UNIVERZA V LJUBLJANI ZDRAVSTVENA FAKULTETA
SANITARNO INŽENIRSTVO, 2. STOPNJA
Nina Mavrič
UGOTAVLJANJE ANTIOKSIDATIVNIH IN PROTIMIKROBNIH LASTNOSTI EKSTRAKTA JABOLČNIH OLUPKOV, KI GA LAHKO DODAJAMO
HITOZANSKEMU PREMAZU ZA ŽIVILA
magistrsko delo
DETERMINATION OF ANTIOXIDANT AND ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF APPLE PEEL
EXTRACT AS POSSIBLE ADITIVE FOR CHITOSANE BASED EDIBLE COATING
master thesis
Mentorica: doc. dr. Mojca Bavcon Kralj
Somentorica: izr. prof. dr. Karmen Godič Torkar Recenzentka: prof. dr. Polonca Trebše
Ljubljana, 2021
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Mojci Bavcon Kralj in somentorici izr. prof. dr. Karmen Godič Torkar za vse nasvete, predajo znanja, pomoč in podporo pri pripravi magistrskega dela.
Zahvaljujem se tudi družini, ki me je pri pripravi magistrskega dela spodbujala in podpirala.
IZVLEČEK
Uvod: Velik del plastične embalaže uporabljamo kot embalažo za živila. S svojimi stranskimi produkti, ki se sproščajo v živilo, plastična embalaža škodljivo vpliva na zdravje ljudi in živali, poleg tega po masi sodi med glavna onesnaževala okolja.
Alternativa plastični embalaži so t. i. jedilni premazi za živila, ki so biorazgradljivi, užitni in sestavljeni iz obnovljivih virov, npr. iz beljakovin, lipidov in polisaharidov ter njihovih kombinacij. Hitozan, derivat hitina, je eden izmed polisaharidov, ki ga lahko uporabljamo kot užitni premaz. Zaradi svoje slabe antioksidativne in protimikrobne učinkovitosti hitozanskemu premazu dodajamo razne dodatke, ki te lastnosti izboljšajo, npr. jabolčni ekstrakt. Namen: Namen magistrskega dela je ugotoviti protimikrobno in antioksidativno delovanje jabolčnega ekstrakta, izdelanega iz domačih jabolk. Metode dela: Najprej smo pregledali obstoječo literaturo, na temelju katere smo nadaljevali z laboratorijskim delom.
Iz različnih sort jabolk smo z eksperimentiranjem pripravili jabolčni ekstrakt s čim višjo vsebnostjo klorogene kisline, ki je bila modelna spojina z antioksidativnimi lastnostmi. Le- te smo določili z metodo Folin–Ciocalteu in jih preverili še v primeru raztopin, ki so vsebovale hitozan. Protimikrobno delovanje jabolčnega ekstrakta, standardne raztopine klorogene kisline in raztopine hitozana smo preverjali z določanjem občutljivosti na desetih izbranih sevih standardnih mikroorganizmov in nekaj osamljenih sevov iz jabolka.
Rezultati: Z eksperimentalno analizo smo določili optimalen način ekstrakcije. Izmed petih ekstraktov vzorcev domačih sort jabolk in enega vzorca kupljenih jabolk je najvišjo vsebnost klorogenske kisline imela domača sorta Jabolka 2, ki je imel 10-krat boljšo antioksidativno učinkovitost od drugih vzorcev, prav tako je imela tudi boljšo antioksidativno učinkovitost od standardne raztopine klorogene kisline. Raztopina hitozana ni prikazala antioksidativne učinkovitosti. Najboljše protimikrobne lastnosti proti preiskovanim mikroorganizmom, predvsem na standardni bakterijski sev B. cereus in na bakterijska seva B. cereus in S. sciuri, ki smo ju osamili iz jabolk, je imela raztopina hitozan in višje koncentracije jabolčnega ekstrakta, medtem ko standardna raztopina klorogene kisline na nobenega izmed preizkušenih sevov ni delovala inhibitorno.
Razprava in zaključek: V primerjavi z drugimi avtorji ima naš jabolčni ekstrakt višje koncentracije klorogene kisline. Antioksidativna učinkovitost našega jabolčnega ekstrakta je primerljiva z rezultati študij drugih avtorjev. Jabolčni ekstrakt ima inhibitorne lastnosti na 40 % preiskovanih mikroorganizmov. Na temelju svojih rezultatov lahko trdimo, da ima jabolčni ekstrakt potencial za dodatek hitozanu kot jedilni premaz. Antimikrobne in antioksidativne lastnosti jedilnega premaza na osnovi hitozana in jabolčnega ekstrakta pa bi se dalo z določenimi dodatki še dodatno izboljšati, kar druge študije že potrjujejo.
Ključne besede: Jedilni premaz, hitozan, jabolčni ekstrakt, antioksidativno delovanje, protimikrobno delovanje
ABSTRACT
Introduction: Plenty of plastic material is used as food packaging. It can be released in food and consequently it affects human and animal health. Nowadays, plastic material and microplastics pollution represent one of the major issues on planet Earth. An alternative to plastic packaging are the so called edible coatings for foods, which are biodegradable, edible and composed of renewable sources e.g. from proteins, lipids and polysaccharides or/and their combinations. Chitosan, a derivative of chitin, is one of the polysaccharides that can be used as edible coating. Due to its poor antioxidant and antimicrobial efficacy, various additives are added to the chitosan coating, which have the characteristics of improvement, like apple extracts. Purpose: The aim of this study is the determination of antioxidant and antimicrobial potential of an apple extract, made from home-grown apples without any pesticide treatment. Methods: Firstly, we reviewed the existing literature on the basis of which we continued with the laboratory work. From various varieties of apples, we prepared an apple extract with the highest possible chlorogenic acid (a model compound coming from naturally present apple antioxidants) content through experimentation. The antioxidant activity of apple extract, standard chlorogenic acid solution and chitosan solution was tested by the Folin–Ciocalteu method. The antimicrobial activity of apple extract, reference chlorogenic acid solution and chitosan solution were checked by determining the susceptibility of ten strains of microorganisms to their presence. Results: The optimal method of antioxidants extraction from apples was determined by experimental analysis. Among the five samples extracts of home-grown apple varieties and one sample of purchased apples, the highest content of chlorogenic acid showed the domestic variety Jabolka 2, which had 10 times better antioxidant activity than other apple extracts and also had better antioxidant efficiency than standard chlorogenic acid solution. Chitosan solution did not show antioxidant efficacy. The solution of chitosan and higher concentrations of apple extract had the best antimicrobial properties against the investigated microorganisms, while the standard solution of chlorogenic acid did not have an inhibitory effect on any of the analyzed microorganisms. Discussion and conclusion:
Compared to other authors, our apple extract had higher concentrations of chlorogenic acid. The antioxidant efficacy of our apple extract was comparable to the results of studies by other authors. Apple extract had inhibitory properties on 40% of the microorganisms tested. Based on our results, we can claim that apple extract has the potential to improve chitosan based edible coating. However, the antimicrobial and antioxidant properties of chitosan could be further improved with the addition of other additives, which would offer an overall protection of food.
