Amela MRVOLJAK
OPTI Č NE LASTNOSTI LISTOV PLAV Č KA (Salvinia auriculata)
DIPLOMSKO DELO
Ljubljana, 2015
Študijski program: Biologija in gospodinjstvo
Amela MRVOLJAK
Mentorica: prof. dr. Alenka Gaberščik
OPTI Č NE LASTNOSTI LISTOV PLAV Č KA (Salvinia auriculata)
DIPLOMSKO DELO
Ljubljana, 2015
II
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študija na Pedagoški fakulteti, smer Biologija-gospodinjstvo. Opravljeno je bilo na Katedri za ekologijo in varstvo okolja Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Vzorci rastlin so bili nabrani v Botaničnem vrtu v Ljubljani in obdelani v laboratoriju katedre.
Študijska komisija Pedagoške fakultete je 29. maja 2015 odobrila predlagano temo diplomske naloge z naslovom Optične lastnosti listov plavčka (Salvinia auriculata).
Za mentorico diplomskega dela je imenovala prof. dr. Alenko Gaberščik.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: prof. dr. Mateja GERM, univ. dipl. biol.
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Mentorica: prof. dr. Alenka GABERŠČIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Članica: doc. dr. Tadeja TROŠT SEDEJ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo
Datum zagovora:
Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Podpisana se strinjam z objavo svoje naloge v polnem tisku na spletni strani Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.
Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Amela Mrvoljak
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD KG AV SA KZ ZA LI IN TD OP IJ JI AI
Du1
odbojnost/presevnost/ lastnosti listov/plavček (Salvinia auriculata) MRVOLJAK, Amela
GABERŠČIK, Alenka (mentor) SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo 2015
OPTIČNE LASTNOSTI LISTOV PLAVČKA (Salvinia auriculata) Diplomsko delo (univerzitetni študij)
IX, 37 str., 4 pregl., 10 sl., 34 vir.
sl sl/en
Namen diplomskega dela je raziskati optične lastnosti listov plavčka (Salvinia auriculata) in ugotoviti, kateri parametri in v kakšni meri vplivajo na odbojnost in prepustnost lista za posamezne dele elektromagnetnega spektra. Proučevali smo anatomske in biokemijske lastnosti listov ter izmerili njihovo presevnost in odbojnost. Odbojnost in presevnost listov smo izmerili v območju med 280 nm in 887 nm valovne dolžine. Izračunali smo specifično listno površino in vsebnost vode. Z mikroskopom smo analizirali zgradbo lista v prečnem prerezu in izmerili razdalje med trihomi, debelino lista in posameznimi tkivi (zgornja in spodnja povrhnjica, aerenhim). V listih smo določili tudi vsebnost antocianov, klorofilov, karotenoidov in UV-absorbirajočih snovi. Rezultati meritev odbojnosti in presevnosti so pokazali najnižjo odbojnost in presevnost v UV-območju (280–
400 nm) in najvišjo v območju NIR (700–887 nm). V raziskavi smo ugotovili, da na optične lastnosti vplivajo tako anatomski kot biokemijski dejavniki, ki so z odbojnimi in presevnimi spektri povezane pozitivno, nekatere pa tudi negativno.
Rezultati so pokazali, da na odbojnost vplivajo le anatomske lastnosti, kot so debelina povrhnjice, debelina aerenhima in razdalja med trihomi. Na presevnost pa vplivajo anatomske in tudi biokemijske lastnosti.
IV KEY WORDS DOCUMENTATION
DN CX AU AA PP PB PY TI DT NO LA AL AB
B. Se. Thesis
reflectance/transmittance/leaf optical properties/Salvinia auriculata Mrvoljak, Amela
GABERŠČIK, Alenka (supervisor) SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology 2015
OPTICAL PROPERTIES OF Salvinia auriculata LEAVES Graduation Thesis (University studies)
IX, 37 p., 4 tab., 10 fig., 34 ref.
sl sl/en
The purpose of the thesis was to examine optical properties of Salvinia auriculata leaves. Our goal was to find out if any of measured parameters have influence on leaf reflectance and transmittance. We studied anatomical and biochemical properties of leaves and measured transmittance and reflectance. Leaf reflectance and transmittance were measured in the range between 280 nm and 887 nm. Specific leaf area and density were determined. We analysed leaf structure with microscope and we measured the distance between trichomes and leaf tickness (upper and lower epidermis, aerenchyma). Leaf contents of anthocyanin, chlorophyll, carotenoid and UV-absorbing substances were also measured. The results of optical properties showed that chosen plant samples have very low transmittance and reflectance in the UV area (280-40 nm), while the highest transmittance and reflectance was in NIR area (700-887 nm). In this study, we found that optical properties affect both anatomical and biochemical factors, which were positively or negatively related with leaf reflectance and transmittance. The results showed that the reflectance was affected only by anatomical features such as the thickness of the epidermis, the thickness of the aerenchyma and the distance between trichomes. The transmittance wasaffected by anatomical and biochemical properties.
V
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC... VII KAZALO SLIK ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... IX
1 UVOD ... 1
1.1 HIPOTEZE ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 2
2.1 MORFOLOŠKE IN ANATOMSKE ZNAČILNOSTI LISTOV VODNIH RASTLIN . 2 2.2 OPTIČNE LASTNOSTI LISTOV ... 3
2.2.1 Transmitanca oziroma prepustnost svetlobe ... 4
2.2.2 Absorbanca oziroma absorpcija svetlobe ... 5
2.2.3 Reflektanca oziroma odboj svetlobe ... 7
3 MATERIALI IN METODE ... 10
3.1 RASTLINSKA VRSTA ... 10
3.2 MERITVE OPTIČNIH LASTNOSTI ... 13
3.2.1 Meritve odbojnosti ... 15
3.2.2. Meritve presevnosti ... 15
3.3 ANATOMSKE ANALIZE ... 15
3.3.1 Specifična listna površina in vsebnost vode ... 15
3.3.2 Zgradba lista ... 16
3.4 BIOKEMIJSKE ANALIZE ... 16
3.4.1 Klorofili in karotenoidi ... 16
3.4.2 Antociani ... 17
3.4.3 UV-absorbirajoče snovi ... 18
3.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV ... 18
4 REZULTATI ... 20
4.1 ODBOJNOST IN PRESEVNOST LISTOV ... 20
VI
4.2 ANATOMIJA LISTOV ... 21
4.3 BIOKEMIJA LISTOV ... 23
4.4 KORELACIJA MED OPTIČNIMI IN ANATOMSKIMI TER BIOKEMIJSKIMI LASTNOSTMI LISTOV ... 24
4.4.1 Odbojnost lista ... 24
4.4.2 Presevnost lista ... 27
5 RAZPRAVA ... 28
6 SKLEPI ... 31
7 POVZETEK ... 32
8 UPORABA V PRAKSI ... 33
9 VIRI ... 34
VII
KAZALO PREGLEDNIC
Tabela 1: Vsebnost biokemijskih parametrov listov, izražena na površino lista.. ... 23 Tabela 2: Vsebnost biokemijskih parametrov listov, izražena na maso suhe snovi lista. ... 23 Tabela 3: Soodvisnost odbojnosti in biokemijskih ter anatomskih značilnosti listov v določenih spektralnih pasovih, izraženih s Spearmanovim korelacijskim koeficientom. ... 25 Tabela 4: Soodvisnost presevnosti in biokemijskih ter anatomskih značilnosti listov v določenih spektralnih pasovih, izraženih s Spearmanovim korelacijskim koeficientom. ... 26
VIII
KAZALO SLIK
Slika 1: Vodna kapljica na listu vrste Salvinia oblongifolia (vir: Cerman in sod., 2009)... 10
Slika 2: Vrsta Salvinia auriculata Aubl. (Vir: Biolib.cz) ... 12
Slika 3: Spektrometer JAZ-ULM-200 ... 14
Slika 4: Svetlobni vir DH-2000BAL (Vir: Oceanoptics.com) ... 14
Slika 5: ISP-R integracijska sfera (Vir: Oceanoptics.com) ... 14
Slika 6: Spektri povprečnih vrednosti relativnega odboja (zelena barva) in relativne presevnosti (modra barva) skozi liste pri vrsti Salvinia auriculata; n = 10 ... 20
Slika 7: Razdalja med trihomi, debelina povrhnjice, aerenhima in celotnega lista ... 21
Slika 8: Površina lista vrste Salvinia auriculata (Foto: Dragan Abram) ... 21
Slika 9: Površina lista vrste Salvinia auriculata (Foto: Dragan Abram) ... 22
Slika 10: Trihomi pri vrsti Salvinia auriculata (Foto: Dragan Abram) ... 22
IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Ant
EM
E470, E510, E645, E662
IR Kar Kl a Kl b n NIR P PAR Rpm ss SD SLA t-test UV UV abs UV-A UV-B UV-C V
antociani
elektromagnetno valovanje
absorpcije pri posameznih valovnih dolžinah infrardeče sevanje
karotenoidi klorofil a klorofil b število vzorcev
bližnje infrardeče sevanje površina vzorca
fotosintezno aktivno sevanje obrati na minuto
suha snov
standardna deviacija specifična listna površina dvovzorčni Študentov t-test ultravijolično sevanje
snovi, ki absorbirajo ultravijolično sevanje
ultravijolično sevanje A z valovno dolžino 320–400 nm ultravijolično sevanje B z valovno dolžino 280–319 nm ultravijolično sevanje C z valovno dolžino 100–280 nm volumen ekstrakta
1 1 UVOD
Rastline so v neprestanih interakcijah z okoljskimi dejavniki. Interakcije se dogajajo tako na mikro kot tudi makro ravneh, zato je pomembno, da razumemo biološke in fizikalne odzive rastlin na spremembe v okolju (Liew in sod., 2008). Eden izmed teh dejavnikov je sevanje. Sevanje je oddajanje energije v obliki elektromagnetnega (EM) valovanja (Tome, 2006). Sevanje, ki pade na listno površino, se lahko absorbira, odbije ali pa prehaja skozi list (Jacquemound in sod., 1989). Listi različnih vrst imajo specifične anatomske, biokemijske in optične lastnosti, ki jih pogojujejo različni listni parametri in ti parametri so absorbanca, reflektanca in transmitanca (Levizou in sod, 2005). Optične lastnosti se lahko razlikujejo tudi znotraj vrste kot posledica variabilnosti v ontogenetskem razvoju in okoljskih dejavnikov, v katerih rastlina uspeva, kot so na primer hranila, svetloba in voda (Klančnik in sod., 2014). Različne rastlinske vrste imajo različne listne strukture, ki močno vplivajo na količino prepuščene in odbite svetlobe v vidnem in NIR-delu spektra, medtem ko so v UV-delu spektra te razlike manjše (Yoshimura in sod., 2010). Med drugimi je posledica optičnih lastnosti tudi barva listov, saj različna barvila absorbirajo različne valovne dolžine (Holmes in Keiller, 2002).
