PEDAGOŠKA FAKULTETA
TJAŠA SOVDAT
OPTI Č NE LASTNOSTI STELJKE LIŠAJA Pseudevernia furfuracea
DIPLOMSKO DELO
LJUBLJANA, 2015
PEDAGOŠKA FAKULTETA BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
Študijski program: Biologija in Kemija
TJAŠA SOVDAT
Mentorica: prof. dr. Alenka GABERŠ Č IK
OPTI Č NE LASTNOSTI STELJKE LIŠAJA Pseudevernia furfuracea
DIPLOMSKO DELO
Ljubljana, 2015
II
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija biologije in kemije. Opravljeno je bilo v laboratoriju Katedre za ekologijo in varstvo okolja na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete v Ljubljani.
Študijska komisija Pedagoške fakultete je 3. maja 2015 odobrila predlagano temo diplomske naloge z naslovom Optične lastnosti steljke lišaja Pseudevernia furfuracea.
Za mentorico je imenovala prof. dr. Alenko Gaberščik.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Tadeja TROŠT SEDEJ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Mentorica: prof. dr. Alenka GABERŠČIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: prof. dr. Mateja GERM
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tekstu na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
III KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd
DK UDK 581.5:582.29(043.2)
KG odbojnost/navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea)/lastnosti listov AV SOVDAT, Tjaša
SA GABERŠČIK, Alenka (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Program Kemija in Biologija
LI 2015
IN OPTIČNE LASTNOSTI STELJKE LIŠAJA Pseudevernia furfuracea TD Diplomsko delo (univerzitetni študij)
OP IX, 23 str., 2 pregl., 7 sl., 24 vir.
IJ sl JI sl/an
AI Proučevali smo razlike odbojnih spektrov med različnimi vzorci steljk lišaja
navadnega rogovilarja (Pseudevernia furfuracea). Primerjali smo spektre odbojnosti suhih in vlažnih steljk lišaja v območju od 280 nm do 887 nm. Določili smo vsebnost klorofilov in karotenoidov ter jih primerjali med vzorci suhih in vlažnih steljk.
Testirali smo tudi razlike v vsebnosti klorofila a in b ter karotenoidov med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja ter ugotavljali povezanost med barvnimi pasovi odbojnih spektrov in biokemijskimi parametri. Rezultati so pokazali, da imajo spektri
odbojnosti vlažnih steljk tipične značilnosti zdravih aktivnih steljk, medtem ko spektri odbojnosti suhih postopno naraščajo do NIR spektra in potem upadejo. Odbojni spektri vlažnih steljk imajo relativno nizko odbojnost v UV območju. Vrh je v zelenem pasu pri 560 nm. Ugotovili smo, da so bili suhi in vlažni vzorci steljk statistično značilno različni v vsebnosti klorofila a in karotenoidov. Povezanost med barvnimi pasovi odbojnih spektrov in biokemijskimi lastnostmi nismo dokazali.
Dokazali smo le vpliv klorofila a in karotenoidov na NIR spektre pri vlažnih lišajih.
IV KEY WORDS DOCUMENTATION
DN Dd
DC UDC 581.5:582.29(043.2)
CX reflectance/Pseudevernia furfuracea/leaf properties AU SOVDAT, Tjaša
AA GABERŠČIK, Alenka (supervisior) PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16
PB University of Ljubljana, Faculty of Education, Biotehnical Faculty, Academic Study Programme Chemistry and Biology
PY 2015
TI OPTICAL PROPERTIES OF THALLUS OF THE LICHEN Pseudevernia furfuracea DT Graduation Thesis (University studies)
NO IX, 23 p., 2 tab., 7 fig., 21 ref.
LA sl AL sl/en
AB We have studied the differences in the reflectance spectra between various samples of lichen thalli plain (Pseudevernia furfuracea). We have compared the reflectance spectra of the dry and wet lichen thalli in the range of 280 nm to 887 nm. We have determined the contents of chlorophylls and carotenoids and compared them between the samples of dry and wet thalli. We have also tested the differences in the
concentration of chlorophyll a and b and carotenoids between dry and wet lichen thalli, trying to determine the correlation between the colour reflectance spectral bands and biochemical parameters. The results have shown that the reflectance spectra of wet thalli have all the typical characteristics of a healthy active thalli, while the reflectance spectra of the dry thalli gradually rise to the NIR spectrum and then decline. The reflectance spectra of the wet thalli have a relatively low reflectance in the UV range.
Its highest point is in the green belt at 560 nm. We have found that the dry and wet samples of thalli were statistically significantly different in the concentration of
chlorophyll a and carotenoids. The relationship between the colour reflectance spectral bands and the biochemical properties have not been proved. We have only been able to prove the influence of chlorophyll a and carotenoids on the NIR spectra in wet lichens.
