DIPLOMSKO DELO

U

L

F

DIPLOMSKO DELO

Taja Ahlin

Ljubljana, 2021

U

L

F

VISOKOŠOLSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM KEMIJSKA TEHNOLOGIJA

SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE VITAMINOV V PREHRANSKIH DOPOLNILIH

DIPLOMSKO DELO

Taja Ahlin

M

: prof. dr. Helena Prosen

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega/magistrskega dela

Spodaj podpisani/-a Taja Ahlin sem avtor/-ica diplomskega/magistrskega dela z naslovom: Spektrofotometrično določanje vitaminov v prehranskih dopolnilih.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Helene Prosen;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, Podpis avtorja/-ice:

ZAHVALA

Najlepše se zahvaljujem mentorici prof. dr. Heleni Prosen za strokovno svetovanje, potrpežljivost in spodbudo pri nastajanju diplomskega dela. Rada bi se zahvalila tudi asistentom in tehničnim sodelavcem na katedri za analizno kemijo, kateri so mi bili ves čas na voljo pri iskanju laboratorijskega inventarja.

Iskrena zahvala gre še moji družini, posebno mami in očetu za vso podporo in finančno pomoč pri študiji in pa fantu Maticu, ker me je optimistično spodbujal in mi nesebično pomagal.

SPEKTROFOTOMETRIČNO DOLOČANJE VITAMINOV V PREHRANSKIH DOPOLNILIH

Povzetek: Za določitev vitaminov C, B2 in B6 v prehranskih dopolnilih sem uporabila spektrofotometrično metodo. Pri vseh vitaminih je določevanje temeljilo na obarvanju ali pa spremembi obarvanja vzorca zaradi kemijske reakcije ali pa naravnega obarvanja raztopine vitamina.

V delu so podani rezultati preizkušanja metode za vsak vitamin posebej. V prvi fazi sem pripravila umeritvene krivulje s pomočjo standardnih raztopin. Za vitamin C sem izdelala umeritveno krivuljo v območju od 5-100 mg/L, za vitamin B2 v območju 5-30 mg/L in za vitamin B6 v območju 10-50 mg/L.

Izkazalo se je, da se spektrofotometrične metode za vse tri vitamine na realnih vzorcih ne obnesejo dobro, zaradi kompleksne matrice analiziranih vzorcev. Ti namreč vsebujejo veliko polnil in dodanih barvil, ki motijo meritve.

Ključne besede: spektrofotometrija, vitamin C, vitamin B2, vitamin B6, prehranska dopolnila

SPECTROFOTOMETRIC DETERMINATION OF VITAMINS IN FOOD SUPPLEMENTS

Abstract: I used a spectrophotometric method to determine vitamins C, B2 and B6 in dietary supplements. For all vitamins, the determination was based on the color or change of color of the sample due to a chemical reaction or the natural color of the vitamin solution.

The paper presents the results of the method evaluation for each vitamin separately. In the first phase, I prepared calibration curves using standard solutions. For vitamin C, I constructed a calibration curve in the range of 5–100 mg/L, for vitamin B2 in the range of 5–30 mg/L, and for vitamin B6 in the range of 10–50 mg/L.

It turned out that the spectrophotometric methods for all three vitamins did not work well on real samples, due to the complex matrix of the analyzed samples. These contain a lot of fillers and added dyes, which interfere with the measurements.

Keywords: spectrophotometry, vitamin C, vitamin B2, vitamin B6, dietary supplements