Ker sta odbojnost in presevnost posledica vpliva različnih dejavnikov, je pomembno, da poleg meritev odbojnosti in presevnosti opravimo še druge meritve in jih povežemo s tema lastnostma. Torej je bil namen diplomske naloge ugotoviti, v kolikšni meri anatomski in biokemijski parametri vplivajo na odbojni in presevni spekter sevanja v območju od 280 do 887 nm valovne dolžine pri vrsti Salvinia auriculata.
1.1 HIPOTEZE
1. Predvidevamo, da anatomske lastnosti listov vplivajo na odbojnost in presevnost listov.
2. Predvidevamo, da bodo spektri odbojnosti in presevnosti lista odvisni od vsebnosti klorofila in antocianov, ki so v posameznem vzorcu.
3. Predvidevamo, da bodo spektri odbojnosti in presevnosti v območju UV nizki.
2 2 PREGLED OBJAV
2.1 MORFOLOŠKE IN ANATOMSKE ZNAČILNOSTI LISTOV VODNIH RASTLIN Listi vodnih rastlin se po zgradbi razlikujejo od listov kopenskih rastlin (Cronk in Fennessy, 2001). Prav tako pa se tudi listi vodnih rastlin med seboj razlikujejo. Posebnost vodnih rastlin je aerenhim. Gre za sistem zračnih prostorov, ki potekajo od listov skozi listne peclje, steblo in vse do korenin. Aerenhim na ta način omogoča prehajanje plinov od listov do korenin in obratno, prav tako pa tudi zmanjša specifično težo rastlinskih delov (Hutchinson, 1975). Tako so plavajoči listi navadno debelejši od potopljenih in imajo preprosto morfologijo. Plavajoči listi so po navadi okrogle, ledvičaste, ščitaste ali podolgovate oblike. Povrhnjica plavajočih listov je enoplastna, dobro razvita in prekrita z debelo kutikulo in epikutikularnimi voski. Na zgornji povrhnjici je veliko listnih rež, medtem ko so na spodnji strani prisotne številne hidropote. Mezofil lista je diferenciran v gobasto in stebričasto tkivo. Za plavajoče liste je značilen zmanjšan obseg prevajalnih tkiv in prisotnost obsežnega aerenhimskega tkiva. Obsežen aerenhim zmanjšuje specifično težo rastlinskih delov, predvsem listov, kar listom omogoča plavanje na vodi (Cronk in Fennessy, 2001; Larcher, 2003; Trošt-Sedej, 2005; Klančnik in sod., 2012; Klančnik in sod., 2014).
Potopljeni listi so za razliko od plavajočih navadno tanki, lasasti in drobno razcepljeni, zaradi česar je razmerje med volumnom in površino lista povečano, kar omogoča lažjo izmenjavo plinov ter učinkovitejše sprejemanje hranil iz vode. Pri potopljenih listih je povrhnjica zelo tanka, v nekaterih primerih lahko tudi manjka. Kutikula je zelo slabo razvita, listne reže večinoma manjkajo, če pa so že razvite, niso funkcionalne. Na celicah listne povrhnjice se nahajajo žlezne diferenciacije, tako imenovane hidropote, ki služijo absorpciji ionov iz vode. Asimilacijsko tkivo ni diferencirano v gobasto in stebričasto tkivo. Celice asimilacijskega tkiva so izodiametrične, zaradi česar bolje prepuščajo svetlobo, kot bi jo sicer podolgovate celice stebričastega tkiva, kjer bi se velik delež sevanja absorbiral na poti skozi celične stene. Tudi v povrhnjici so lahko prisotni kloroplasti, kar še dodatno izboljša izkoristek svetlobe. Mezofil je sestavljen iz manjšega števila celičnih plasti, zaradi česar sta olajšana prehajanje svetlobe in difuzija snovi (Trošt- Sedej, 2005).
3 2.2 OPTIČNE LASTNOSTI LISTOV
Rastlinski listi predstavljajo območje, kjer poteka interakcija svetlobe z različnimi plastmi celic. Sevanje, ki pade na listno površino, se lahko absorbira, odbije ali pa prehaja skozi list. (Jacquemound in sod., 1989). Govorimo o absorbanci, reflektanci in transmitanci.
Absorbanca je obratno sorazmerna z reflektanco in transmitanco (Levizou in sod, 2005).
Relativne vrednosti absorbance, reflektance in transmitance so odvisne od anatomske in biokemične strukture lista. Vse te vrednosti skupaj definirajo optične lastnosti posameznih listov. Optične lastnosti se lahko razlikujejo tudi znotraj vrste kot rezultat fenotipske plastičnosti, ki nastane zaradi variabilnosti v ontogenetskem razvoju in okoljskih pogojev, kot so hranila, voda in svetloba. Količina sevanja, ki pade na list, je odvisna tudi od različnih dejavnikov, ki se lahko nahajajo na listni površini, kot sta prah ali perifiton. Torej prvi sloj na površini listov močno vpliva na nadaljnje prodiranje fotonov v listno tkivo (Klančnik in sod., 2014).
Oddajanju energije v obliki elektromagnetnega (EM) valovanja pravimo sevanje. Sevanje v splošnem delimo na kratkovalovno in dolgovalovno. Kratkovalovno sevanje prihaja od Sonca in je sestavljeno iz UV-sevanja (10 %), vidne svetlobe (50 %) in IR-sevanja do 3000 nm (okrog 40 %). Dolgovalovno sevanje pa oddaja Zemlja pretežno v IR-spektru. Vidna svetloba in IR-sevanje sta glavna vira energije za biosfero. Škodljivo sevanje (pod 280 nm) v celoti zadrži plast ozona v stratosferi, prav tako pa seva velik del sevanja tudi mimo Zemlje. Najmočnejše kratkovalovno sevanje je pri okoli 500 nm in predstavlja valovne dolžine vidne svetlobe. Ljudje in živali ta del vidnega valovanja zaznavamo s fotoreceptorji. Za proces fotosinteze rastline uporabljajo predvsem EM-sevanje med 380 in 710 nm. Temu delu svetlobe pravimo fotosintezno aktivni del sevanja (PAR-photosynthetically active radiation) (Tome, 2006).
Vidni del spektra delimo na več barvnih pasov: vijolična svetloba (380–425 nm), modra svetloba (425–490 nm), zelena svetloba (490–572 nm), rumena svetloba (575–585 nm), oranžna svetloba (585–650 nm) in rdeča svetloba (650–750 nm) (Tome, 2006). Za tipičen zeleni list je značilna nizka odbojnost v vidnem delu spektra (400–700 nm), ki narašča in doseže rahel vrh v delu spektra, kjer se nahaja zelena svetloba (okoli 550 nm), nato pa odbojnost nad 680 nm valovne dolžine strmo narašča na tako imenovani rdeči rob, ki vodi
4
do visoke absorpcije v bližnjem IR-delu spektra, kjer pigmenti v listih ne absorbirajo sevanja (Blackburn, 2006).
Za celotno UV-območje so značilne nizka presevnost in odbojnost ter visoka absorpcija.
Svetlobno območje UV je razdeljeno na tri segmente: UV-A z obsegom od 320 do 400 nm valovne dolžine, UV-B z obsegom od 280 do 320 nm valovne dolžine ter UV-C z obsegom od 100 do 280 nm valovne dolžine. Manjša kot je valovna dolžina, več energije vsebuje.
