Delo sem začela s pripravo umeritvene premice. Iz standardne raztopine askorbinske kisline s koncentracijo 100 mg/L sem v Coulterjevih posodah pripravila raztopine s koncentracijami: 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70 in 100 mg/L v 10 mL. Tem vzorcem sem nato dodala 10 mL raztopine KMnO4 s koncentracijo 100 mg/L in deionizirano vodo, da je bil skupni volumen vsakega vzorca 20 mL. Po približno 30 s sem v vzorcih opazila rjavo obarvanje, zlasti v Coulterjevih posodah z višjim preostankom KMnO4 (Slika 13).
Slika 13: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C
Sklepala sem, da je nastal MnO2 (s), torej reagent KMnO4 v prvem poskusu ni bil dovolj kisel. V takem primeru poteka redukcija MnO4- le do MnO2(s), ne pa do Mn2+ (Slika 14).
22
Slika 14: Reakcije redukcije KMnO4
Pripravila sem novo raztopino KMnO4, tako da sem za razredčevanje uporabila le 1 M raztopino H2SO4. Celoten postopek priprave raztopin za merjenje sem ponovila in tokrat je bilo obarvanje lepo rožnato (Slika 15). Absorbance vseh raztopin sem izmerila 3x.
Slika 15: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C po 10 min
Slika 16: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C po 60 min Iz samih vrednosti absorbanc pa tudi slik raztopin (Slika 15 in 16) je bilo razvidno, da se barva in posledično absorbanca raztopin s časom spreminjajo, zato sem ponovno pripravila raztopine in absorbance merila v 10 min časovnih intervalih. Tudi po 1 h se niso ustalile, zato sem se odločila, da bom absorbance raztopin pomerila v najkrajšem možnem času in tudi za umeritveno krivuljo sem izbrala premico, katere absorbance so bile posnete v največ 10 min po pripravi (Graf 1).
1.
2.
3.
(s)
23
Graf 1: Umeritvena premica za vitamin C
Sledila je priprava vzorcev. Vzorec Cedevite sem pripravila tako, da sem v Coulterjevo posodo dala 0,5 mL že pripravljenega vzorca (glej poglavje 4.5), dodala 9,5 mL deionizirane vode in 10 mL raztopine KMnO4. Vzorec Kruger multivitaminskih tablet sem pripravila tako, da sem v Coulterjevo posodo dala 0,4 mL že pripravljenega vzorca, dodala 9,6 mL deionizirane vode in 10 mL raztopine KMnO4. Vzorec Supradyna sem pripravila tako, da sem v Coulterjevo posodo dala 0,1 mL že pripravljenega vzorca, dodala 9,9 mL deionizirane vode in 10 mL raztopine KMnO4. Za vsako prehransko dopolnilo sem pripravila po 2 vzorca. V prvem poskusu so se vzorci ob dodatku KMnO4
popolnoma razbarvali, torej se je porabil ves oksidant. Poskus sem ponovila, tako da sem naredila 10x redčitve vseh vzorcev, vendar sta se tudi v tem primeru vzorca Cedevite in Kruger multivitaminskih tablet popolnoma razbarvala (Slika 17), zato sem pomerila le absorbanco Supradyna. Končno izračunana koncentracija vitamina C v Supradynu je bila 77 mg/L (deklaracija 64 mg/L), vzrok za odstopanje izračunane koncentracije od deklarirane je prisotnosti drugih primesi, ki jih je oksidant oksidiral in se pri tem porabil.
Iz rezultatov pa lahko sklepam, da je teh primesi veliko več v vzorcu Cedevite in Kruger kot pa v Supradynu.
24
Slika 17: Prvi poskus določanja vitamina C v vzorcih (K= Kruger, C= Cedevita, S=
Supradyn) 5.2 Določanje vitamina B2
Delo sem začela s pripravo umeritvene premice. Iz standardne raztopine riboflavina s koncentracijo 100 mg/L sem v 10 mL merilnih bučkah pripravila raztopine s koncentracijami: 0, 5, 10, 20, 30 in 40 mg/L in do oznake dopolnila s citratnim pufrom.
