BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA
DIPLOMSKO DELO
BRIGITA URBANČIČ
UNIVERZA V LJUBLJANI PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO NARAVOSLOVNOTEHNIŠKA FAKULTETA
Študijski program: Kemija in biologija
AKTIVNOST PROTEINOV NLP NA TOBAKOVIH LISTIH DIPLOMSKO DELO
NLP PROTEINS ACTIVITY ON TOBACCO LEAVES GRADUATION THESIS
Mentor: prof. dr. Gregor Anderluh Kandidatka: Brigita Urbančič
Ljubljana, junij 2014
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija smeri kemije in biologije. Opravljeno je bilo na Katedri za biokemijo Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Študijska komisija Oddelka za biologijo je dne 16. 5. 2013 sprejela temo in za mentorja diplomske naloge imenovala prof. dr. Gregorja Anderluha.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Polona Zalar
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Recenzentka: prof. dr. Kristina Sepčić
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: prof. dr. Gregor Anderluh, mentor
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Datum zagovora:
Podpisana se strinjam z objavo svojega diplomskega dela v popolnem besedilu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je diplomsko delo, ki sem ga oddala v elektronski obliki, identično tiskani verziji.
Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Brigita Urbančič
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Dn
UDK 543.384(043.2)
KG proteini NLP, nekroza, fungicidi AV URBANČIČ, Brigita
SA ANDERLUH, Gregor (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, program Kemija in biologija
LI 2014
IN Aktivnost proteinov NLP na tobakovih listih TD Diplomsko delo (univerzitetni študij) OP X, 45 str., 15 pregl., 12 sl., 44 vir.
IJ Sl
JI sl/en
AI Nekatere bakterije, glive in oomicete lahko izločajo proteine NLP (ang. Nep1-like proteins), ki pri rastlinah inducirajo sproščanje etilena, povzročajo nekroze tkiv in sprožijo preobčutljivostni odziv. Ker proteini NLP delujejo le na dvokaličnice in je znano, da povzročajo nekrozo tkiv tudi na listih tobaka, smo kot testno rastlino uporabili tobak (Nicotiana tabaccum). Poleg nekroze tkiv, gnitja in ožiga se pojavljajo še številni drugi simptomi, ki so posledica okužbe dvokaličnice s patogenim organizmom. V tej raziskavi smo uporabili dva rekombinantna proteina PaNIE in NPP, pridobljena s pomočjo ekspresijskega sistema v kvasovki Pichia pastoris. Protein PaNIE izloča patogena oomiceta Pythium aphanidermatum, protein NPP pa patogena oomiceta Phytophthora parasitica.
Želeli smo pokazati, da bosta oba proteina na tobakovih listih povzročala nekroze v nM koncentracijah. Poleg tega smo želeli preveriti aktivnost nekaterih organskih molekul na tobakovih listih v prisotnosti in odsotnosti proteina. Ker oomiceti, ki izločata omenjena proteina, povzročata veliko materialno škodo na pridelku, smo želeli raziskati pripravke, s katerimi zatiramo te patogene organizme. Omejili smo se na slovensko tržišče.
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Dn
UDC 543.384(043.2)
CX NLP proteins, necrosis, fungicides AU URBANČIČ, Brigita
AA ANDERLUH, Gregor (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
PB University of Ljubljana, Faculty of education, Biotehnical faculty, Chemistry and biology
PY 2014
TI NLP proteins activity on tobacco leaves DT Graduation thesis (University studies) NO X, 45 p., 15 tab., 12 fig., 44 ref.
LA Sl
AL sl/en
AB Some bacteria, fungi and oomycetes can produce NLP proteins (Nep1-like proteins), which induce the release of ethylene, cause tissue necrosis and trigger a hypersensitive response. Since NLP proteins only affect dicotyledons and are also known to cause tissue necrosis in tobacco leaves, tobacco (Nicotiana tabaccum) has been used as test plant. Tissue necrosis, rotting and blight are only some of the numerous symptoms that appear as a consequence of dicotyledonous infection with a pathogenic organism. Two recombinant proteins PaNIE and NPP, obtained by means of an expression system in the yeast Pichia pastoris, have been used in this research. The aim is to show that both proteins will cause necrosis on tobacco leaves in nM concentrations. PaNIE protein is produced by pathogenic oomycete Pythium aphanidermatum, while NPP protein is produced by pathogenic oomycete Phytophthora parasitica. We wanted to test the activity of some organic molecules on tobacco leaves both in the presence and in the absence of the protein. Since the oomycetes that produce the mentioned proteins cause severe material damage on crops, we decided to explore the products used to exterminate pathogenic organisms. The research has been limited to Slovene market.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VII KAZALO PREGLEDNIC ... VIII KAZALO GRAFIKONOV ... IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... X
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN DELA ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 2
2.1 PROTEINI NLP ... 2
2.1.1 Značilnosti proteinov NLP ... 2
2.1.2 Struktura proteinov NLP ... 3
2.1.3 Strukturna podobnost z drugimi proteini ... 3
2.1.4 Prisotnost proteinov NLP v oomicetah, glivah in bakterijah ... 5
2.1.5 NLP v rodu Phytophthora ... 6
2.1.6 Interakcija med rastlino in patogenom ... 6
2.1.7 Pozitivna vloga proteinov NLP pri virulenci ... 9
2.2 ODZIV TOBAKA ... 10
2.2.1 Opis rastline ... 10
2.2.2 Tobak kot sistemski model ... 10
2.2.3 Odziv tobaka na Nep1 ... 10
2.3 BOLEZNI RASTLIN ... 13
2.3.1 Bolezni, ki jih povzročajo bakterije ... 13
2.3.2 Bolezni, ki jih povzročajo prave glive ... 13
2.3.3 Bolezni, ki jih povzročajo predstavniki skupine Oomycota ... 13
2.4 BOJ PROTI RASTLINSKIM BOLEZNIM ... 14
2.4.1 Mehanizem delovanja kemikalij ... 14
2.4.2 Anorganske kemikalije ... 15
2.4.3 Organske kemikalije ... 16
3 MATERIALI IN METODE ... 19
3.1 MATERIALI IN OPREMA ... 19
3.1.1 Uporabljene kemikalije ... 19
3.1.2 Uporabljene aparature ... 20
3.1.3 Sestava barvila, nosilca in nanašalnega gela ... 20
3.1.4 Sadike tobaka ... 20
3.1.5 Proteini NLP ... 21
3.1.6 Kemijske spojine ... 22
3.2 METODE ... 23
3.2.1 Merjenje absorbance ... 23
3.2.2 Priprava pufrov in raztopin ... 23
3.2.3 Infiltriranje ... 23
3.2.4 Fotografiranje in obdelava podatkov ... 23
3.2.5 Elektroforeza ... 24
4 REZULTATI ... 26
4.1 IZRAČUN MOLSKE KONCENTRACIJE PROTEINOV ... 26
4.2 REZULTATI NaDS-ELEKTROFOREZE ... 27
4.3 UČINEK PROTEINOV NPP IN PaNIE NA TOBAKOVE LISTE ... 27
4.4 POGOSTOST POJAVLJANJA NEKROZ PO TRETIRANJU Z NPP in PANIE .. 31
4.5 KONTROLNI EKSPERIMENTI S SPOJINAMI ... 32
4.6 VBRIZGAVANJE SPOJIN V TOBAKOVE LISTE V PRISOTNOSTI PROTEINA ... 34
4.7 PRIPRAVKI ZA ZATIRANJE NEKATERIH POGOSTEJŠIH POVZROČITELJEV BOLEZNI ... 35
5 RAZPRAVA IN SKLEPI ... 37
5.1 RAZPRAVA ... 37
5.2 SKLEPI ... 40
6 POVZETEK ... 41
7 VIRI ... 42
KAZALO SLIK
Slika 1: Kristalne strukture proteina NLP, aktinoporina in lektina.. ... 4
Slika 2: Kristalna struktura proteina MpNEP2.. ... 5
Slika 3: Odsotnost nekroze pri zamenjavi aspartata ... 9
Slika 4: Nekroza tkiv, povzročena z infiltriranjem proteina Nep1 v tobakove liste.. ... 11
Slika 5: Obsežna nekroza kot posledica pršenja sadike tobaka s proteinom Nep1.. ... 12
Slika 6: Strukturna formula mankozeba ... 16
Slika 7: Strukturna formula klorotalonila ... 16
Slika 8: Strukturna formula metalaksila ... 17
Slika 9: Strukturna formula zoksamida ... 18
Slika 10: Ločevanje proteinov NPP in PaNIE z NaDS-elektroforezo.. ... 27
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Uporabljene kemikalije. ... 19
Preglednica 2: Uporabljene aparature in laboratorijska oprema. ... 20
Preglednica 3: Sestava nosilca in nanašalnega gela. ... 20
Preglednica 4: Sestava barvila. ... 20
Preglednica 5: Imena spojin in pripadajoče strukturne formule. ... 22
Preglednica 6: Rezultati meritev absorbance in izračun molske koncentracije. ... 26
Preglednica 7: Primerjava nekrotične aktivnosti z višanjem koncentracije pri proteinih NPP in PaNIE.. ... 28
Preglednica 8: Aktivnost proteina PaNIE (200 nM) na tobakovih listih. ... 29
Preglednica 9: Aktivnost proteina PaNIE (500 nM) na tobakovih listih. ... 29
Preglednica 10: Aktivnost proteina NPP (1000 nM) na tobakovih listih ... 30
Preglednica 11: Primerjava efektov proteinov NPP (250 nM) in PaNIE (250 nM) ... 31
Preglednica 12: Vbrizgavanje organskih spojin (0,5 mM) v tobakove liste ... 32
Preglednica 13: Rezultat kontrolnih poskusov s pufrom MES in 5 % DMSO ... 33
Preglednica 14: Vbrizgavanje spojin (0,5 mM) v tobakove liste v prisotnosti proteina PaNIE. ... 34
Preglednica 15: Fungicidi za zatiranje nekaterih pogostejših povzročiteljev bolezni - na slovenskem tržišču v obdobju 2006-2012 ... 35
KAZALO GRAFIKONOV
Grafikon 1: Pojavljanje nekroz na tobakovih listih po tretiranju s proteinom NPP.. ... 31 Grafikon 2: Pojavljanje nekroz na tobakovih listih po tretiranju s proteinom PaNIE. ... 32
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ACC aminociklopropan karboksilna kislina APS amonijev persulfat
AVR avirulenca (ang. avirulence)
DAMP receptorske molekule, ki zaznavajo poškodbo oziroma učinek patogena (ang. danger associated molecular patterns)
DMSO dimetilsulfoksid
HRP preobčutljivostni odgovor in patogenost (ang. hypersensitive reaction and pathogenicity)
MAP prek mitogena aktivirana proteinska – ( ang. mitogen- activated protein-) MES 2 – morfolinoetansulfonska kislina
NEP1 protein, ki povzroča nekroze in inducira proizvajanje etilena (ang. necrosis and ethylene inducing peptide 1)
NLP družina proteinov, ki so podobni proteinu NEP1 (ang. NEP1–like proteins) NPP proteini iz rodu Phytophthora, ki povzročajo nekrozo (ang. necrosis
inducing Phytophthora proteins)
PAMP receptorske molekule, ki zaznavajo molekulsko zgradbo mikroorganizma (ang. pathogen-associated molecular patterns)
PaNIE protein, ki ga izloča oomiceta Pythium aphanidermatum in povzroča nekrozo (ang. Pythium aphanidermatum necrosis inducing elicitor)
PRR receptorske molekule na površini rastline, ki prepoznajo vzorec poškodbe ali mikroorganizem (ang. pattern recognition receptors)
NaDS/SDS natrijev dodecil sulfat (ang. sodium dodecyl sulphate)
TEM mikroskopija z transmisijskim elektronskim mikroskopom (ang.