Keywords: Edible Coating, Chitosan, Apple Extract, Antioxidative Properties, Antimicrobial Properties
KAZALO VSEBINE
1 UVOD ... 1
2 TEORETIČNA IZHODIŠČA ... 3
2.1 Naravni – jedilni premazi (užitna embalaža) za živila ... 3
2.1.1 Polisaharidi ... 4
2.1.1.1 Hitozan ... 4
2.1.1.1.1 Fizikalno-kemijske lastnosti hitozana ... 6
2.1.1.1.2 Protimikrobno delovanje hitozana ... 7
2.1.1.1.3 Antioksidativno delovanje hitozana ... 9
2.2 Naravni polifenoli ... 10
2.2.1 Jabolčni ekstrakt ... 11
2.2.1.1 5'-kafeoil kininska oz. klorogena kislina ... 12
3 NAMEN IN CILJI ... 14
4 METODE DELA ... 15
4.1 Pregled literature... 15
4.2 Izbira jabolk ... 15
4.3 Kemijske analize... 16
4.3.1 Umeritvena krivulja standarda... 17
4.3.2 Obstojnost standarda v hladilniku in v zamrzovalniku ... 17
4.3.3 Razvoj metode ekstrakcije ... 18
4.3.3.1 Poskus določanja optimalnega časa ekstrakcije ... 18
4.3.4 Preverjanje vsebnosti polifenolov v vseh vzorcih ... 19
4.3.5 Preverjanje vsebnosti polifenolov v ekstraktu, ki smo mu dodali vodo ... 19
4.3.5.1 Pridobivanje ekstraktov z višjimi koncentracijami 5'-kafeoil kininske oz. klorogene kisline ... 20
4.3.5.2 Poskus koncentriranja ekstrakta z višjo temperaturo ... 20
4.3.5.3 Ekstrakcija večjih količin naribanih jabolk z etil acetatom... 20
4.3.5.4 Ekstrakcija večjih količin naribanih jabolk z etanolom ... 21
4.3.6 Določanje antioksidativne učinkovitosti ... 23
4.4 Mikrobiološke preiskave ... 24
4.4.1 Opredelitev standardnih sevov mikroorganizmov ... 24
4.4.2 Priprava gojišč ... 25
4.4.3 Osamitev in identifikacija bakterijskih sevov mikroorganizmov s površine jabolk 27 4.4.3.1 Odvzem vzorca jabolk ... 27
4.4.3.2 Odvzem brisa jabolk ... 27
4.4.3.3 Gojenje in osamitev mikroorganizmov iz jabolk ... 28
4.4.3.4 Identifikacija sevov mikroorganizmov, osamljenih s površine jabolk .. 29
4.4.4 Določanje občutljivosti mikroorganizmov za jabolčni ekstrakt (JE) in hitozan 30 5 REZULTATI ... 33
5.1 Kemijski del ... 33
5.1.1 Umeritvena krivulja standarda ... 33
5.1.2 Obstojnost standarda v hladilniku in v zamrzovalniku ... 34
5.1.3 Poskus določanja optimalnega časa ekstrakcije ... 36
5.1.4 Preverjanje vsebnosti polifenolov v vseh vzorcih ... 36
5.1.5 Preverjanje vsebnosti 5-CQA v supernatantu, ki smo mu dodali vodo ... 38
5.1.6 Poskus koncentriranja ekstrakta z višjo temperaturo ... 41
5.1.7 Ekstrahiranje večjih količin naribanih jabolk z etil acetatom ... 41
5.1.7.1.1 Ekstrahiranje večjih količin sesekljanih jabolčnih olupkov v etanolu42 5.1.8 Določanje antioksidativne učinkovitosti ... 42
5.2 Mikrobiološki del ... 44
5.2.1 Osamitev in identifikacija bakterijskih sevov s površine jabolk ... 44
5.2.1.1 Gojenje in osamitev mikroorganizmov iz jabolk ... 44
5.2.1.2 Identifikacija bakterijskih sevov mikroorganizmov iz jabolk ... 45
5.2.2 Določanje občutljivosti mikroorganizmov ... 47
6 RAZPRAVA ... 52
6.1 Kemijski del ... 52
6.1.1 Umeritvena krivulja in obstojnost standarda 5-CQA ... 52
6.1.2 Razvoj metode ekstrakcije ... 53
6.1.3 Preverjanje koncentracije polifenolov v vseh vzorcih ... 53
6.1.4 Pridobivanje ekstraktov z višjimi koncentracijami polifenolov ... 54
6.1.4.1 Poskus koncentriranja ekstrakta z višjo temperaturo ... 54
6.1.5 Ekstrahiranje večjih količin naribanih jabolk z etil acetatom... 55
6.1.5.1 Ekstrahiranje večjih količin sesekljanih jabolčnih olupkov v etanolu ... 55
6.1.6 Določanje antioksidativne učinkovitosti ... 56
6.2 Mikrobiološki del ... 57
6.2.1 Identifikacija bakterijskih sevov mikroorganizmov iz jabolk ... 57
6.2.2 Določanje občutljivosti mikroorganizmov ... 58
7 ZAKLJUČEK ... 61
8 LITERATURA IN DOKUMENTACIJSKI VIRI ... 63
8.1 Dokumentacijski viri ... 79
9 PRILOGE
9.1 Uporabljeni vzorci jabolk in pripadajoče jablane
KAZALO SLIK
Slika 1: Kemična struktura hitozana (NCBI, 2020). ... 5
Slika 2: Viri hitozana in strukturni formuli hitina in hitozana (El-Hack et al., 2020). ... 6
Slika 3: Sistematični prikaz protimikrobnega delovanja hitozana in njegovih derivatov (Hosseinnejad, Jafari, 2016). ... 8
Slika 4: Strukturna formula 5-CQA (NCBI, 2021). ... 12
Slika 5: Umeritvena krivulja standarda 5-CQA. ... 33
Slika 6: Umeritvena krivulja standarda, hranjenega v hladilniku 1 teden. ... 35
Slika 7: Kromatogram standardne raztopine 5-CQA koncentracije 220 mg/L. ... 35
Slika 8: Kromatogram vzorca 2,3. ... 38
Slika 9: Kromatogram vzorca 2etanol.... 40
Slika 10: Kromatogram vzorca 2destilirana voda. ... 40
Slika 11: Umeritvena krivulja raztopine galne kisline. ... 44
Slika 12: MYP gojišče s kolonijo bakterije B. cereus. ... 45
KAZALO TABEL
Tabela 1: Opredelitev uporabljenih standardnih sevov mikroorganizmov ... 25
Tabela 2: Rezultati kromatografske analize raztopin standarda. ... 33
Tabela 3: Rezultati kromatografske analize preverjanja obstojnosti standarda v hladilniku in zamrzovalniku. ... 34
Tabela 4: Rezultati kromatografske analize poskusa določanja optimalnega časa ekstrakcije in izračun vsebnosti 5-CQA v posameznem vzorcu. ... 36
Tabela 5: Rezultati kromatografske analize in izračun vsebnosti 5-CQA v preiskovanih vzorcih. ... 37
Tabela 6: Rezultati kromatografske analize in izračun vsebnosti 5-CQA v analiziranih vzorcih. ... 39
Tabela 7: Rezultati kromatografske preostale priprave ekstrakta na višji temperaturi. ... 41
Tabela 8: Rezultati kromatografske analize v vzorcih jabolk, ki smo jih obravnavali z etil acetatom. ... 41
Tabela 9: Rezultati kromatografske analize in izračun vsebnosti 5-CQA v vzorcih jabolk. ... 42
Tabela 10: Rezultati določanja antioksidativne učinkovitosti na temelju Folin-Ciocalteu metode. ... 43
Tabela 11: Rezultati opazovanja mikroskopskih preparatov, obarvanih po Gramu. ... 46
Tabela 12: Določanje občutljivosti mikroorganizmov: prva ponovitev ... 48
Tabela 13: Določanje občutljivosti mikroorganizmov: druga ponovitev. ... 49
Tabela 14: Določanje občutljivosti mikroorganizmov: tretja ponovitev. ... 50
Tabela 15: Povprečne vrednosti inhibicijskih con določanja občutljivosti mikroorganizmov prve in druge ponovitve na učinkovine, ki smo jih dodajali po 10 µL. ... 51
SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC IN OKRAJŠAV
5-CQA 5'-kafeoil kininska kislina
ATCC American Type Culture Collection
CCA Kromogeno gojišče za koliformne bakterije (angl. Chromogenic Coliform Agar)
CCM Czech Collection of Microorganisms DPPH- 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal FW Teža svežih jabolk (Fresh Weight) GAE Ekvivalent galne kisline
HP Hitozanski premaz
JE Jabolčni ekstrakt
MEA Gojišče s sladnim ekstraktom za gojenje plesni (angl. Malt Extract Agar)
MH Gojišče Mueller Hinton
MYP Selektivno gojišče za odkrivanje bakterije B. cereus z manitolom, jajčnim rumenjakom in polimiksinom (angl. Manitol Yolk
Polimixin Agar)
ORAC Absorpcijska zmogljivost kisikovega radikala (angl. Oxygen Radical Absorbance Capacity)
PCA Gojišče za določanje skupnega števila mikroorganizmov (angl.
Plate Count Agar)
SŠMO Skupno število aerobnih mezofilnih mikroorganizmov TBX Kromogeno gojišče s triptonom in žolčnimi solmi za gojenje
bakerije E. coli (angl. Tryptone bile X-gluc agar) TE Trolox-ovi ekvivalenti
YEPD Gojišče s kvasnim ekstraktom, peptonom in dekstrozo za gojenje kvasovk (angl. Yeast Extract Peptone Dextrose Agar)
ZIM Zbirka industrijskih mikroorganizmov Biotehniške fakultete v Ljubljani
1 UVOD
Plastična embalaža je vsestranski produkt različnih kemijskih komponent, ki jo vsakodnevno uporabljamo povsod v svetu. Kljub vsestranskosti gospodinjske uporabe je njena razgradnja časovno in okoljsko zahtevna. Med antropogenimi onesnaževali, ki jih ljudje odlagamo v okolje, sodi plastična embalaža po masi med glavna onesnaževala (Rajmohan et al., 2019). Embalaža kot takšna ni inertna, njene strupene sestavine se v okolju razpršijo v obliki mikropastičnih delcev, ki lahko prenašajo snovi. Le-te so nato izvor različnih zdravstvenih težav (Kavlock et al., 2002; Cox et al., 2019). Med gorenjem se iz plastične embalaže sproščajo razni produkti, ki predstavljajo nevarnost za ekosistem, medtem ko mikroplastika predstavlja nevarnost ne le za vodne in kopenske organizme ter ozračje, temveč tudi za celotno prehransko verigo (Rajmohan et al, 2019; Waring et al, 2018).
V zadnjih desetletjih vse več plastične embalaže med drugim uporabljamo tudi za zaščito živil. Primarna funkcija plastične embalaže za živila je ločiti živilo od okolja in s tem zmanjšati ali preprečiti izpostavljenost živila dejavnikom kvarjenja živila, kot so mikroorganizmi, kisik, temperatura in vlažnost. Na tak način se živilu podaljšuje njegov rok uporabnosti (Kumar et al., 2020). Na voljo je široka paleta različnih vrst plastične embalaže za zaščito živil, ki so jim dodani različni aditivi. Med obdelavo in shranjevanjem ter morebitno spremembo temperature se ti aditivi izločajo iz embalaže v živila, posledica česar je sprememba organoleptičnih lastnosti živila, medtem ko so epidemiološke raziskave pokazale številne spremembe na zdravju po izpostavljenosti pri ljudeh in živalih, kot so vedenjske motnje, nepravilno delovanje reproduktivnega sistema, slabša odzivnost imunskega sistema, nepravilno delovanje ščitnice in hipofize, povečana incidenca raka dojk, testisov in prostate ter drugih vrst raka (Yang et al., 2011; Cox et al., 2019; Khajavi et al., 2019).