Listi višjih rastlin po navadi odbijejo le okoli 5 % UV-sevanja, preostali del sevanja skozi list pa rastline popolnoma absorbirajo. Absorpcija je v UV-delu spektra močna zaradi UV-absorbirajočih snovi, kot so flavonoidi in klorofili (Yoshimura in sod., 2010).
Interakcija elektromagnetnega sevanja z rastlinskimi listi (odboj, presevnost, absorpcija) je v veliki meri odvisna od kemičnih in fizikalnih lastnosti teh listov (Jacquemoud in Baret, 1990).
Številne študije so pokazale, da so odbojnost, prepustnost in absorpcija rastlinskih listov povezane s fiziološkim stresom, le-ta pa naj bi bil povezan s spremembami koncentracij klorofila. Carter in Knapp (2011) ugotavljata, kako lahko različni stresorji, vključno z dehidracijo, poplavami, zamrznitvijo, ozonom, herbicidi, boleznimi in žuželkami, katerimi so bile rastline izpostavljene, vplivajo na optične lastnosti listov. V vseh primerih je do največje variabilnosti v optičnih lastnostih prišlo pri valovnih dolžinah blizu 700 nm.
Ugotovili so, da so optične lastnosti v relativno ozkem spektralnem pasu (blizu 700 nm) ključnega pomena za odkrivanje stresa rastlin in za oceno koncentracije klorofila v samem listu. Ta skupni optični odgovor na stres bi bil lahko natančno simuliran s spreminjanjem koncentracije klorofila vzorčnih listov. To še posebej velja v zeleno-rumenem delu spektra, kjer ni vpliva karotenoidov in ostalih pigmentov, ki lahko zakrijejo učinek zmanjšanja vsebnosti klorofila v modrem delu spektra (Carter in Knapp, 2001).
2.2.1 Transmitanca oziroma prepustnost svetlobe
Koliko svetlobe bodo listi prepustili, je odvisno od same strukture in debeline listov.
Mehki in fleksibilni listi prepustijo 10–20 % sončevega sevanja, zelo tanki listi prepustijo več kot 40 % sončevega sevanja, medtem ko debeli in grobi listi skoraj ne prepuščajo svetlobe oziroma jo prepustijo zelo malo (manj kot 3 %). Presevnost je najvišja v valovnih
5
pasovih, kjer je visoka tudi odbojnost, to pa je v zelenem in zlasti tudi v bližnjem IR-delu spektra (Larcher, 2003).
2.2.2 Absorbanca oziroma absorpcija svetlobe
Absorpcija svetlobe v vidnem in IR-delu spektra je predvsem posledica raztezanja in krivljenja kovalentne vezi med kisikom, ogljikom, vodikom in dušikom v rastlinskih biokemičnih sestavinah, kot so sladkor, lignin, celuloza in beljakovine. Prav tako pa je absorpcija v veliki meri odvisna tudi od različnih pigmentov, ki se nahajajo v listih in ki dajejo listom različne barve (Liew in sod., 2008). Te snovi absorbirajo določene valovne dolžine sevanja, kar zmanjša odboj v teh delih spektra (Blackburn, 2006).
Rastlinski pigmenti so izjemnega pomena za biosfero. Klorofili so najbolj pomembne organske molekule na Zemlji, saj so nujno potrebne za to, da lahko rastline opravljajo fotosintezo. Karotenoidi so bistvenega pomena za rastline in preživetje sesalcev, medtem ko so druge pigmentne skupine ključne za fiziologijo rastlin in organizmov, ki med seboj sodelujejo (Blackburn, 2006).
Znotraj kloroplastov antenski pigmenti absorbirajo sončno sevanje in omogočajo prenos energije do pigmentnega reakcijskega centra, katerega naloga je, da sproži fotosintezo.
Najpomembnejša izmed pigmentov sta klorofil a in klorofil b (Blackburn, 2006). Klorofil a je prevladujoč pigment in prispeva k rdeči fluorescenci v listih, medtem ko je klorofil b pomožni pigment, ki predstavlja eno tretjino ali manj celotne vsebnosti klorofila v listu (Liew in sod., 2008). Klorofili so zelo pomembni iz več razlogov. Imajo namreč prevladujoč nadzor nad količino sončevega sevanja, ki ga bo list absorbiral, foliarna koncentracija klorofilov nadzoruje fotosintezni potencial in posledično tudi primarno produkcijo. Ob stresu se količina klorofilov običajno zmanjša, prav tako pa abiotski dejavniki, predvsem svetloba, vplivajo na razmerje med klorofilom a in klorofilom b.
Ravno zato nam lahko meritve tega razmerja ali pa skupnega klorofila zagotovijo koristne vpoglede v interakcije med rastlinami in okoljem (Blackburn, 2006). Absorpcijski spekter intaktnih molekul klorofila kaže na dva prevladujoča pasova v rdečem in modrem delu vidnega spektra. Absorpcija molekul klorofila pa je minimalna na valovni dolžini okoli 500 nm (Liew in sod., 2008).
6
Karotenoidi so druga glavna skupina rastlinskih pigmentov, ki so sestavljeni iz karotenov in ksantofilov. Karotenoidi so bistvene strukturne komponente antenskega kompleksa in reakcijskega centra, zato lahko absorbirajo sevanje in prispevajo energijo za fotosintezo.
Tako karotenoidi kot tudi klorofil b so zadolženi, da energijo, ki jo absorbirajo, posredujejo klorofilu a. Na ta način je fotosintezni potencial rastlin odvisen od koncentracije posameznih pigmentov (Blackburn, 2006). Zanimivo je, da večina rastlin spremeni sestavo karotenoidne kompozicije kot posledica odgovora na polno sončno svetlobo ali pa na senco. Skupno število karotenoidnih molekul na molekulo klorofila je navadno večje v sončnih listih kot pa v senčnih listih. Listi, ki rastejo v senci, veliko večino absorbirane svetlobe uporabijo za fotosintezo, medtem ko je situacija z listi, ki so izpostavljeni sončni svetlobi, bistveno drugačna. Kljub dejstvu, da je stopnja fotosinteze v sončnih listih večja kot v senčnih listih, sončni listi na vrhuncu obsevanja ne morejo izkoristiti vse absorbirane svetlobe za proces fotosinteze. Demmig-Adams, Gilmore in Adams (1996) ugotavljajo, da ob vrhuncu obsevanja, torej opoldne, sončni listi hitro rastočega pridelka izkoristijo manj kot 50 % absorbirane sončne svetlobe, številne zimzelene vrste pa izkoristijo le približno 10 % absorbirane sončne svetlobe. Preostalih 50 % v prvem primeru in 90 % absorbirane svetlobe v drugem primeru je torej v prebitku (Demmig-Adams, 1996). Visok fotonski tok lahko pri različnih rastlinskih vrstah povzroči majhne reverzibilne spremembe v absorbanci in odbojnosti blizu 535 nm valovne dolžine zaradi preoblikovanja karotenoidov violaksantinskega centra. Različni karotenoidi pa najbolje absorbirajo vidno svetlobo v modrem delu spektra. V senescentnih listih je prisotna zelo nizka koncentracija klorofila, kar ima za posledico manjšo absorpcijo rdečih in zelenih valovnih dolžin, medtem ko v modrem delu ostane visoka, in sicer zaradi prisotnosti karotenoidov (Zur in sod., 2000).
Antociani so vodotopni flavonoidi in so tretja večja skupina pigmentov v listih (Blackburn, 2006). Porazdelitev antocianov v listnih tkivih se precej razlikuje med vrstami. Po navadi se nahajajo v celičnih vakuolah, najdemo jih pa lahko tudi v gobastem in stebričastem tkivu (Merzlyak in sod., 2008). Pri nekaterih rastlinskih vrstah lahko postanejo prevladujoča pigmentna skupina. Antociani imajo potencial za urejanje fotosinteze, prav tako lahko nudijo tudi zaščito pred fotoinhibicijo (Blackburn, 2006) in foto poškodbami na ta način, da v primeru pretiranega sončevega sevanja absorbirajo višek sevanja, ki bi ga sicer absorbirali kloroplasti (Merzlyak in sod., 2008). Antociani lahko delujejo kot
7
osmotski regulatorji in omogočajo rastlinam zaščito oziroma odpornost proti različnimi stresnimi dejavniki, kot so nizke temperature, suše (Blackburn, 2006), povečano UV-sevanje, ekstremne temperature in pomanjkanje hranil (Merzlyak in sod., 2008).
Obstajajo tudi dokazi, da imajo antociani antioksidativne lastnosti, zaradi česar lahko pripomorejo k obnovitvi poškodovanih listov (Blackburn, 2006). Antociani najmočneje absorbirajo na območju med 450 nm in 600 nm valovne dolžine, torej najbolje absorbirajo rumene in zelene valovne dolžine. Prav tako močno absorbirajo v vrzeli med območjem močne absorpcije karotenoidov in klorofilov v modrem delu vidnega spektra (400–500 nm) in območjem močne absorpcije klorofilov v rdečem delu vidnega spektra (Merzlyak in sod., 2008).