transmission electron microscopy) TEMED tetrametiletilendiamin
TRIS tris(hidroksimetil)aminometan
1 UVOD
Koevolucija rastlinskih patogenov in njihovih gostiteljev se kaže v visoko prilagojenih strategijah vdora mikrobov in številnih obrambnih mehanizmih gostiteljskih rastlin. Moderni agronomski pristopi vključujejo sajenje pridelka na ogromnih površinah, monokulture so pogosto izbrane glede na želene lastnosti, niso pa odporne. Tako okolje je ugodno za razvoj patogenih organizmov (Wirthmueller s sod., 2013).
Nekateri patogeni organizmi lahko izločajo proteine NLP (ang. necrosis and ethylene inducing peptide 1 (NEP1) - like proteins), ki pri rastlini sprožijo preobčutljivostni odziv, povzročajo nekrozo tkiv in inducirajo sproščanje etilena (Gijzen s sod., 2006).
Znano je, da proteini NLP povzročajo nekrozo tkiv tudi na listih tobaka (Nicotiana tabacum) (Jennings s sod., 2001). Proteini NLP poleg tobaka povzročajo nekrozo na mnogih dvokaličnicah, - tudi na za kmetijstvo zelo pomembnem krompirju (Solanum tuberosum), medtem ko na enokaličnice nimajo vpliva (Bailey, 1995; Fellbrich s sod., 2002). Bolezni, ki jih povzročajo patogeni, ki izločajo NLP proteine, so eden največjih fitopatoloških problemov z uničujočimi posledicami na agroekonomijo.
1.1 NAMEN DELA
V tem diplomskem delu smo želeli raziskati aktivnost dveh rekombinatnih proteinov na listih tobaka. Uporabili smo proteina, ki ju izločata patogena mikroorganizma iz skupine Oomycota:
NPP, ki ga izloča patogena oomiceta Phytophtora parasitica in PaNIE, ki ga izloča oomiceta Pythium aphanidermatum. Oba proteina sta bila pridobljena s pomočjo ekspresijskega sistema gostiteljske kvasovke Pichia pastoris. V tej nalogi smo želeli raziskati aktivnost omenjenih dveh proteinov na tobakovih listih in njuno aktivnost v prisotnosti nekaterih organskih molekul. Ker oomicete iz rodov Pythium in Phytophthora povzročajo veliko škodo na pridelku, smo želeli podrobneje raziskati bolezni, ki jih povzročajo in pripravke s katerimi zatirajo delovanje oomicet.
Delovne hipoteze:
Proteina PaNIE in NPP bosta na tobakovih listih povzročala nekroze v nM koncentracijah.
Preverili bomo aktivnost nekaterih organskih spojin na tobakovih listih v prisotnosti in odsotnosti proteinov.
Poiskali bomo pripravke, ki se na slovenskem tržišču uporabljajo za zatiranje nekaterih najpogostejših povzročiteljev bolezni rastlin. Osredotočili se bomo predvsem na zatiranje oomicet iz rodu Phytophthora.
2 PREGLED OBJAV 2.1 PROTEINI NLP
2.1.1 Značilnosti proteinov NLP
Prvi protein iz družine proteinov NLP, Nep1 (ang. Necrosis and Ethylene Inducing Peptide 1) z molekulsko maso 24 kDa, je bil izoliran leta 1995 iz glive Fusarium oxysporium (Bailey s sod., 1995). Od takrat je bilo najdenih veliko proteinov pri različnih organizmih, ki so strukturno podobni proteinu Nep1 in ki jih uvrščamo v družino NLP (Nep1-Like Proteins) (Pemberton in Salmond, 2004).
Proteine iz družine NLP proizvajajo bakterije, glive in oomicete. Večina vrst, ki izloča proteine NLP, je rastlinskih patogenov, vendar obstajajo izjeme, saj so gene, ki kodirajo proteine NLP, odkrili tudi pri glivah in bakterijah, ki niso patogene (Gijzen s sod., 2006).
Široka distribucija znotraj taksona, predvsem pa prisotnost tako v evkariontskih organizmih kot tudi v prokariontskih, je precej nenavadna pri do sedaj znanih mikrobnih fitopatogenih, katerih produkcija je običajno omejena na majhno število mikrobnih vrst (Ottmann s sod., 2009).
Dejanski mehanizem delovanja proteinov NLP še ni poznan, znano pa je, da delujejo kot pozitivni virulenčni faktorji ter pospešujejo bolezen in rast patogena na rastlinskih gostiteljih.
K okužbi gostitelja pripomorejo z razgradnjo celične stene in citolizo (Ottmann s sod., 2009).
Zanje je značilno, da delujejo le na dvokaličnice, kljub temu, da so prisotni tudi v patogenih, ki napadajo enokaličnice (Jennings s sod., 2001; Veit s sod., 2001; Fellbrich s sod., 2002;
Keates s sod., 2003; Verica s sod., 2004; Bailey s sod., 2005).
Rastlinske celice se odzovejo na prisotnost proteinov NLP in sprostijo etilen, aktivirajo MAP- kinaze, sintetizirajo fitoaleksine, inducirajo transkripcijo genov in sprožijo še veliko drugih bliskovitih sprememb v fiziologiji celice in ekspresiji genov, kar lahko vodi do nekroze tkiv ali v celično smrt (Gijzen s sod., 2006).
Med seboj se proteini razlikujejo po sposobnosti povzročanja nekroz in celične smrti, obstajajo pa proteini NLP, ki ne povzročajo nekroz. Primerjava v delovanju štirih različnih proteinov na rastlini Nicotiana bethamiana, ki je bližnja sorodnica tobaku (Nicotiana tabaccum), je pokazala različne učinke. Ti so v intenzivnosti variirali od nikakršnih sprememb do obsežnih nekroz tkiva (Quotob s sod., 2002). Poskusi z oomiceto Phytophthora infestans so pokazali, da le eden od štirih proteinov povzroči nekrozo tkiv (Gijzen s sod., 2006).
Njihova sposobnost aktiviranja imunskega sistema pri rastlini je odvisna od razgradnje membrane in pospeševanja celične smrti. Rastlina prepozna delovanje toksina, ne pa molekule kot take. Rastline so sposobne zaznati spremembe v celici, povzročene zaradi poškodb membrane, kot so razlike v ionski homeostazi ter sproščanje endogenih elicitorjev (Küfner s sod., 2009).