Kazalo

1 Uvod ... 1

2 Namen dela ... 3

3 Teoretični del ... 5

3.1 Splošno o vitaminih ... 5

3.2 Vitamin C ... 5

3.2.1 Določevanje vitamina C v prehranskih dopolnilih ... 6

3.3 Vitamin B2 ... 7

3.3.1 Določevanje vitamina B2 v prehranskih dopolnilih ... 8

3.4 Vitamin B6 ... 8

3.4.1 Določevanje vitamina B6 v prehranskih dopolnilih ... 9

3.5 Spektrofotometrija ... 10

4 Eksperimentalni del ... 13

4.1 Uporabljene kemikalije ... 13

4.1.1 Standardi vitaminov ... 13

4.1.2 Topila in drugi reagenti ... 13

4.2 Laboratorijski pripomočki ... 13

4.3 Priprava standardnih raztopin in drugih reagentov ... 14

4.3.1 Vitamin C ... 14

4.3.2 Vitamin B2 ... 14

4.3.3 Vitamin B6 ... 14

4.4 Priprava standardnih raztopin za umeritveno premico ... 15

4.4.1 Vitamin C ... 15

4.4.2 Vitamin B2 ... 15

4.4.3 Vitamin B6 ... 15

4.5 Priprava vzorcev ... 15

4.6 Spektrofotometrična metoda ... 17

4.6.1 Metoda za vitamin C ... 18

4.6.2 Metoda za vitamin B2 ... 18

4.6.3 Metoda za vitamin B6 ... 18

5 Rezultati z razpravo ... 21

5.1 Določanje vitamina C ... 21

5.2 Določanje vitamina B2 ... 24

5.3 Določanje vitamina B6 ... 27

6 Zaključek ... 33

7 Viri ... 35

Kazalo slik

Slika 2: Oksidacija askorbinske kisline ... 6

Slika 3: Riboflavin in njegova koencima ... 7

Slika 4: Struktura riboflavina ... 8

Slika 5: Struktura piridoksina, PLP in PMP ... 9

Slika 6: Struktura piridoksina ... 9

Slika 7: Spektrofotometer z enim žarkom ... 11

Slika 8: Spektrofotometer z dvema žarkoma ... 11

Slika 9: Deklaracija multivitaminskih tablet Kruger ... 16

Slika 10: Deklaracija multivitaminskega napitka Cedevita ... 16

Slika 11: Deklaracija prehranskega dopolnila Supradyn ... 17

Slika 12: Rekacija tvorbe vijoličnega kompleksa B6 s kloranilom ... 19

Slika 13: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C ... 21

Slika 14: Reakcije redukcije KMnO4 ... 22

Slika 15: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C po 10 min ... 22

Slika 16: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C po 60 min ... 22

Slika 17: Prvi poskus določanja vitamina C v vzorcih (K= Kruger, C= Cedevita, S= Supradyn) ... 24

Slika 18: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B2 ... 24

Slika 19: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B2 ... 25

Slika 20: Prvi poskus določanja vsebnosti vitamina B2 v vzorcu ... 27

Slika 21: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6 ... 27

Slika 22: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6 ... 28

Slika 23: Tretji poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6 ... 28

Kazalo grafov

Graf 2: Umeritvena premica za vitamin B2, širše območje ... 25

Graf 3: Umeritvena premica za vitamin B2, ožje območje ... 26

Graf 4: Umeritvena premica za vitamin B6, širše območje ... 29

Graf 5: Umeritvena premica za vitamin B6, ožje območje ... 30

Kazalo tabel

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

ATR-IR infrardeča spektroskopija z oslabljenim odbojem DCPI diklorofenolindofenol

DNA deoksiribonukleinska kislina FAD flavin adenin dinukleotid FIA pretočna inekcijska analiza

FMN flavin mononukleotid

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti IR infrardeča svetloba

LED svetleča dioda PLP piridoksal fosfat PMP piridoksin fosfat UV ultravijolična svetloba

UV/VIS ultravijolično-vidna spektroskopija ali spektralno območje

1

1 Uvod

Vitamini so snovi, ki so nujno potrebne za normalno delovanje in razvoj našega telesa. V telo jih v zelo majhnih količinah vnašamo s hrano, če pa to ni mogoče, lahko vnos vitaminov dopolnjujemo z jemanjem prehranskih dopolnil. To so koncentrirani viri posameznih ali kombiniranih vitaminov, mineralov in izvlečkov rastlin. Običajno so v obliki tablet, kapsul, praškov ali bonbonov.

Vsak vitamin ima v telesu točno določeno vlogo, ki je ne more nadomestiti noben drug vitamin, zato je pomembno, da z raznoliko prehrano v telo vnašamo vse vrste vitaminov.

Pri tem je pomembno, da smo pozorni tudi na priporočen dnevni vnos vitaminov in mineralov, ki je različen za otroke in odrasle, saj lahko vitamini v prevelikih količinah na telo delujejo negativno in postanejo strupeni.

Za zagotovitev kakovosti izdelkov in regulatornih zahtev je potrebno znati pravilno določati vsebnost aktivnih učinkovin v prehranskih dopolnilih, da se specifikacija izdelka sklada s samo vsebino. Prav tako pa je to pomembno tudi z vidika kontrole vnosa priporočene dnevne količine vitaminov.

Določevanje koncentracije vitaminov v prehranskih dopolnilih je zahtevna naloga, zaradi kompleksne matrice, znotraj katere jih določamo. Metode za določevanje vitaminov vključujejo različne tehnike. Najprimernejša je tekočinska kromatografija z različnimi načini detekcije npr. UV, masna spektrometrija. Pogosto pa se uporabljajo tudi plinska kromatografija, kapilarna elektroforeza in UV-VIS ali IR spektrometrija. Koncentracije vitaminov v prehranskih dopolnilih so nizke, zato je potrebno pripraviti bolj koncentrirane raztopine za nadaljnje določanje.

2

3

2 Namen dela

Namen diplomske naloge je preizkusiti spektrofotometrične metode za določanje vsebnosti treh različnih vitaminov: C, B2 in B6 v različnih prehranskih dopolnilih.