V KAZALO VSEBINE
1. UVOD ... 1
1.1 Hipoteze... 2
2. Pregled objav ... 3
2.1 Biokemijske značilnosti ... 4
2.1.1 Barvila ... 4
2.1.2 Klorofil ... 4
... 5
2.1.3 Karotenoidi ... 6
2.2 Anatomske in morfološke značilnosti ... 8
2.3 Vsebnost vode ... 10
3. Materiali in metode ... 11
3.1 Območje raziskav ... 11
3.2 Predmet raziskav ... 11
3.2.1 Navadni rogovilar – Pseudevernia furfuracea ... 11
3.3 Metode dela ... 12
3.3.1 Merjenje odbojnih spektrov ... 12
3.3.2 Specifična listna površina in vsebnost vode ... 12
3.3.3 Biokemijske analize... 13
4. REZULTATI ... 14
4.1 Primerjava odbojnosti vlažne in suhe steljke lišaja NAVADNI ROGOVILAR (pseudevernia furfuracea) ... 14
4.2 Vsebnost pigmentov v vlažnih in v suhih steljkah lišaja ... 16
4.3 UGOTAVLJANJE POVEZANOSTI MED BARVNIMI PASOVI ODBOJNIH SPEKTROV IN BIOKEMIJSKIMI PARAMETRI ... 18
5. Razprava ... 19
5.1 Primerjava odbojnosti steljk glede na vsebnost vode: ... 19
5.3 Primerjava korelacijskih analiz barvnih pasov glede na vsebnost vode: ... 19
6. Sklep ... 21
7. Povzetek ... 22
8. Viri in literatura ... 23
8.1 VIRI IN LITERATURA VSEBINE ... 23
8.2 VIRI SLIK ... 24
VI KAZALO SLIK
Slika 1: Strukturni formuli klorofila a in klorofila b ... 5
Slika 2: Strukturne formule karotenoidov (likoprena, astaksantina, zeaksantina in luteina) ... 6
Slika 3: Navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea) ... 11
Slika 4: Odbojna spektra suhih in vlažnih steljk lišaja Pseudevernia furfuracea; n=10. ... 14
Slika 5: Testiranje razlik vsebnosti klorofila a med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea; n=10. ... 16
Slika 6: Testiranje razlik vsebnosti klorofila b med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfurace; n=10. ... 16
Slika 7: Testiranje razlik vsebnosti karotenoidov med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea; n=10. ... 17
VII KAZALO TABEL
Tabela 1: Vrednosti korelacijskih koeficientov med barvnimi pasovi, ki kažejo povezanost odbojnih spektrov in biokemijskih parametrov suhih steljk, in vsebnostjo pigmentov. ... 18 Tabela 2: Vrednosti korelacijskih koeficientov med barvnimi pasovi, ki kažejo povezanost odbojnih spektrov in biokemijskih parametrov vlažnih steljk, in vsebnostjo pigmentov. ... 18
VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
E470, E530, E645, E662 ekstinkcije pri danih valovnih dolžinah
Kar karotenoidi
Kl a, Kl b klorofil a, klorofil b
NIR bližnje infrardeče sevanje (700 – 1400 nm)
Ρ Spearmanov korelacijski koeficient
SLA specifična listna površina
ss suha masa
t-test dvosmerni Studentov T - test
UV ultravijolično sevanje (100 – 400 nm)
UV-A ultravijolični del spektra z valovno dolžino 320-400 nm UV-B ultravijolični del spektra z valovno dolžino 280-320 nm
1
1. UVOD
Optične lastnosti listov in drugih rastlinskih delov opišemo z odbojnostjo, presevnostjo in absorpcijo. Najbolj proučevani so spektri odbojnosti in presevnosti. Odbojnost svetlobe je odvisna od anatomskih, morfoloških in biokemijskih značilnosti tkiva (Liew in sod., 2008; Underwood in sod., 2007).
Raziskave odbojnih spektrov, presevnosti in absorpcije so omogočile natančnejše razumevanje fizioloških odzivov rastlin na razmere v katerih rastejo in prilagoditve teh rastlin na okoljske razmere.
Odbojna spektroskopija nam omogoča tudi sledenje vsebnosti barvil, kot so klorofili in karotenoidi (Levizou in sod., 2005; Liew in sod., 2008). Karotenoidi in klorofili so glavni pigmenti zelenih listov. Na odbojne lastnosti v območju 400 – 700 nm najbolj vplivajo fotosintezni pigmenti in antociani. Poleg pigmentov na odbojnost in presevnost vpliva tudi vsebnost proteinov, škroba, voskov, lignina, celuloze ter vode v rastlini (Daughtry in Walthall, 1998; Underwood in sod. 2007). Podobno informacijo pa lahko dobimo tudi z merjenjem optičnih lastnosti lišajskih steljk.
Sončevo sevanje vpliva skoraj na vsak vidik živega in neživega okolja na Zemlji in blizu zemeljskega površja. Stopnja UV-B sevanja se zaradi tanjšanja ozonske plasti povečuje.
Optične lastnosti rastlin nam omogočajo boljše razumevanje, kako UV-B sevanje vpliva na rastlino (Qi in sod., 2002).
Spektre lahko merimo neposredno in z daljinskim zaznavanjem, ki je tudi eden izmed načinov raziskave optičnih lastnosti rastlin (Chanrash, 2005) in tudi lišajev.
Navadni rogovilar ali Pseudevernia furfuracea je lišaj, ki raste na lubju jelke in bora.
Uvrščamo ga v družino Parmeliaceae. Steljka lišaja je listasta ali grmičasta. Na substrat se pritrjuje s koreninskimi hifami, lahko pa je tudi prirasla. Lišaj je občutljiv na onesnaževanje zraka.
2
V diplomski nalogi smo proučevali odbojne spektre vzorcev steljk lišaja navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea). Spektre smo merili pri svežih (vlažnih) in suhih lišajih. Odbojne spektre steljk smo med seboj primerjali. Da bi ugotovili vsebnost fotobiontov (zelenih alg), smo merili vsebnost klorofilov in karotenoidov v posameznem vzorcu. Količina barvil se lahko spreminja na stanje steljke in razmere v katerih živi. Med seboj smo primerjali vsebnosti teh pigmentov v suhih steljkah in vlažnih steljkah.
1.1 HIPOTEZE
• Spektri odbojnosti lišaja bodo odvisni od vsebnosti klorofila, ki je v posameznem vzorcu
• Predvidevamo, da se bodo odbojni spektri suhih in vlažnih steljk lišaja med seboj razlikovali, kot posledica sprememb v biokemijskih lastnostih
3
2. PREGLED OBJAV
Lišaji so velika skupina organizmov. Predstavljajo simbiotični organizem, ki je sestavljen iz gliv (mikobiontov) in alg (fikobiontov) ali cianobakterij. Če lišaj prerežemo in pogledamo pod mikroskopom vidimo, da so zgrajeni iz prepleta hif in celic alg oziroma cianobakterij. Gliva poskrbi, da alga dobi vodo in mineralne snovi, ki jih pridobi iz substrata, alge oziroma cianobakterije pa s procesom fotosinteze proizvajajo organske snovi. Razmnoževanje pri lišajih je različno. Lahko se razmnožujejo s sporami (spolno), kakor se razmnožujejo glive, ali pa vegetativno s soraliji – mesta, kjer se tvorijo soridji, kar je značilno za alge, pri katerem iz vsakega koščka steljke zraste lišaj (The Science of Biology, eight edition). Razširjeni so po vsem svetu in živijo tam, kjer druge rastline ne morejo živeti, kot na primer na strmih stenah gora ali betonskem zidu. S steljko, ki je prilegla na podlago, izboljšujejo razmere in se zato tam naseljujejo tudi druge rastline. Ko lišaji odmrejo, za njimi ostanejo organske snovi, na katero se lahko naselijo mahovi, kasneje pa tudi praprotnice in semenke.