2.1.2 Struktura proteinov NLP
Ottmann je s sodelavci leta 2009 prvi objavil strukturo proteina NLP in sicer NLPPya, ki ga izloča oomiceta Pythium aphanidermatum (slika 1). Določitev kristalne strukture proteina NLP je razkrila molekulo z eno domeno, ki sestoji iz centralnega β-sendviča, sestavljenega iz osmih trakov: treh v prvi ravnini in petih antiparalelnih v drugi ravnini. β-sendvič obdajajo tri α-vijačnice, ki formirajo ravno površino na vrhu. Neravno površino na spodnji strani proteina tvorijo tri zanke (L1, L2 in L3). Med dvema zankama je negativno nabita vdolbina z dvovalentnim kationom Mg2+ (Ottmann s sod., 2009).
Domena NPP1 lahko vsebuje dva ali štiri cisteinske ostanke, imenujemo ju tip 1 in tip 2.
Domena tipa 1 je prisotna pri glivah, oomicetah in bakterijah, medtem ko se domena tipa 2 pojavlja le pri glivah in bakterijah. Pri nekaterih glivah lahko najdemo proteine NLP z obema tipoma domen. Poleg cisteinskih ostankov je značilnost domene NPP1 centralna regija s heptapeptidnim motivom, sestavljenim iz sedmih aminokislin (GHRHDWE). Z nekaj izjemami imajo NLP proteini na N-koncu signalni peptid, ki usmerja protein v sekretorno pot (Gijzen s sod, 2006).
Štirje aminokislinski ostanki (D93, H101, D104 in E106) so pomembni za citolitično aktivnost proteina NLP in koordinacijo Mg2+ znotraj vdolbine. Pri raziskovanju vloge negativnega naboja so aspartat na mestu 104 nadomestili z nenabitim, kationskim ter anionskim aminokislinskim ostankom. Da je koordinacija kationa ključnega pomena so pokazali rezultati: nobena mutanta razen anionske ni bila citolitično aktivna (Ottmann s sod, 2009).
2.1.3 Strukturna podobnost z drugimi proteini
Primerjava terciarnih struktur z NLPPya je razkrila 35 podobnih proteinov (Ottmann s sod., 2009). Glede na strukturna prekrivanja in fiziološko skladnost, so proteinu NLPPya najbolj podobni glivni lektini (Birck, 2004) in aktinoporini, ki jih izločajo morske vetrnice (Athanasiadis s sod., 2001). Kot NLPPya, so tudi omenjeni proteini majhni in imajo eno domeno, ki zajema centralni β-sendvič, katerega obdajajo α-vijačnice. Strukturno prekrivanje aktinoporinov in lektinov predvideva visoko stopnjo podobnosti, medtem ko naj bi bili ti proteini s proteini NLPPya v daljnem sorodu (Ottmann s sod., 2009).
Aktinoporini in lektini so topni proteini, ki prek izpostavljene vdolbine napadajo specifične komponente membranskega dvosloja (Ottmann s sod., 2009). Aktinoporini so citolitični toksini, ki prek fleksibilnih N-terminalnih regij tvorijo membranske pore (Mancheno, 2003).
Pri lektinih se N-terminalna regija ne pojavi, se pa pojavlja pri NLPPya, kar nakazuje, da bi lahko imela pomembno vlogo pri povzročanju nekroz in sprožanju obrambnega mehanizma gostiteljske rastline (Fellbrich s sod., 2002).
Leta 2011 je Zaparolli s sodelavci objavil strukturo še enega proteina NLP (slika 2). Študije genoma glive Moniliophthora perniciosa, ki povzroča bolezen 'Witches' broom' na
kakavovcu, so razkrile pet predstavnikov družine NLP, ki so jih poimenovali MpNEP1-5.
MpNEP2 je edini NLP, ki se izraža med infekcijo. V nasprotju z nekaterimi drugimi
predstavniki NLP, mehanizem delovanja oziroma nekrotična aktivnost MpNEP2 ni odvisna od dvovalentnega iona. Eksperimenti so potrdili vlogo negativno nabite vdolbine in
hidrofobne zanke. Elektronska paramagnetna resonanca in fluorescenčna analiza nista
pokazali nobene interakcije med proteini in lipidi, kar pomeni, da MpNEP2 pri pospeševanju citolize in pošiljanju signalov zahteva druge elemente v membrani (Zaparolli s sod., 2011).
Proteina MpNEP2 in NLPPya sta si strukturno podobna, glavna razlika pa se pojavlja v lokaciji dvovalentnega iona. V primeru NLPPya je magnezijev ion znotraj negativno nabite vdolbine, koordiniran z Asp93 in Asp104 ter štirimi molekulami vode. V primeru proteina MpNEP2 je cinkov ion v središču kristala koordiniran s stranskimi verigami His116, ki je ekvivalenten His101 v NLPPya in Asp210 (Zaparolli s sod., 2011).
Slika 1: Kristalne strukture proteina NLP, aktinoporina in lektina. (A) Kristalna struktura proteina NLPPya, (B) aktinoporin stiholizin, (C) lektin, (D) elektrostatsko površje proteina NLPPya, (E) prikaz elektronske gostote okrog dvovalentnega kationa, (F) primerjava struktur treh proteinov NLPPya
(oranžno), NLPPp (modro) in NLPPcc (zeleno) (Povzeto po Ottmann s sod., 2009).
2.1.4 Prisotnost proteinov NLP v oomicetah, glivah in bakterijah
Geni, ki kodirajo proteine NLP, ali proteini sami, so prisotni tako v evkariontskih kot prokariontskih organizmih in so bili odkriti tudi pri vrstah, ki niso znane kot patogene.
Proteini NLP se pojavljajo v vsaj dveh glavnih evkariontskih vejah – pri glivah in oomicetah, poleg tega pa so bili odkriti tudi pri Gram pozitivnih ter Gram negativnih bakterijah (Gijzen s sod., 2006).
Analiza zaporedja genoma pri oomicetah iz rodu Phythopthora je pokazala, da je družina NLP proteinov velika, raznolika, ter kodirana s 50-60 lokusi pri vsaki vrsti, kljub temu da je več kot pol genov najverjetneje psevdogenov. Družina proteinov NLP se v rodu Phythophtora razvija zelo hitro, kar nakazujejo številne vrstno-specifične skupine proteinov NLP pri sevih vrst P. sojae in P. ramorum (Gijzen s sod., 2006). Proteini NLP se izražajo tudi v nekaterih hemibiotrofičnih in obligatnih biotrofičnih patogenih in mnogi ne inducirajo celične smrti (Wirthmueller s sod., 2013). Eden od vzrokov, da so proteini NLP prisotni v različnih organizmih, je horizontalni genski prenos (Gijzen s sod., 2006). Porazdelitev bakterijskega zaporedja NLP skozi filogram in zgradba nukleotida bakterijskih genov NLP dokazujeta, da so le-ti pridobljeni iz drugih organizmov (Pemberton in Salmond, 2004).
Slika 2: Kristalna struktura proteina MpNEP2. (A) Kristalna struktura proteina MpNEP2, modri N- terminalni konec, rdeči C-terminalni konec, zeleno obarvani cinkov ion Zn2+. (B) Elektrostatsko površje proteina MpNEP2, rdeče obarvana močno negativno nabita vdolbina. (C) Primerjava struktur dveh proteinov MpNEP2 in NEPPya. (D) Aminokislinski ostanki, ki koordinirajo ion. (E) Primerjava koordinacije ionov cinka in magnezija pri obeh proteinih (Povzeto po Zaparolli s sod., 2011).
Kasnejše študije so razkrile številne proteine NLP, kot so na primer NIP oziroma NLPPcc iz bakterije Pectobacterium carotovorum ssp. carotovorum (Mattinen s sod., 2004), PsojNIP oziroma NLPPs iz oomicete Phytophthora sojae (Qutob s sod, 2002), NPP1 oziroma NLPPp iz oomicete Phytophthora parasitica (Fellbrich s sod., 2002) in PaNIE oziroma NLPPya iz oomicete Pythium aphanidermatum (Veit s sod., 2001).
2.1.5 NLP v rodu Phytophthora
V rod Phytophthora, ki sodi med najbolj škodljive rastlinske patogene, uvrščamo približno 65 vrst (Erwin in Ribeiro, 1996; Tyler, 2002; Kamoun, 2003). Ti organizmi sodijo v skupino Oomycota, ki jo obravnavamo ločeno od kraljestva pravih gliv (Cooke, 2000). Kljub izredni raznolikosti proteinov NLP znotraj rodu Phytophthora, le-ti tvorijo svojo monofiletsko skupino. Proteini NLP iz rodu Phytophthora vsebujejo domeno NPP1 tipa 1. Pri raziskovanju genoma P. sojae in P. ramorum je bil odkrit nov razred proteinov, ki poleg navedene domene vsebujejo še dodatno hidrofilno domeno, vrinjeno med signalni peptid in domeno NPP1.
Gene, ki kodirajo proteine NLP, so odkrili v eni kopiji pri več različnih rastlinskih patogenih in saprofitskih bakterijskih vrstah, vsekakor pa prisotnost proteinov NLP ni značilna za bakterijski genom. Dokazi kažejo, da proteini NLP iz rodu Phytophthora izhajajo iz predniškega gena, ki se je v času evolucije tega rodu korenito spremenil in razširil (Gijzen s sod., 2006).