Vitamin C sem določala s pomočjo reakcije s kalijevim permanganatom, pri katerem sem merila zmanjšanje vijoličnega obarvanja raztopine. Vitamin B2 sem določala na podlagi rumenega obarvanja raztopine tega vitamina, vitamin B6 pa sem določala s tvorbo obarvanega kompleksa pri reakciji s kloranilom. Pri vseh treh metodah sem najprej določila umeritvene krivulje, nato pa sem se lotila določanja vitaminov v realnih vzorcih.

4

5

3 Teoretični del

3.1 Splošno o vitaminih

Vitamini so organske kemijske snovi, ki so v zelo majhnih količinah prisotne v vseh skupinah živil. Potrebni so za delovanje organizma oziroma opravljanje osnovnih življenjskih nalog. Spadajo med esencialna živila, saj jih telo v glavnem samo ne more proizvajati v zadostnih količinah. Poznamo kar 13 različnih vitaminov, ki jih v splošnem delimo na topne v vodi in topne v maščobi [1].

Vodotopni vitamini se v telesu ne shranjujejo in jih odvečne izločimo iz telesa. Sem sodijo vitamini iz skupine B in vitamin C. Vsi vitamini v tej skupini so topni v vodi, vendar pa je stopnja raztapljanja posameznega vitamina v vodi različna. To vpliva tudi na pot absorpcije, izločanja in stopnjo shranjevanja v posameznem tkivu. V svojem osnovnem stanju so ti vitamini neaktivni, aktivni postanejo šele, ko se pretvorijo v koencimsko obliko. Ko vitamin preide v aktivno koencimsko obliko, se mora dalje združiti z ustrezno beljakovinsko komponento, imenovano apoencim, da lahko pride do reakcij, ki jih katalizirajo encimi. Edini vitamin v tej skupini, ki ni opredeljen kot koencim, je vitamin C.

V maščobah topni vitamini pa se v telesu shranjujejo v jetrih in jih telo lahko pravilno vsrka le, če zaužijemo dovolj maščob. Sem sodijo vitamini A, D, E in K. Ti vitamini so si po strukturi podobni, kar kaže na to, da imajo podobne kemijske lastnosti, vendar pa imajo tudi pomembne razlike, ki jim dajejo edinstvene lastnosti in določajo njihovo biološko aktivnost, funkcije, presnovo in izločanje.

V diplomski nalogi sem preizkusila spektrofotometrične metode za vitamine C, B2 in B6.

Vsi ti vitamini so vodotopni. Zaradi njihove pomembne vloge v telesu je pomembno znati pravilno kvantificirati njihove količine v živilih, da lahko zagotovimo zadosten vnos vitaminov preko živil ali pa s pomočjo prehranskih dopolnil [2].

3.2 Vitamin C

Imenujemo ga tudi L-askorbinska kislina. Je pomemben antioksidant, ki sodeluje pri nastajanju vezivnega tkiva, vsrkavanju železa iz črevesja, krepi bele krvničke, povečuje količino protiteles in zmanjšuje oksidativne okvare na DNA. Ob pomanjkanju vitamina C se pri dojenčkih pojavi Moeller-Barlowova bolezen, pri odraslih pa skorbut. Obe se kažeta v obliki motenj tvorbe kosti in rasti ter krvavitev v koži, sluznicah, mišičevju in notranjih organih. Glavni viri vitamina C so sadje in zelenjava, priporočeno je, da jih zaužijemo kar sveže [3].

6

Molekulska formula vitamina C je C6H8O6, njegova molska masa znaša 176,13 g/mol.

Poznamo dva izomera D in L (Slika 1), slednji se v naravi pojavlja najpogosteje. Je v obliki bledo rumenega kristaliničnega prahu, ki ima močan okus po kislem in je brez vonja. V vodi je zelo dobro topen, njegova topnost znaša 330 g/L pri 20 ᵒC.

Slika 1: L in D-askorbinska kislina

Je močan antioksidant, zato ga lahko preprosto pretvorimo iz njegove reducirane oblike (askorbinska kislina) v oksidirano obliko (dehidroakorbinska kislina) (Slika 2) [4].

Slika 2: Oksidacija askorbinske kisline 3.2.1 Določevanje vitamina C v prehranskih dopolnilih

V literaturi lahko najdemo kar nekaj različnih metod za določevanje vitamina C.

Najbolj osnovna metoda je direktna redoks titracija askorbinske kisline, ki je močan reducent, z močnim oksidantom (npr. 2,6-diklorofenolindofenol - DCPI) [5].

Med bolj napredne metode določanja vitamina C pa spadajo tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti HPLC, pretočno-injekcijska analiza FIA, kapilarna elektroforeza, amperometrične in kolorimetrične metode v povezavi z tekočinsko kromatografijo in spektrofotometrične metode. Nekatere od teh metod so drage, zamudne in potrebujejo veliko različnih reagentov [6].

7

V diplomskem delu sem se osredotočila na spektrofotometrično določanje vitamina C, ki temelji na zmanjšanja vijoličnega obarvanja kalijevega permanganata, saj se ta porabi.