Zdrava in varna hrana brez sintetičnih kemikalij, kot so konzervansi, je postala eden izmed ključnih izzivov za proizvajalce in živilska podjetja (Kumar et al., 2020). V zadnjem desetletju so naraščajoči pomisleki potrošnikov glede zdravja in okolja okrepili uporabo embalažnih materialov za živila na osnovi biološko razgradljivih polimerov kot nadomestilo za sintetične polimere (Rodríguez-Rojas et al., 2019). Ena izmed alternativ, ki bi se v svetu lahko bolj razširila, je uporaba t. i. užitne embalaže za živila oziroma jedilnih
razni polisaharidi, kot so celuloza, škrob, hitozan, agar; razne beljakovine, kot so kazein, mlečni serum in kolagen; ter lipidi, kot so eterična olja in voski (Cazón et al., 2017), vsi našteti so potencialne zamenjave plastičnih polimerov (Fabra et al., 2014). Užitna embalaža se v prisotnosti ustrezne količine vlage, ustreznih temperaturnih razmer in prisotnosti kisika biorazgradi brez nastanka strupenih ostankov. Nekateri biopolimeri se razgradijo že v nekaj tednih, medtem ko razgradnja sintetičnih polimerov traja več deset let, odvisno od tipa in izvora polimera (Barboza et al., 2018).
Številni izmed naštetih biopolimerov sami po sebi nimajo zadostne protimikrobne in antioksidativne sposobnosti, da bi jih lahko samostojno uporabljali kot JP (Mir et al., 2018). Zato je dodajanje aktivnih naravnih sestavin obetaven pristop k izboljšanju učinkovitosti JP na osnovi biopolimerov (Rambabu et al., 2018). Zanimalo nas je delovanje hitozana, ki ga lahko uporabljamo kot JP za živila. Zato smo v okviru magistrskega dela pripravili ekstrakt iz jabolk, ki so bogat vir polifenolov z dobrimi protimikrobnimi (Bajko et al., 2014) in antioksidativnimi (Vrhovšek et al., 2004) lastnostmi. Pripravljenemu ekstraktu smo preverili antioksidativne in protimikrobne lastnosti, rezultate primerjali z že obstoječo literaturo in na koncu ovrednotili uporabo ekstrakta iz jabolk kot dodatek JP iz hitozana kot samostojen JP za živila.
2 TEORETIČNA IZHODIŠČA
V poglavju teoretična izhodišča so podrobneje predstavljeni posamezni sklopi.
Predstavljeni so naravni premazi, pri čemer je izmed širokega izbora podrobneje predstavljen hitozanski premaz (v nadaljevanju besedila: HP), vključno z njegovimi prednostmi in slabostmi. Predstavljene so možnosti, kako lahko izboljšamo učinkovitost HP.
2.1 Naravni – jedilni premazi (užitna embalaža) za živila
JP oziroma t. i. užitni premazi predstavljajo zelo tanek užitni sloj embalaže na površini živila, ki služi kot zaščita pred fizikalnim, kemičnim in biološkim propadom živila (Sahraee et al., 2019). Užitni in biološko razgradljivi premazi so alternativa sintetičnim embalažnim materialom. V neposrednem stiku z živili preprečujejo izgubo vode, arom, onemogočajo transport topnih snovi, absorpcijo vode iz okolice v živilo in preprečujejo oksidacijo v živila (Aider, 2010; Dutta et al., 2009). Zaradi zgoraj naštetih zmožnosti jih uporabljamo za zaščito in podaljševanje roka uporabnosti živil (Galus, Kadzińska, 2015).
JP za živila so izdelani iz surovin, pridobljenih iz obnovljivih virov, večinoma so to beljakovine, lipidi in polisaharidi ter njihove kombinacije. Za izboljšanje splošnih lastnosti se JP večinoma primešajo razni dodatki (Cazón et al., 2017; Hassan et al., 2018).
Vse opisane skupine snovi, ki jih uporabljamo za izdelavo JP za živila, omogočajo zmanjševanje pritiska onesnaževal na okolje, ki ga prinaša odpadna embalaža.
Preden JP uporabimo za živila, je treba snovi, iz katerih je sestavljen, ustrezno obdelati.
Osnovno surovino raztopimo ali razpršimo z ustreznim topilom oziroma mešanico topil.
Pri obdelavi uporabimo tudi pomožna sredstva, kot so mehčala, protimikrobna sredstva, barvila, arome ipd. Za lažjo topnost sta morda potrebna prilagoditev pH in segrevanje oziroma ohlajevanje raztopin. Po tem, ko pridobimo želeni JP, ga na živilo lahko nanesemo s potapljanjem živila v JP, brizganjem in ščetkanjem JP na živilo, čemur sledi sušenje (Bourtoom, 2008).
2.1.1 Polisaharidi
Na voljo imamo številne polisaharide in široko paleto dodatkov, ki jih lahko uporabimo za izdelavo JP. Poznamo polisaharide rastlinskega izvora (celuloza, škrob, pektini), polisaharide morskega izvora (polisaharidi iz alg), polisaharide mikrobiološkega izvora in polisaharide živalskega izvora (hitin, hitozan) (Mohamed et al., 2020; Zhu, 2021).
Polisaharidi niso zdravju škodljivi in so široko razširjeni v naravi (Erginkaya et al., 2014).
V nadaljevanju je podrobneje opisan hitozan, ki smo ga v okviru tega dela tudi uporabili.
2.1.1.1 Hitozan
Hitozan, katerega sinonimi so tudi poliglusam, deacetilhitin idr., je derivat hitina, ki ga pridobimo z deacetiliranjem hitina. Hitin je za celulozo drugi najpogostejši biopolimer v naravi. Najdemo ga v eksoskeletu rakov in žuželk (členonožcev), v celičnih stenah gliv in v drugih bioloških materialih (Campos et al., 2010; Cazón, Vázquez, 2019).
Sestavljen je iz naključno razporejenih verig β-(1-4) d-glukozamina (deacetilirana skupina) in N-acetil-d-glukozamina (acetilirana skupina), ki sta po verigi naključno razporejena.
Hitozan ni čista spojina, temveč zmes polimerov z različnimi molekulskimi masami in stopnjami deacetilacije, kar močno vpliva na njegovo biološko aktivnost. Ker hitozan pridobivamo iz obnovljivih virov, ni drag in je komercialno dostopen. Pri sobni temperaturi je v trdnem agregatnem stanju (Cazón, Vázquez, 2019; NCBI, 2020).
Primer strukturno razvejane molekule hitozana je prikazan na Sliki 1.
Slika 1: Kemična struktura hitozana (NCBI, 2020).
Zaradi svojih lastnosti: biorazgradljivosti, nestrupenosti in zmožnosti tvorjenja filma, je hitozan primeren za uporabo kot JP. Lastnosti tega polisaharida so trpežnost, stabilnost, prožnost in antioksidativna aktivnost (Grande-Tovar et al., 2018). Zanimanje za hitozan je posledica njegovih številnih zdravju koristnih učinkov, vključno s protitumorskim učinkom (Karagozlu, Kim, 2014) in antioksidativnimi aktivnostmi (Muxika et al., 2017). Zaradi slednjih ga lahko uporabljamo samostojno ali v kombinaciji z drugimi učinkovinami z antioksidativnimi in protimikrobnimi lastnostmi (Qin, Li, 2020).
Kot že omenjeno, hitozan pridobivamo iz hitina. Pridobivanje hitozana vključuje tri glavne korake: demineralizacijo, deproteinizacijo in deacetilacijo. Pri pridobivanju hitozana uporabljamo koncentrirane raztopine močne kisline ali baze (npr. NaOH), s katerimi raztapljamo kalcijeve karbonate oziroma beljakovine (Negm et al., 2020). Slika 2 prikazuje nekatere vire hitina ter strukturni formuli hitina in hitozana. Hitin je sam po sebi zelo slabo topen v vodi in ni reaktiven (van den Broek et al., 2015). Z deacetilacijo hitina v hitozan izboljšamo topnost novo nastale spojine v vodi, ki ima zaradi prostih amino-skupin več možnosti za kemijska preoblikovanja spojine (Negm et al., 2020).
Hitozan se zlahka oprijema bioloških površin, kar je posledica pozitivnega naboja, ki omogoča pridobivanje stabilnih premazov s selektivno prepustnostjo plinov (Grande-Tovar et al., 2018).
Slika 2: Viri hitozana in strukturni formuli hitina in hitozana (El-Hack et al., 2020).
Smrtni odmerek hitozana za 50 % populacije (LD50) znaša 16 g/dan/kg telesne teže pri miših in 1,33 g/dan/kg telesne teže pri ljudeh. Klinično dokazano je, da dnevno uživanje 3–
6 g hitozana na ljudi nima škodljivih učinkov (Bakshi et al., 2020).
2.1.1.1.1 Fizikalno-kemijske lastnosti hitozana
Fizikalno-kemijske lastnosti hitozana določata molekulska masa in odstotek deacetilacije, ki jo določimo na dva načina: kot stopnjo deacetilacije in kot stopnjo acetilacije. Slednja je pogosteje uporabljena in predstavlja razmerje med monomeri N-acetil glukozamina v primerjavi s skupnim številom monomera. Stopnja acetilacije polimera običajno znaša <50
%, vendar se lahko spreminja (Benediktsdóttir et al., 2014).
Hitozan je netopen v vodi in v večini organskih topil, topen je v razredčenih kislinah, ki imajo vrednosti pH manjši od 6,5 npr. klorovodikova kislina, mravljična kislina, ocetna kislina (Hosseinnejad, Jafari 2016; Wang et al., 2020). Optimalno topnost v kislem mediju ima hitozan pri stopnji acetilacije med 45 in 55 % (El-Hack et al., 2020). Splošno velja, da višja, kot je stopnja deacetilacije hitozana, višja je stopnja protonacije amino-skupin molekule hitozana, zato se lažje raztopi. Nasprotno velja za molsko maso hitozana: večja, kot je, več je v njej intra- in intermolekularnih vodikovih vezi, kar povzroča večjo prepletenost verige polimera. Posledično je takšna molekula hitozana težje topna (Wang et al., 2020).