2.1.6 Interakcija med rastlino in patogenom
Rastlinske celice se odzovejo na številne biotske kemijske signale iz okolja, vključno s faktorji, ki jim niso lastni (naprimer fragmenti celične stene na površju patogena), zaznavajo pa tudi določene fragmente lastne celične stene, ki jih rastlina sprosti ob vdoru patogena in spojine, ki jih izloči patogeni organizem. Rastline so razvile učinkovit nadzorni sistem, ki sproža signalne kaskade in aktivira obrambni odziv. Receptorji na površju celice prepoznajo mikroorganizem ali pa vzorec poškodbe, ki jo le-ta povzroči. Ti receptorji so znani kot PRR (ang. Pattern Recognition Receptors). Ločimo dva tipa receptorjev PRR: receptorje PAMP (ang. Pathogen-Associated Molecular Patterns), ki zaznavajo molekulsko zgradbo mikroorganizma, in receptorje DAMP (Danger-Associated Molecular Patterns), ki zaznavajo poškodbo oziroma efekt, ki ga patogeni organizem povzroči. Zaznava vzorcev oziroma poškodb sproži imunski odziv rastline. Ko rastlinski patogeni vstopijo skozi zunanjo površino rastlinske celice, se zadržujejo v medceličnem prostoru imenovanem apoplast. V apoplastu skušajo patogeni manipulirati z gostiteljem tako, da izločijo proteine, ki nato vstopajo v celico. Znotraj celice proteini potujejo do različnih celičnih struktur. Rastline prepoznajo prisotnost neznanih molekul preko znotrajceličnih imunoreceptorjev. Aktivira se preobčutljivostni odziv kot oblika programirane celične smrti, kar lahko omeji širjenje biotrofičnih patogenov (Wirthmueller s sod., 2013).
Zaradi aktivnosti, ki pospešujejo razvoj bolezni, postane rastlina bolj dovzetna za infekcijo.
Prek efektorja sprožena dovzetnost za infekcijo je lahko rezultat zunanjih ali notranjih efektorskih aktivnosti (Wirthmueller in sod., 2013).
Številni bakterijski in filamentozni rastlinski patogeni pridobivajo hranila iz gostiteljske celice, za kar je nujno potreben zajedalski odnos med tema dvema organizmoma. Patogeni izločajo efektorske proteine, ki spremenijo fiziologijo celice gostitelja tako, da le-ta podpira zajedavstvo. Glavne skupine substanc, ki jih izločajo patogeni, so encimi, toksini, rastni regulatorji in polisaharidi (Agrios, 2005).
2.1.6.1 Toksini
Že zgodaj so odkrili, da patogeni lahko proizvajajo toksine, ki pospešujejo bolezen in povzročajo celično smrt (Luke in Wheeler, 1955). Toksini so bili klasificirani v dve glavni skupini: selektivni in neselektivni toksini, ki vključujejo široko paleto mikro- in makro- molekul, kot so poliketidi, terpenoidi, peptidi in proteini (Daly in Deverall, 1983; Walton, 1996; Kimura s sod., 2001).
Produkcija toksina je pogost pojav, ki doprinese k virulenci patogena. Toksine proizvajajo številne glive, bakterije in rastlinski patogeni, predvsem fakultativni paraziti vključeni v nekrotrofični življenjski krog (Gijzen s sod., 2006).
Toksini poškodujejo celico tako, da vplivajo na prepustnost celične membrane ali pa zavirajo encime in s tem encimske reakcije. Določeni toksini delujejo kot antimetaboliti in inducirajo pomanjkanje rastnega faktorja. Motnje v metabolnih procesih povzročajo napake v fizioloških procesih, kar lahko privede do razvoja bolezni (Agrios, 2005).
Študija s pomočjo mikroskopije TEM (ang. Transmission Electron Microscopy) je po tretiranju rastline rodu Arabidopsis iz družine križnic (Brassiaceae) s proteinom Nep1 razkrila spremembo strukture in debeline epidermalne povrhnjice ter izginotje granul v tilakoidni membrani kloroplasta gostiteljske rastlinske celice, kar sovpada s pomanjkanjem organizacije v membranah. Domnevno naj bi lipofilni značaj proteina Nep1 omogočil prehajanje skozi voskasti epidermalni sloj. Tako je protein v neposredni interakciji z membranami in drugimi lipofilnimi skupinami, kar nakazuje podobnost s toksini, ki modificirajo membrano (Keates s sod., 2003; Bae s sod., 2006).
2.1.6.2 Elicitorji
Obstajajo patogene molekule, ki niso toksini, vendar lahko prav tako povzročajo celično smrt – to so elicitorji (Flor, 1971). Patogeni elicitorji so molekule, ki jih rastlinske celice prepoznajo in sprožijo obrambni odziv, taki obrambni mehanizmi pa lahko vodijo tudi v celično smrt (Nürnberger s sod., 1999). Elicitorji so znani kot faktorji omejevanja bolezni (Gijzen s sod., 2006).
Ne glede na vrsto patogena je odpornost s pomočjo preobčutljivostnega odziva rezultat prepoznave specifičnih signalnih molekul ali elicitorjev, ki jih prepoznajo specifični receptorji v celici. Prepoznavi sledi aktivacija kaskad gostiteljskih genov, kar vodi do razmaha oksidativnih reakcij, poškodb celične membrane in izpusta toksičnih spojin. Sproži se preobčutljivostni odziv, kot posledica pa nastopita celična smrt in inhibicija rasti patogena, od tod tudi odpornost rastline na posamezen patogen (Agrios, 2005).
Večina elicitorjev je splošnih, obstajajo pa tudi gostiteljsko specifični elicitorji, ki sprožijo odziv le pri določenih vrstah. Tak primer so avirulenčni (avr – ang. avirulence) proteini, ki jih kodirajo Avr-geni. Avirulenčne gene je leta 1950 prvi identificiral H. H. Flor, zatem pa so bili odkriti še številni Avr-geni, prisotni v bakterijah in glivah. Geni Avr kodirajo protein Avr, ki ga prepozna receptorski protein v rastlini, ki ga kodirajo R-geni. Prepoznavanje proteina Avr vodi do aktivacije kaskad obrambnega odziva, kar pogosto vključuje tudi celično smrt v območju infekcije. Tak preobčutljivostni odziv je značilen za gen-za-gen koncept. Avr geni tako določajo obseg gostiteljskih vrst, ki jih patogen lahko prizadene (Agrios, 2005).
Proteini Avr so v glavnem hidrofilni, posledično topni v vodi in brez manjkajočega odseka hidrofobne aminokisline, ki bi jim omogočala 'zasidranje' v celični membrani, zato so ali lokalizirani v citoplazmi patogena, ali pa vstopijo prek membranskih por, ki jih tvorijo HRP (ang. Hipersensitive Response and Pathogen) proteini (Agrios s sod., 2005).
2.1.6.3 Delovanje proteinov NLP
Obarvanje s koloidnim zlatom je pokazalo, da Nep1, izoliran iz glive Fusarium oxysporum, ni bil prisoten le v celičnih stenah rastline vrste Arabidopsis iz družine križnic (Brassiaceae), ampak tudi v citosolu, kar dokazuje, da lahko prehaja skozi celično membrano (Bae s sod., 2006).
Številni hitri obrambni odzivi, aktivirani v dvokaličnicah kot odgovor na prisotnost proteina NLP, so primerljivi z delovanjem elicitorjev ali PAMP (ang. Pathogen Associated Molecular Pattern). Takšen primer je flagelin iz bakterije Escherichia coli (Felix in sod., 1999) ali transglutaminaza iz rodu Phytophthora (Nürnberger in sod., 1994). Kljub temu se proteini NLP in elicitorji znatno razlikujejo v delovanju (Gijzen s sod, 2006).
Proteini NLP delujejo direktno na membrano, medtem ko se PAMP-elicitorji vežejo na membranske receptorje, ki prepoznajo določeno molekulo na patogenu in sprožijo odziv celice. Obe vrsti molekul sprožata obrambni odziv gostiteljske celice, a le NLP povzročajo celično smrt (Gijzen s sod, 2006).
Obrambni odziv gostitelja na elicitorje, kot so PAMP, poteka prek podobnih receptorjev, kot so receptorji, ki prepoznajo proteine Avr (Gomez-Gomez in Boller, 2000). Ne glede na to, kakšen obrambni odziv sproži gostiteljska rastlina, je ta vedno posredno ali neposredno kontroliran preko genov (Agrios s sod., 2005).
Testi izražanja in poskusi na protoplastih so pokazali, da je vezavno mesto proteina zunanja celična membrana gostitelja. Izpostavljenost protoplasta čistemu proteinu NLP je privedla do aktivacije obrambnih mehanizmov in posledično do celične smrti (Gijzen s sod., 2006).
Glede na podatke, ki so bili na voljo, je Küfner s sodelavci predlagala model vezave NLP proteina na membrano: hidrofobni del, podoben hidrofobni regiji pri aktinoporinih in perfringolizinu, lahko vstopa skozi lipidni dvosloj. Izpostavljene stranske verige predstavljajo pozitivno nabito področje, ki bi lahko reagirale s polarnimi fosfolipidnimi glavami ali drugimi membranskimi strukturami. Funkcijske analize strukture so pokazale, da je za citolitično aktivnost ključnega pomena koordinacija dvovalentnega kationa ali tvorba domnevne interaktivne zanke (Küfner s sod, 2009).