Absorpcijski maksimum kalijevega permanganata je pri 525 nm [5].

3.3 Vitamin B2

Imenujemo ga tudi riboflavin. Sodeluje v oksidacijsko-redukcijskih procesih kot prenašalec elektronov. Potreben je za rast in razvoj zarodka, presnovo ogljikovih hidratov, maščob, beljakovin in sodeluje pri tvorbi in razgradnji rdečih krvničk. V telesu deluje v obliki dveh koencimov, flavin adenin dinukleotida - FAD in pa flavin mononukleotida - FMN (Slika 3).

Slika 3: Riboflavin in njegova koencima

Ob pomanjkanju pride do motenj v rasti, dermatitisa, vnetja ustne sluznice in anemije.

Glavni vir vitamina B2 so mleko in mlečni izdelki, meso, ribe in jajca [7].

Molekulska formula vitamina B2 je C17H20N4O6 (Slika 4), njegova molska masa znaša 376,36 g/mol. Je v obliki rumeno-oranžnega kristaliničnega prahu, ki ima grenek okus in poseben vonj. V vodi je slabo topen, njegova topnost znaša 84,7 mg/L. Raztopina riboflavina je rumene barve in je občutljiva na svetlobo, saj se vitamin pod svetlobo hitro razgradi [8].

8

Slika 4: Struktura riboflavina 3.3.1 Določevanje vitamina B2 v prehranskih dopolnilih

V literaturi lahko najdemo kar nekaj različnih metod za določevanje vitamina B2.

Najbolj pogosto se uporabljajo reverzno fazna tekočinska kromatografija visoke ločljivosti HPLC, fluorescenčna spektroskopija, tankoplastna kromatografija z različnimi mobilnimi fazami in ionska kromatografija. Možno pa je tudi določanje z UV/VIS spektroskopijo [9].

V diplomskem delu sem se osredotočila na spektrofotometrično določanje vitamina B6, ki temelji na rumenem obarvanju raztopine riboflavina. Njegov absorpcijski maksimum je pri 440 nm [8].

3.4 Vitamin B6

Imenujemo ga tudi piridoksin. Pomemben je za presnovo aminokislin, maščob in ogljikovih hidratov, tvorbo protiteles in rdečih krvničk in obnavljanje živčnih celic. V telesu deluje v obliki dveh koencimov, piridoksal fosfata - PLP in piridoksin fosfata - PMP (Slika 5).

9

Slika 5: Struktura piridoksina, PLP in PMP

Vsebujejo ga skoraj vsa živila, največ ga je v piščančjem mesu, svinjini, ribah, zelju, fižolu, krompirju in bananah [10].

Molekulska formula vitamina B6 je C8H11NO3 (Slika 6), njegova molska masa pa znaša 169,18 g/mol. Je v obliki belega kristaliničnega prahu, ki nima vonja. V vodi je dobro topen, njegova topnost znaša 220 g/L pri 20 ᵒC. Je zelo stabilen vitamin, ki tudi v močno kisli ali bazični raztopini ob segrevanju obdrži svojo strukturo. Je pa občutljiv na svetlobo in pod njenim vplivom hitro razpada [11].

Slika 6: Struktura piridoksina 3.4.1 Določevanje vitamina B6 v prehranskih dopolnilih

V literaturi najdemo kar nekaj metod za določevanje vitamina B6.

Najbolj pogosto se za določevanje uporablja tekočinska kromatografija, plinska kromatografija, kapilarna elektroforeza, diferenčna pulzna voltametrija in plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo.

V diplomski nalogi sem se osredotočila na spektrofotometrično določevanje vitamina B6, ki temelji na tvorbi vijolično obarvanega kompleksa. Ta ima absorpcijski maksimum pri 550 nm [12].

10

3.5 Spektrofotometrija

Spada med molekulsko absorpcijsko spektrometrijo, saj pri tej tehniki koncentracijo analita določamo z merjenjem absorpcije monokromatske svetlobe pri prehodu skozi raztopino vzorca. Za vzbujanje lahko uporabimo monokromatsko svetlobo v dveh področjih in sicer UV (190-380 nm) ali pa vidnem področju (380-800 nm). Svetloba v molekulah zaradi vzbujanja povzroči spremembe v elektronskih stanjih [13].

Aparatura za spektrofotometrijo se imenuje spektrofotometer. Sestavljen je iz:

- izvor svetlobe→ izbiramo lahko med različnimi žarnicami, odvisno od zahtevane valovne dolžine svetlobe:

o volframove žarnice→ uporabljamo jih najpogosteje, oddajajo svetlobo od 360 do 950 nm;

o volframovo-halogenske žarnice→ odlikuje jih večja svetilnost pri nižjih valovnih dolžinah, oddajajo svetlobo od 290 do 900 nm;

o vodikova žarnica→ oddaja svetlobo od 220 do 360 nm (pri 340 nm je svetilnost že slaba);

o devterijeva žarnica→ podobna kot vodikova žarnica, le da ima večjo svetilnost;

o svetleče diode LED→ zadnje čase se vedno več uporabljajo; to so polprevodniški materiali, ki oddajajo svetlobo v ozkem območju valovnih dolžin, s kombinacijo rdeče, zelene in modre diode pa dobimo belo svetlobo.

