperellum (TaREM) pri obeh temperaturah. Iz slike je razvidna tudi počasna rast glive B.

bassiana pri 15 in 25 °C. Prav zaradi tega se je glivo B. bassiana nacepilo samo enkrat in sicer na začetku poskusa.

Slika 1: Rast micelija glive B. bassiana in gliv Trichoderma spp. iz posameznih kontrolnih obravnavanj (TaPSP, TaREM, TgREM, TaTRI) v prvem terminu, podana kot povprečna površina (cm²) za vsak dan, pri 15 in 25 °C.

0 10 20 30 40 50 60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Površina (cm²)

Dan

1. termin kontrola TaPSP 25 °C 1. termin kontrola TaPSP 15 °C 1. termin kontrola TaREM 25 °C 1. termin kontrola TaREM 15 °C 1. termin kontrola TgRTG 25 °C 1. termin kontrola TgRTG 15 °C 1. termin kontrola TaTRI 25 °C 1. termin kontrola TaTRI 15 °C B. bassiana kontrola 25 °C B. bassiana kontrola 15 °C

(26)

4.2 VPLIV GLIVE B. bassiana NA RAST GLIV Trichoderma spp. PRI TEMPERATURI 15 °C.

4.2.1 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaPSP) pri 15 °C

Iz podatkov v preglednici 1 je razvidno (modra barva), da v obdobju merjenja površin micelija, med kontrolnim obravnavanjem in obravnavanji TaPSP obstaja statistično značilna razlika. Statistično značilne razlike med površinami micelija (cm²) v kontrolnem obravnavanju in ostalimi obravnavanji smo potrdili pri:

- tretjem terminu v 2. dnevu med kontrolnim obravnavanjem in TaPSP, v korist kontrolnega obravnavanja.

Preglednica 1: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaPSP) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

Dan 1. termin

(kontrola) 1. termin

TaPSP 2. termin

TaPSP 3. termin

(kontrola) 3. termin TaPSP 1 0,610±0,11 a 0,627±0,12 a 1,070±0,18 b 0,922±0,16 b 0,947±0,07 b 0,798±0,08 ab 2 2,070±0,28 a 2,003±0,13 a 3,113±0,23 bc 2,797±0,26 bc 3,207±0,14 c 2,677±0,14 b 3 3,722±0,60 a 3,500±1,27 a 6,047±0,27 b 5,640±0,38 b 5,977±0,24 b 5,225±0,19 b 4 6,380±0,57 a 6,350±0,52 a 8,993±0,10 b 8,362±0,50 b

5 8,512±0,61 a 8,583±0,55 a 11,773±0,35 b 10,865±0,67 b 6 10,984±0,65 a 11,287±0,75 a 14,243±0,34 b 13,247±1,04 b 7 12,970±0,75 a 13,282±1,23 a 16,473±0,61 b 15,323±0,80 b 8 14,372±0,95 a 14,977±1,93 a

9 15,786±1,37 a 16,907±2,28 a 10 16,850±1,51 a 18,703±2,84 a

Statistično značilne razlike smo potrdili tudi med termini za obravnavanja TaPSP in sicer (zelena barva) (Preglednica 1):

- v 1. dnevu med prvim in drugim terminom, v korist drugega termina,

- v 2. in 3. dnevu med prvim in drugim / tretjim terminom, v korist drugega in tretjega termina in

- od 4. do 7. dneva med prvim in drugim terminom, v vseh primerih v korist drugega termina.

4.2.2 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaREM) pri 15 °C

Iz podatkov v preglednici 2 je razvidno (modra barva), da v obdobju merjenja površin micelija, med kontrolnim obravnavanjem in obravnavanji TaREM obstaja statistično značilna razlika. Statistično značilne razlike med površinami micelija (cm²) v kontrolnem obravnavanju in ostalimi obravnavanji smo potrdili pri:

- prvem terminu v 8., 9. in 10. dnevu med kontrolnim obravnavanjem in TaREM, vse dni v korist TaREM v dvojnih kulturah.

(27)

Preglednica 2: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

Dan 1. termin (kontrola)

1. termin TaREM

2. termin (kontrola)

2. termin TaREM

3. termin (kontrola)

3. termin TaREM 1 0,184±0,03 a 0,199±0,02 a 0,300±0,03 ab 0,297±0,12 ab 0,487±0,03 c 0,414±0,04 bc 2 0,410±0,04 a 0,467±0,08 a 0,900±0,16 ab 0,943±0,34 b 1,560±0,26 c 1,472±0,28 c 3 0,880±0,11 a 1,198±0,16 a 2,050±0,19 ab 2,493±1,02 b 3,367±0,50 b 3,382±0,69 b 4 1,998±0,43 a 2,687±0,46 ab 3,767±0,07 ab 4,228±1,60 b