Pomembnost domene je bila potrjena pri poskusih z NLPPya, kjer je mutacija histidina na mestu 101 ali aspartata na mestu 104 z alaninom bistveno zmanjšala biološko aktivnost proteina (slika 3 ) (Ottmann s sod., 2009).
V raziskavi v primeru proteina MpNep2 so histidin na mestu 116 nadomestili z alaninom ali serinom in aspartat na mestu 119 z lizinom. Vse mutacije so ovirale promocijo puščanja elektrolitov in nekrotično aktivnost. Mutacija aspartata na mestu 119 v lizin je rahlo zmotila negativni potencial vdolbine, spremenjeni histidin na mestu 116 v nepolarni alanin ali polarni serin pa se je vmešal v koordinacijo iona. Pri dokazovanju vloge koordinacije iona v primeru proteina MpNep2 so aspartat na mestu 210 (drugi koordinator kovinskega iona) nadomestili z alaninom ali serinom. Nobena mutacija ni vodila do oslabljene aktivnosti proteina, kar nakazuje na nepomembno vlogo iona pri aktivnosti MpNep2 in močan vpliv histidina prek drugačnega mehanizma (Zaparoli s sod., 2011).
Do sedaj pri proteinih, ki niso citotoksični, ni bilo odkritih struktur, ki bi kakorkoli razkrile, kako se ti proteini izognejo aktivaciji celične smrti, kljub temu da imajo podobno zgradbo kot citotoksični proteini (Wirthmueller s sod, 2013).
2.1.7 Pozitivna vloga proteinov NLP pri virulenci
Prvi poskusi genske transformacije proteina Nep1 pri kulturi F. oxysporum so pokazali, da Nep1 ne vpliva na agresivnost in virulenco patogena (Bailey in sod., 2002), medtem ko je transformacija glive Colletotrichum coccodes z Nep1 vidno zvišala virulenco ter povečala razpon gostiteljskih vrst. Spremenjena kultura C. coccodes, ki je bila nato vbrizgana v sadike Abutilon theophrasti iz družine slezenovk, je povzročila bliskovito smrt rastline, nespremenjena kultura C. coccodes pa je na rastlini povzročila le blažje simptome bolezni (Amsellem s sod., 2002). Spremenjena kultura C. coccodes z Nep1 lahko okuži tobak in paradižnik, ki sta odporna proti divjemu tipu kulture C.coccodes (Gijzen s sod, 2006).
Slika 3: Odsotnost nekroze pri zamenjavi aspartata na mestu 104 in histidina na mestu 101 z alaninom (Povzeto po Ottmann s sod., 2009).
2.2 ODZIV TOBAKA
2.2.1 Opis rastline
Navadni tobak (Nicotiana tabacum) sodi v družino Solanaceae in rod Nicotiana. Tobak je zeliščna rastlina, ki zraste nekje do 2,5 m. Vsi deli rastline vsebujejo alkaloid nikotin, katerega koncentracija naraste pred cvetenjem. S trganjem cvetov tako vzdržujejo visoko raven nikotina v listih. Razširjen je po vsem svetu, prvotno pa izhaja iz držav Južne Amerike.
Danes je poleg Južne Amerike nasade tobaka najti tudi v Severni Ameriki, na Bližnjem Vzhodu in jugovzhodnih delih Evrope (Ross, 2005).
2.2.2 Tobak kot sistemski model
Tobak je kot testna rastlina vsestransko uporaben pri raziskovanju celičnih in tkivnih kultur.
In vitro študija tobakove tkivne kulture je omogočila vpogled v rast in diferenciacijo tkiva ter nadzor nad procesoma. Tobak je v preteklih letih postal sistemski model za tkivne kulture in genski inženiring. Po zaslugi poskusov na tobakovih tkivnih kulturah, sta indukcija haploidnih organizmov in selekcija mutiranih linij celic postali zelo uporabni orodji.
Tobak se poleg tega uporablja za izolacijo, kulture in regeneracijo rastlin iz protoplastov ter somatsko hibridizacijo. Kot testna rastlina je uporaben za transformacijo rastlin, ekspresijo in stabilnost genov, obenem pa se uporablja tudi pri študijah o produkciji rekombinatnih proteinov, protiteles in kemikalij, ki se uporabljajo v medicini in industriji (Ganapathi, 2004).
2.2.3 Odziv tobaka na Nep1
Obseg nekroze na tobakovih listih, infiltriranih s proteinom Nep1, ki je bil izoliran iz glive Fusarium oxysporum, je bil odvisen od koncentracije proteina. Nekroze tkiva so postale vidne pri koncentracijah, višjih od 6 ng/ml in so se pojavile le na območju infiltracije (slika 4). Če je protein Nep1 vstopil prek žil, se je nekroza razvila čez celotno površino lista, predvsem okrog žil. Po tretiranju listnih pecljev tobakovih listov z Nep1 so se robovi lista skodrali in počrnili.
Po pršenju sadike tobaka z Nep1 v spreju (208 nM) so se pojavile obsežne nekroze listnega tkiva (slika 5) (Jennings s sod., 2001).
Poleg nekroze tkiv so se rastlinske celice tobaka odzvale tudi z biosintezo rastlinskega hormona etilena (Jennings s sod., 2001). Hormon izločajo poškodovane ali obolele rastline kot odziv na stres ali poškodbo tkiva. Etilen povzroča številne simptome kot so kloroza, prezgodnje staranje in odpadanje listov, prezgodnje dozorevanje plodov, poleg tega pa povečuje prepustnost celične membrane, kar je običajen znak okužbe rastlinskega tkiva.
Proizvajanje etilena pogosto poteka sočasno s sintezo fitoaleksinov in signalnih molekul, ki bi lahko imele vlogo pri odpornosti rastline na infekcijo (Agrios, 2005).
Višja koncentracija proteina Nep1 je vodila do večje količine proizvedenega etilena.
Biosinteza etilena je povezana z aktivacijo vsaj dveh encimov: ACC-oksidaze in ACC- sintaze. Analiza je potrdila, da tretiranje z Nep1 inducira transkripcijo obeh encimov, sodelujočih v biosintezi etilena, poleg tega pa se je pri tretiranih sadikah povečala tudi poraba O2 (Jennings s sod., 2001).
V povezavi s preobčutljivostnim odzivom, ki je posledica nekompatibilne interakcije med patogenom in rastlino, je tudi povečanje koncentracije K+ in pH zunaj celičnega prostora (Jennings s sod., 2001). Mathieu in sodelavci so povišanje koncentracije H+ v citoplazmi, ki je posledica fosforilacije proteina, označili za zgodnji odziv celic tobaka na prisotnost elicitorja.
Slika 4: Nekroza tkiv, povzročena z infiltriranjem proteina Nep1 v tobakove liste.
Obseg nekroze variira s koncentracijo proteina, številke označujejo količino proteina v nanogramih, ki so bili infiltrirani v list v končnem volumnu 50 µl. Slika je posneta 48 ur po infiltraciji s proteinom Nep1 (Povzeto po Jennings s sod., 2001).
Slika 5: Obsežna nekroza kot posledica pršenja sadike tobaka s proteinom Nep1 iz glive Fusarium oxysporum. 1- kontrolna zdrava sadika Nicotiana tabacum, 2- sadika Nicotiana tabacum tretirana z NEP1 ( Povzeto po Jennings s sod., 2001).
2.3 BOLEZNI RASTLIN
Bolezni rastlinskih vrst občutno zmanjšajo količino in kakovost pridelka, obenem pa omejujejo področje rasti posamezne kulture, kar posledično vpliva tudi na prisotnost industrije in intenzivnega kmetijstva na določenem območju. Poleg škode, ki jo bolezni povzročijo na pridelku, je velika nevarnost tudi toksičnost rastlin, ki so okužene s patogenimi organizmi.
2.3.1 Bolezni, ki jih povzročajo bakterije
Večina bakterijskih vrst je saprofitov in so za človeka pomembne kot dekompozitorji organske snovi. Številne bakterije pri ljudeh povzročajo bolezni, kot sta tuberkuloza in pljučnica, pri živalih pa brucelozo in antraks. Okrog 100 bakterijskih vrst povzroča bolezni na rastlinah. Bolezni se pojavijo povsod, kjer je dovolj vlažno in toplo okolje ter napadajo vse vrste rastlin. Listna pegavost, ožig, gnitje plodov in korenin je le nekaj simptomov, ki so posledica bakterijske infekcije (Agrios, 2005).
2.3.2 Bolezni, ki jih povzročajo prave glive
Glive razvrščamo v šest debel: Chytridiomycota, Glomeromycota, Microsporidia, Zygomycota, Ascomycota in Basidiomycota. Povzročajo številne lokalne ali generalne simptome na gostiteljih, simptomi pa se pojavljajo posamič, si sledijo ali se pojavijo hkrati.
Patogene glive pogosto zmanjšajo rast rastlinskih organov in rastlin samih ali pospešujejo rast okuženih delov. Najbolj pogosti nekrotični simptomi so listne pege, ožig, gnitje korenin in razpoke. Patogene glive poleg tega dušijo rast sadik in povzročajo osutje. Pojavljajo se tudi plesni, rje, sneti in venenje rastlin. Pri nekaterih primerih bolezni patogene glive rastejo ali tvorijo strukture na površini gostitelja. Najbolj poznane so plesni, ki jih povzročajo prostotrosnice (Agrios, 2005).