2.1.1.1.2 Protimikrobno delovanje hitozana
Hitozan deluje protimikrobno na široko področje bakterij, tako po Gramu pozitivnih in po Gramu negativnih bakterij. Predstavniki po Gramu pozitivnih bakterij so Bacillus cereus (B. cereus), Staphylococcus aureus (S. aureus), Bacillus megaterium (B. megaterium), Lactobacillus plantarum (L. plantarum), Listeria monocytogenes (L. monocytogenes), Lactobacillus brevis (L. brevis) in Lactobacillus bulgaricus (L. bulgaricus) ter predstavniki po Gramu negativnih npr. Salmonella typhimurium (S. typhimurium), Escherichia coli (E.
coli), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Pseudomonas fluorescens (P.
fluorescens), Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus), Enterobacter aerogenes (E.
aerogenes), in Vibrio cholerae (V. cholerae) (Hosseinnejad, Jafari, 2016; Sahariah, Masson, 2017). Nekateri avtorji trdijo, da je protimikrobno delovanje hitozana proti po Gramu negativnim bakterijam močnejše kot proti po Gramu pozitivnim bakterijam (No et al., 2002), medtem ko drugi trdijo nasprotno (Chung et al., 2004).
V svojem preglednem članku Hosseinnejad in Jafari (2016) navajata štiri različne načine, na temelju katerih hitozan deluje protimikrobno na bakterije.
1. Protibakterijska aktivnost hitozana je posledica interakcij hitozanovih pozitivno nabitih skupin NH3+ z negativno nabitimi delci v zunanji lipopolisaharidni plasti celične stene po Gramu negativnih bakterij oziroma teihoični kislini v celični steni pri po Gramu pozitivnih bakterij, kar poveča prepustnost celične stene in povzroči uhajanje znotrajceličnih sestavin in končno lizo celice (Li et al., 2015).
2. Produkti hitozana reagirajo z DNA mikroorganizma, kar inhibira sintezo mRNA in beljakovin v mikroorganizmu (Yuan et al., 2016b).
3. Hitozan zavira rast mikroorganizma s kelacijo hranil in esencialnih kovin (Yuan et al., 2016b).
4. Hitozan tvori polimersko membrano na površini celice, kar prepreči vstop hranil v celico oziroma tvori kisikovo oviro, kar preprečuje rast aerobnih bakterij (Yuan et al., 2016b).
Protimikrobno delovanje hitozana je prikazano na Sliki 3. Za natančnejšo opredelitev protimikrobnega delovanja hitozana so potrebne še dodatne preiskave.
Slika 3: Sistematični prikaz protimikrobnega delovanja hitozana in njegovih derivatov (Hosseinnejad, Jafari, 2016).
Protimikrobno delovanje hitozana je odvisno od več pogojev in dejavnikov:
1. vrednosti pH – boljše protimikrobne lastnosti hitozana so pri pH-vrednosti, nižji od 6 (Liu et al., 2004; Younes et al., 2014),
2. molska masa – molekule z veliko molsko maso zaradi svoje velikosti ne prehajajo skozi celično steno mikroorganizma, ampak se pritrdijo na površini celice, spremeni prepustnost celice in povzroči lizo celic (Li et al., 2010a; Li et al., 2010b);
molekule z manjšo molsko maso prehajajo skozi celično in membrano mikroorganizma, se vežejo na molekulo DNA in zavirajo sintezo mRNA, čemur prav tako sledi liza celice (Kulikov et al., 2015),
3. koncentracija hitozana (El-tahlawy et al., 2005),
4. dodajanje drugih bioaktivnih snovi hitozanu, ki mu izboljšajo protimikrobno delovanje (El-Hack et al., 2020),
5. derivati hitozana imajo boljše protimikrobne lastnosti kot čisti hitozan (Hosseinnejad, Jafari, 2016),
6. tip mikroorganizma – hitozan delujejo različno protimikrobno na različne mikroorganizme; skupne rešitve glede protimikrobnega delovanja avtorji raziskav še vedno niso našli (No et al., 2002; Chung et al., 2004),
7. sestava živil – prisotnost kovin in kovinskih ionov na živilu lahko zmanjša protimikrobno delovanje hitozana, olje na to ne vpliva, medtem ko je prisotnost EDTA odvisna od tipa mikroorganizma (Hosseinnejad, Jafari, 2016),
8. stopnja deacetilacije – hitozan z višjo stopnjo deacetilacije ima boljše protimikrobne lastnosti, ker ima večje število amino skupin in posledično je bolj pozitivno nabit (Li et al., 2015),
9. vir hitozana – hitozan, pridobljen iz gliv, ima slabše protimikrobne lastnosti kot hitozan, pridobljen iz oklepov rakov (Jeihanipour et al., 2007; Chein et al., 2016).
2.1.1.1.3 Antioksidativno delovanje hitozana
Drugi, zelo pomemben učinek hitozana, je antioksidativno delovanje, ki ni tako zelo raziskano kot protimikrobno delovanje. Antioksidativno delovanje hitozana se poveča s sintezo hitozanovih derivatov. Amino skupina in dve hidroksi skupini monomera hitozana (Slika 2) lahko reagirata s prostimi radikali (Wei et al., 2019; Marín et al., 2019).
Uporaba antioksidantov v JP z namenom zmanjšanja oksidativnega kvarjenja oziroma žarkosti hrane v zadnjih letih močno narašča. Potek delovanja posamezne antioksidativne snovi je lahko različen. Antioksidanti delujejo:
1. kot reducirajoče snovi,
2. kot spojine, ki lovijo proste radikale,
3. z oblikovanjem kompleksov s kovinami, ki katalizirajo oksidacijske reakcije, 4. s preprečevanjem reakcij, ki jih povzroči en sam aktivni atom kisika in
5. z zaviranjem oksidativnih encimov, kot so lipooksigenaze (Jamróz, Kopel, 2020;
Tkaczewska, 2020).
Antioksidativno delovanje je močno povezano z molekulsko maso hitozana. Hitozan z večjo molekulsko maso ima slabše antioksidativno delovanje na superokside in hidroksidne radikale kot hitozan z manjšo molekulsko maso. Razlog za to je, da je manjša verjetnost, da bodo manjše molekule hitozana tvorile intramolekularne vodikove vezi, zaradi česar hidroksi in amino-skupine molekul ostajajo proste in na razpolago za antioksidativno delovanje (Sun et al., 2007). Schreiber in sodelavci (2013) navajajo, da hitozan z molekulsko maso 307 kDa in stopnjo deacetilacije 80 % ni deloval antioksidativno proti 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilnemu radikalu (v nadaljevanju besedila:
DPPH-), medtem ko Woranuch in Yoksan (2013) navajata do 96,6-odstotno uspešnost antioksidativnega delovanja hitozana z molekulsko maso 200 kDa in stopnjo deacetilacije 90 % proti DPPH-.
Poleg molske mase je jakost antioksidativnega delovanja hitozana odvisna tudi od njegove koncentracije, stopnje deacetilacije in od časa nanosa. Hitozan kot takšen ima relativno šibke antioksidativne lastnosti, ki se mu občutno lahko povečajo s tvorbo njegovih derivatov in z dodatkom drugih sestavin z dobrimi antioksidativnimi lastnostmi, kot so razne kovine in naravni ekstrakti (Yuan et al., 2016a).
2.2 Naravni polifenoli
Razni avtorji navajajo dobre protimikrobne in antioksidativne lastnosti naravnih spojin, med katere spadajo predvsem eterična olja in naravni ekstrakti. Uporaba rastlinskih izvlečkov za zdravljenje ljudi sega že davno v zgodovino (Dubick, 1986), pri čemer ne gre dvomiti, da so takrat ljudje poznali tudi njihove učinke, ki jih danes obravnavamo kot antioksidativne in protimikrobne lastnosti. Kljub prej omenjenim lastnostim, ki jih ima hitozan, so te še vedno nezadostne za samostojno uporabo na živilu (Zhang et al., 2019).
HP z dodanimi eteričnimi olji in naravnimi ekstrakti podaljša rok uporabe mesnih in ribjih izdelkov ter zmanjša količino patogenih mikroorganizmov. HP z dodanimi eteričnimi olji in naravnimi ekstrakti deluje na površini sadja in zelenjave tako, da zmanjša prenos vlage, omeji vnos kisika v živilo, zmanjša prehod zraka, zavira proizvodnjo etilena, zavira izhlapevanje hlapnih arom ter prenese dodane funkcionalne sestavine z antioksidativnim in protimikrobnim delovanjem (Yuan et al., 2016a). S tega stališča številni avtorji dokazujejo dobro medsebojno sodelovanje HP in različnih naravnih ekstraktov ter eteričnih olj za
izboljšanje antioksidativnih in protimikrobnih funkcij hitozana, kot so fenolni ekstrakt semen grozdja (Rodrigues et al., 2020), ekstrakti citrusov (Khaledian et al., 2021), ekstrakt zelenega čaja (Sabaghi et al., 2015), eteričnega olja modrega evkalipta (Hafsa et al., 2016), ekstrakta bananinih olupkov (Zhang et al., 2019) in jabolčnih olupkov (Riaz et al., 2018;
Sun et al., 2017; Sun et al., 2018) idr.
2.2.1 Jabolčni ekstrakt
V široki paleti nabora naravnih ekstraktov obstajajo snovi, ki HP izboljšajo ne le z vidika antioksidativnih in protimikrobnih lastnosti, temveč preprečujejo tudi številne mehanske in fizikalne poškodbe. Na ta način se izboljša oziroma ohrani stanje premazanega živila oziroma se mu podaljša rok uporabnosti. Taka snov je naravni jabolčni ekstrakt (v nadaljevanju besedila: JE), ki smo ga raziskovali v magistrskem delu.
Jabolka, zlasti njihovi olupki, so pomemben in bogat vir polifenolov, ki imajo močno antioksidativno delovanje (Eberhardt et al., 2000). Poleg antioksidativnega učinka jabolka oziroma JE delujejo tudi proliferativno proti celicam raka debelega črevesja, jeter in dojk.