V rastlinskih listih najdemo tudi UV-absorbirajoče snovi, kot so flavonoidi. Flavonoidi se nahajajo v epidermalnih celicah in blažijo škodljive vplive valovnih dolžin UV-sevanja na liste. Med UV-absorbirajoče snovi spadajo tudi klorofili, karotenoidi in antociani.
Fotosintezni pigmenti oziroma klorofili, ki se nahajajo v mezofilu lista, prispevajo k zmanjševanju UV-sevanja na ta način, da UV-sevanje absorbirajo in ga izsevajo kot fluorescenco. Absorpcijski spektri fotosinteznih pigmentov v UV-območju zajemajo valovne dolžine, manjše od 400 nm. Fotosintezni pigmenti na ta način pomembno prispevajo k listni odbojnosti in prepustnosti svetlobe v UV-območju. Višje rastline imajo podobne optične lastnosti skozi celotno UV-območje, torej tako skozi UVA- kot tudi skozi UVB- in UVC-del spektra. Odbojnost lista znaša 5 %, medtem ko je prepustnost enaka nič.
V UV-delu spektra prevladuje močna absorpcija, ravno na račun UV-absorbirajočih snovi.
Yoshimura in sod. (2010) ugotavljajo, da je redukcija UV-sevanja na račun odbojnosti in prepustnosti listov prisotna skozi celo leto, ne glede na letne sezone, ki prinašajo spremembe v količinah rastlinskih pigmentov. Spektralne lastnosti kažejo na to, da vegetacija bistveno pripomore k zmanjšanju škodljivih vplivov UV-žarkov, ki so škodljivi za vse organizme. Ščitijo tako kopenske kot tudi vodne ekosisteme (Yoshimura, 2010).
2.2.3 Reflektanca oziroma odboj svetlobe
Na odbojnost sevanja pri rastlinah v veliki meri vplivajo predvsem anatomske značilnost lista, ne smemo pa zanemarjati tudi biokemičnih značilnosti oziroma vsebnosti različnih rastlinskih pigmentov. Obstajajo tako imenovani trije vrhovi odbojnosti, in sicer v
8
modrem delu spektra (450–495 nm), kjer na odbojnost vpliva predvsem absorpcija klorofilov in karotenoidov, del na meji med modrim in zelenim spektrom (495–570 nm), kjer je pri 550 nm opazen zeleni vrh, in nazadnje še na meji rdečega spektra (620–750 nm), kjer je opazen vpliv absorpcije klorofila (Liew in sod., 2008).
Listi v povprečju odbijejo 6–10 % svetlobe, v primeru, da so listi zelo svetleči, pa skoraj še enkrat toliko. Listi najmočneje odbijajo zeleno svetlobo (10–20 %), najmanj pa ultravijolično sevanje, ki se skoraj popolnoma absorbira. Odboj je majhen tudi pri oranžni in rdeči svetlobi (3–10 %) (Larcher, 2003). V vidnem delu spektra je odbojnost zelo majhna (5–10 %). Glavni dejavnik, ki vpliva na odbojnost v vidnem delu spektra, je absorpcija listnih pigmentov. Za razliko od vidnega dela spektra je odbojnost v bližnjem infrardečem delu spektra in srednje infrardečem delu spektra visoka, saj na tem območju pigmenti nimajo vpliva. V tem delu je za odbojnost odgovorna predvsem notranja struktura lista (Grant, 1987; Vogelmann, 1993). Pri valovni dolžini od 400 do 700 nm imajo največji vpliv na odbojnost svetlobe od listne površine klorofili, karotenoidi in antociani. Medtem ko imajo pri valovni dolžini od 700 do 1400 nm največji vpliv na odbojnost svetlobe od listne površine morfološke lastnosti listov, kot so kutikula, povrhnjica, vsebnost vode in ostala listna tkiva (Baltzer in Thomas, 2005; Vogelmann, 1993).
Liew in sod. (2008) ugotavljajo, v kakšni interakciji so svetloba in določene anatomske strukture v listu. Dorziventralen list je omejen z zgornjo in spodnjo povrhnjico.
Epidermalne celice ne vsebujejo klorofila, po celični strukturi se med seboj razlikujejo, združene so zelo skupaj in tako na tesno, da med njimi ni presledkov. Epidermalne celične stene so značilno impregnirane z voskasto snovjo, imenovano kutin, ki tvori zunanji površinski sloj, imenovan povrhnjica, zlasti na zgornji strani listov. Površinska tekstura povrhnjice je lahko gladka, spiralasta, brazdasta ali razpokana, odvisno od vrste. Debelina povrhnjice se lahko razlikuje glede na vrsto in okoljske pogoje, v katerih vrste uspevajo.
Debelina povrhnjice pomembno vpliva na količino svetlobe, ki se odbije s površine lista.
Odbiti kot svetlobe je komplementaren vpadnemu kotu svetlobe, kar vpliva na sprejem in porazdelitev svetlobe na meji zrak–kutikula. Debelina povrhnjice, večja od 1 µm, predstavlja eno izmed ključnih kazalcev odbojnosti v bližnjem infrardečem spektru (Liew in sod., 2008).
9
V mezofilu se nahaja gobasto in stebričasto tkivo. Stebričasto tkivo sestavljajo specializirane podolgovate celice, ki ležijo pravokotno glede na listno površino. Vsebujejo veliko količino kloroplastov, ki močno absorbirajo v modrem in rdečem delu vidnega spektra. Svetloba nato prehaja do stebričastih celic, ki vodijo svetlobo naprej do tkiv, ki so locirana globlje v sami strukturi lista. Pod stebričastim tkivom se nahaja gobasto tkivo, ki je sestavljeno iz celic, ki so lahko okrogle ali pa nepravilne oblike. Zaradi tega med njimi nastanejo zračni prostori. Te celice vsebujejo manj kloroplastov. Debelina stebričastega in gobastega tkiva močno vpliva na prodiranje svetlobe skozi list in stopnjo sipanja svetlobe v listu (Liew in sod., 2008).
Tako na spodnji kot tudi na zgornji strani lista so lahko prisotni enocelični ali večcelični epidermalni laski, imenovani trihomi. Zgradba trihomov se od vrste do vrste lahko zelo razlikuje. Visoka gostota trihomov lahko izkrivlja odbojnost v območju vidnega dela spektra. To pomeni, da trihomi ali dlake močno povečajo odboj svetlobe v vidnem območju, medtem ko je njihov vpliv v bližnjem infrardečem spektru variabilen. Tudi stopnja hidracije lista pomembno vpliva na odbojnost, pri čemer je odbojnost v vidnem delu spektra večja pri suhem listju kot pri vlažnem listju (Liew in sod., 2008).
Pri rodu Salvinia najdemo štiri različne vrste trihomov, in sicer so pri vrstah Salvinia cucullata in Salvinia hastata prisotni enorogeljni trihomi, vrsta Salvinia oblongifolia ima dvorogeljne trihome, vrsti Salvinia natans in Salvinia minima imata štirirogeljne trihome, medtem ko imajo vrste Salvinia auriculata, Salvinia biloba, Salvinia herzogii in Salvinia molesta štirirogeljne trihome, ki so na vrhu združeni. Kaul (1976) je predstavil možno funkcijo površinskih struktur pri rodu Salvinia. Meni, da so trihomi namenjeni predvsem preprečevanju močenja listov. Voda, ki pade na liste, se na trihomih zlije v kroglice in z lista odteče. Tako je list na dorzalni strani skoraj nezmočljiv. Torej kombinacija trihomov in voskov omogoča, da je listna površina pri rodu Salvinia superhidrofobna, kar pomeni, da voda z listov odteka. Vodna kapljica, ki pade na listno površino, ima srebrn sijaj, ki ga povzroča zrak, ujet med trihomi (Cerman in sod., 2009).
10
Slika 1: Vodna kapljica na listu vrste Salvinia oblongifolia (vir: Cerman in sod., 2009)
3 MATERIALI IN METODE 3.1 RASTLINSKA VRSTA
Preučevana vrsta spada v rod Salvinia, v družino plavčevk (Salviniaceae). Rod je poimenovan po italijanskem znanstveniku Antoniu Mariji Salviniju (1633–1729), ki je poučeval grški jezik na Univerzi v Florenzi, prav tako pa je pomagal botaniku Pieru Antoniju Micheliju (1679–1737) pri številnih študijah. Rod ni obsežen in trenutno šteje okrog 10 vrst prosto plavajočih vodnih praproti, ki so predvsem ameriškega in azijskega izvora (Parsons in Cuthbertson, 2011).
Plavček (Salvinia auriculata)
Vrsta Salvinia auriculata je prosto plavajoča vodna praprot s plagiotropnimi poganjki (Suvarnalantha Devi in sod., 2015; Coelho in sod., 2000). Osnovna enota je rameta (osebek, ki je rezultat vegetativnega razmnoževanja). Rameta je sestavljena iz stebla, listov ter lateralnih in apikalnega brsta, ki omogoča rast novih ramet (Coelho in sod., 2000).