Lišaje delimo glede na obliko steljke na skorjaste, listaste in grmičaste lišaje. Skorjasti lišaji so običajno v zelo tesnem stiku s substratom, da se jih komaj loči od njega. Listasti lišaji so vmesna oblika med skorjastimi in grmičastimi lišaji. Steljka leži na podlagi in je na več krajih pritrjena nanjo. Nekateri največji listasti lišaji lahko zrastejo 0,3 m ali več v premeru. Grmičasti lišaji so s posebnimi ploščami pritrjeni na podlago. Njihova steljka je zelo razrasla in ima zato največ stika z zrakom (Boedijin, 1978)
Lišaji imajo pomembne vloge tako v ekosistemih, kot tudi za ljudi. So primarni producenti, sodelujejo pri nastajanju tal, zadržujejo vodo in hranila ter tvorijo mikrohabitate za nevretenčarje. Za človeka so pomembni kot hrana, krma (pri severnih jelenih), uporabljamo jih kot barvila za tekstil in kot surovine za parfume in fitofarmacevtska sredstva. Njihova pomembnejša vloga pa je bioindikacija stanja okolja.
Lišaji so zelo občutljivi in uspevajo le tam, kjer je zrak čist, zato jim pravimo, da so bioindikatroji. Bioindikatroji so organizmi, ki jih uporabljamo za določitev stanja nekega ekosistema. S svojo številčnostjo, fiziološkim stanjem in vedenjem odražajo stanje ali spremembo v okolju, v katerem se organizem nahaja. So naravni pokazatelji območja čistega zraku. Občutljivost lišajev na onesnažen zrak je povezana z rastno obliko njihove steljke. Najmanj občutljivi lišaji so skorjasti, sledijo jim listast, najbolj občutljivi pa so grmičasti lišaji (Hale, 1970).
4 2.1 BIOKEMIJSKE ZNAČILNOSTI
2.1.1 Barvila
Med fotosintezne ali asimilacijske pigmente spadajo klorofili, karotenoidi in fikobilini. V listih zelenih rastlin najdemo barvila, ki absorbirajo svetlobo v ultravijoličnem in vidnem delu spektra, čemur lahko pripišemo zmanjšano odbojnost v teh območjih (Woolley, 1971). Barvila v lišajih pa so odvisna od vrste fikobionta.
Cianobakterije (modrozelene alge) in rdeče alge vsebujejo visoke koncentracije fotosinteznih pigmentov, ki imajo svetlobno aktivnost v območju med 400 in 650 nm (Glazer, 1977).
Cianobakterije so dobile ime po modrikastem pigmentu, ki ga uporabljajo za fotosintezo (Life History and Ecology, 2015). Prav tako vsebujejo fotosintezni pigment klorofil a, in druga fotosintezna barvila, kot na primer fikocian in fikoeritrin. Ta barvila prevladujejo, zato so kolonije pogosto obarvane zeleno, modrozeleno, rdeče, vijoličasto ali celo v nekaterih primerih črno (Wikipedia, 2015). Zelene alge pa vsebujejo predvsem klorofil a in klorofil b (Wikipedia, 2015), kar daje značilno zeleno obarvanje.
2.1.2 Klorofil
Klorofil a je zeleno barvilo, ki ga najdemo v rastlinah, algah in tudi modrozelenih cepljivkah. Kemijsko so sestavljeni iz tetrapirolovega obroča s centralno vezanim atomom magnezija, na katerega je zaestren hidrofobni fitolni rep (Liew in sod., 2008;
Taiz in Zeiger, 2002). V rastlinah vedno prevladuje klorofil a, klorofil b pa je pomožno barvilo, ki zavzema le približno eno tretjino skupne vsebnosti klorofilov v rastlinah (Liew in sod., 2008; Taiz in Zeiger, 2002). Klorofil a ima vezano metilno skupino, medtem ko ima klorofil b vezano aldehidno skupino (Liew in sod., 2008). Klorofili imajo značilna vrhova absorpcije v modrem in rdečem pasu (Qi in sod., 2003), klorofil a pri 430 in 670 nm, klorofil b pri 460 in 650 nm (Underwood in sod., 2007), ter absorpcijski minimum v zelenem pasu (500 – 600 nm), z vrhom pri 550 nm (Liew in sod., 2008). Absorpcijski spekter obeh klorofilov se razteza v UV- A in UV-B območje spektra (Taiz in Zeiger, 2002). Fotosintezna barvila zato vplivajo tudi na odbojnost in presevnost steljk v UV območju in s tem prispevajo k zaščiti steljke pred UV sevanjem (Yoshimura in sod., 2010).
5 Slika 1: Strukturni formuli klorofila a in klorofila b
6 2.1.3 Karotenoidi
Druga skupina asimilacijskih barvil so karotenoidi. Najdemo jih v kloroplastih. Kemijsko se razlikujejo od klorofilov, saj so tetraterpeni, ki absorbirajo v modrem delu spektra, od 400 nm do 500 nm. So pomožna barvila, ki sprejemajo energijo v obliki svetlobe in jo prenašajo na klorofil a. Karotenoide delimo na karotene in ksantofile. Glavni in najpogostejši karotenoidi v funkcionalnih kloroplastih so beta karoteni, lutein, neoksantin in violaksantin (Yoshimura, 2001). Karotenoidi pomagajo pri zaščiti pred UV-B sevanjem, ker zmanjšujejo vpliv aktivnih kisikovih spojin (Filella in Peñuelas, 1999).