Raztopinam sem 3x pomerila absorbance (Slika 18).
Slika 18: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B2
25
Graf 2: Umeritvena premica za vitamin B2, širše območje
Ker je zadnja vrednost nekoliko krivila umeritveno premico (Graf 2) navzdol, sem sklepala, da je zadnja koncentracija že previsoka, zato sem ponovno pripravila raztopine s koncentracijami: 0, 5, 10, 15, 20 in 30 mg/L. Ponovno sem vsem raztopinam 3x pomerila absorbance (Slika 19) in v tem primeru zadnja vrednost ni več tako zelo krivila umeritvene premice navzdol (Graf 3).
Slika 19: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B2
y = 0,0178x + 0,0714
26
Graf 3: Umeritvena premica za vitamin B2, ožje območje
Sledila je priprava vzorcev tako, da sem v v 10 mL merilno bučko dala posamezno po 0,5 mL že pripravljenega vzorca (glej poglavje 4.5) Cedevite, Kruger multivitaminskih tablet in Supradyna ter do oznake dopolnila s citratnim pufrom (Slika 20). Pomerila sem absorbance, ki so bile zelo visoke, zato sem se odločila preizkusiti še metodo standardnega dodatka.
Za vsako prehransko dopolnilo sem pripravila dve bučki, v eno sem dala 0,5 mL vzorca in 0,5 mL standardne raztopine s koncentracijo 100 mg/L ter dopolnila do oznake s citratnim pufrom, v drugo pa sem dala le 0,5 mL vzorca in dopolnila do oznake s citratnim pufrom in pomerila absorbance. Končno izračunana koncentracija vitamina B2 v Cedeviti je bila 296,7 mg/L (deklaracija 0,93 mg/L), v Krugerju 90,4 mg/L (deklaracija 1,4 mg/L) in v Supradynu 44,8 mg/L (deklaracija 4,2 mg/L). Vzrok za odstopanje izračunane koncentracije od deklarirane so dodana barvila, ki motijo merjenje absorbance.
y = 0,0196x + 0,0627
27
Slika 20: Prvi poskus določanja vsebnosti vitamina B2 v vzorcu 5.3 Določanje vitamina B6
Delo sem pričela s pripravo umeritvene premice. Iz standardne raztopine piridoksina s koncentracijo 200 mg/L sem v 10 mL merilnih bučkah pripravila raztopine s koncentracijami: 0,4, 2, 5, 10, 20, 30, 40 in 50 mg/L, dodala 1 mL raztopine NaHCO3, mešala 1 min, dodala 2,5 mL raztopine kloranila in dopolnila do oznake z deionizirano vodo. Dobila sem raztopine precej podobne barve (Slika 21), česar nisem pričakovala, a sem vseeno pomerila absorbance, ki seveda niso bile ustrezne (slepi vzorec je imel previsoko vrednost, razlike v absorbancah so bile zelo majhne, pa tudi vrednosti niso lepo naraščale s koncentracijo).
Slika 21: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6
Zato sem v drugem poskusu raztopine pripravila podobno, le da sem jih do oznake razredčila z acetonitrilom. V tem primeru se je v bučkah izločila trdna bela snov, sklepala sem, da je to karbonat, ki je slabo topen v acetonitrilu. Počakala sem, da se bo trdna snov posedla na dno bučk, vendar so bile raztopine nad njo še vedno rahlo motne, kar je motilo meritev absorbanc (Slika 22). Slepa vrednost je bila zopet zelo visoka, zato so bile
28
absorbance vzorcev glede na slepo negativne. Sklepala sem, da je težava v motnosti raztopin in pa v tem, da NaHCO3 ni zares 2 M, saj se ni povsem raztopil in zato raztopine niso dovolj bazične.
Slika 22: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6
Odločila sem se, da bom NaHCO3 zaradi te težave zamenjala z NaOH z istim pH.