Nima korenin, ima pa rizome, ki imajo v prerezu obliko črke U. Listi so dveh tipov, in sicer so nekateri plavajoči, nekateri pa potopljeni (Suvarnalantha Devi in sod., 2015). Njeni listi so rahlo do srednje zelene, lahko pa tudi malce rjavkaste barve in ko so starejši, postanejo njihovi robovi rjavkasti. So krožne oblike z zaobljenim ali pa rahlo usločenim
11
vrhom in v dolžino lahko merijo 1,5–2,5 cm. Zgornja stran listov je gosto poraščena s kratkimi ali pa tudi rahlo podaljšanimi papilami, ki so razporejene v vzporednih vrstah po celotnem listu. Na vrhu vsake papile se razvijejo štirje trihomi. Konci trihomov se stikajo skupaj. Vrsta Salvinia auriculata je zelo rodovitna vrsta. Njen obstoj je odvisen predvsem od proizvodnje spor in prezimovanja le-teh. Večina plavajočih rastlin namreč ne more uspevati v zimskih mesecih in v okolju, kjer prevladujejo nizke temperature. Nove populacije se pogosto razvijejo iz spor, ki so v sedimentu prezimile in bile v dormanci oziroma v mirujočem stanju. Spomladi, ko temperature začnejo naraščati, se spore iz sedimenta dvignejo na vodno gladino in začnejo kaliti (Ferreira Soares in sod., 2007).
Vrsta Salvinia auriculata uspeva predvsem v počasnih in stoječih vodah. Najdemo jo lahko v različnih vodnih habitatih, kot so jezera, rezervoarji, ribniki, reke, močvirja, jarki, potoki ter riževa polja, v blagih pogojih, čeprav lahko prenaša tudi določene slanosti in občasno zmrzal. Prav tako je prilagodljiva in tolerantna do visokih stopenj sedimentacije (Cavenaghi in sod., 2005). Domovina vrste Salvinia auriculata je Južna in Srednja Amerika (Raizer in Amaral, 2001). Zanjo je značilna visoka stopnja rasti. V ugodnih razmerah oziroma v okolju, ki je bogato s hranili, raste zelo na gosto (Coelho in sod., 2000). S svojimi listi velikokrat tvori velike neprekinjene preproge na vodni gladini (Raizer in Amaral, 2001). Te goste preproge pa se ne tvorijo, ko temperatura pade pod 10 °C (Cavenaghi in sod., 2005). Debele preproge, ki jih tvori vrsta Salvinia auriculata na vodni gladini, lahko izpodrivajo avtohtone vrste, vplivajo na kakovost vode in onemogočijo plovbo. Zaradi velike pokrovnosti negativno vplivajo na potopljene rastline, saj svetlobi onemogočajo pot do njih. Velika pokrovnost lahko negativno vpliva tudi na proizvodnjo električne energije in ohromi ribištvo. Torej preproge lahko povzročijo številne ekonomske težave (Bini in sod., 1999). Zaradi tega so vrsto Salvinia auriculata v njenem naravnem območju označili kot nadležno vrsto (Thomaz in sod., 1999).
12
Slika 2: Vrsta Salvinia auriculata Aubl. (Vir: Biolib.cz)
Torej največjo grožnjo vodnemu ekosistemu predstavlja vrsta Salvinia auriculata ravno zaradi gostih preprog, ki jih tvori na vodni površini. Te goste preproge škodljivo vplivajo na sladkovodni ekosistem oziroma na organizme, ki živijo pod preprogami, saj ustvarjajo anoksične razmere, zaradi katerih se biomasa živali in sama raznolikost v vodnem ekosistemu močno zmanjša. Scheffer in sod. (2002) ugotavljajo, da so za naraščanje dominance vodnih plavajočih rastlin krivi vdori oziroma prinašanje eksotičnih vrst, prav tako naj bi se plavajoče rastline hitro širile zaradi evtrofikacije. Plavajoče rastline nimajo neposrednega dostopa do sedimenta in imajo velik del listne površine bolj izpostavljen atmosferi kot pa vodi, zaradi česar je zmanjšan privzem hranil, razen ogljika, ki ga privzemajo skozi liste. Za razliko od plavajočih rastlin pa potopljeni ukoreninjeni makrofiti velik del hranil privzemajo iz substrata in učinkovito uporabljajo tudi svoje poganjke za privzem hranil iz vodnega stolpca. Čeprav so plavajoče rastline superiorni tekmeci za svetlobo in s tem negativno vplivajo na uspevanje potopljenih rastlin, lahko tudi potopljene rastline negativno vplivajo na rast prosto plavajočih rastlin z zmanjšanjem razpoložljivih hranil v vodnem stolpcu (Scheffer in sod., 2002).
13
Vrsta Salvinia auriculata pa ima tudi pomembno vlogo v ekosistemu. Rezultati dolgotrajnega poskusa so namreč pokazali, da je vrsta Salvinia auriculata dober primer vodnega makrofita, ki ima veliko zmogljivost privzemanja različnih elementov in organskih spojin iz vode in odpadne vode. Zato jo lahko štejemo kot možnega alternativnega bio absorbenta, kar pomeni, da se lahko uporablja za odstranjevanje različnih kovin in drugih nevarnih snovi, ki jih v mokrišča prinesejo industrijske odplake (Espinoza-Quiñones in sod., 2009).
Rastlinski material smo nabrali aprila 2015 v Botaničnem vrtu v Ljubljani (46° 2' 23.30'' N; 14° 30' 51.88'' E; 289,19 n. m). Vzorčno rastlino smo pazljivo položili v zabojnik z vodo in jo prenesli v laboratorij, kjer smo še isti dan opravili meritve optičnih lastnosti.
Meritve odbojnosti in presevnosti smo opravili na 10 paralelnih vzorcih.
3.2 MERITVE OPTIČNIH LASTNOSTI
Vse meritve odbojnosti in presevnosti smo naredili s pomočjo spektrofotometra (Jaz Modular Optical Sensing Suite, Ocean Optics, Inc., Dunedin, USA), ki je bil preko optičnega kabla QP600-1-SR-BX (Ocean Optics, Inc., FL, USA) povezan z integracijsko sfero ISP-30-6-R (Ocean Optics, Inc., FL, USA). Liste izbrane vrste smo osvetljevali s svetlobnim virom (UV-VIS-NIR, DH-2000, Ocean Optics, Inc., FL, USA). Napravo pa smo umerili s pomočjo bele referenčne ploščice (Spectrolon, Labsphere, North Sutton, New Hampshire, USA). Merili smo z ločljivostjo 0,3 nm v območju 280–887 nm.
Svetlobni vir smo usmerili na bel standard in na ta način smo spektrofotometer kalibrirali na 100-procentno odbojnost. Nato pa smo izmerili še temni spekter, tako da smo svetlobni vir ugasnili in sfero prekrili s črno brisačo, da smo stimulirali popolno temo. Da bi se izognili merskim napakam, smo postopek med merjenji večkrat ponovili. Rezultate merjenj smo obdelali v računalniškem programu SpectraSuite.
14
Slika 5: ISP-R integracijska sfera (Vir: Oceanoptics.com)
Slika 3: Spektrometer JAZ-ULM- 200 (Vir: Oceanoptics.com)
Slika 4: Svetlobni vir DH-2000BAL (Vir: Oceanoptics.com)
15 3.2.1 Meritve odbojnosti
Pri meritvah odbojnosti smo uporabili spektrofotometer, ki je bil preko optičnega kabla povezan z integracijsko sfero in priključen na računalnik. Pod sfero smo postavili 10 vzorcev izbrane vrste. Integracijsko sfero smo pri merjenju postavili pravokotno na zgornjo listno površino, na osrednji del listne lamine med glavno žilo in listnim robom in to površino smo osvetljevali s svetlobnim virom, ki je bil prav tako preko optičnega kabla povezan s sfero. Na ta način se je svetloba, ki se je odbila od listne površine, preusmerila v sfero in potem v spektrofotometer. Odbojnost smo izračunali kot razmerje med količino svetlobe, odbite od listne površine, in bele referenčne ploščice.
3.2.2. Meritve presevnosti
Pri meritvah presevnosti smo uporabili 10 listov in vsakega posebej smo namestili pod integracijsko sfero tako, da je bila sferi izpostavljena spodnja stran lista. Zgornjo stran vsakega lista smo osvetljevali s svetlobnim virom. Prepuščena svetloba je na ta način prehajala skozi list do integracijske sfere na spodnji strani lista. Pred meritvami pa smo spektrofotometer umerili na 100-procentno prepustnost s pomočjo svetlobnega žarka, ki je neposredno prehajal v notranjost integracijske sfere. Presevnost listov smo izračunali kot razmerje zmanjšanja jakosti svetlobnega žarka po prehodu skozi list.
3.3 ANATOMSKE ANALIZE
3.3.1 Specifična listna površina in vsebnost vode
Iz listov, ki smo jim izmerili optične lastnosti, smo s pomočjo luknjača izrezali krožce s premerom 1 cm. Krožce smo stehtali, nato pa jih zavili v folijo znane mase in jih 24 ur sušili v peči pri temperaturi 105 °C. Po sušenju smo jih še enkrat stehtali in jim določili suho maso, tako da smo lahko iz podatkov o sveži in suhi masi izračunali tudi vsebnost vode [%]. Ko smo pridobili vse podatke, smo lahko izračunali specifično listno površino (Specific Leaf Area – SLA), ki je količnik med površino vzorca in njegovo suho maso, izražen v [cm2 mg-1].