5 3,746±0,99 a 4,942±0,53 ab 5,230±0,19 ab 6,282±1,88 b 6 6,482±1,39 a 8,382±0,39 a 7,027±0,44 a 8,060±2,17 a 7 9,130±1,73 a 11,032±0,67 a 8,790±0,58 a 10,037±2,47 a 8 11,400±2,01 a 13,525±0,94 b

9 13,494±2,02 a 16,400±1,27 b 10 15,502±1,97 a 19,168±1,41 b

Statistično značilne razlike smo potrdili tudi med termini za obravnavanja TaREM (zelena barva) (Preglednica 2):

- v 1. dnevu med prvim in tretjim terminom, v korist tretjega termina,

- v 2. dnevu med prvim drugim in tretjim terminom, v korist tretjega termina in

- v 3. dnevu med prvim in drugim / tretjim terminom, v korist drugega oziroma tretjega termina.

4.2.3 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. gamsii (TgREM) pri 15 °C

Preglednica 3: Površine micelija glive T. gamsii (TgREM) (cm²) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

Dan 1. termin

TgREM 2. termin

TgREM 3. termin

(kontrola) 3. termin TgREM 1 1,006±0,13 a 1,147±0,18 a 1,600±0,30 bc 1,617±0,23 c 1,150±0,15 ab 1,213±0,15 ab 2 4,522±0,39 a 5,020±0,33 ab 5,647±0,92 bc 5,908±0,43 c 5,453±0,57 ac 4,893±0,45 ab 3 12,120±0,68 a 12,310±0,67 a 13,540±1,58 ab 14,348±1,25 b 12,853±0,70 ab 12,465±1,01 a 4 21,858±1,16 a 21,227±1,04 a 22,553±0,68 a 22,952±1,15 a

5 32,050±1,60 a 30,832±1,27 a 31,893±1,23 a 32,503±1,19 a 6 41,818±1,75 a 40,925±1,59 a 42,203±1,40 a 42,282±1,00 a 7 51,860±1,68 a 50,757±1,44 a 50,680±1,12 a 51,793±0,77 a 8 56,479±0,42 a 55,675±0,70 a

9 56,745±0 a 56,745±0 a 10 56,745±0 a 56,745±0 a

(28)

Iz podatkov v preglednici 3 je razvidno, da je micelij 9. dan prvega termina uspel prerasti celotno površino petrijevke tako pri kontrolnem obravnavanju, kot pri obravnavanju TgREM v dvojnih kulturah, kjer je hkrati prerasel glivo B. bassiana.

Statistično značilne razlike pa smo potrdili med termini za obravnavanja TgREM (zelena barva) (Preglednica 3):

- od 1. do 3. dneva med drugim in prvim / tretjim terminom, v korist drugega termina.

4.2.4 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaTRI) pri 15 °C

Iz podatkov v preglednici 4 je razvidno (modra barva), da v obdobju merjenja površin micelija, med kontrolnim obravnavanjem in obravnavanji TaTRI obstaja statistično značilna razlika. Statistično značilne razlike med površinami micelija (cm²) v kontrolnem obravnavanju in ostalimi obravnavanji smo potrdili pri:

- prvem terminu v 6., 7., 8., 9., in 10. dnevu med kontrolnim obravnavanjem in TaTRI, vse dni v korist TaTRI v dvojnih kulturah.

Preglednica 4: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaTRI) (povprečje ±SE) pri temperaturi 15 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

Dan 1. termin

(kontrol) 1. termin

TaTRI 2. termin

TaTRI 3. termin

(kontrola) 3. termin TaTRI 1 0,850±0,21 ab 1,061±0,05 b 1,123±0,15 b 1,007±0,14 ab 1,010±0,07 ab 0,810±0,12 a 2 3,528±0,11 a 3,528±0,28 a 3,477±0,25 a 3,380±0,38 a 3,443±0,15 a 3,282±0,35 a 3 6,770±0,59 a 7,265±0,71 ab 8,177±0,37 b 7,125±0,64 ab 7,193±0,18 ab 6,730±0,40 a 4 9,452±0,88 a 10,633±1,26 ab 11,487±0,62 b 10,693±0,60 ab

5 11,416±0,87 a 13,002±1,32 ab 14,077±0,68 b 13,417±0,96 b 6 13,218±1,10 a 15,642±1,63 b 17,317±0,58 b 16,022±0,99 b 7 15,600±1,48 a 18,717±1,63 b 20,36±0,64 b 19,057±1,41 b 8 17,698±1,92 a 21,047±2,07 b

9 19,660±2,58 a 23,872±1,97 b 10 21,724±3,20 a 26,605±2,02 b

Statistično značilne razlike smo potrdili tudi med termini za obravnavanja TaTRI (zelena barva) (Preglednica 4):

- v 1. dnevu med prvim in tretjim terminom, v korist prvega termina.