2.3.3 Bolezni, ki jih povzročajo predstavniki skupine Oomycota
Dve najbolj pomembni patogeni skupini oomicet sta Saproleginiales in Peronosporales, ki vključuje znana rodova Pythium in Phytophthora, najbolj poznan pa je zagotovo rod Peronospora, ki povzroča belkasto plesen na solati, tobaku, vinski trti in bučnicah.
Bolezni, ki jih povzročajo oomicete, v grobem delimo na dva tipa:
a) bolezni, ki napadejo rastlinske dele v tleh ali tiste dele, ki so v stiku s tlemi- korenine, stebla, semena, zrele sadeže. Takšen tip bolezni povzroča rod Pythium in nekateri predstavniki rodu Phytophthora;
b) bolezni, ki prizadenejo nadzemne dele rastline- liste, mlada stebla in plodove. Sem uvrščamo nekatere predstavnike rodu Phytophthora (Agrios, 2005).
Pythium povzroča ožig, gnitje korenin in semen ter zaduši rast sadik. Zoospore, ki jih tvori sporangij na belem, hitrorastočem miceliju, v stiku s semeni ali semenskim tkivom vstopijo v celico z direktno penetracijo. Pektinolitični encimi razgradijo pektin, proteolitični encimi pa uničijo protoplast. Razgradnji celuloze sledi popolno sesutje in razpad celične stene, kar povzroči gnitje ali celo smrt semena.
Phytophthora povzroča množico uničujočih bolezni, ki prizadenejo sadike zelenjave in okrasnih rastlin, zrelo sadje ter mnoge drevesne vrste. Večina vrst povzroča gnitje korenin, stebel in gomoljev ter zaduši rast sadik, medtem ko druge vrste povzročajo ožig. Najbolj znana vrsta je P. infestans, ki povzroča krompirjevo in paradižnikovo plesen (Agrios, 2005).
2.4 BOJ PROTI RASTLINSKIM BOLEZNIM
Za zaščito pridelka so v uporabi številne kemikalije in načini tretiranja, vse od hlapnih pesticidov, sprejev, barv, past in sistemikov (Agrios, 2005).
2.4.1 Mehanizem delovanja kemikalij
Za nekatere kemikalije domnevajo, da zmanjšujejo infekcijo z večanjem odpornosti gostitelja, za večino pa mehanizem njihovega delovanja ni znan. Večino kemikalij uporabljajo zaradi njihove toksičnosti do patogena: učinkovite so kot zaščita na točki vstopa patogena ali pa delujejo sistematično skozi rastlino. Te kemikalije zavirajo sposobnost patogena, da bi sintetiziral katero od substanc v lastni celični steni, delujejo lahko kot topilo ali kako drugače poškodujejo membrano patogena. Tvorijo lahko komplekse z esencialnimi koencimi patogena in tako deaktivirajo delovanje patogena ali kar direktno deaktivirajo encime in tako povzročijo propad proteinov v patogenem organizmu (Agrios, 2005).
Žveplo se vmeša v transport elektronov pri citokromskem sistemu gliv in na ta način prikrajša protein za celično energijo. Žveplo se reducira do dihidrogen sulfida (H2S), ki je toksičen za večino celičnih proteinov in verjetno prispeva k celični smrti.
Bakrov ion Cu2+ je toksičen za vse celice, saj reagira s –SH skupino določenih aminokislin in povzroči denaturacijo proteinov. Tudi številni organski fungicidi so za patogen toksični, ker deaktivirajo proteine in encime prek reakcije s –SH skupino (Agrios, 2005).
Ditiokarbamati in etazol po zavzetju celice glive sprostijo –N=C–S skupino, ki se veže ireverzibilno na, in deaktivira –SH skupino. Podobno delujejo klorirane aromatske spojine in heterociklične spojine, ki reagirajo z –NH2 in –SH skupino in tako deaktivirajo encime, ki vključujejo omenjeni funkcionalni skupini (Agrios, 2005).
Kemikalije, ki rastlino ozdravijo infekcije, so poimenovali kemoterapevtiki. V kontaktu s patogenom delujejo specifično: nekateri zavirajo encim hidrogenazo, ki sodeluje pri celičnem dihanju, druge sodelujejo pri delitvi jedra tako, da se vežejo na proteinske podenote mikrotubulov (Agrios, 2005).
2.4.2 Anorganske kemikalije
2.4.2.1 Bakrove spojine
Bordojsko brozgo, ki je produkt reakcije med bakrovim (VI) sulfatom in kalcijevim hidroksidom, uporabljamo za zatiranje peronospore na vinski trti in za zatiranje ožiga. Je prvi odkrit fungicid in še vedno največ v rabi (Agrios, 2005).
2.4.2.2 Žveplove spojine
Žveplo lahko uporabljamo v prahu, kot puder, pasto ali tekočino. Z njim zatiramo peronosporo, ožig listov, rje in gnitje plodov (Agrios, 2005).
2.4.2.3 Karbonatne spojine
Z natrijevim bikarbonatom in ostalimi bikarbonatnimi solmi lahko zatiramo peronosporo na cvetlicah, glivne infekcije na kumarah, črno pegavost cvetlic ali ožig in črno vlago (Agrios, 2005).
2.4.2.4 Fosfatne spojine
KH2PO4 in K2HPO4 uporabljajo za zatiranje peronospore na kumarah in vinski trti (Agrios, 2005).
2.4.2.5 Spojine, ki tvorijo film
Sem spadajo antitranspirantni polimeri, mineralna olja, surfaktanti in drugi. Na rastline jih nanesejo pred vstopom proteina in tako znatno zmanjšajo število infekcij. Večina teh spojin je prepustnih za pline, odpornih na vremenske vplive vsaj teden dni, biorazgradljivih in niso fitotoksične. Na okužbo in delovanje patogena očitno vplivajo s spremembo značilnosti površja lista, kar vpliva na adhezijo patogena do gostitelja ter na prepoznavo gostitelja (Agrios, 2005).
2.4.3 Organske kemikalije
2.4.3.1 Kontaktni fungicidi
2.4.3.1.1 Ditiokarbamati
Organske žveplove spojine so ene od najbolj pomembnih in razširjenih fungicidnih sredstev.
Sem spadajo derivati ditiokarbamatne kisline thiram, maneb, zineb in mancozeb. –N=C–S radikal deaktivira –SH skupino v aminokislinah in s tem zavira produkcijo in delovanje teh spojin. Ditiokarbamati se uporabljajo pri zaščiti semen in čebulic, za zatiranje plesni, ožiga, listne pegavosti in gnitja (Agrios, 2005).
2.4.3.1.2 Aromatske spojine
Številne spojine z aromatskim obročem so toksične za mikroorganizme, zato jih uporabljajo kot fungicidna sredstva. Večina spojin zavira produkcijo aminokislin in encimov, najbolj razširjene so pentakloronitrobenzen, dikloran, klorotalonil in bifenil. Z njimi zatirajo listno pegavost, plesni, peronosporo, gnitje sadja, zelenjave in okrasnih rastlin (Agrios, 2005).
Slika 6: Strukturna formula mankozeba
Slika 7: Strukturna formula klorotalonila
2.4.3.1.3 Heterociklične spojine
Tako kot aromatske spojine tudi heterociklične zavirajo produkcijo esencialnih spojin, kot so aminokisline in encimi. Kaptan, iprodion, flutolanil in vinklozolin so fungicidna sredstva, ki so večinoma v uporabi za zatiranje plesni (Agrios, 2005).
2.4.3.2 Sistemski fungicidi
Sistemski fungicidi se absorbirajo prek korenin in po rastlini potujejo skozi ksilem. So specifični fungicidi in zavirajo le en ali nekaj korakov v metabolizmu določene glive, ki jo kontrolirajo. Posledica tega je odpornost glive, ki z manjšo mutacijo postane odporna na fungicidno sredstvo (Agrios, 2005).
2.4.3.2.1 Acilalanini
Najpomembnejši acilalanin je fungicid metalaksil, s katerim zatirajo oomicete iz rodu Pythium in Phytophthora ter peronosporo (Agrios, 2005).
2.4.3.2.2 Benzimidazoli
Sem spadajo benomil, karbendazim, tiabendazol in tiofanat. Učinkoviti so pri zatiranju gliv, saj se na površju spremenijo v metil benzimidazol karbamat, ki sodeluje pri delitvi jedra glive (Agrios, 2005).
2.4.3.2.3 Oksantini
Oksantini so prve spojine, pri katerih so odkrili fungicidne lastnosti. Karboksin in oksikarboksin uporabljamo pri tretiranju semen in zatiranju rje. Oksantini zavirajo produkcijo encima hidrogenaze, ki je pomemben pri celičnem dihanju (Agrios, 2005).
Slika 8: Strukturna formula metalaksila
2.4.3.3 Organofosfatni fungicidi
K organofosfatnim fungicidom prištevamo pirimidine in trizaole. Pirimidine uporabljajo pri zatiranju peronospore, listne pegavosti in rje. Triazoli vključujejo številne sistemske fungicide, ki delujejo kot zaščitna sredstva pred okužbo in po njej. Uporabljajo se v obliki foliarnih sprejev ter za tretiranje tal in semen. Z njimi zatirajo bolezni, ki jih povzročajo zaprtotrosnice, prostotrosnice in glivam podobni organizmi (Agrios, 2005).