16 3.3.2 Zgradba lista
Te meritve smo opravili s pomočjo svetlobnega mikroskopa Olympus CX41, povezanega z digitalno kamero Olympus XC30, s pomočjo pribora za mikroskopiranje ter računalniškega programa Cell (CellSens, Olympus, Japan). Na predelu lista, kjer smo merili optične lastnosti, smo prečno odrezali tanek kos lista in naredili poltrajne preparate v glicerolu. Nato smo si prečne prereze listov pogledali pod svetlobnim mikroskopom in na desetih mestih vsakega lista izmerili različne parametre. S pomočjo računalniškega programa smo pri 100-kratni povečavi izmerili debelino lista, razdalje med trihomi, debelino povrhnjice in debelino aerenhima. Podatke smo sproti vnašali v program Excel, s pomočjo katerega smo naredili statistične izračune in grafične prikaze.
3.4 BIOKEMIJSKE ANALIZE
Za biokemijske analize smo s pomočjo luknjača iz svežih listov naluknjali krožce s premerom 1 cm. Določali smo torej vsebnosti karotenoidov, klorofilov, antocianov in UV- absorbirajočih snovi. Med opravljanjem meritev smo določene vzorce, ki jih nismo tako preučili, shranili v zamrzovalniku in na ta način upočasnili delovanje encimov, ki bi lahko vplivali na naše rezultate, ter ohranili vsebnosti barvil v listih.
3.4.1 Klorofili in karotenoidi
Vsebnosti klorofila a in b ter karotenoidov smo določili po metodi Lichtenthalerja in Buschmanna (2001a, 2001b). Vzorce smo strli v terilnici, ekstrahirali v 5 mL acetona (100 % (v/v)) in centrifugirali (4000 rpm, 4 °C, 4 min) v centrifugirkah za klorofil. Po centrifugiranju smo odčitali prostornine ekstraktov. Absorbcije smo izmerili s spektrofotometrom VIS pri valovnih dolžinah 470, 645 in 662 nm. Vsebnost klorofilov (Kl a, b) in karotenoidov (Kar) smo izrazili na suho maso vzorca in na površino vzorca.
Enačba za numerično oceno vsebnosti klorofilov in karotenoidov, prirejena na suho maso vzorca:
Kl a [mg g⁻¹ ss] = ca * V / ss = (11,24 E662 - 2,04 E645) *V / ss … (1)
17
Kl b [mg g⁻¹ ss] = ca* V / ss= (20,13 E645 - 4,19 E662) * V / ss … (2) Kar [mg g⁻¹ ss] = (1000 E470 – 1,9 ca - 63,14 cb) * V / ss / 214 ... (3)
ca,b - koncentracija klorofila a, oziroma b V - volumen ekstrakta [ml]
ss - suha masa vzorca [g]
P - površina vzorca [cm²]
E - absorpcija pri izbrani valovni dolžini
Ko želimo enačbo za numerično oceno vsebnosti klorofilov in karotenoidov prirediti na površino vzorca, potem v zgornji formuli suho maso vzorca (ss) nadomestimo s površino vzorca (P).
3.4.2 Antociani
Vsebnost antocianov smo določili po metodi Drumma in Mohra (1978). Vzorce smo strli v terilnici, ekstrahirali v 5 ml ekstrakcijskega medija (metanol : HCl (37 %) = 99 : 1 (v/v)) in centrifugirali (4000 rpm, 4 °C, 4 min). Po centrifugiranju smo odčitali prostornine ekstraktov. Vzorce smo nato za 24 ur postavili v temo pri temperaturi 3–5 °C. Ekstinkcije smo z VIS-spektrometrom izmerili pri valovni dolžini 510 nm. Vsebnost antocianov (Ant) smo izrazili v relativnih enotah na suho maso vzorca in na površino vzorca.
Enačba za numerično oceno vsebnosti antocianov, prirejena na suho maso:
Ant (relativna enota) = E510 * V * ss⁻¹ ... (4)
E510 - absorpcija pri valovni dolžini 510 nm V - prostornina ekstrakta [ml]
ss - suha masa vzorca [g]
P - površina vzorca [cm²]
18
Ko želimo enačbo za numerično oceno vsebnosti antocianov prirediti na površino vzorca, potem v zgornji formuli suho maso vzorca (ss) nadomestimo s površino vzorca (P).
3.4.3 UV-absorbirajoče snovi
Vsebnost absorbirajočih snovi UV-B in UV-A (UVB 280–320 nm, UVA 320–400 nm) smo določili po Caldwellovi metodi (1968). Vzorce smo strli v terilnici, ekstrahirali v 5 mL ekstrakcijske raztopine metanol : destilirana voda : HCl (37 %) = 79 : 20 : 1 (v/v) in jih 20 minut inkubirali v temi. Vzorce smo nato centrifugirali (4000 rpm, 10 °C, 10 min) in odčitali prostornine ekstraktov. S pomočjo spektrofotometra UV/VIS in kvarčnih kivet smo izmerili absorbance v spektralnem razponu 280–320 (UV-B) in 320–400 (UV-A) nm.
Vsebnost UV-absorbirajočih snovi smo izračunali kot integral ekstinkcijskih vrednosti od 280 do 319 nm ter od 320 do 400 nm. Vsebnost UV-absorbirajočih snovi smo izrazili v relativnih enotah na suho maso vzorca in na površino vzorca.
Enačba za numerično oceno vsebnosti UV-absorbirajočih snovi, prirejena na suho maso vzorca:
UV abs (relativna enota) = I * V-1* ss-1 ... (5)
I - integral absorpcijskih vrednosti v intervalu 280–320 nm (UV-B abs) ter 320–400 nm (UV-A abs)
V - prostornina ekstrakta [ml]
ss - suha masa vzorca [g]
P - površina vzorca [cm²]
Ko želimo enačbo za numerično oceno vsebnosti UV-absorbirajočih snovi prirediti na površino vzorca, potem v zgornji formuli suho maso vzorca (ss) nadomestimo s površino vzorca (P).
3.5 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV
Vse podatke meritev smo sproti vnašali v program Excel, s pomočjo katerega smo izračunali povprečja in standardne deviacije. Nekatere podatke smo predstavili v grafih,
19
nekatere pa v tabelah. Za primerjavo biokemijskih in anatomskih parametrov listov smo uporabili Študentov dvovzorčni t-test z upoštevanjem enakih varianc. Podatke o biokemijskih lastnostih in morfoloških lastnostih smo analizirali s Spearmanovim korelacijskim testom. Test nam je povedal, ali obstaja povezava med prepustnostjo oziroma odbojnostjo in biokemijskimi oziroma morfološkimi parametri. Korelacijsko analizo smo naredili v programu IBM SPSS 19.0. Ničelno hipotezo smo zavrnili, kadar je bil p ≤ 0,05 (statistično značilna razlika).
4 REZULTATI
4.1 ODBOJNOST IN PRESEVNOST LISTOV
Za prikaz presevnosti in odbojnosti smo uporabili glajena povpre listih.
Slika 3: Spektri povprečnih vrednosti relativnega odboja (zelena barva) in relativne presevnosti (modra barva)
Iz grafa (Slika 6) je razvidno, da
presevnost. Potem pa pride v vidnem delu spektra (400 tem delu spektra presevnost ve
presevnost v vidnem delu spe
odbojnost doseže maksimum v zelenem delu spektra pri 500 nm, medtem ko presevnost doseže maksimum v rumenem delu spektra pri 582 nm. Iz grafa je razvidno tudi, da odbojnost in presevnost dosežeta minimu
dolžini okrog 690 nm. V NIR več kot očitna. Odbojnost je v NIR odbojnost kot tudi presevnost za
20 4.1 ODBOJNOST IN PRESEVNOST LISTOV
Za prikaz presevnosti in odbojnosti smo uporabili glajena povprečja intenzitet po
nih vrednosti relativnega odboja (zelena barva) in relativne presevnosti (modra barva) skozi liste pri vrsti Salvinia auriculata; n = 10
Iz grafa (Slika 6) je razvidno, da je odbojnost v UV-območju (280–
ride v vidnem delu spektra (400–700 nm) do preobrata in tako je v tem delu spektra presevnost večja kot odbojnost. Še vseeno pa sta tako odbojnost kot tudi presevnost v vidnem delu spektra večji kot v UV-območju. V delu vidnega spektra odbojnost doseže maksimum v zelenem delu spektra pri 500 nm, medtem ko presevnost doseže maksimum v rumenem delu spektra pri 582 nm. Iz grafa je razvidno tudi, da odbojnost in presevnost dosežeta minimum v rdečem delu vidnega spektra
dolžini okrog 690 nm. V NIR-območju (700-887 nm) je razlika v odbojnosti in presevnosti itna. Odbojnost je v NIR-območju še vedno manjša kot presevnost, vendar tako odbojnost kot tudi presevnost začneta nad 680 nm valovne dolžine strmo naraš
čja intenzitet po desetih
nih vrednosti relativnega odboja (zelena barva) in relativne presevnosti (modra
–400 nm) večja kot 700 nm) do preobrata in tako je v ja kot odbojnost. Še vseeno pa sta tako odbojnost kot tudi ju. V delu vidnega spektra odbojnost doseže maksimum v zelenem delu spektra pri 500 nm, medtem ko presevnost doseže maksimum v rumenem delu spektra pri 582 nm. Iz grafa je razvidno tudi, da em delu vidnega spektra pri valovni 887 nm) je razlika v odbojnosti in presevnosti ju še vedno manjša kot presevnost, vendar tako ad 680 nm valovne dolžine strmo naraščati.