Glavne skupine bioaktivnih komponent v jabolkih so poleg polifenolov tudi fenolne kisline, flavonoli, procianidini, klorogene kisline in druge snovi (Vayndorf et al., 2013).
Poleg antioksidativnega delovanja sestavin jabolk številni znanstveniki navajajo tudi dobre protimikrobne lastnosti jabolk in JE (Zambrano et al., 2019; Carpes et al., 2021; Liya, Siddique, 2018). Potencial sestavin iz jabolčnih olupkov so študirali na osnovi ekstraktovbioaktivnih polifenolov, s frakcioniranjem vlaken in z uporabo celotne tropine kot sestavine (Li et al., 2020; Mojzer et al., 2016). Vsebnost polifenolov v različnih sortah jabolk variira. Vrhovšek in sodelavci (2004) navajajo, da izmed preiskovanih sort jabolk vsebuje najnižjo količino polifenolov sorta jabolk Fuji in najvišjo vsebnost polifenolov sorta Reneta. Glavna spojina v skupini polifenolov je bila v vseh vrstah jabolk večinoma 5'-kafeoil kininska kislina (v nadaljevanju besedila: 5-CQA) oziroma klorogena kislina, sledila ji je p-kumaroil kininska kislina, medtem ko je p-kumarinska kislina v jabolkih prisotna zgolj v sledovih. V skupni količini je bilo flavonolov, ki sodijo v skupino polifenolov, sicer največ, vendar je količina posameznega flavonola zanemarljiva. V majhni količini so bili prisotni tudi hidroksicinamati in v sledovih antocianini (Vrhovšek et al., 2004).
2.2.1.1 5'-kafeoil kininska oz. klorogena kislina
Klorogene kisline so mono-, di-, tri- ali tetra-estri ene ali več cinamatne ali alifatske kisline in kininske kisline. Te kisline v obliki kristaliziranih soli je odkril A. Payen v kavnih zrnih in poimenoval jih je 'chloroginate de potasse et de caféine' (kogein-kalijev klorogenat).
Payenovi zapisi iz leta 1849 prvič opisujejo izraz klorogena kislina (Bajko et al., 2016).
Največ klorogenih kislin (do 70 različnih tipov te kisline) najdemo v zelenih zrnih kave (Kuhnert et al., 2012). Glavna med klorogenimi kislinami je 5-CQA, ki sodi med kofeoilkininske kisline. Poznamo tudi njene druge izomere, kot so 3-O-kafeoilkininska kislina in 4-O-kafeoilkininska kislina (Bajko et al., 2016). Velike količine 5-CQA najdemo v jabolčnem soku (Van Buren et al., 1973), krompirju, korenju, paradižniku (De Maria et al., 1999) in v listih Yerba mate (Marques, Farah, 2009).
Slika 4 predstavlja strukturno formulo molekule 5-CQA, katere molekulska formula je C16H18O9. To je ester med kininsko in cinamatno kislino. Njena dvojna vez med atomoma C7 in C8 predstavlja trans konfiguracijo med obema kislinama. Molska masa molekule 5- CQA znaša 354,31 g/mol (Bajko et al., 2016).
Slika 4: Strukturna formula 5-CQA (NCBI, 2021).
Klorogena kislina 5-CQA deluje citotoksično (Jiang et al., 2000), protimikrobno (Bajko et al., 2016) in antioksidativno (Naveed et al., 2018). Bioaktivne komponente fenolnih kislin
lahko povzročijo fiziološke spremembe na membrani mikroorganizma, zaradi česar lahko celica propade (Kabir et al., 2014).
Klorogena kislina je glavna fenolna kislina v jabolku. V jabolku ima veliko sposobnost odstranjevanja prostih radikalov (Panzella et al., 2013), to sposobnost lahko uporabimo tudi na drugih področjih. V primerjavi z 18 drugimi antioksidativnimi spojinami jabolka, vključno s kvercetinom, galno kislino in α-tokoferolom, ima drugo najmočnejše antioksidativno delovanje, takoj za rutinom (Kalinowska et al., 2014). Natella in sodelavci (1999) med ugotovitvami v svoji študiji navajajo, da so hidroksidne (-OH) skupine na fenolnih delih klorogenih kislin vzrok za antioksidativno delovanje in delujejo kot pozitivni deli za svoje antioksidativne lastnosti (Natella et al., 1999; Naveed et al., 2018).
5-CQA dokazano zmanjšuje negativni učinek 3-nitropropionične kisline, ki povzroča nevrodegenerativno motnjo (Alarcón-Herrera et al., 2017). Cheng in sodelavci (2017) dokazujejo zaščitni potencial 5-CQA na odrasle miši, ki so bile izpostavljene injekciji z AlCl3, ki posredno poškoduje dedni material izpostavljenim, tudi pri ljudeh (Mailloux et al., 2011). Na diabetes in diabetično nevropatijo pri podganah Wistar je 5-CQA delovala blažilno (Saraswat et al., 2020). Kaur in sodelavci (2009) so klorogeno kislino iz listov tobaka požgali pri 640 °C, pri čemer so v delcih dima zaznali dve glavni snovi: katehol in 3,4-dihidroksi benzojsko kislino. 3,4-dihidroksi benzojska kislina ni bila genotoksična in ni bila zaviralka celične proliferacije, medtem ko je katehol znana toksična spojina (Kaur et al., 2009). Toksikologija dokazuje pozitivne učinke 5-CQA na izpostavljene organizme. V primeru obravnave z višjimi temperaturami lahko razpade na zdravju škodljive učinkovine.
3 NAMEN IN CILJI
Namen tega magistrskega dela je ugotoviti antioksidativno in protimikrobno delovanje jabolčnega ekstrakta, ki ga bomo izdelali iz olupkov domačih jabolk. Jabolčni ekstrakt bomo ovrednotili na osnovi vsebnosti 5-CQA.
Pri delu bomo poskusili odgovoriti na naslednja raziskovalna vprašanja:
1. Kako najuspešneje ekstrahirati 5-CQA iz jabolčnih olupkov domačih jabolk?
2. Katera domača neobdelana ekološka jabolka imajo največ 5-CQA?
3. Kako učinkovite bodo antioksidativne lastnosti ekstrakta?
4. Kako učinkovito bo protimikrobno delovanje našega ekstrakta proti izboru mikroorganizmov?
4 METODE DELA
Delo na magistrskem delu je potekalo v več stopnjah. Najprej smo pregledali obstoječo literaturo na temo magistrskega dela. Pregled literature smo opravljali tudi sproti v naslednjih fazah dela.
Druga stopnja je obsegala eksperimentalni del, ki ga v grobem lahko delimo na kemijski del in na mikrobiološki del. Kemijski del predstavlja pripravo umeritvene krivulje standarda, razvoj ekstrakcije JE, s katero smo želeli dobiti čim večjo koncentracijo 5-CQA, kromatografsko analizo z uporabo HPLC-naprave, s katero smo določili vsebnost 5-CQA v našem vzorcu in po metodi Folin-Chicalteu določili antioksidativno delovanje ekstrakta.
Razvoj ekstrakcije JE je obsegal več eksperimentalnih analiz, s katerimi smo poskušali dobiti ekstrakt s čim višjo koncentracijo 5-CQA, ki smo ga kasneje uporabili v okviru mikrobioloških preiskav.
Mikrobiološki del predstavlja pregled in gojenje standardnih sevov bakterij, kvasovk in plesni, osamitev dveh sevov iz površine jabolk ter njuno identifikacijo in določanje občutljivosti vsakega izmed mikroorganizmov za različne učinkovine.
V tretji fazi smo rezultate posameznih preiskav ovrednotili in o njih razpravljali.
4.1 Pregled literature
Pri pregledu literature smo si pomagali s spletnimi portali Google Scholar, PubMed, ScienceDirect, Web of Science, Scopus idr., pa tudi z osnovnim iskanjem na spletnem strežniku Google. Največkrat smo si pomagali s strokovnimi članki, zapisanimi v angleškem jeziku, poleg teh smo si pomagali tudi z raznimi standardi in navodili proizvajalcev ter tehničnimi listi. Osredotočili smo se na raziskave, ki niso bile starejše od petih let, izjemoma smo uporabili tudi starejše.
4.2 Izbira jabolk
Za pripravo JE smo izbrali sveža domača jabolka, nabrana v avgustu in septembru leta 2020. Večino kemijskih in mikrobioloških analiz smo izvedli v poletno-jesenskem času,
nekatere ponovitve smo zaradi znanih razlogov, vezanih na epidemiološko situacijo, povezano s koronavirusno boleznijo Covid-19, in ukrepov izvedli takoj po ponovnem odprtju fakultete v marcu 2021. Pri tem smo uporabili pol leta stara jabolka.
Vsa uporabljena jabolka so bila izključno lokalna, nabrali smo jih v Zgornjem Tuhinju, razen dveh vrst jabolk, ki smo jih kupili v trgovini Mercator na Ambroževem trgu. Ker ne poznamo sort uporabljenih domačih jabolk, smo posamezne jablane označili s števili, npr.
Jablana 1, Jablana 2 itd. do Jablana 5; jabolka iz posamezne jablane smo označili z Jabolka 1 (izbrana jabolka z jablane 1), Jabolka 2 itd. do Jabolka 5. Kupljena jabolka smo označili podobno: Jabolka 6 (Jabolka letna SLO) in Jabolka 7 (Zlati delišes). Vse vrste domačih jabolk smo obirali ročno, nobena izmed domačih jabolk niso bila škropljena ali kako drugače kemično obdelana pred analizami.
V Prilogi 9.1 so vsa jabolka slikovno predstavljena. Slikam domačih jabolk so dodane tudi slike jablan, iz katerih so bila jabolka obrana. Vzorcu Jabolk 2 je poleg slike svežega jabolka dodana tudi slika pol leta starih jabolk, ki smo jih uporabili pri zadnjem sklopu preiskav.