(29)

4.3 VPLIV GLIVE Beauveria bassiana NA RAST GLIV Trichoderma spp. PRI TEMPERATURI 25 °C.

4.3.1 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaPSP) pri 25 °C

Iz podatkov v preglednici 5 je razvidno, da je micelij 5. dan prvega termina uspel prerasti celotno površino petrijevke tako pri kontrolnem obravnavanju, kot pri obravnavanju TaPSP v dvojnih kulturah, kjer je hkrati prerasel glivo B. bassiana.

Preglednica 5: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaPSP) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C, nacepljenih v prvem, drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

Dan 1. termin

TaPSP 2. termin

TaPSP 3. termin

(kontrola) 3. termin TaPSP 1 7,642±0,52 ab 7,217±0,42 a 8,973±0,29 c 8,998±0,45 c 8,267±0,15 bc 8,500±0,51 bc 2 21,988±1,60 a 21,662±1,11 a 24,053±0,32 ab 24,663±1,57 b 23,553±0,74 ab 25,048±1,65 b 3 39,124±2,02 a 38,668±1,35 a 40,950±0,58 ab 42,508±2,30 b 39,353±1,10 ab 40,704±1,93 ab 4 54,822±1,37 a 54,780±1,34 a 54,247±0,53 a 55,793±0,97 a

5 56,745±0 a 56,745±0 a 56,745±0 a 56,745±0 a

Statistično značilne razlike pa smo potrdili med termini za obravnavanja TaPSP (zelena barva) (Preglednica 5):

- v 1 in 2. dnevu med prvim in drugim / tretjim terminom, v korist drugega oziroma tretjega termina in

- v 3. dnevu med prvim in drugim terminom, v korist drugega termina.

4.3.2 Vpliv glive B. bassiana na rast glive T. asperellum (TaREM) pri 25 °C

Preglednica 6: Površine micelija (cm²) glive T. asperellum (TaREM) (povprečje ±SE) pri temperaturi 25 °C, nacepljenih v prvem drugem (3 dni stara B. bassiana) in tretjem terminu (7 dni stara B. bassiana). Statistično značilne razlike med termini nacepljanja znotraj istega časovnega obdobja ponazarjajo različne male tiskane črke.

Dan 1. termin

TaREM 2. termin

TaREM 3. termin

(kontrola) 3. termin TaREM 1 1,056±0,12 a 1,092±0,21 a 3,020±0,05 bc 3,373±0,61 c 2,650±0,18 b 2,550±0,13 b 2 6,916±0,45 a 7,443±0,75 a 10,490±0,37 b 11,332±2,13 b 10,757±0,34 b 10,790±0,52 b 3 16,520±0,65 a 17,378±1,18 a 17,547±0,67 ab 19,835±2,09 b 18,783±0,43 ab 18,730±0,86 ab 4 25,636±0,83 a 27,227±1,22 a 25,900±0,79 a 27,575±1,54 a

5 34,076±1,31 a 36,182±1,83 ab 36,657±0,56 ab 37,372±2,29 b 6 44,654±0,47 a 44,368±1,01 a 46,553±1,11 a 46,302±2,80 a 7 51,348±0,48 a 54,097±0,97 b 53,493±0,53 b 50,665±0,95 a 8 55,274±0,45 a 55,966±0,13 b

9 56,296±0,48 a 56,227±0,24 a 10 56,745±0 b 56,322±0,18 a

(30)

Iz podatkov v preglednici 6 je razvidno (modra barva), da v obdobju merjenja površin micelija, med kontrolnim obravnavanjem in obravnavanji TaREM obstaja statistično značilna razlika. Statistično značilne razlike med površinami micelija (cm²) v kontrolnem obravnavanju in ostalimi obravnavanji smo potrdili pri:

- prvem terminu v 7. in 8. dnevu med kontrolnim obravnavanjem in TaREM, v obeh primerih v korist TaREM v dvojnih kulturah,

v 10. dnevu med kontrolnim obravnavanjem in TaREM, v korist kontrolnega obravnavanja in

- drugem terminu v 7. dnevu med kontrolnim obravnavanjem in TaREM, v korist kontrolnega obravnavanja.

Statistično značilne razlike smo potrdili tudi med termini za obravnavanja TaREM (zelena barva) (Preglednica 6):

- v 1. dnevu med prvim, drugim in tretjim terminom, v korist drugega termina.

- v 2. dnevu med prvim in drugim / tretjim terminom, v korist drugega oziroma tretjega termina.

- v 3. dnevu med prvim in drugim terminom, v korist drugega termina.

- v 7. dnevu med prvim in drugim terminom, v korist prvega termina.

Za razliko od kontrolnega obravnavanja, gliva T. asperellum v obravnavanju TaREM tudi v 10. dnevu ni uspela prerasti celotne površine petrijevke (Slika 2).

Slika 2: Z alkoholnim flomastrom označena rast micelija gliv B. bassiana in T. asperellum (TaREM) v obdobju 10 dni pri 25 °C. Gliva T. asperellum je na spodnji polovici petrijevke, gliva B. bassiana na zgornji polovici petrijevke.