21 4.2 ANATOMIJA LISTOV
Slika 4: Razdalja med trihomi, debelina povrhnjice, aerenhima in celotnega lista
Na prečnih prerezih listov je opazen obsežen aerenhim, ki predstavlja skoraj celotno debelino lista. Debelina povrhnjice je v primerjavi z debelino aerenhima precej tanka. Iz grafa (Slika 7) je razvidno, da je razdalja med trihomi v primerjavi z drugimi dolžinami precej velika.
Slika 5: Površina lista vrste Salvinia auriculata (Foto: Dragan Abram) 0
100 200 300 400 500 600 700 800 900
razdalja med trihomi debelina povrhnjice debelina lista debelina aerenhima
(µm)
22
Slika 6: Površina lista vrste Salvinia auriculata (Foto: Dragan Abram)
Slika 7: Trihomi pri vrsti Salvinia auriculata (Foto: Dragan Abram)
23 4.3 BIOKEMIJA LISTOV
Tabela 1: Vsebnost biokemijskih parametrov listov, izražena na površino lista. Vrednosti so povprečja ± SD.
Biokemijski parameter Salvinia auriculata
Klorofil a (g/cm²) 0,013 ± 0,004
Klorofil b (g/cm²) 0,016 ± 0,005
Karotenoidi (g/cm²) 0,003 ± 0,001
Antociani (rel. enote/cm²) 1,027 ± 0,588
UV-A as (rel. enote/cm²) 6,175 ± 0,632
UV-B as (rel. enote/cm²) 4,669 ± 0,528
Iz Tabele 1, ki prikazuje vsebnost biokemijskih parametrov listov, izraženo na površino lista, je razvidno, da je povprečna vrednost klorofila b večja od povprečne vrednosti klorofila a, vendar pa se vsebnost klorofila a in klorofila b statistično značilno ne razlikuje pri vrsti Salvinia auriculata (p = 0,123). Iz Tabele 1 je razvidno tudi to, da je povprečna vrednost UVA-absorbirajočih snovi večja od povprečne vrednosti UVB-absorbirajočih snovi. Vsebnost UVA- in UVB-absorbirajočih snovi se statistično značilno razlikuje pri vrsti Salvinia auriculata (p = 0,000018).
Tabela 2: Vsebnost biokemijskih parametrov listov, izražena na maso suhe snovi lista.
Biokemijski parameter Salvinia auriculata
Klorofil a (mg/g ss) 8,403 ± 3,334
Klorofil b (mg/g ss) 10,814 ± 4,656
Karotenoidi (mg/g ss) 2,159 ± 0,904
Antociani (rel. enote/g ss) 684 ± 451
UV-A as (rel. enote/g ss) 3954 ± 972
UV-B as (rel. enote/g ss) 2984 ± 738
Iz Tabele 2, ki prikazuje vsebnost biokemijskih parametrov listov, izraženo na maso suhe snovi lista, je razvidno, da je povprečna vrednost klorofila b večja od povprečne vrednosti klorofila a, vendar pa se vsebnost klorofila a in klorofila b statistično značilno ne razlikuje pri vrsti Salvinia auriculata (p = 0,2). Iz Tabele 2 je razvidno tudi to, da je povprečna vrednost UVA-absorbirajočih snovi večja od povprečne vrednosti UVB-absorbirajočih
24
snovi. Vsebnost UVA- in UVB-absorbirajočih snovi se statistično značilno razlikuje pri vrsti Salvinia auriculata (p = 0,022).
4.4 KORELACIJA MED OPTIČNIMI IN ANATOMSKIMI TER BIOKEMIJSKIMI LASTNOSTMI LISTOV
Naši odvisni spremenljivki sta prepustnost in odbojnost lista za svetlobo, odvisni pa sta od anatomskih in biokemijskih parametrov, ki smo jih opisali.
4.4.1 Odbojnost lista
Rezultati so pokazali statistično signifikantno korelacijo odbojnosti z anatomskimi lastnostmi lista, niso pa pokazali nobene korelacije z biokemijskimi lastnostmi lista (Tabela 3). Večja kot je razdalja med trihomi, manj svetlobe se odbije v spektru UV-A, kar pomeni, da gre v tem primeru za negativno korelacijo med odbojnostjo v spektru UV-A in razdaljo med trihomi. Tudi debelina povrhnjice in odbojnost v modrem, vijoličnem, zelenem in rumenem svetlobnem spektru negativno korelirata, in sicer debelejša kot je povrhnjica, manjša je odbojnost v modrem, vijoličnem, zelenem in rumenem svetlobnem spektru. Debelina aerenhima negativno korelira z odbojnostjo v rdečem delu svetlobnega spektra, torej debelejši kot je aerenhim, manj svetlobe se odbije v rdečem delu svetlobnega spektra.
25
Tabela 3: Soodvisnost odbojnosti in biokemijskih ter anatomskih značilnosti listov v določenih spektralnih pasovih, izraženih s Spearmanovim korelacijskim koeficientom.
Z rdečo barvo smo označili statistično značilne razlike, kjer je p ≤ 0,05. S simbolom ° smo označili p- vrednosti, pri katerih je vrednost korelacijskega koeficienta negativna.
Območje svetlobnega spektra
Parameter UV-B UV-A vijolična modra zelena rumena rdeča NIR Klorofil a (g/cm²) 0,676 ° 0,580 0,365 0,174 0,489 0,293 0,138 0,726 ° Klorofil a (mg/g ss) 0,934 ° 0,676 0,385 0,162 0,556 0,347 0,174 0,855 ° Klorofil b (g/cm²) 0,590 ° 0,751 0,444 0,250 0,444 0,258 0,148 0,688°
Klorofil b (mg/g ss) 0,726 0,489 0,310 0,244 0,511 0,425 0,328 0,987 Karotenoidi (g/cm²) 0,737 ° 0,867 0,712 0,372 0,712 0,392 0,204 0,577 ° Karotenoidi (mg/g ss) 0,855 0,511 0,385 0,162 0,556 0,310 0,150 0,907 ° UV-A abs. snovi (rel.
enota/cm²)
0,907 0,881° 0,310 0,128 0,214 0,244 0,150 0,446
UV-A abs. snovi (rel.
enota/g ss)
0,603 0,651 0,138 0,108 0,162 0,187 0,187 0,425
UV-B abs. snovi (rel.
enota/cm²)
0,881 0,777 ° 0,365 0,260 0,293 0,405 0,385 0,446
UV-B abs. snovi (rel.enota/g ss)
0,701 0,751 0,174 0,150 0,200 0,260 0,260 0,446
Antociani (rel. enota/cm²) 0,467 0,446 0,150 0,446 0,128 0,405 0,651 0,200 Antociani (rel.enota/g ss) 0,328 0,328 0,174 0,511 0,260 0,627 0,855 0,276 Razdalja med trihomi 0,188 0,000 ° 0,285 0,873 0,624 0,624 1,000 0,624 Debelina povrhnjice 0,188 0,624 0,037 ° 0,037 ° 0,000 ° 0,000 ° 0,188 0,104 Debelina lista 0,285 0,391 0,624 0,747 ° 0,873 ° 0,873 ° 0,391 ° 0,505 Debelina aerenhima 0,873 ° 0,873 ° 0,624 ° 0,188 ° 0,285 ° 0,285 ° 0,037 ° 1,000
26
Tabela 4: Soodvisnost presevnosti in biokemijskih ter anatomskih značilnosti listov v določenih spektralnih pasovih, izraženih s Spearmanovim korelacijskim koeficientom.
Z rdečo barvo smo označili statistično značilne razlike, kjer je p ≤ 0,05. S simbolom ° smo označili p- vrednosti, pri katerih je vrednost korelacijskega koeficienta negativna.