4.3 Kemijske analize
Kemijske analize smo opravili v kemijskem laboratoriju (laboratorij K20) in raziskovalnem laboratoriju (laboratorij 222) Zdravstvene fakultete. Pri delu smo uporabili naslednje naprave in pripomočke:
analitsko tehtnico (Sartorius),
ultrazvočno vodno kopel Elma Elmasonic S 180 H (1000 W),
koncentrator miVac SP Scientific DNA-23050-B00,
tekočinski kromatograf Agilent 1100 z detektorjem na sklopljen niz diod (DAD detector) na koloni Supelco® Ascentis Express 90A C18 15 cm × 4,6 cm, 5µm,
spektrofotometer NANOCOLOR ® VIS, Macherey nagel in
preostali laboratorijski inventar.
4.3.1 Umeritvena krivulja standarda
Vse ekstrakte, ki smo jih pripravili, smo tekom celotnega magistrskega dela primerjali s čisto 5-CQA (standardom). Vse ekstrakte, ki smo jih pripravili, smo ovrednotili s pomočjo eksternega standarda čiste 5-CQA (standarda). Pri delu smo upoštevali metodo dela, ki so jo v svojem raziskovalnem članku opisali Chambel in sodelavci (1997). Mobilna faza, ki smo jo pri kromatografskih analizah uporabili, je bila raztopina 2 % ocetne kisline (topilo A) in metanola (topilo B) v razmerju 65:35. Pretok mobilne faze je znašal 1 mL/min, temperatura kolone je znašala cca 25 °C. Posamezna količina vzorca, ki jo je HPLC naprava injicirala, je bila 10 µL. Absorpcijski spekter spojine smo merili z detektorjem na niz diod pri valovni dolžini 280 nm.
V ta namen smo najprej pripravili pet različnih koncentracij standarda v 96-odstotnem etanolu z začetno koncentracijo 220 mg/L 5-CQA (1,1 mg 5-CQA v 5 mL 96 % etanola).
Iz začetne koncentracije smo nato z redčenjem pripravili štiri različne raztopine (11 mg/L, 22 mg/L, 44 mg/L, 110 mg/L in začetno koncentracijo 220 mg/L) in jih analizirali ter pripravili umeritveno krivuljo, s pomočjo katere smo izračunali koncentracije 5-CQA v JE.
Standardne raztopine smo shranili v zamrzovalniku pri temperaturi -18 °C do nadaljnje uporabe. Pred tem smo testirali obstojnost v zamrzovalniku (4.3.2).
4.3.2 Obstojnost standarda v hladilniku in v zamrzovalniku
Želeli smo ugotoviti razliko v obstojnosti hranjenja standarda v hladilniku in v zamrzovalniku. Pripravili smo dve paralelki petih različnih koncentracij standarda: 11 mg/L, 22 mg/L, 44 mg/L, 110 mg/L in 220 mg/L. Za obe paralelki smo opravili kromatografsko analizo, nato smo eno paralelko shranili v zamrzovalniku pri temperaturi - 18 °C in drugo v hladilniku pri temperaturi 4 °C. Po enem tednu smo ponovno analizirali standarde. Test obstojnosti standarda v hladilniku in v zamrzovalniku smo opravili na začetku oktobra 2020, natančneje 6. 10. 2020.
Test obstojnosti standarda v zamrzovalniku smo ponovili po petih mesecih v marcu 2021, natančneje 17. 3. 2021.
4.3.3 Razvoj metode ekstrakcije
Kalinowska in sodelavci (2014) v svojem preglednem članku povzemajo rezultate različnih avtorjev, ki so ekstrahirali polifenole iz različnih sort jabolk, kjer Łata in sodelavci (2009) v svojem raziskovalnem članku navajajo povprečje vsebnosti 5-CQA v jabolčnih olupkih (0,95 mg/g suhe teže) in v celem sadežu (1,13 mg/g suhe teže) pri obravnavanih 19-ih različnih sortah jabolk. Najvišjo koncentracijo 5-CQA so zaznali v olupkih sorte jabolk Red Rome (2,33 mg/g suhe teže) in najnižjo v celotnem jabolku sorte Jonamac.
Večina dela priprave ekstrakta je potekala v obdobju od avgusta do oktobra 2020 in del v marcu 2021. Vse spodaj opisane ekstrakte smo pripravljali iz svežih jabolk, z izjemo ponovitve v marcu 2021, ko smo uporabili pol leta stara jabolka (Jabolka 2). Pri analizah smo uporabljali večinoma domača jabolka in enkrat kupljena.
Rezultate smo izračunali na temelju umeritvene krivulje standarda in jih opredelili na naslednje načine:
kot vsebnost 5-CQA v vzorcu (mg/L),
kot vsebnost 5-CQA na g ekstrakta (mg 5-CQA/g ekstrakta) in
kot vsebnost 5-CQA v mg na 100 g sveže teže jabolka (v nadaljevanju besedila:
FW) (mg 5-CQA/100 g FW).
4.3.3.1 Poskus določanja optimalnega časa ekstrakcije
Pri pripravi ekstrakta smo deloma upoštevali navodila priprave ekstrakta, ki jih v svojem raziskovalnem članku navajajo Yue in sodelavci (2012), deloma smo poskušali ekstrakcijo samostojno optimirati v različnih vmesnih korakih.
V prvem poskusu smo določali optimalen čas ekstrakcije. Vsebnost smo preverjali pri dveh vrstah jabolk: Jabolka 1 in Jabolka 6. Iz vsake sorte smo pripravili po dve paralelki vzorca, ki smo ju koncentrirali različno dolgo.
Ekstrakte smo pripravili iz posamezne sorte jabolk. Masa analiziranega vzorca jabolk je bila 0,5 kg. Jabolka smo razrezali z vertikalnimi rezi na četrtine in uporabili po dve nasprotni četrtini. Izbrana dela jabolk smo nasekljali oziroma nastrgali s strgalnikom na koščke velikosti 5 × 5 × 5 mm ali manj. Posamezen laboratorijski vzorec je predstavljal 5 g
sesekljanih jabolk, ki smo jih zatehtali v erlenmajerico, dodali po 25 mL 96-odstotnega etanola in pokrili z aluminijasto folijo – tako smo preprečili razgradnjo pod vplivom svetlobe. Eno izmed paralelk posameznega vzorca smo v ultrazvočni vodni kopeli pri 50
°C ekstrahirali 15 min in drugo 30 min. Vsak vzorec smo nato prefiltrirali skozi filter papir v centrifugirko in filtrat koncentrirali v koncentratorju pri 50 °C do konstantnega volumna.
V vsaki centrifugirki je ostalo po 2–3 mL supernatanta, ki smo mu dodali 96-odstotni etanol do končne prostornine 5 mL. Raztopino ekstrakta smo nato prefiltrirali skozi filter CHROMAFIL® CA-45/25 in analizirali vsebnost 5-CQA v vzorcih s pomočjo tekočinskega kromatografa.
Vse nadaljnje ekstrakte smo pripravili po zgoraj navedenem postopku (čas ekstrakcij na vodni kopeli je znašal 30 min) – razen, če ni drugače omenjeno.
4.3.4 Preverjanje vsebnosti polifenolov v vseh vzorcih
Iz vsake sorte jabolk smo pripravili po tri paralelke in vzorce preverili na vsebnost 5-CQA.
V vseh nadaljnjih analizah smo uporabili tisto sorto jabolk, ki je po izračunih vsebovala najvišjo koncentracijo polifenolov (Jabolka 2), razen, če ni drugače omenjeno.
4.3.5 Preverjanje vsebnosti polifenolov v ekstraktu, ki smo mu dodali vodo
Ekstrakt smo v nadaljevanju uporabili za določanje mikrobiološke občutljivosti. Pripravili smo torej supernatant, ki ni bil razredčen v 96-odstotnem etanolu, ampak v sterilni destilirani vodi. Etanol bi namreč zaradi protimikrobnega delovanja, ki ga ima sam po sebi, lahko motil rezultate določanja mikrobiološke občutljivosti.
Pripravili smo šest paralelk vzorca Jabolk 2. Tri paralelke smo pripravili po običajnem postopku (kot je opisano v poglavju 4.3.3.1). Drugim trem paralelkam po končanem koncentriranju nismo dodali 96-odstotnega etanol do volumna 5 mL, temveč sterilno destilirano vodo.
Glede na dobljene rezultate smo s pomočjo standardnega dodatka opredelili razliko med vsebnostjo 5-CQA v vzorcih med obema pripravama.
4.3.5.1 Pridobivanje ekstraktov z višjimi koncentracijami 5'- kafeoil kininske oz. klorogene kisline
Vsi tako pridobljeni ekstrakti so imeli prenizke koncentracije 5-CQA, da bi z njimi lahko učinkovito inhibirali rast mikroorganizmov, če upoštevamo navedbe v raziskavi Bajko in sodelavcev (2016), ki navajajo, da je bila najnižja inhibitorna koncentracija pri večini preiskovanih mikroorganizmov 10 mg/mL. Višje koncentracije polifenolov smo poskusili pridobiti s povečanjem količine vzorca jabolk, kar smo izvedli na spodaj opisane načine.
4.3.5.2 Poskus koncentriranja ekstrakta z višjo temperaturo
Priprava ekstrakta je bila zamudno delo, saj se je ekstrakt v koncentratorju koncentriral tudi do 4 ure. Zato smo v nadaljevanju pripravili ekstrakt tako, da smo ga koncentrirali pri višji temperaturi, kar je tvegano početje, kar se tiče stabilnosti polifenolov. Hkrati smo želeli dobiti višjo koncentracijo 5-CQA v ekstraktu, zato smo več paralelk vzorca med koncentriranjem združili in pripravili združen vzorec.