Slika 2: Strukturne formule karotenoidov (likoprena, astaksantina, zeaksantina in luteina)
7
Karotenoidi in klorofili so glavni pigmenti zelenih listov. Karotenoide ponavadi zastopajo karoteni in ksantofili (lutein, ksantin), ki kažejo močno absorpcijo svetlobe v modrem območju spektra. Več specifičnih funkcij je bilo pripisanih karotenoidom, zaradi njihove edinstvene fizikalno-kemične in fotokemične funkcije: strukturna vloga, vpliv na organizacijo fotosintezne membrane ter prenosa energije. Spremembe koncentracije karotenoidov v rastlini in njihov delež glede na klorofil, se pogosto uporabljajo za diagnosticiranje fiziološkega stanja rastlin med samim razvojem, aklimatizacije in prilagajanje na okoljske spremembe in stres (Gitelson, 2002).
V zadnjem desetletju, so izvedli veliko študij in poskusov razvoja nedestruktivne tehnike za vsebnost karotenoidov v rastlini. Odbojni indeksi, izračunani na podlagi odbojnih spektrov, odražajo na razmerje med karotenoidi in klorofili (Gitelson, 2002).
Analiza koeficientov odbojnih spektrov od rumene do temno zelene, omogoča oceno različnih vidikov od senescence do vsebnosti barvil.
V poskusih, kjer so želeli dobiti spektralne pasove, ki so maksimalno občutljivi na karotenoide v zelenih listih, je Zur et. al. (2002) predlagal normiranje absorbance spektra listov v rdečem delu spektra glede na absorbanco klorofila pri 678 nm. Analize so pokazale, da tudi klorofili bistveno prispevajo k absorbanci in odbojnosti v območju od 510 do 520 nm.
Absorpcija klorofilov v območju 470 do 500 nm je pokazala, da je tesna povezava med odbojnostjo in koncentracijo klorofilov.
Odbojnost v območju med 510 in 550 nm, je v linearni korelaciji z vsemi pigmenti, ki jih vsebuje rastlina. Največja občutljivost na karotenoide je v območju 510 nm, čeprav tudi klorofili vplivajo na odbojnost v tem spektralnem območju (Gitelson, 2002).
8
2.2 ANATOMSKE IN MORFOLOŠKE ZNAČILNOSTI
Sončevo sevanje vpliva skoraj na vsak vidik življenja na Zemlji in blizu zemeljskega površja. Njegove interakcije z atmosfero in vodo ustvarjajo podnebni sistem. Enako pomembna komponenta, ki vpliva na podnebni sistem, je interakcija sončne svetlobe z vegetacijo. Poleg očitnega pomena za kmetijstvo, vrtnarstvo in gozdarstvo, je razumevanje optičnih odzivov rastlin v vidnem in IR spektru izredno pomembno za daljinsko zaznavanje (vidno in IR svetlobo) in tudi natančno modeliranje učinka vegetacije na globalno segrevanje in ogljikov cikel. Ravno daljinsko zaznavanje je eden izmed glavnih razlogov za nadaljnje zanimanje in raziskave optičnih lastnosti rastlin (Chanrash, 2005).
Merjenje optičnih lastnosti je uporabno pri določanju biokemijskih lastnosti. Poznavanje biokemijskih lastnosti je nujno potrebno za razumevanje odbojnosti in presevnosti rastlin.
Različni pigmenti, ki so podlaga za različne barve, so dobro raziskani (Ustin, 2001).
Poleg biokemijskih lastnosti, na optične lastnosti rastlin, še posebej v bližnji IR svetlobi, vpliva struktura listov. Razne študije, ki dokazujejo biokemijske lastnosti na optični odziv rastlin, večinoma ne vključujejo študij strukturnih interakcij s sevanjem. Ta vidik je pomemben z vidika daljinskega zaznavanja in tudi boljše razumevanje transporta fotonov preko listov (Chanrash, 2005).
Optične lastnosti vplivajo na razpoložljivost fotosintezno aktivnega sevanja na celičnem nivoju in na prodiranje svetlobe skozi rastlino.
Optične lastnosti rastlin omogočajo tudi različne ocene stanja rastlin. S to metodo lahko proučujemo tudi dejavnike stresa, kot je izpostavljenost zračnim onesnaževalom (Carter et al., 1992, 1995), povišanim temperaturam in CO2 (Carter et al., 2000), težkim kovinam (Schwaller et al., 1983), UV-B sevanju (Bornman in Vogelmann, 1991) in drugim abiotskim dejavnikom, kot je suša in pomanjkanje hranil (Carter e tal., 1989; Carter, 1993, 1994; Zhao e tal., 2003).
Nekaj raziskav pa poroča tudi med optičnimi odzivi v povezavi s kemično sestavo v rastlini.
Odbojnost je obratno povezana z absorbanco, posledično je povezana tudi s kemično sestavo listov in njihovo koncentracijo. Razvitih je bilo več indeksov odbojnosti za ocenjevanje količine klorofila in razmerja med klorofili in karotenoidi (Blackburn, 1999;
9
Gitelson in Merzlyak, 1994; Penuelas in Filella, 1998; Sims in Gamon, 2002; Richardson et al., 2002), pa tudi dušika (Filella in Penuelas, 1994), ksantofilov in drugih karotenoidov (Gamon et al, 1997;. Gitelson et al., 2002).
Reflektanca in transmitanca vzorcev v vidnem območju je odvisna predvsem od koncentracije prisotnih klorofilov (Vogelmann, 1993).
Koncentracija klorofila je povezana s svetlobo na rastišču (Björkman, 1981; Givnish, 1988). Svetloba je najbolj vpliven dejavnik in primarno vpliva na funkcijo spreminjanja koncentracije pigmentov. Koncentracija klorofila je tudi glavni dejavnik, ki vpliva na absorpcijo (Baltzer, 2005).
Optične lastnosti odražajo tudi koncentracije karotenoidov in prispevajo k razlagi variabilnosti absorpcije in odbojnosti.
Tudi razmerje med karotenoidi in klorofili se zmanjšuje z zmanjševanjem jakosti svetlobe (Levizou, 2007). Razmerje klorofilov a in b je v senci nizko (Anderson, 1986).
Aklimatizacija na svetlobo povzroči tudi povečanje debeline kutikule, katere primarna funkcija je preprečevanje izgube vode (pregledni članek Grace and van Gardingen, 1996).
Spremembe, kot je povečanje debeline kutikule, lahko spremenijo vzorce odbojnosti (Grant et al, 1993;. Barnes in Cardosa-Vilhena, 1996).