- monokromator→ sestavljen je običajno iz optične mrežice ali optične prizme, z izbiro kota padanja svetlobe na optično mrežico/prizmo pa lahko izberemo valovno dolžino svetlobe, ki jo bo monokromator prepustil.

- kiveta z raztopino vzorca→ kivete so iz stekla (za svetlobo valovne dolžine od 320 do 950 nm) ali kvarčnega stekla (za UV območje), v zadnjem času pa so v uporabi tudi večnamenske plastične kivete. Kivete so ponavadi kvadratne oblike, njihova širina pa je 1 cm (širina je lahko tudi večja, kar pomeni, da je svetlobna pot daljša, to pa poveča občutljivost postopka). Imamo pa tudi kivete z manjšim volumnom, ki jih uporabimo v primeru, ko imamo manjše količine vzorca.

11

- detektorji na osnovi različnih senzorjev:

o fotovoltaična celica;

o fotopomnoževalka;

o fotodiode.

- računalniški procesor in zaslon→ ta analizira signal in dobljene podatke ter jih prikaže na zaslonu.

Ločimo spektrofotometre z (Slika 7 in 8):

- enim žarkom→ pri tej vrsti spektrofotometra merjenje poteka v dveh korakih in sicer najprej pomerimo absorbanco referenčnemu slepemu vzorcu, nastavimo absorbanco na nič in pomerimo absorbanco vzorca;

- dvojnim žarkom→ pri tej vrsti spektrofotometra pa se istočasno meri referenčni slepi vzorec in vzorec ter oba signala sproti digitalizira in odšteva [14].

Slika 7: Spektrofotometer z enim žarkom

Slika 8: Spektrofotometer z dvema žarkoma

Monokromator

Monokromator

12

Spektrofotometrične meritve potekajo pri izbrani valovni dolžini, ki ustreza absorpcijskemu maksimumu analita, to je valovna dolžina, pri kateri je sprememba absorbance na enoto koncentracije največja. Absorpcijski maksimum določimo tako, da posnamemo spekter analita v širšem spektralnem območju. Iz tega lahko nato določimo, pri kateri valovni dolžini smo dobili največji odziv. Nato sledi merjenje absorbance vzorcev pri določenem absorpcijskem maksimumu [13].

13

4 Eksperimentalni del

4.1 Uporabljene kemikalije

4.1.1 Standardi vitaminov

• L-askorbinska kislina: Gram-mol, Hrvaška; čistost: >99,0 %

• Riboflavin: Sigma Aldrich, Nemčija; čistost: >98,0 %

• Piridoksin hidroklorid: Sigma Aldrich, Nemčija; čistost: >98 % 4.1.2 Topila in drugi reagenti

• Kloranil: Fluka, Nemčija; čistost: >99 %

• Natrijev hidrogenkarbonat: Merck, Nemčija; čistost: >99,7 %

• Citronska kislina monohidrat: Sigma Aldrich, Nemčija; čistost: >99,5 %

• Acetonitril: Fisher Scientific, UK; čistost: >99,9 %

• Mravljična kislina: Fluka, Nemčija; čistost: >98 %

• že pripravljena raztopina NaOH, 2 M

• že pripravljena raztopina H2SO4, 1 M

• že pripravljena raztopina KMnO4, 0,02 M

4.2 Laboratorijski pripomočki

• UV-VIS spektrofotometer Cary 50, Varian, Nizozemska

• Kiveta kvadratne oblike (1 cm) in kiveta z ožjim vratom (1 cm), material: steklo

• Bučke, avtomatske pipete, čaše, palčke, ladjice za tehtanje, žličke, terilnica, lij, kapalke, filter papir (črn in bel), pH lističi, kavtarice

14

4.3 Priprava standardnih raztopin in drugih reagentov

4.3.1 Vitamin C

Standardno raztopino vitamina C sem pripravila iz trdnega standarda L-askorbinske kisline. Za pripravo standardne raztopine s koncentracijo 100 mg/L sem natehtala 0,025 g standarda in ga v 250 mL merilni bučki raztopila do oznake z deionizirano vodo.

Potrebovala sem tudi raztopino KMnO4 s koncentracijo 100 mg/L. Prvo raztopino sem pripravila tako, da sem v 250 mL merilno bučko dala 7,2 mL 0,02 M KMnO4, 24,2 mL 1 M H2SO4 in do oznake dopolnila z vodo. Drugo raztopino KMnO4 sem pripravila tako, da sem v 250 mL merilno bučko dala 7,2 mL 0,02 M KMnO4 in do oznake dopolnila z 1 M H2SO4.