2.4.3.4 Strobilurini
Skupna lastnost vsem strobilurinom je vmešavanje v proces celičnega dihanja. Strobilurini blokirajo prenos elektronov in tako preprečijo razporeditev molekule ATP, zato sodijo med specifične fungicide. Najpomembnejši strobilurini so azoksistrobin, trifloksistrobin in kresoksim metil (Agrios, 2005).
2.4.3.5 Mešani sistemiki
Sem spadajo številni fungicidi, ki se razlikujejo v kemijski zgradbi in v delovanju. Kloroneb, etazol, imazalil, triflumizol, prokloraz, propamocarb in triforin so nekatere spojine, s katerimi preprečujemo bolezni, ki jih med drugim povzročata tudi Pythium in Phytophthora. Zoksamid in cink sta dve učinkovini, ki spadata v skupino mešanih organskih fungicidov (Agrios, 2005).
2.4.3.6 Antibiotiki
Antibiotiki nadzorujejo bolezen z aktivnostjo na patogenu ali na gostitelju. Najpomembnejši antibiotiki so streptomicin, tetraciklin in cikloheksimid. Streptomicin se veže na bakterijske ribosome in prepreči sintezo proteinov. Večinoma se uporablja pri dezinfekciji semen proti bakterijskim patogenom. Tudi tetraciklin preprečuje sintezo proteinov, uporabljajo pa ga za preprečevanje ožiga (Agrios, 2005).
Za večjo učinkovitost kombinirajo fungicide z različnimi mehanizmi delovanja in tako razširijo spekter delovanja. Bolezni na ekonomsko pomembnih rastlinah povzročajo veliko agroekonomsko škodo in je zatorej razvoj različnih substanc, ki zatirajo te bolezni, izredno pomemben.
Slika 9: Strukturna formula zoksamida
3 MATERIALI IN METODE 3.1 MATERIALI IN OPREMA 3.1.1 Uporabljene kemikalije
Preglednica 1: Uporabljene kemikalije.
Uporabljene kemikalije Proizvajalec MES
NaCl
Merck, Nemčija Merck, Nemčija
DMSO Merck, Nemčija
destilirana voda
modro barvilo Coomassie Blue akrilamid
TEMED (tetrametiletilendiamin) TRIS
1,5 % APS (amonijev persulfat) SDS (natrijev dodecil sulfat) metanol
glicin
proteinski marker
Merck, Nemčija Bio-Rad, ZDA Sigma, ZDA Merck, Nemčija Serva, Nemčija Merck, Nemčija Merck, Nemčija Merck, Nemčija Fermentas
3.1.2 Uporabljene aparature
Preglednica 2: Uporabljene aparature in laboratorijska oprema.
3.1.3 Sestava barvila, nosilca in nanašalnega gela
Preglednica 3: Sestava nosilca in nanašalnega gela.
12 % gel nanašalni gel
40 % akrilamid 1,8 ml 0,5 ml
destilirana voda 3,104 ml 2,945 ml
3 M TRIS pufer 0,75 ml; pH 8,8 /
0,5 M TRIS pufer / 1,25 ml; pH 6,8
10 % SDS 40 µl 50 µl
1,5 % APS 300 µl 250 µl
TEMED 60 µl 5 µl
Preglednica 4: Sestava barvila.
raztopina za barvanje raztopina za razbarvanje
Coomasie B.B 2,5 g /
destilirana voda 500 ml 375 ml
metanol 400 ml 75 ml
ocetna kislina 100 ml 50 ml
3.1.4 Sadike tobaka
Sadike tobaka (Nicotiana tabacum White Burley) so bile vzgojene na Nacionalnem inštitutu za biologijo (Ljubljana) v sodelovanju s Špelo Prijatelj Novak.
Aparature Proizvajalec
pH-meter tehtnica
Mettler Toledo Sartorius
rotacijski stresalnik Tehtnica, Grant bio PCV 2400 rokavice
brizge parafilm
spektrofotometer pipete
epice
stojalo za epice fotoaparat računalnik
Shield BD Plastipak Pechiney
Nanodrop, Thermo Gilson, Biohit Sarstedt Nikon D3000 Dell
3.1.5 Proteini NLP 3.1.5.1 Protein PaNIE
Pythium aphanidermatum je kozmopolitanski patogen s širokim spektrom delovanja na mnoge ekonomsko pomembne pridelke. Večinoma napada oziroma okuži juvenilna tkiva, kot so semena (Veit, 2001). Suspenzijska kultura hif oomicete Pythium aphanidermatum izloča številne elicitorske molekule, med drugim tudi ogljikove hidrate in proteine (Schnitzler, 1992).
PaNIE je protein z molekulsko maso 23,2 kDa, ki ga izloča patogena oomiceta Pythium aphanidermatum. Ime PaNIE izhaja iz angleške kratice Pythium aphanidermatum Necrosis Inducing Elicitor (Veit, 2001).
> NLP(Pya)
AVINHDAVPVWPQPEPADATQALAVRFKPQLDVVNGCQPYPAVDPQGNTSGGLKPS GSQAAACRDMSKAQVYSRSGTYNGYYAIMYSWYMPKDSPSTGIGHRHDWENVVV WLDNAASANIVALSASAHSGYKKSFPADKSYLDGITAKISYKSTWPLDHELGFTTSA GKQQPLIQWEQMTQAARDALESTDFGNANVPFKSNFQDKLVKAFFQ
Ekstincijski koeficient [ε] proteina PaNIE je bil glede na zaporedje določen s pomočjo orodja ProtParam: 48025 [M-1 cm-1]
3.1.5.2 Protein NPP
Veliko število vrst iz rodu Phytopthora v celični steni poleg transgluminaze vsebuje še en protein v velikosti 24 kDa. Proteini NPP (ang. Necrosis inducing Phytophtora Proteins) so skupina sekrecijskih toksinov. NPP1, izoliran iz oomicete Phytophtora parasitica, je povzročil preobčutljivostni odziv in celično smrt na gostiteljski rastlini. Infiltracija proteina NPP1 v liste kulture Arabidopsis thaliana je sprožila kopičenje PR-genov, produkcijo etilena in reaktivnih kisikovih spojin, nalaganje sladkorja in posledično celično smrt. Proteinu NPP1 podobni strukturni homologi so bili odkriti v oomicetah, glivah in bakterijah, v rastlinah pa ne (Fellbrich, 2002).
> NLP(Pp)
DVISHDAVVPFAQPTATTTEQKAGVKFKPQIHISNGCHPYPAVDANGNTSGGLKPTGS SSAGCKGSGYGSQVYGRVATYNGVYAIMYSWYFPKDSPVTGLGHRHDWEHVVVW VDDIKLDSPSIIAVSPSAHSGYNIYYPPESNTIDGYSAKVDYSSSWVVINHALDSTTDA GETQDLIMWDQLTDAARTALENTDFGDANVPMKDGNFLTKVGNAYYA
Ekstincijski koeficient [ε] proteina NPP je bil glede na zaporedje določen s pomočjo orodja ProtParam: 48485 [M-1 cm-1]
V tej raziskavi smo uporabili rekombinantna proteina NPP in PaNIE, ki sta bila pridobljena s pomočjo ekspresijskega sistema v kvasovki Pichia pastoris in pripravljena v skupini prof. dr.
Thorsten-a Nürnberger-a iz Tübingna (Center for Plant Molecular Biology; University of Tübingen; Tübingen, Germany).
3.1.6 Kemijske spojine
• spojine 1, 2, 3, 4, (iz banke spojin, dobljene od skupine prof. dr. Stanislava Gobca, Fakulteta za farmacijo, Ljubljana)
• spojina 5 (dobljena z virtualnim rešetanjem in kupljena pri ponudniku)
Preglednica 5: Imena spojin in pripadajoče strukturne formule.
Strukturna formula Ime substance Oznaka
1-{2-[(4-fluorobenzoil)amino]etil}pirolidinium 1
2-[(5-amino-1H-1,2,4-triazol-3-il)sulfanil]-1- (2,3-dihidro-1,4-benzodioksin-6-il)etanon
2
3-(1H-pirolo[2,3-b]piridin-3-il)alanin 3
N'-[(E)-1H-indol-3-il-metilen]-3-metil-1H- pirazol-5-karbohidrazid
4
9-benzil-2-kloro-5,9-dihidro-4H-purin-6-amin 5
3.2 METODE
3.2.1 Merjenje absorbance
Rekombinantna proteina NPP in PaNIE so s pomočjo ekspresijskega sistema v kvasovki Pichia pastoris pridobili v laboratoriju prof dr. Thorsten-a Nürnberger-ja iz Tübingna (Center for Plant Molecular Biology; University of Tübingen; Tübingen, Germany). Proteinoma smo s spektrofotometrično metodo določili koncentracijo. Za meritve smo uporabili spektrofotometer Nanodrop, ki omogoča natančne meritve že v 1-2 µl vzorca in s tem manjšo porabo le-tega. Glede na izmerjeno absorbanco ter znan ekstinkcijski koeficient posameznega proteina, smo določili koncentracijo proteinov NPP in PaNIE. Pri poskusih smo upoštevali koncentracijo in preračunali potrebno razredčitev proteina pri posameznem poskusu.