Raziskave kažejo, da so optični parametri, poleg svetlobe, tudi pod velikim vplivom vsebnosti hranilnih snovi, kar pomeni, da so spremembe v razpoložljivosti hranil predvsem rezultat spremenjene koncentracije pigmentov (Gitelson et al., 2002).
Razne študije so pokazale, da se rastlina odzove na stres s povečano odbojnostjo (Bornman and Vogelmann, 1991; Carter, 1993; Carter et al., 1995, 2000) v zelenem spektru (okrog 550 nm) in v rdečem spektru (okrog 700 nm).
Reflektanca karotenoidov in klorofilov se prekriva v območju modre. Prav zaradi tega, je težko razlikovati med njimi s tehnikami daljinskega zaznavanja. Reflektanca je za klorofil pri 678 nm, s pomembnim vrhom pri 520 nm,. Karotenoidi močno absorbirajo v modrem delu spektra (Palett in Young, 1993) v območju med 500 nm in 520 nm (Gitelson e tal., 1966; Zur e tal., 2000).
10 2.3 VSEBNOST VODE
Odbojnost pri suhih vzorcih je načeloma nekoliko večja, kot pri odbojnosti vlažnih (svežih) vzorcev na vseh valovnih dolžinah. (Woolley, 1971).
Značilna odbojnostna krivulja suhih listov v infrardečem delu spektra je precej drugačna od tiste pri vlažnih (svežih) listih. (Woolley, 1971).
11 3.
MATERIALI IN METODE
3.1 OBMOČJE RAZISKAV
Rastline so bile nabrane na smrekah na pobočju Komna v Smrekovškem pogorju.
Laboratorijsko delo je potekalo v laboratoriju na Biološkem središču, od 3.11.2014 do 7.4.2015. Merili smo spektre odbojnosti in vsebnost klorofilov ter karotenoidov steljk lišaja Pseudevernia furfuracea. Meritve smo izvajali na desetih paralelkah z oznakami od 1 do 10.
3.2 PREDMET RAZISKAV
3.2.1 Navadni rogovilar – Pseudevernia furfuracea
Proučevali smo lišaj navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea) (Slika 3)
Navadni rogovilar je lišaj, ki je splošno znano kot »tree moss«, raste na lubju jelke in bora. Uvrščamo ga v družino Parmeliaceae. Steljka je listasta in ležeča ali pa je grmičasta in pokončna. Na substrat se pritrjuje s koreninskimi hifami, lahko pa je tudi prirasla.
Običajno raste na ležečih vejah ali deblih, včasih pa tudi na skalah in na zemlji. Vlago, ki jo potrebuje za svojo rast, dobi iz zraka. Navadni rogovilarji živijo zelo dolgo, dokler jih ne ovirajo druga živa bitja ali pa jih uniči ogenj, saj so zelo vnetljivi organizmi. Po uničenju se težko opomorejo. Sam lišaj je precej občutljiv na onesnaževanje zraka, njegova prisotnost ponavadi kaže dobre pogoje zraka. Je pomemben tudi za ljudi, saj ga uporabljajo za parfume, balzamiranje in v medicini. Veliko količino drevesnega mahu,
»tree moss«, obdelajo v Franciji v industriji parfumov, za balzamiranje so ga uporabljajo stari Egipčani, v medicini pa ga uporabljajo za respiratorna obolenja (Wikipedia, 13.4.2015).
Slika 3: Navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea)
12 3.3 METODE DELA
3.3.1 Merjenje odbojnih spektrov
Odbojne spektre smo merili s pomočjo spektrofotometra Jaz Modular Optical Sensing Suite (Ocean Optics, Inc., Dunedin, Florida, USA). Kot svetlobni vir smo uporabili lučko UV-VIS-NIR (DH-2000, Ocean Optics, Inc., Florida, USA), ki smo jo preko optičnega kabla QP600-1-SR-BX (Ocean Optics, Inc., Dunedin, Florida, USA) povezali s sfero IPS- 30-6-P (Ocean Optics, Inc., Florida, USA), ki smo jo pri merjenju pravokotno postavili na površino vsakega posameznega vzorca lišaja. To sfero smo z drugim optičnim kablom povezali s spektrofotometrom. Spektrofotometer pa smo povezali z računalnikom.
Svetlobo smo najprej standardizirali s pomočjo bele ploščice (Ocean Optics, Inc., Florida, USA), tako smo izmerili referenčni spekter in umerili instrument na 100% odbojnost.
Kontrolo smo naredili tako, da smo vir svetlobe izključili in pomerili. Meritve smo nato začeli izvajati na desetih vzorcih suhih in desetih vzorcih vlažnih steljk lišaja Pseudevernia furfuracea. Odbojne spektre smo merili tako, da smo najprej posamezen vzorec potopili v destilirano vodo, ga rahlo obrisali s papirnato brisačo in sfero s svetlobnim žarkom položili na zgornjo ploskev vzorca. Pomerili smo tudi spektre brez dovajanja svetlobe. Izmerjene spektre smo obdelali v programu Spectra Suite (Ocean Optics, Inc., Florida, USA) na računalniku. Spektri so bili izračunani kot razmerje med izmerjenim in referenčnim spektrom. Za lažjo obdelavo podatkov smo spektre razdelili na barvne pasove: UV-B, UV-A, vijolično, modro, zeleno, rumeno, rdeče in NIR območje.
3.3.2 Specifična listna površina in vsebnost vode
Iz vseh vzorcev tako suhih, kot vlažnih (svežih), smo naluknjali krožce s premerom 9 mm. Te krožce smo pozneje potrebovali pri biokemijskih raziskavah za merjenje vsebnosti klorofilov in karotenoidov v posameznih vzorcih. Sveže krožce smo stehtali z miligramsko tehtnico Sartorius in jih nato 24 ur sušili v sušilniku Sterimatic ST-11.
Določili smo suho maso posameznih krožcev, preračunali vsebnost vode [%] in specifično listo površino vzorca (SLA), ki smo jo izračunali kot količnik med suho maso in površino posameznih vzorcev.