4.3.2 Vitamin B2

Standardno raztopino vitamina B2 sem pripravila iz trdnega standarda riboflavina. Za pripravo standardne raztopine z koncentracijo 100 mg/L sem natehtala 0,025 g standarda in ga v 250 mL merilni bučki raztopila do oznake z deionizirano vodo.

Potrebovala sem še citratni pufer s koncentracijo 0,025 M in pH=5, ki sem ga pripravila tako, da sem natehtala 2,63 g citronske kisline, jo v 0,5 L čaši raztopila z 450 mL deionizirane vode, nato pa sem na pH-metru s pomočjo NaOH pH nastavila na 5.

Raztopino sem nato dala v 0,5 L bučko in razredčila do oznake z deionizirano vodo.

4.3.3 Vitamin B6

Standardno raztopino vitamina B6 sem pripravila iz trdnega standarda piridoksin hidroklorida. Za pripravo standardne raztopine s koncentracijo 200 mg/L sem natehtala 0,02 g standarda in ga raztopila v 100 mL bučki z deionizirano vodo in acetonitrilom (1:1).

Potrebovala sem še raztopino natrijevega hidrogenkarbonata s koncentracijo 2 mol/L.

Pripravila sem jo tako, da sem v 100 mL bučko dala 16,8 g natrijevega hidrogenkarbonata in dopolnila do oznake z deionizirano vodo. Bučko sem dala za 15 min na ultrazvočno kopel, vendar se še vseeno ni raztopil ves natrijev hidrogenkarbonat, torej sem imela v bučki nasičeno raztopino.

Potrebovala sem tudi 0,02% raztopino kloranila, ki sem jo pripravila tako, da sem natehtala 0,02 g kloranila in ga v 100 mL bučki do oznake raztopila z acetonitrilom.

15

4.4 Priprava standardnih raztopin za umeritveno premico

4.4.1 Vitamin C

Iz osnovne standardne raztopine vitamina C s koncentracijo 100 mg/L sem pripravila standardne raztopine z naslednjimi koncentracijami: 5, 10, 20, 30, 50, 70 in 100 mg/L. Za razredčevanje vzorcev sem uporabila raztopino KMnO4 s koncentracijo 100 mg/L.

4.4.2 Vitamin B2

Iz osnovne standardne raztopine vitamina B2 s koncentracijo 100 mg/L sem pripravila standardne raztopine z naslednjimi koncentracijami: 5, 10, 20, 30 in 40 mg/L. Za razredčevanje vzorcev sem uporabila citratni pufer s koncentracijo 0,025 mol/L in pH 5.

Pri ponovni pripravi umeritvene premice pa sem pripravila standardne raztopine z naslednjimi koncentracijami: 5, 10, 15, 20 in 30 mg/L. Za razredčevanje vzorcev sem uporabila citratni pufer s koncentracijo 0,025 mol/L in pH 5.

4.4.3 Vitamin B6

Iz osnovne standardne raztopine vitamina B6 s koncentracijo 200 mg/L sem pripravila standardne raztopine z naslednjimi koncentracijami: 0,4. 2, 5, 10, 20, 30, 40 in 50 mg/L.

Za razredčevanje vzorcev sem uporabila acetonitril.

4.5 Priprava vzorcev

Vitamin B6 sem določevala v dveh vzorcih in sicer v multivitaminskih tabletah Kruger (Slika 9) in pa v Cedeviti (Slika 10).

Multivitaminsko tableto Kruger sem raztopila v deionizirani vodi in vzorec prefiltritala skozi filtrni papir, nato pa sem ga dala v 50 mL bučko in razredčila do oznake z deionizirano vodo.

16

Slika 9: Deklaracija multivitaminskih tablet Kruger

Natehtala sem 25 g prahu Cedevite, ki sem ga prav tako raztopila v deionizirani vodi, prefiltritala skozi filtrni papir 'beli trak', nato pa sem vzorec prenesla v 50 mL bučko in razredčila do oznake z deionizirano vodo.

Slika 10: Deklaracija multivitaminskega napitka Cedevita

Vitamin C in B2 sem določala v zgornjih dveh vzorcih in še v dodatnem vzorcu Supradyna (Slika 11), ki sem ga pripravila tako, da sem 2 tableti raztopila v deionizirani vodi, vzorec filtrirala skozi filtrni papir 'beli trak', ga prenesla v 50 mL bučko in dopolnila do oznake z deionizirano vodo.

17

Slika 11: Deklaracija prehranskega dopolnila Supradyn

V tabeli 1 sem zbrala pričakovane vrednosti posameznega vitamina v vsakem od vzorcev.