Pomerila sem pH NaHCO3, ki je bil 8,5 in glede na to preračunala, da moram v raztopine dodati 30 μL 0,001 M NaOH (naredila sem ga iz že pripravljenega 2 M NaOH, tako da sem v 100 mL bučki 0,05 mL 2 M NaOH razredčila do oznake). V posamezno raztopino sem nato najprej dodala 30 μL, nato pa še 50 μL raztopine NaOH, vendar pH raztopine ni bil dovolj bazičen, pa tudi absorbance niso bile ustrezne, zato sem se odločila uporabiti kar 1 mL 2 M NaOH. Pripravila sem 2 paralelki raztopin in dobila 2 umeritveni premici, pri obeh pa so bila odstopanja pri nižjih koncentracijah (Slika 23, Graf 4).
Slika 23: Tretji poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6
29
Graf 4: Umeritvena premica za vitamin B6, širše območje
Zato sem se odločila, da bom prve 3 točke na umeritveni premici izpustila in tako sem dobila linearno umeritveno premico (Graf 5).
y = 0,0037x + 0,0947 R² = 0,774
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
0 10 20 30 40 50 60
Absorbanca [/]
Koncentracija [mg/L]
Vitamin B6
30
Graf 5: Umeritvena premica za vitamin B6, ožje območje
Sledila je priprava vzorcev tako, da sem v 10 mL merilno bučko posamezno dala po 2,5 mL že pripravljenega vzorca (glej poglavje 4.5) Cedevite in Kruger multivitaminskih tablet, 1 mL NaOH in 2,5 mL kloranila in dopolnila do oznake z acetonitrilom. Pri tem pa sta se pojavili 2 težavi:
- nastali sta 2 fazi, saj se zaradi prenasičenja vode s solmi acetonitril v njej ni več dobro raztapljal in se je zato ločil;
- pri Cedeviti se je med tema dvema fazama pojavila še plast bele usedline;
sklepala sem, da je to karbonat iz vzorca.
Težavo s karbonatom sem poskusila rešiti z dodatkom mravljične kisline (predhodno sem koncentrirano kislino razredčila z deionizirano vodo v razmerju 1:10): v raztopine Cedevite 11 kapljic, v raztopine Kruger pa 3 kapljice, dokler pH vzorca ni bil enak 3.
Težavo z ločenimi fazami sem poskusila rešiti z razredčevanjem do oznake z deionizirano vodo namesto z acetonitrilom.
Pri vzorcih zaradi teh sprememb ni prišlo do pričakovanega vijoličnega obarvanja.
Sklepala sem, da zaradi dodatka mravljične kisline vzorec ni bil dovolj bazičen za tvorbo kompleksa. Že pri pripravi umeritvenih premic pa sem lahko ugotovila, da v primeru uporabe vode namesto acetonitrila ne dobimo do pravih rezultatov.
y = 0,0055x + 0,0282
31
Določitev v vzorcu je bila torej neuspešna zaradi kompleksne matrice analiziranih vitaminskih pripravkov. Ti namreč vsebujejo veliko polnil, ki so v vodi topna in jo nasitijo z različnimi solmi.
32
33
6 Zaključek
Vitamini so bistvena hranila, ki jih naše telo potrebuje za svoje delovanje. Ker jih telo samo ne more zgraditi, je pomembno, da jih z uravnoteženo prehrano dnevno zaužijemo dovolj, saj pomanjkljiv vnos lahko povzroči hude motnje presnove, poškodbe organov in številne bolezni. Pri tem si lahko pomagamo tudi z jemanjem vitaminov v obliki vitaminskih napitkov ali dopolnil. Ravno zaradi tega pa je pomembno, da znamo določiti pravilno vsebnost vitaminov v tovrstnih izdelkih, da lahko vnos prilagajamo glede na dnevne potrebe vnosa posameznih vitaminov.
V diplomskem delu sem poskusila spektrofotometrično določiti vitamin C, B2 in B6 v nekaj realnih vzorcih. Pri vseh treh metodah so se že ob določanju umeritvene premice ali pa kasneje ob določanju vitamina v realnem vzorcu pojavile težave.
Pri vitaminu C sem pri določanju umeritvene premice opazila časovno spreminjanje obarvanja raztopin, ki se tudi po 1 h ni ustalilo, pri določanju v vzorcih pa se je takoj ob dodatku porabil ves KMnO4 zaradi prisotnosti drugih primesi, ki jih je oksidant oksidiral in se pri tem porabil.