13 3.3.3 Biokemijske analize
3.3.3.1 Klorofili in karotenoidi
Vsebnost klorofilov a in b ter karotenoidov smo določali po metodi Lichtenthaler in Buschmann (2001a, 2001b). Vzorce smo strli v terilnici in ekstrahirali z 10mL acetona (100% (v/v)) ter prelili v plastično epruveto. Vzorec v epruveti smo centrifugirali pri 4000 rpm, 4°C, 4 minute v centrifugirkah za klorofil. Po končanem centrifugiranju smo odčitali prostornino ekstraktov. Ekstrakcije smo zmerili z VIS spektrofotometrom pri valovnih dolžinah 470 nm, 645 nm in 662 nm.
Za izračun si bomo pomagali s formulami:
Kl a[mg g⁻¹ss; mg dm⁻²] = ca * V * 10-3 * ss-1; ca * V * 10-3 * P-1 Kl b [mg g⁻¹ss; mg dm⁻²] = cb * V * 10-3 * ss-1; cb * V * 10-3 * P-1
Kar [mg g-1 ss; mg cm-2] = c(x+c) * V * 10-3 * ss-1; c(x+c) * V * 10-3 * P-1 c(x+c) = (1000 E470 - 1,9 ca - 63,14 cb) / 214
ca - koncentracija klorofila a (11,24 E662-2,04 E645); cb - koncentracija klorofila b (20,13 E645-4,19 E662); E - absorpcija pri izbrani valovni dolžini; V - prostornina ekstrakta [ml]; ss - suha masa vzorca [g]; P - površina vzorca [cm²]
3.3.3.2 Statistična obdelava podatkov
Pridobljene podatke – vrednosti odbojnih spektrov suhih vzorcev in vlažnih vzorcev lišaja, smo vstavili v računalniški program Excel in izračunali povprečja in standardne deviacije. Značilnosti razlik, med suhimi in vlažnimi vzorci lišaja, smo določili s Studentovim t-testom.
Iz pridobljenih podatkov smo izračunali tudi barvne pasove, ki smo jih razdelili na posamezna območja: UV-B (280 – 319,95 nm), UV-A (320 – 399,73 nm), vijolična (400 – 454,94 nm), modro (455 – 499,88 nm), zeleno (500 – 79,74 nm), rumeno (580 – 619,86 nm), rdečo (620 – 699,94 nm) in NIR (700 – 887,19 nm). Povezanost med barvnimi pasovi in biokemijskimi parametri smo ugotavljali z izračunom Spearmanovega korelacijskega koeficienta. Analize smo naredili posebej za suhe vzorce lišaja in za vlažne vzorce lišaja.
14
4. REZULTATI
4.1 PRIMERJAVA ODBOJNOSTI VLAŽNE IN SUHE STELJKE LIŠAJA NAVADNI ROGOVILAR (PSEUDEVERNIA FURFURACEA)
Slika 4 prikazuje odbojna spektra suhih in vlažnih steljk lišaja navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea).
Odbojnost vlažne steljke je nizka v UV B (280 – 320 nm) in UV A (320 – 400 nm) območju. Prvi večji vrh doseže v vidnem območju, v pasu vijolične pri približno 400 nm in v pasu zelene pri približno 560 nm. Relativno visoka odbojnost je v NIR delu spektra (700 – 887 nm), kjer doseže vrh pri približno 720 nm. Manjši padec je v vidnem območju v pasu modre pri približno 500 nm, drugi večji padec pa v pasu rdeče pri približno 680 nm, na kar je vplivala vsebnost klorofilov.
Pri suhih steljkah lišaja relativna odbojnost steljk narašča od 280 nm vse do približno 800 nm, v območju 800 – 880 nm pa relativna odbojnost strmo upada.
Slika 4: Odbojna spektra suhih in vlažnih steljk lišaja Pseudevernia furfuracea; n=10.
15
Rezultati opravljene analize odbojnosti kažejo, da so spektralna območja le delno povezana z biokemijskimi lastnostmi.
16
4.2 VSEBNOST PIGMENTOV V VLAŽNIH IN V SUHIH STELJKAH LIŠAJA
Slika 5 kaže primerjavo razlik vsebnosti klorofila a med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea. Suhi in vlažni vzorci se med seboj značilno razlikujejo (p=0,00).
Slika 6: Testiranje razlik vsebnosti klorofila b med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfurace;
n=10.
Slika 6 kaže primerjavo razlik vsebnosti klorofila b med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea. Suhi in vlažni vzorci se med seboj ne razlikujejo (p=0,70).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
SUHI VLAŽNI
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
SUHI VLAŽNI
Slika 5: Testiranje razlik vsebnosti klorofila a med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea; n=10.
17
Slika 7: Testiranje razlik vsebnosti karotenoidov med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea; n=10.
Slika 7 kaže primerjavo razlik vsebnosti karotenoidov med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea. Suhi in vlažni vzorci se med seboj značilno razlikujejo (p=0,00).
0,0 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3
SUHI VLAŽNI
18
4.3 UGOTAVLJANJE POVEZANOSTI MED BARVNIMI PASOVI ODBOJNIH SPEKTROV IN BIOKEMIJSKIMI PARAMETRI
Tabela 1: Vrednosti korelacijskih koeficientov med barvnimi pasovi, ki kažejo povezanost odbojnih spektrov in biokemijskih parametrov suhih steljk, in vsebnostjo pigmentov.
UVB UVA VIJ MODRA ZELENA RUMENA RDEČA NIR
Kl a -,317 -,236 ,127 ,200 -,091 -,333 -,164 ,100
KL b -,200 -,212 -,042 ,115 -,018 -,115 -,491 -,600
Kar -,498 -,394 -,067 ,139 ,103 -,224 ,248 ,400
V tabeli 1 so predstavljene vrednosti korelacijskih koeficientov med barvnimi pasovi in biokemijskimi parametri (vsebnostjo pigmentov) suhih steljk. Značilne povezanosti med parametri nismo določili.
Tabela 2: Vrednosti korelacijskih koeficientov med barvnimi pasovi, ki kažejo povezanost odbojnih spektrov in biokemijskih parametrov vlažnih steljk, in vsebnostjo pigmentov.