Tabela 1: Pričakovane vsebnosti vitaminov v vzorcih glede na podatke na embalaži

4.6 Spektrofotometrična metoda

Za analizne metode sem uporabila spektrofotometrične metode. Absorpcijskih maksimumov za posamezni vitamin ni bilo potrebno določati, saj sem jih predhodno že poiskala v literaturi. Absopcijski maksimum pri metodi za vitamin C je pri 525 nm, pri metodi za vitamin B2 pri 550 nm in pri metodi za vitamin B6 pri 440 nm.

Merjenje absorbanc je potekalo tako, da sem najprej določila slepo vrednost za vsak set meritev, tako da sem pomerila absorbanco standardne raztopine, ki je bila brez analita.

Sledilo je merjenje absorbance standardnih raztopin, ki je potekalo tako, da sem kiveto pred meritvijo najprej sprala z ustrezno raztopino, nato pa sem jo z njo napolnila, dala v spektrofotometer in pomerila absorbanco. Pri vseh setih standardnih raztopin sem absorbance pomerila trikrat. Na enak način sem nato izmerila absorbance vzorcem.

Vitamin C Vitamin B2 Vitamin B6

V raztopini vzorca

V vzorcu za merjenje

V raztopini vzorca

V vzorcu za merjenje

V raztopini vzorca

V vzorcu za merjenje Multivitaminske

tablete Kruger 1600 mg/L 64 mg/L 28 mg/L 1,4 mg/L 28 mg/L 7 mg/L Cedevita 1065 mg/L 53,3 mg/L 18,5 mg/L 0,93 mg/L 18,5 mg/L 4,6 mg/L Supradyn 6400 mg/L 64 mg/L 84 mg/L 4,2 mg/L 80 mg/L 20 mg/L

18

4.6.1 Metoda za vitamin C

Za določanje vitamina C sem preizkušala spektrofotometrično metodo, ki temelji na zmanjšanju vijoličnega obarvanja raztopine KMnO4 po reakciji z vitaminom C, saj se ta porabi. Vitamin C je namreč močan reducent, zato ga lahko z močnim oksidantom, kot je KMnO4, v kislem oksidiramo. Pri tem poteče naslednja reakcija:

2KMnO4 + 5C6H8O6 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + 5C6H6O6 + K2SO4 + 8H2O Absorpcijski maksimum nastale raztopine je pri 525 nm.

Pri tej metodi je potrebno v prvem koraku določiti umeritveno premico. Za to potrebujemo raztopino KMnO4 s koncentracijo 100 mg/L in pa raztopine vzorcev standarda L-askorbinske kisline z različnimi koncentracijami. Tem raztopinam dodamo enak volumen raztopine KMnO4 in takoj po dodatku poteče reakcija redukcije in zmanjšanje vijoličnega obarvanja raztopine. Pri tem dejansko določamo razliko v spremembi absorpcije med slepim vzorcem, ki ne vsebuje vitamina C, in pa vzorcem, ki vitamin C vsebuje.

Po določitvi umeritvene premice v drugem koraku sledi določanje v realnih vzorcih.

Potrebno je pripraviti raztopine vzorcev, ki jim dodamo enak volumen KMnO4, kot v prvem koraku [5].

4.6.2 Metoda za vitamin B2

Za določanje vitamina B2 sem preizkušala spektrofotometrično metodo, ki temelji na merjenju rumenega obarvanja raztopine riboflavina. Njen absorpcijski maksimum je pri 440 nm.

Pri tej metodi je potrebno v prvem koraku določiti umeritveno premico. Za to potrebujemo standardno raztopino riboflavina, ki ji dodamo citratni pufer s koncentracijo 0,025 M in pH 5, da dobimo različne koncentracije standardne raztopine riboflavina.

Po določitvi umeritvene premice v drugem koraku sledi določanje v realnih vzorcih.

Potrebno je pripraviti raztopine vzorcev, ki jih do želene koncentracije redčimo s citratnim pufrom [8].

4.6.3 Metoda za vitamin B6

Za določanje vitamina B6 sem preizkušala spektrofotometrično metodo, ki temelji na tvorbi obarvanega kompleksa med vitaminom in kloranilom. Raztopina piridoksin klorida

19

je kisla, zato jo moramo v prvem koraku narediti bazično s pomočjo 2 M natrijevega hidrogenkarbonata, da lahko v drugem koraku kot elektron akceptor reagira z kloranilom.

S to reakcijo dosežemo tvorbo vijoličnega kompleksa z absorpcijskim maksimumom pri 550 nm (Slika 12).

Slika 12: Rekacija tvorbe vijoličnega kompleksa B6 s kloranilom

Pri tej metodi je potrebno v prvem koraku določiti umeritveno premico. Za to potrebujemo standardno raztopino piridoksin hidroklorida, raztopino 2 M natrijevega hidrogenkarbonata in acetonitril. V prvi fazi standardni raztopini piridoksin hidroklorida dodamo 1 mL 2 M natrijevega hidrogenkarbonata in dobro premešamo, nato pa dodamo še različne volumne acetonitrila, da dobimo različne koncentracije standardne raztopine piridoskin hidroklorida. Po dodatku acetonitrila lahko takoj opazimo tvorbo vijoličnega produkta.