Območje svetlobnega spektra
Parameter UV-B UV-A vijolična modra zelena rumena rdeča NIR Klorofil a (g/cm²) 0,138 ° 0,676 0,365 0,603 0,603 ° 0,829 ° 0,907 0,033 ° Klorofil a (mg/g ss) 0,048 ° 0,881 0,328 0,365 0,881 ° 0,855 0,580 0,128 ° Klorofil b (g/cm²) 0,137 ° 0,789 0,532 0,841 0,403 ° 0,602 ° 0,841 ° 0,023 ° Klorofil b (mg/g ss) 0,074 ° 0,907 ° 0,511 0,726 0,467 ° 0,627 ° 0,934 ° 0,150 ° Karotenoidi (g/cm²) 0,011 ° 0,960 0,486 0,464 0,907 ° 0,802 0,542 0,141 ° Karotenoidi (mg/g ss) 0,038 ° 0,751 0,244 0,260 0,934 0,701 0,425 0,214 ° UV-A abs. snovi (rel.
enota/cm²)
0,701 0,855 ° 0,907 0,934 ° 0,603 ° 0,726 ° 0,881 ° 0,138 °
UV-A abs. snovi (rel.
enota/g ss)
0,293° 0,803 ° 0,651 0,855 0,365 ° 0,489 ° 0,751 ° 0,150 °
UV-B abs. snovi (rel.
enota/cm²)
0,533 0,533 ° 0,627 ° 0,627 ° 0,489 ° 0,580 ° 0,777 ° 0,385 °
UV-B abs. snovi (rel.enota/g ss)
0,244 ° 0,627 ° 0,829 0,907 0,405 ° 0,556 ° 0,829 ° 0,187 °
Antociani (rel. enota/cm²) 0,934 0,511 ° 0,533 ° 0,229 ° 0,067 ° 0,060 ° 0,128 ° 0,276 ° Antociani (rel.enota/g ss) 0,803 ° 0,446 ° 0,627 ° 0,310 ° 0,098 ° 0,090 ° 0,187 ° 0,365 ° Razdalja med trihomi 0,505 0,873 0,873 0,037 ° 0,037 ° 0,037 ° 0,037 ° 0,624 ° Debelina povrhnjice 0,037 0,285 0,391 0,391 ° 0,391 ° 0,391 ° 0,391 ° 0,624 ° Debelina lista 0,624 ° 0,188 ° 0,747 ° 0,747 ° 0,747 ° 0,747 ° 0,747 ° 0,285 ° Debelina aerenhima 0,188 ° 0,000 ° 0,188 ° 0,624 0,624 0,624 0,624 0,037
27 4.4.2 Presevnost lista
Rezultati so pokazali korelacijo presevnosti z anatomskimi in biokemijskimi lastnostmi lista (Tabela 4). Klorofil a negativno korelira s presevnostjo v območju UV-B in NIR, kar pomeni, da večja kot je količina klorofila a, manjša je presevnost v območju UV-B in NIR.
Klorofil b negativno korelira s presevnostjo v NIR-območju, torej večja kot je količina klorofila b, manjša je presevnost v NIR-območju. Karotenoidi negativno korelirajo s presevnostjo v spektru UV-B, torej večja kot je količina karotenoidov, manjša je presevnost v spektru UV-B. Rezultati so pokazali tudi negativno korelacijo med presevnostjo in razdaljo med trihomi, kar pomeni, da večja kot je razdalja med trihomi, manjša je presevnost v modrem, zelenem, rumenem in rdečem delu svetlobnega spektra.
Debelina povrhnjice pozitivno korelira s presevnostjo v območju UV-B, torej debelejša kot je povrhnjica, večja je presevnost v območju UV-B. Debelina aerenhima negativno korelira s presevnostjo v območju UV-A in pozitivno korelira v NIR-območju, kar pomeni, da debelejši kot je aerenhim, manjša je presevnost v območju UV-A in večja je presevnost v NIR-območju.
28 5 RAZPRAVA
Listi različnih vrst imajo poleg anatomskih in biokemijskih tudi specifične optične lastnosti, ki so določene z različnimi listnimi parametri. Ti parametri so absorpcija in prepustnost listov ter razpršenost svetlobe znotraj lista (Carter in Knapp, 2001). Relativne vrednosti teh parametrov so odvisne od anatomske in biokemične strukture lista (Klančnik in sod., 2014). Torej je bil glavni namen diplomske naloge raziskati vpliv anatomskih in biokemijskih lastnosti listov na odbojnost in presevnost listov vrste Salvinia auriculata iz družine plavčevk (Salviniaceae).
Izmerili smo odbojne in presevne spektre listov, šele potem smo preučili anatomijo in biokemijo listov in korelacijo med optičnimi in anatomski ter biokemijskimi lastnostmi listov.
Pri meritvah odbojnosti in presevnosti smo upoštevali rezultate v območju sevanja UV-A in UV-B, vidnem območju in območju bližnjega infrardečega sevanja (270–887 nm).
Rezultati so pokazali, da sta odbojnost in presevnost v vidnem delu spektra večji kot v UV-območju in manjši kot v NIR-območju.
Yoshimura in sod. (2010) ugotavljajo, da odbojnost lista v UV-delu spektra znaša 5 %, medtem ko je prepustnost enaka nič. V UV-delu spektra prevladuje močna absorpcija, ravno na račun UV-absorbirajočih snovi (Yoshimura in sod., 2010).
Odbojnost in presevnost sta v NIR-območju največji zato, ker na tem območju pigmenti ne absorbirajo svetlobe in nimajo nobenega vpliva. Največji vpliv v tem delu imajo anatomske lastnosti lista. (Grant, 1987; Vogelmann, 1993). Tudi iz naših rezultatov je razvidno (Slika 6), da tako odbojnost kot tudi presevnost začneta v NIR nad 680 nm valovne dolžine strmo naraščati na tako imenovani ''rdeči rob'', ki vodi do visoke absorpcije v bližnjem IR-platoju, kjer pigmenti v listih ne absorbirajo sevanja (Blackburn, 2006). V delu vidnega spektra je presevnost najvišja v valovnih pasovih, kjer je visoka tudi odbojnost, to pa je v zelenem in rumenem delu spektra (Larcher, 2003). Naši rezultati so pokazali, da v delu vidnega spektra odbojnost doseže maksimum v zelenem delu spektra pri 500 nm, saj v tem delu klorofili svetlobe ne absorbirajo (Larcher, 2003). Presevnost pa
29
pri naši raziskavi doseže maksimum v rumenem delu vidnega spektra pri 582 nm.
Maksimuma predstavljata območje, kjer rastlinski pigmenti svetlobo predvsem odbijajo ali pa svetloba prehaja skozi list (Slaton,1995). Odbojnost in presevnost pri naši raziskavi dosežeta minimum v rdečem in modrem delu vidnega spektra. Minimumi predstavljajo močna absorpcijska področja, kjer rastlinski pigmenti absorbirajo večino vpadne svetlobe (Slaton, 1995).
Korelacije, ki smo jih izračunali med biokemijskimi in anatomskimi parametri ter med odbojnimi spektri pri vrsti Salvinia auriculata, so nam pokazale, da imajo anatomske lastnosti listov največji vpliv na odbojnost, kar so v svojih raziskavah potrdili tudi Slaton in sod. (2001). Liew in sod. (2008) ugotavljajo, da predvsem debelina povrhnjice vpliva na količino svetlobe, ki se odbije s površine lista (Liew in sod., 2008). Iz naših rezultatov je razvidno (Tabela 3), da debelina povrhnjice vpliva na odbojnost v modrem, zelenem, rumenem in rdečem delu spektra. Poleg tega so rezultati pokazali, da na odbojnost v spektru UV-A vpliva razdalja med trihomi, medtem ko na odbojnost v rdečem delu spektra vpliva debelina aerenhima. Čeprav smo predvidevali, da bo naša raziskava pokazala tudi korelacijo med odbojnostjo in biokemijskimi parametri, tega nismo uspeli dokazati.
Pričakovali smo predvsem korelacijo med klorofili in odbojnostjo v zelenem delu spektra.
Sama raziskava vsebnosti biokemijskih parametrov v listu je pokazala, da je povprečna vrednost klorofila a večja kot povprečna vrednost klorofila b, vendar pa se vsebnost obeh statistično značilno ne razlikuje pri vrsti Salvinia auriculata. Liew in sod. (2008) v svoji raziskavi ugotavljajo, da na razmerje med klorofilom a in klorofilom b vplivajo predvsem abiotski dejavniki, predvsem svetloba. Tudi ob stresu se količina klorofilov običajno zmanjša (Liew in sod., 2008)
Pri raziskavi smo ugotovili, da imajo anatomske lastnosti vpliv tudi na presevnost. Tudi Larcher (2003) v svoji raziskavi ugotavlja, da je količina prepuščene svetlobe odvisna predvsem od same strukture in debeline listov. Namreč zelo tanki listi prepustijo več kot 40 % sončevega sevanja, medtem ko debeli in grobi listi skoraj da ne prepuščajo svetlobe, oziroma jo prepustijo zelo malo (manj kot 3 %) (Larcher, 2003). Naša raziskava je pokazala korelacijo med debelino povrhnjice in presevnostjo v spektru UV-B, razdalja med trihomi vpliva na presevnost v modrem, zelenem, rumenem in rdečem delu spektra,
30
medtem ko debelina aerenhima vpliva na presevnost v območju UV-A in NIR. Rezultati naše raziskave so pokazali, da imajo tudi biokemijske lastnosti vpliv na presevnost. Iz rezultatov je razvidno, da klorofil a vpliva na presevnost v območju UV-B in v NIR, klorofil b vpliva na presevnost le v NIR-območju, medtem ko karotenoidi vplivajo na presevnost v spektru UV-B.