UVB UVA VIJ MODRA ZELENA RUMENA RDECA NIR
Kl a ,365 ,382 ,309 ,333 ,552 ,394 ,358 ,867**
KL b ,353 ,358 ,321 ,418 ,321 ,394 ,612 ,467
Kar ,207 ,139 ,212 ,164 ,430 ,176 ,006 ,745*
V tabeli 2 so predstavljene vrednosti korelacijskih koeficientov, ki kažejo povezanost med barvnimi pasovi odbojnih spektrov in biokemijskimi parametri (vsebnostjo pigmentov) vlažnih steljk.
Vidna je samo pozitivna korelacija v NIR območju v tabeli 2, pri vlažnih lišajih - med NIR in klorofilom a ter med NIR in karotenoidi.
19
5. RAZPRAVA
V diplomski nalogi smo proučevali razlike odbojnih spektrov med vlažnimi in suhimi vzorci steljk lišaja navadnega rogovilarja (Pseudevernia furfuracea). Merili smo tudi vsebnost klorofilov in karotenoidov ter primerjali vzorce suhih in vlažnih steljk.
Potrdili smo, da so razlike v vsebnosti različnih pigmentov.
5.1 PRIMERJAVA ODBOJNOSTI STELJK GLEDE NA VSEBNOST VODE:
Spektri odbojnosti se med steljkami lišaja glede na vsebnost vode razlikujejo. Odbojnost je relativno nizka, tako pri suhih steljkah kot pri vlažnih, v UV-B (280 – 320 nm) in UV- A (320 -400 nm) območju. Pri vrh se pokaže pri vlažnih steljkah v območju vijolične, pri približno 400 nm. V pasu modre je manjši padec pri približno 500 nm, kar pripisujemo vsebnosti klorofilom. V pasu zelene prav tako opazimo vrh, ki ga doseže pri približno 560 nm. V pasu zelene je odbojnost velika, kar je posledica tudi tega, da vidimo rastline zelene barve. Ponovni padec je v pasu rdeče, pri približno 680 nm, na kar je zopet vplivala vsebnost klorofilov. Vidi se, da karotenoidi močno absorbirajo svetlobo v modrem delu spektra (Palett in Young, 1993), še posebej v območju med 500 nm in 520 nm (Gitelson e tal., 1966; Zur e tal., 2000).
Pri suhih steljkah vrednosti odbojnosti postopno naraščajo od UV-B, vse do pasu rdeče, v NIR pasu pa odbojnost strmo pada.
Testirali smo tudi razlike v vsebnosti klorofila a in b ter karotenoidov med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea. Suhi in vlažni vzorci so se med seboj značilno razlikovali pri testiranju razlik v vsebnosti klorofila a (p=0,00) in v vsebnosti karotenoidov (p=0,00). Pri testiranju razlik v vsebnosti klorofila b, se suhi in vlažni vzorci steljk med seboj ne razlikujejo (p=0,70).
5.3 PRIMERJAVA KORELACIJSKIH ANALIZ BARVNIH PASOV GLEDE NA VSEBNOST VODE:
Ugotavljali smo tudi povezanost med barvnimi pasovi odbojnih spektrov (UV - B, UV - A, vijolična, modra, zelena, rumena, rdeča in NIR) in biokemijskimi parametri. Rezultati opravljene analize niso pokazali povezanosti spektralnih območji z biokemijskimi lastnostmi lišaja pri suhih steljkah. Pri vlažnih steljkah smo značilno korelacijo dobili med odbojnimi spektri v NIR in klorofilom a ter karotenoidi.
20
Odsotnost povezanosti med spektri suhih in vlažnih steljk lišaja navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea), je posledica majhnega števila vzorcev. Za dokaz povezanosti spektrov in biokemijskih lastnosti lišajev so potrebne nadaljnje raziskave.
21
6. SKLEP
Spektri odbojnosti vlažnih steljk imajo tipične značilnosti zdravih aktivnih steljk, medtem ko spektri odbojnosti suhih steljk postopno naraščajo do NIR spektra in potem upadejo.
Suhi in vlažni vzorci steljk lišaja navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea) so bili statistično značilno različni v vsebnosti klorofila a in karotenoidov.
Korelacij med barvnimi pasovi, ki kažejo povezanost odbojnih spektrov in biokemijskih parametrov suhih in vlažnih steljk, in vsebnostjo pigmentov, nismo dokazali. Dokazali smo le vpliv v NIR delu spektra pri vlažnih lišajih - med NIR in klorofilom a ter med NIR in karotenoidi.
Odsotnost povezanosti med spektri suhih in vlažnih steljk lišaja navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea), je posledica majhnega števila vzorcev. Za dokaz povezanosti spektrov in biokemijskih lastnosti lišajev so potrebne nadaljnje raziskave.
22
7. POVZETEK
V diplomski nalogi smo proučevali razlike odbojnih spektrov med različnimi vzorci steljk lišaja navadnega rogovilarja (Pseudevernia furfuracea). Primerjali smo spektre odbojnosti suhih steljk lišaja in vzorce vlažnih steljk lišaja. Merili smo tudi vsebnost klorofilov in karotenoidov ter jih primerjali med vzorci suhih in vlažnih steljk.
Delo je potekalo v laboratoriju na katedri za ekologijo in varstvo okolja v Biološkem središču Biotehniške fakultete. Izbrali smo deset vzorcev suhih steljk in deset vzorcev vlažnih steljk, na katerih smo opravili meritve odbojnosti v območju od 280 do 880 nm.
Odbojnost smo merili na zgornjem delu steljk. Določili smo tudi vsebnost pigmentov – klorofila a, klorofila b in karotenoidov.
Spektri odbojnosti vlažnih steljk so pokazali tipične značilnosti zdravih aktivnih steljk, medtem ko spektri odbojnosti suhih steljk postopno naraščajo do NIR spektra in potem upadejo. Vzrok je predvsem v nizki vsebnosti vode v steljkah. Odbojni spektri vlažnih steljk imajo relativno nizko odbojnost v UV območju (280 – 400 nm) in v vidnem območju (400 – 700 nm). Vrh je v zelenem pasu pri 560 nm. Največja odbojnost je v NIR območju (700 – 887 nm).