Pri vitaminu B2 se je pojavila težava pri določanju v vzorcih zaradi dodanih barvil, ki motijo spektrofotometrične meritve.
Pri vitaminu B6 pa določanje v vzorcih ni bilo možno zaradi prenasičenja vzorca s solmi, ki so onemogočile potek reakcije nastanka obarvanega kompleksa.
Ustrezen način določanja bi torej bil z uporabo HPLC tehnike. Druga možnost pa je, da bi iz vzorcev odstranila problematične primesi, kot so polnila in barvila, oziroma bi poskusila iz vzorcev izolirati posamezen vitamin, nato pa bi sledila spektrofotometrična določitev.
34
35
7 Viri
[1] “Kaj so vitamini.” https://www.ezdravje.com/zdravje-in-dobro-pocutje/vitamini-in-minerali/vitamini/ (accessed Jul. 03, 2021).
[2] “Vitamin - Regulatory role.”
https://www.britannica.com/science/vitamin/Regulatory-role (accessed Jul. 03, 2021).
[3] “Zakaj je Vitamin C esencialno mikrohranilo?” https://www.zdravo.si/vitamin-c/
(accessed Jul. 03, 2021).
[4] “Varnostni list: vitamin C.” https://www.carlroth.com/medias/SDB-3525-SI-SL.pdf?context=bWFzdGVyfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0c3wyMzU1NT
R. Maldonado, SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS OF VITAMIN C IN DIFFERENT MATRICES UTILIZING POTASSIUM PERMANGANATE, Eur.
Int. J. Sci. Technol. 2018, 7(1): 70-84.
[6] Z. Gazdik, Ondrej Zitka, Determination of Vitamin C (Ascorbic Acid) Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with Electrochemical Detection, Sensors 2008, 8(11): 7097–7112. doi: 10.3390/s8117097
[7] “Vitamin B2 | Riboflavin | Esencialno hranilo je pomembno za rast in plodnost.”
https://www.zdravo.si/vitamin-b2-riboflavin/ (accessed Jul. 03, 2021).
[8] R. Bartzatt, M. L. Follis, Detection and Assay of Riboflavin (Vitamin B2) Utilizing UV/VIS Spectrophotometer and Citric Acid Buffer, J. Sci. Res. Reports 2014, 3(6):
799–809. doi: 10.9734/jsrr/2014/8598
[9] R. Bartzatt, T. Wol, Detection and Assay of Vitamin B-2 (Riboflavin) in Alkaline Borate Buffer with UV/Visible Spectrophotometry, Int. Schol. Res. Not. 2014, Article ID 453085, 7 str. doi: 10.1155/2014/453085
[10] “Vitamin B6 | Piridoksin | Zakaj je pomembno to esencialno hranilo?”
https://www.zdravo.si/vitamin-b6-piridoksin/ (accessed Jul. 03, 2021).
[11] “Varnostni list: piridoksin hidroklorid.” https://www.carlroth.com/medias/SDB-
T914-SI-SL.pdf?context=bWFzdGVyfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0c3wzMjk1NzZ 8YXBwbGljYXRpb24vcGRmfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0cy9oMzcvaG RjLzg5NzE0Njk2ODQ3NjYucGRmfGJiOGI4NDRhMTZkMGQ2NjUyNWE3Y zMxMmEzMGMwZGE0ZmU3MGRmM2EwYTFmMGZjNjAwOTI3 (accessed
36
Jul. 03, 2021).
[12] A. Raza, A. Rehman, S. B. Niazi, T. M. Ansari, Spectrophotometric Determination of Pyridoxine Hydrochloride (Vitamin B6) in Bulk and Tablets by Charge-Transfer Complexation with Chloranil, J. Chem. Soc. Pakistan 2007, 29(6): 33-36.
[13] B. Pihlar, H. Prosen, Osnove analizne kemije. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2019.
[14] D. Černe, B. Ostanek, Biomedicinska analitika I. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2012.