Pripravili smo tri paralelke ekstrakta vzorca Jabolk 2, kot je opisano v poglavju 4.3.3.1. Po 1,5 h koncentriranja na 50 °C smo vse tri paralelke združili in nadaljevali s koncentriranjem pri 60 °C do stalnega volumna. Ekstraktu smo dodali sterilno destilirano vodo do 5 mL, opravili kromatografsko analizo in s pomočjo umeritvene krivulje standarda preračunali vsebnost 5-CQA v vzorcu.
Ekstrakt smo pripravili iz trikratne količine jabolk (15 g).
4.3.5.3 Ekstrakcija večjih količin naribanih jabolk z etil acetatom
Pripravili smo dve seriji ekstrakcije naribanih jabolk s pomočjo topila etil acetat:
1. V erlenmajerico smo natehtali 250 g naribanih jabolk in jim dodali 100 mL 96- odstotnega etanola, pokrili z alu-folijo in pustili na vodni kopeli za 30 min. Po ekstrakciji dobljene brozge nismo mogli filtrirati skozi filter papir, prav tako se vakuumska filtracija skozi mufo ni obnesla, saj je skozi filter steklo le malo tekočine. Brozgo smo prefiltrirali skozi gazo. Filtrat je bila motna rdeče-rjava
tekočina. V primerjavi s prejšnjimi postopki koncentriranja je bil čas koncentriranja tega ekstrakta občutno daljši, kljub temu da smo v zakup vzeli večjo količino snovi, ki smo jo koncentrirali. Odločili smo se za eksperimentalno analizo: 50 mL ekstrakta smo dodali 50 mL etil acetata in 15 min stresali v liju ločniku. Ostanek motne raztopine smo odlili, bistro raztopino smo koncentrirali na programu ETOH do suhega pri 60 °C. Supernatantu smo dodali sterilno destilirano vodo do volumna 5 mL, opravili kromatografsko analizo in s pomočjo umeritvene krivulje standarda preračunali vsebnost 5-CQA v vzorcu.
2. V erlenmajerico smo natehtali 250 g naribanih jabolk in jim dodali 100 mL etil acetata. Erlenmajerico smo pokrili s steklenim pokrovčkom in alu-folijo ter ekstrahirali na vodni kopeli 30 min pri 50 °C. Filtrirali smo skozi gazo. Filtrat je bil sestavljen iz dveh plasti: bistre plasti in motne brozge. Brozgo smo odlili in bistro plast koncentrirali na programu ETOH pri 60 °C do suhega. Supernatantu smo dodali sterilno destilirano vodo do volumna 5 mL, opravili kromatografsko analizo in s pomočjo umeritvene krivulje standarda preračunali vsebnost 5-CQA v vzorcu.
4.3.5.4 Ekstrakcija večjih količin naribanih jabolk z etanolom
Ekstrahiranje večjih količin sesekljanih jabolčnih olupkov v etanolu je potekalo dvakrat.
Pri prvi ponovitvi smo JE uporabili za mikrobiološke preiskave, v drugi ponovitvi smo JE uporabili za določanje antioksidativne učinkovitosti.
JE za mikrobiološke preiskave
V erlenmajerico smo zatehtali 250 g sesekljanih jabolčnih olupkov in jim dodali 100 mL 96-odstotnega etanola. Erlenmajerico smo pokrili z alu-folijo in ekstrahirali 30 min pri 50
°C na vodni kopeli. Filtrirali smo skozi gazo. Filtrat smo približno pol ure pustili stati, da so se težji delci filtrata posedli na spodnjo polovico čaše, bistrejši del filtrata je ostal v zgornji polovici. Bistro plast smo previdno odlili v tri centrifugirke in koncentrirali v koncentratorju. Ko je bilo to mogoče, smo vse skupaj prelili v eno centrifugirko in koncentrirali do suhega pri 50 °C. Supernatanta nismo redčili. Kromatografsko analizo smo opravili na del supernatanta na dva načina:
1. 50 µL supernatanta smo dodali 950 µL vode,
2. 50 µL supernatanta smo dodali 950 µL raztopine čiste 5-CQA koncentracije 100 mg/L.
Takšno razredčitev smo pripravili, ker višje koncentracije supernatanta nismo mogli filtrirati skozi filter papir CHROMAFIL® CA-45/25.
Z rezultati kromatografske analize smo s pomočjo umeritvene krivulje standarda preračunali vsebnost 5-CQA v vzorcu.
JE za določanje antioksidativne učinkovitosti
Pripravili smo dva ekstrakta: prvega iz pol leta starih Jabolk 2, drugega iz Jabolk 7.
V erlenmajerico smo natehtali 200 g sesekljanih jabolčnih olupkov in jim dodali 100 mL 96-odstotnega etanola. Erlenmajerico smo pokrili z alu-folijo in ekstrahirali na vodni kopeli 30 min pri 50 °C. Filtrirali smo skozi gazo. Filtrat smo približno pol ure pustili stati, da so se težji delci filtrata posedli na spodnjo polovico čaše, bistrejši del filtrata je ostal v zgornji polovici. Bistro plast posameznega vzorca smo previdno odlili v tri centrifugirke in koncentrirali v koncentratorju. Ko je bilo to mogoče, smo vse skupaj prelili v eno centrifugirko in nadaljevali s koncentriranjem v koncentratorju pri 50 °C. Zaradi okvare koncentratorja nam ni uspelo koncentrirati do suhega. Končni volumen posameznega JE je znašal med 35 in 40 mL, zato smo posameznemu JE do oznake 40 mL dodali 96-odstotni etanol. JE smo dvakrat filtrirali skozi filter papir CHROMAFIL® CA-45/25. Opravili smo kromatografsko analizo in s pomočjo umeritvene krivulje standarda preračunali vsebnost 5-CQA v vzorcu. Preostanek filtriranega JE smo uporabili za določanje antioksidativne učinkovitosti.
Priprava JE za določanje antioksidativne učinkovitosti je potekala z nekajmesečnim zamikom, torej v marcu 2021, medtem ko so vse druge priprave ekstraktov potekale v času med avgustom in oktobrom 2020. Pri pripravi umeritvene krivulje standarda 5-CQA smo uporabili tri iste koncentracije, kot smo jih uporabili za preverjanje obstojnosti standarda 5- CQA v zamrzovalniku.
4.3.6 Določanje antioksidativne učinkovitosti
Antioksidativno učinkovitost ekstrakta smo določali na temelju metode Folin-Ciocalteu, opisane v raziskovalnem članku Huber in Rupasinghe (2009) z nekaj prilagoditvami.
Antioksidativno učinkovitost smo ugotavljali za štiri vzorce:
1. sveže pripravljen JE iz pol leta starih Jabolk 2, 2. sveže pripravljen JE iz Jabolk 7,
3. standard 5-CQA koncentracije 200 mg/L in 4. raztopino hitozana.
Raztopino hitozana smo pripravili tako, da smo 2 % (w/v) hitozana raztopili v 1-odstotni (v/v) ocetni kislini med mešanjem na magnentem mešalu pri 50 °C (Hafsa et al., 2016).
Pripravili smo izhodno raztopino 11 mg galne kisline monohidrata v 100 mL 100- odstotnega metanola. V epruvete smo odpipetirali različne volumne galne kisline (80, 120, 240 in 400 µL), ki smo jim do volumna 400 µL dodali 100-odstotni metanol. Iz izhodne raztopine smo tako pripravili naslednje koncentracije galne kisline, ki smo jo uporabili za pripravo umeritvene krivulje: 11,76 µM, 17,63 µM, 35,27 µM in 58,78 µM.
100 µL ekstrakta, raztopine standarda 5-CQA ali raztopine galne kisline smo odpipetirali v epruvete in dodali 500 µL 0,2 N Folin-Ciocalteu fenolnega reagenta. Epruvete smo pokrili s parafilmom in 6 min nežno stresali. Po stresanju smo v vsako epruveto z raztopino dodali po 400 µL 7,5 % (w/v) natrijevega karbonata, premešali in ponovno pokrili s parafilmom.
Vzorce smo 2 uri pustili na sobni temperaturi. Pred merjenjem absobrance smo raztopine JE in standardne raztopine 5-CQA razredčili.
Absorbanco smo izmerili na spektrofotometru NANOCOLOUR® VIS Macherey Nagel pri valovni dolžini 760 nm. Pri tem smo uporabili 10 mm vialo High Precision Cell Hellma Analytic. Rezultate smo opredelili v mg ekvivalenta galne kisline (v nadaljevanju besedila:
GAE) na 100 g sveže teže jabolka (mg GAE/g FW).
4.4 Mikrobiološke preiskave
Po izdelavi ekstrakta in kemijskih analizah ekstrakta smo opravili še mikrobiološke preiskave, ki smo jih izvajali v mikrobiološkem laboratoriju Zdravstvene fakultete v Ljubljani.
Pri delu smo uporabili naslednje naprave, pripomočke in potrošni material:
analitsko tehtnico (Mettler),
avtoklav Tuttnauer autoclave – steam sterilizer (model 2840ELVP-WR-D; SemLab d. o. o.),
inkubator Kambič I-50,
hladilnik,
mešalnik za epruvete,
avtomatske pipete z nastavki,
sterilne brise,
preostali laboratorijski inventar.
4.4.1 Opredelitev standardnih sevov mikroorganizmov
Protimikrobno aktivnost JE in hitozana smo ugotavljali pri 10 sevih mikroorganizmov.
Štiri bakterijske standardne seve smo pridobili iz Czech Collection of Microorganisms (v nadaljevanju besedila: CCM) (Brno, Češka) (CCM), tri seve kvasovk in en sev plesni, ki so bili osamljeni iz sadja in grozdja, ter iz Zbirke industrijskih mikroorganizmov (v nadaljevanju besedila: ZIM) Biotehniške fakultete v Ljubljani (BF UL). Omenjeni mikroorganizmi so opredeljeni v Tabeli 1.