Testirali smo tudi razlike v vsebnosti klorofila a in b ter karotenoidov med suhimi in vlažnimi steljkami lišaja Pseudevernia furfuracea. Ugotovili smo, da so bili suhi in vlažni vzorci steljk lišaja navadni rogovilar (Pseudevernia furfuracea) statistično značilno različni v vsebnosti klorofila a (p=0,00) in karotenoidov (p=0,00).
Ugotavljali smo povezanost med barvnimi pasovi odbojnih spektrov (UV - B, UV - A, vijolična, modra, zelena, rumena, rdeča in NIR) in biokemijskimi parametri. Povezanost med barvnimi pasovi in biokemijskimi parametri suhih in vlažnih steljk, nismo dokazali.
Dokazali smo le vpliv klorofila a in karotenoidov v NIR delu spektra pri vlažnih lišajih.
23
8. VIRI IN LITERATURA
8.1 VIRI IN LITERATURA VSEBINE
Alge. (n.d.). Retrieved July 31, 2015, from https://sl.wikipedia.org/wiki/Alge
Baltzer J.L., Thomas S.C. 2005. Leaf optical responses to light and soil nutrient availability in temperate deciduous trees. American journal of botany, 92, 2: 214- 223
Carter G.A., Knapp A.K. 2001. Leaf optical properties in higher plants: Linking spectral characteristics to stress and chlorophyll concentration. American Journal of Botany, 88, 4: 677 – 684
Chandrasekharan R.2005. Optical properties of leaves. 13. dec 2005
Cyanobacteria: Life History and Ecology. (n.d.). Retrieved July 28, 2015, from http://www.ucmp.berkeley.edu/bacteria/cyanolh.html
Ehleringer J. 1989. Leaf Morphology and Reflectance in Relation to Water and Temperature Stress. Adaptation of plants to water and high temperature stress: 295 – 308
Gitelson A., Zur Y., Chivkunova O. B., Merzlyak M. N. 2000 The spectral contribution of carotenoids to light absorption and reflectance in green leaves.
Gitelson A., Zur Y., Chivkunova O. B., Merzlyak M. N. 2002. Assessing Carotenoid Content in Plant Leaves with Reflectance Spectroscopy. Photochemistry and Photobiology 75(3): 272 – 281
Glazer, Alexander N. 1977. Structure and molecular organization of the photosynthetic accessory pigments of cyanobacteria and red algae, Volume 18, 2-3: 125-140
Hale, M. E. The biology of lichens. London: Arnold, 1970.
Levizou E., Manetas Y. 2006. Photosynthetic pigment contents in twigs of 24 woody species assessed by in vivo reflectance spectroscopy indicate low chlorophyll levels but high carotenoid/chlorophyll ratios. Environmental and Experimental Botany 59 : 293–298
Liew O.W., Chong P.C.J., Li B., Asundi A.K. 2008. Signature optical cues: Emerging technologies for monitoring plant health. Sensors, 8: 3205-3239
Mitrović, T. (2014). PLATISMATIA GLAUCA AND PSEUDEVERNIA
FURFURACEA LICHENS AS SOURCES OF ANTIOXIDANT,
ANTIMICROBAL AND ANTIBIOFILM AGENTS. EXCLI Journal, 938-953.
Modrozelene cepljivke. (2013, December 21). Retrieved July 31, 2015, from https://sl.wikipedia.org/wiki/Modrozelene_cepljivke
24
Pseudevernia furfuracea. (n.d.). Retrieved April 13, 2015, from https://en.wikipedia.org/wiki/Pseudevernia_furfuracea
Qi Y., Bai S., Heisler G.M. 2003. Changes in ultraviolet-B and visible optical properties and absorbing pigment concentrations in pecan leaves during a growing season.
Agricultural and Forest Meteorology 120, 1: 229-240
Sadava, D. (2011). Life: The science of biology (8th ed., pp. 655 - 657). Sunderland, Mass.: Sinauer Associates.
Underwood E.C., Ustin S.L., Ramirez C.M. 2007. A comparison of spatial and spectral image resolution for mapping invasive plants in coastal California. Environmental management, 39, 1: 63-83
What are Lichens? (n.d.). Retrieved July 31, 2015, from http://www.countrysideinfo.co.uk/fungi/lichens.htm
Woolley J. R. 1971. Reflectance and transmittance of light by leaves. Plant Physiology, 47, 5: 656-662
Yoshimura H. 2001. Spectral properties of leaves affected by carotenoid components.
Journal of Japanese Society of Revegetation Technology, 26, 4: 327-336 (in Japanese, with English abstract)
8.2 VIRI SLIK
Delovanje klorofila. (n.d.). Retrieved June 22, 2015, from http://projekti.gimvic.org/2003/2c/jesenskolistje/klorofil2.html
Pseudevernia furfuracea. (n.d.). Retrieved June 22, 2015, from https://www.google.si/search?q=pseudevernia
furfuracea&espv=2&biw=1366&bih=681&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=pV 2SVerWF8nXU5Xekng&ved=0CAYQ_AUoAQ#imgdii=WI9tZiYeI1sxrM:;WI9tZ iYeI1sxrM:;CuoVsE82-kirJM:&imgrc=WI9tZiYeI1sxrM:
Ugljikovodici i pigmenti. (n.d.). Retrieved June 22, 2015, from http://www.plantagea.hr/dev/ugljikovodici-i-pigmenti
ZAHVALA
Posebna zahvala gre moji mentorici prof. dr. Alenki Gaberščik, ki mi je svetovala, nudila strokovno pomoč in mi dajala napotke, ki so me pripeljali do cilja. Hvala za prijazen odnos in pozitivno energijo.
Hvala Katji Klančnik za vse nasvete in pomoč pri statistični obdelavi podatkov. Hvala tudi Draganu Abramu za pomoč pri delu v laboratoriju.
Hvala mami, tatiju in bratcu za vso podporo in spodbude tekom študija. Hvala za potrpežljivost, razumevanje in veliko dobre volje.
Hvala tudi vsem prijateljem, sošolkam in sošolcu za vso pomoč in potrpljenje.