3.2.2 Priprava pufrov in raztopin
V začetku smo pripravili pufer, ki smo ga potrebovali pri nadaljnjih redčenjih proteinov.
Zatehtali smo ustrezno količino MES (0,976 g) in NaCl (2,0454 g) ter dodali destilirano in filtrirano vodo po sistemu MilliQ. Z dodatkom NaOH smo popravili vrednost pH na 5,8, pred umerjanjem pa kalibrirali pH-meter. Spojine, ki so bile raztopljene v 100 % DMSO, smo pred vbrizganjem v rastlino redčili tako, da so bile ob vbrizganju v 50 mM MES, 140 mM NaCl in 5 % DMSO.
3.2.3 Infiltriranje
Pri vsaki seriji poskusov smo na spodnjo stran lista kot kontrolo vbrizgali 20 µl pufra MES, DMSO v pufru, protein v pufru ter določeno spojino v pufru. Pri poskusih s spojinami v prisotnosti proteinov smo odpipetirali protein, dodali spojino in ustrezno redčili s pufrom do 20 µl, nato pa zmes v epici premešali na vorteksu ter z mililitrsko plastično brizgo infiltrirali na spodnjo stran tobakovega lista 20 µl pripravljene mešanice. Vsako vbrizganje smo označili z datumom in imenom spojine oziroma kontrolnega vzorca.
3.2.4 Fotografiranje in obdelava podatkov
Območje na spodnji strani lista, kamor je bila zmes vbrizgana, smo fotografirali takoj po vbrizganju in po oseminštiridesetih urah, pri primerjanju efektov proteinov pa po sedmih dneh. Ob koncu vsakega poskusa smo pripravili poročilo, opremljeno s podatki, slikami in interpretacijo rezultatov.
3.2.5 Elektroforeza
Elektroforezo lahko uporabimo kot analitsko ali preparativno metodo. Gre za metodo ločevanja komponent ionnizirane snovi. Če pozitivno oziroma negativno nabite delce izpostavimo delovanju električnega polja, potujejo pozitivne molekule na negativno nabito katodo, negativno nabite molekule pa na pozitivno anodo. Hitrost potovanja nabitega delca je večinoma odvisna od električnega polja, ki nanjo deluje, in od upora, ki zavira hitrost potovanja. Nosilci električnega toka med elektrodama so nabite molekule vzorca in ioni, ki sestavljajo pufer, v katerem poteka elektroforeza. Elektroforezo snovi z nabitimi delci izvedemo v raztopini ali na nosilcu, omočenem v ustreznem pufru. Nosilec je lahko inerten ali ima določene lastnosti, ki vplivajo na mobilnost različno velikih molekul. Najobičajnejši nosilci so agaroza, aluminijev oksid, celuloza-acetat, papir, silikagel in poliakrilamid. Snovi z nabitimi delci se ločijo glede na njihovo elektroforetsko mobilnost, na katero vpliva:
- električno polje: mobilnost nabitega delca je odvisna od napetosti, upornosti in jakosti električnega toka, ki teče skozi medij. Hitrost potovanja je obratnosorazmerna z napetostjo.
- lastnost vzorca: hitrost potovanja nabitega delca je premosorazmerna z nabojem, kar pa je odvisno od pH. Večji kot je delec, večji upor mu nudi nosilni medij, zaradi česar potuje počasneje.
- nosilec: adsorpcija na nosilec upočasni potovanje delcev in povzroči tvorbo repov.
Čim večji je delec, večji upor mu nudi gel, zato potuje počasneje kot manjši delec.
Čim večja je zamreženost gela, tem počasneje potuje delec skozi nosilec.
- pufer: čim večja je ionska jakost pufra, več toka prevaja, vzorec pa v takem primeru prevaja manj – gibljivost delcev iz vzorca je posledično manjša. Pri manjši ionski jakosti pufra je tudi tok manjši, kar podaljša čas elektroforeze.
Snovi pri elektroforezi potujejo kot lise, ki jih zasledujemo z ustrezno analitsko metodo. V osnovi vsako elektroforezo sestavljata elektroforetska komora z nosilcem, ki je lahko nameščen horizontalno ali vertikalno, in napajalnik z usmerjeno napetostjo. Najpreprostejši tip elektroforeze je papirna elektroforeza, ki se danes le redko uporablja. Za analitsko in preparativno ločevanje makromolekul so zelo primerni različne geli, nasičeni s pufrom.
Škrobne in agarozne gele pripravimo tako, , da jih za krajši čas segrevamo v pufru, nato z njimi prelijemo trden nosilec in pustimo, da se strdijo. V gel nato naredimo manjšo luknjico ali zarezo, v katero lahko nanesemo vzorec. Poliakrilamidne gele, ki so najpogosteje v uporabi za ločevanje proteinov in drugih nabitih molekul, pripravimo tik pred uporabo s polimerizacijo akrilamida in bis-akrilamida v ustreznem odstotnem razmerju, s katerim pridobimo zaželjeno zamreženost gela. (Anderluh s sod., 2009).
3.2.5.1 NaDS (SDS) - elektroforeza
NaDS (natrijev dodecil sulfat)- ali SDS (ang. sodium dodecyl sulphate) - elektroforeza je analitska metoda in ena najbolj uporabljenih elektroforez, s pomočjo katere določamo molekulsko maso proteinom in polipeptidom. NaDS-elektroforeza temelji na uporabi anionskega detergenta NaDS (natrijev dodecil sulfat), ki denaturira sekundarno in terciarno strukturo proteinskih molekul ter jih obda z lastnimi molekulami. Zaradi negativnega naboja anionskega detergenta imajo negativni naboj tudi denaturirani proteini, velikost naboja pa je odvisna od velikosti molekule proteina. V električnem polju tako vse molekule potujejo proti pozitivno nabiti anodi, hitrost premikanja pa je obratnosorazmerna z njihovo velikostjo, kar pomeni, da manjše molekule prepotujejo daljšo razdaljo, večje molekule pa bodo potovale počasneje zaradi večjega upora nosilca. Na rob nosilca za primerjavo nanesemo standarde z znanimi molekulskimi masami. Iz umeritvene krivulje lahko tako odčitamo molekulsko maso proteina, ki smo ga uporabili pri poskusu (Anderluh s sod., 2009).
NaDS elektroforezo lahko izvedemo v kontinuiranem ali diskontinuiranem pufrskemu sistemu. Slednji je primernejši saj se lise oblikujejo kot zelo ozke linije, kar izboljša ločljivost. Pri diskontinuirani elektroforezi ima nanašalni gel bistveno manjšo zamreženost kot ločitveni gel. Ker se pufra v gelih razlikujeta, pripotujejo vse molekule do meje med geloma v izredno tanki liniji, zaradi česar v ločitvenem gelu ne pride do prekrivanja lis. NaDS elektrforeza poteka na poliakrilamidnih nosilcih z različno zamreženostjo. Izberemo jo glede na velikost molekule, ki ji želimo določiti molekulsko maso. Za ločevanje večjih molekul je potrebna manjša zamreženost kot za ločevanje majhnih molekul (Anderluh s sod., 2009).
Pri poskusu smo uporabili 12 % NaDS gel, ki smo ga pripravili tako, da smo zamešali 40 % akrilamid, destilirano vodo, 3 M TRIS pufer, 10% SDS, 1,5 % APS in TEMED. Količine so navedene v preglednici 4. Štiri ml tako pripravljene mešanice smo vlili v pripravljena stekelca in dodali destilirano vodo ter počakali, da se je gel strdil. Nanašalni gel smo pripravili na podoben način, razlika je bila le v količinah oziroma koncentracijah posameznih sestavin.
Uporabili smo 40 % akrilamid, destilirano vodo, 0,5 M tris pufer, 10 % SDS, 1,5 % APS in TEMED. Količine so navedene v preglednici 4. Na vrh smo položili glavniček z 10 jamicami debeline 1 mm. Zopet smo počakali, da se je gel strdil.
Za elektroforezo smo uporabili 1 x pufer SDS in 5 x nanašalni gel. 10 x pufer SDS smo pripravili iz 10 g SDS-a, 30,3 g TRIS-a, 144 g glicina in 8 dl destilirane vode. Mešanico smo postavili na magnetno mešalo. Ko so se snovi dodobra premešale, smo do enega litra dolili destilirano vodo. V jamice smo nanesli proteinsko lestvico Fermentas ter dve različni količini (2 µg in 5 µg) dveh rekombinatnih proteinov NPP in PaNIE, ki smo ju uporabljali pri infiltracijah. Elektroforezo smo izvajali 65 minut pri napetosti 150 V, toku 3 A in 300 W.
Po končani elektroforezi smo gel trikrat sprali z destilirano vodo. Da bi komponente, ločene z elektroforezo lahko opazovali, jih je potrebno obarvati in fiksirati. Gel smo potopili v raztopino barvila Coomasie modro, pripravljenega kot kaže preglednica 5, ter ga čez noč pustili na stresalniku. Naslednji dan smo odvečno barvilo odstranili z razbarvanjem z isto raztopino le brez barvila. Gel smo sprali z destilirano vodo in ga v njej pustili še 20 min. Gel smo nato skenirali.