Tabela 1: Opredelitev uporabljenih standardnih sevov mikroorganizmov Vrsta mikroorganizma Šifra mikroorganizma Ime mikroorganizma
Kvasovke ZIM 668 Hanseniaspora guilliermondii
ZIM 2241 Candida intermedia var. intermedia ZIM 3594 Saccharomyces cerevisiae
Plesen ZIM F080 Penicillium expansum
Bakterije ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa
ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 4698 Micrococcus luteus ATCC 14579 Bacillus cereus ZIM – Zbirka industrijskih mikroorganizmov
ATCC – American Type Culture Collection
Poleg standardnih sevov smo uporabili tudi dva bakterijska seva, ki smo ju osamili iz površine jabolk, iz katerih smo pridobili JE. Celoten postopek osamitve in identifikacije teh dveh sevov smo opisali v poglavju 4.4.3.
4.4.2 Priprava gojišč
Za mikrobiološke preiskave smo uporabili naslednja trdna gojišča za gojenje in namnožitev mikroorganizmov ter določanje njihove občutljivosti. Uporabili smo standardna gojišča za posamezne skupine mikroorganizmov in jih pripravili po navodilih proizvajalcev:
Kromogeno gojišče za ugotavljanje koliformnih bakterij (angl. Chromogenic Coliform Agar; v nadaljevanju besedila: CCA) je gojišče, ki omogoča sočasno odkrivanje in razlikovanje med E. coli in drugimi koliformnimi bakterijami.
Kolonije bakterije E. coli se na gojišču CCA obarvajo modro, druge koliformne bakterije tvorijo rdeče kolonije. Kolonije drugih bakterij so brezbarvne oziroma je njihova rast inhibirana (Rambach, 2019). Pri pripravi smo uporabili dehidrirano gojišče CCA. (Biolife Italiana Srl, 2006, Biolife Italiana Srl, a).
Gojišče s sladnim ekstraktom (angl. Malt Extract Agar; v nadaljevanju besedila:
MEA) (Termo Fisher Scientific, 2021) je gojišče za gojenje in štetje kvasovk in plesni.
Gojišče Mueller Hinton (v nadaljevanju besedila: MH) smo uporabili za ugotavljanje občutljivosti bakterij z difuzijsko metodo z diski (CLSI, 2015). Pri delu smo uporabili dehidrirano gojišče MG proizvajalca Biolife (Biolife Italiana Srl, 2020).
Selektivno gojišče za odkrivanje bakterije Bacillus, zlasti za vrsto B. cereus, vsebuje manitol, jajčni rumenjak in polimiksin (angl. Bacillus cereus selective agar base; v nadaljevanju besedila: MYP). B. cereus na gojišču tvori rožnate kolonije z rožnato precipitacijsko cono zaradi razgradnje lecitina. Pri delu smo uporabili dehidrirano gojišče MYP, protimikrobni dodatek polimiksin in emulzijo jajčnega rumenjaka (Biolife Italiana Srl, 2011a). MYP smo uporabili za ugotavljanje prisotnosti ter osamitev bakterije B. cereus in drugih vrst rodu Bacillus s površine jabolk.
Gojišče za določanje skupnega števila aerobnih mezofilnih mikroorganizmov (angl.
Plate Count Agar; v nadaljevanju besedila: PCA) (Biolife Italiana Srl, c) smo uporabili za ugotavljanje skupnega števila aerobnih mezofilnih mikroorganizmov (v nadaljevanju besedila: SŠMO) s površine jabolk.
Kromogeno gojišče s triptonom in žolčnimi solmi za gojenje bakterije E. coli (angl.
Tryptone bile X-gluc agar, v nadaljevanju besedila: TBX) (Biolife Italiana Srl, 2011b) je selektivno in kromogeno gojišče za ugotavljanje sevov E. coli v živilih in živalski krmi, ki tvorijo encim β-glukuronidazo. Pripravili smo ga v skladu s standardom ISO 16649-2 (2018). Kolonije β-glukuronidaza pozitivne E. coli se na gojišču obarvajo zeleno. To gojišče smo uporabili za ugotavljanje prisotnosti bakterije E. coli na površini jabolka.
Gojišče s kvasnim ekstraktom, peptonom in dekstrozo za gojenje kvasovk (angl.
Yeast Extract Peptone Agar; v nadaljevanju besedila: YEPD) je selektivno gojišče, ki ga uporabljamo za osamitev ter štetje kvasovk in plesni v živilih (Biolife Italiana Srl, b). YEPD smo uporabili za ugotavljanje občutljivosti kvasovk in plesni z difuzijsko metodo z diski.
4.4.3 Osamitev in identifikacija bakterijskih sevov mikroorganizmov s površine jabolk
4.4.3.1 Odvzem vzorca jabolk
Pri odvzemu vzorca iz jabolk smo upoštevali navedbe Laboratorijskega priročnika da Silva in soavtorjev (2018).
Odvzeli smo dva vzorca po tri jabolka. Izbrali smo tista, ki so imela najvišjo vsebnost polifenolov glede na predhodne kromatografske meritve ekstraktov. Ker so bila jabolka, iz katerih smo pripravljali JE, že obrana, smo jih z umitimi in razkuženimi rokami vzorčili neposredno iz zabojčka. Čisto vrečko za vlaganje smo na roko namestili obrnjeno narobe in jabolka jemali z notranjo stranjo vrečke z upoštevanjem načela nedotikanja. Po tri jabolka smo položili v drugo, čisto vrečko za vlaganje. Jabolka smo izbirali reprezentativno. Vrečko z vzorcem jabolk smo zavezali in jo položili v še eno, večjo vrečko za vlaganje in jo prav tako zavezali. Takoj po odvzemu smo vzorca v hladni verigi transportirali v mikrobiološki laboratorij, kjer smo nadaljevali z nadaljnjimi mikrobiološkimi preiskavami.
4.4.3.2 Odvzem brisa jabolk
Bris površine vzorčenih jabolk smo izvedli po standardu ISO 18593 (2018) in priporočilih (da Silva et al., 2018; Carpentier, Barre 2012). Bris z jabolk in vse nadaljnje mikrobiološke preiskave smo izvajali v aseptičnih pogojih. Pred odvzemom brisa smo pripravili:
po 1 epruveto z 10 mL sterilne fiziološke raztopine za vsak vzorec jabolk,
po 2 sterilna brisa za vsak vzorec jabolk,
petrijevke z različnimi gojišči za preverjanje prisotnosti posameznih vrst mikroorganizmov:
o 2 petrijevki z gojiščem PCA za ugotavljanje SŠMO, o 2 petrijevki z gojiščem TBX za določanje bakterije E. coli, o 2 petrijevki z gojiščem MYP za določanje bakterij rodu Bacillus.
Ob gorilniku smo odprli vrečki z vzorcem in vzeli po eno jabolko iz vrečke, pri tem smo ga držali zgolj za pecelj. Sterilni bris smo omočili v sterilni fiziološki raztopni v eni izmed epruvet in ga oželi na notranjem robu epruvete. Celotno površino vsakega jabolka posebej smo obrisali z istim mokrim brisom. Ko smo obrisali prvo jabolko, smo bris potopili v sterilno fiziološko raztopino v isti epruveti kot na začetku in močno premešali. Postopek smo ponovili na ostalih jabolkih. Celoten postopek smo ponovili še s suhim brisom, po končanem brisanju smo ga pomočili v fiziološki raztopini v isti epruveti. Bris smo odstranili iz epruvete, jo pokrili s pokrovčkom in vsebino 10 sekund mešali na električnem stresalniku. Tako smo dobili v eni epruveti mikroorganizme iz celotne površine treh jabolk enega vzorca. Postopek smo ponovili pri drugem vzorcu.
4.4.3.3 Gojenje in osamitev mikroorganizmov iz jabolk
Za ugotavljanje SŠMO smo uporabili metodo štetja kolonij na trdnih gojiščih z decimalnim razdredčevanjem in vmešavanjem vzorca v gojišče. Po prenosu 1 mL vzorca v petrijevko in vmešavanjem raztopljenega gojišča z vzorcem smo petrijevke s strjenim gojiščem inkubirali v aerobnih pogojih 72 ur pri 30 °C. Prešteli smo vse porasle kolonije na gojiščih, kjer je poraslo med 10 in 300 kolonij (ISO 4833, 2013).
Za določanje bakterij E. coli v vzorcu smo uporabili metodo štetja kolonij na trdnih gojiščih z vmešavanjem vzorca v gojišče TBX. Petrijevke smo inkubirali v aerobnih pogojih 18–24 ur pri temperaturi 44 °C. Prešteli smo zeleno obarvane kolonije E. coli na petrijevkah, kjer je poraslo manj kot 150 tipičnih kolonij E. coli (ISO 16649-2, 2018).
Za določanje koliformnih bakterij, vključno z bakterijo E. coli na gojišču CCA, smo uporabili metodo razmazovanja 0,1 mL vzorca po površini gojišča s hokejko (Hartman, 2011). Gojišča smo inkubirali pod aerobnimi pogoji 18–24 ur pri 37 °C. Prešteli smo rdeče obarvane kolonije koliformnih bakterij, medtem ko so modro obarvane kolonije tvorili sevi E. coli.
Za določanje sevov B. cereus na gojišču MYP smo upoštevali standard ISO 7932 (2004).
Uporabili smo metodo razmazovanja 0,1 mL vzorca po površini gojišča s hokejko (Hartman, 2011). Gojišča smo inkubirali pod aerobnimi pogoji 18–24 ur pri 30 °C in dodatnih 24 ur, če kolonije niso bile vidne. Prešteli smo velike rožnate kolonije, ki jih je