Po določitvi umeritvene premice v drugem koraku sledi določanje v realnih vzorcih.

Potrebno je pripraviti raztopine vzorcev, ki jim dodamo 1 mL natrijevega hidrogenkarbonata in jih do želene koncentracije nato razredčimo z acetonitrilom [12].

20

21

5 Rezultati z razpravo

Cilj pri spektrofotometričnem določanju vitaminov je bil, da v prvi fazi za vse 3 vitamine izberem absorpcijski maksimum, saj s takim pristopom bistveno zmanjšamo napake, izboljšamo občutljivost in mejo zaznavnosti metode. Nato sem za vse 3 vitamine izdelala umeritvene premice, ki naj bi bile linearne.

V drugi fazi pa sem analizne metode poskušala prenesti na realne vzorce in s pomočjo umeritvenih premic poskušala določiti koncentracijo iskanega analita v različnih vzorcih prehranskih dopolnil. Rezultate sem primerjala z deklariranimi vrednostmi.

5.1 Določanje vitamina C

Delo sem začela s pripravo umeritvene premice. Iz standardne raztopine askorbinske kisline s koncentracijo 100 mg/L sem v Coulterjevih posodah pripravila raztopine s koncentracijami: 0, 5, 10, 20, 30, 50, 70 in 100 mg/L v 10 mL. Tem vzorcem sem nato dodala 10 mL raztopine KMnO4 s koncentracijo 100 mg/L in deionizirano vodo, da je bil skupni volumen vsakega vzorca 20 mL. Po približno 30 s sem v vzorcih opazila rjavo obarvanje, zlasti v Coulterjevih posodah z višjim preostankom KMnO4 (Slika 13).

Slika 13: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C

Sklepala sem, da je nastal MnO2 (s), torej reagent KMnO4 v prvem poskusu ni bil dovolj kisel. V takem primeru poteka redukcija MnO4- le do MnO2(s), ne pa do Mn²⁺ (Slika 14).

22

Slika 14: Reakcije redukcije KMnO4

Pripravila sem novo raztopino KMnO4, tako da sem za razredčevanje uporabila le 1 M raztopino H2SO4. Celoten postopek priprave raztopin za merjenje sem ponovila in tokrat je bilo obarvanje lepo rožnato (Slika 15). Absorbance vseh raztopin sem izmerila 3x.

Slika 15: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C po 10 min

Slika 16: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin C po 60 min Iz samih vrednosti absorbanc pa tudi slik raztopin (Slika 15 in 16) je bilo razvidno, da se barva in posledično absorbanca raztopin s časom spreminjajo, zato sem ponovno pripravila raztopine in absorbance merila v 10 min časovnih intervalih. Tudi po 1 h se niso ustalile, zato sem se odločila, da bom absorbance raztopin pomerila v najkrajšem možnem času in tudi za umeritveno krivuljo sem izbrala premico, katere absorbance so bile posnete v največ 10 min po pripravi (Graf 1).

1.

2.

3.

(s)

23

Graf 1: Umeritvena premica za vitamin C

Sledila je priprava vzorcev. Vzorec Cedevite sem pripravila tako, da sem v Coulterjevo posodo dala 0,5 mL že pripravljenega vzorca (glej poglavje 4.5), dodala 9,5 mL deionizirane vode in 10 mL raztopine KMnO4. Vzorec Kruger multivitaminskih tablet sem pripravila tako, da sem v Coulterjevo posodo dala 0,4 mL že pripravljenega vzorca, dodala 9,6 mL deionizirane vode in 10 mL raztopine KMnO4. Vzorec Supradyna sem pripravila tako, da sem v Coulterjevo posodo dala 0,1 mL že pripravljenega vzorca, dodala 9,9 mL deionizirane vode in 10 mL raztopine KMnO4. Za vsako prehransko dopolnilo sem pripravila po 2 vzorca. V prvem poskusu so se vzorci ob dodatku KMnO4

popolnoma razbarvali, torej se je porabil ves oksidant. Poskus sem ponovila, tako da sem naredila 10x redčitve vseh vzorcev, vendar sta se tudi v tem primeru vzorca Cedevite in Kruger multivitaminskih tablet popolnoma razbarvala (Slika 17), zato sem pomerila le absorbanco Supradyna. Končno izračunana koncentracija vitamina C v Supradynu je bila 77 mg/L (deklaracija 64 mg/L), vzrok za odstopanje izračunane koncentracije od deklarirane je prisotnosti drugih primesi, ki jih je oksidant oksidiral in se pri tem porabil.

Iz rezultatov pa lahko sklepam, da je teh primesi veliko več v vzorcu Cedevite in Kruger kot pa v Supradynu.

y = -0,0054x + 0,53 R² = 0,9923

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 20 40 60 80 100 120

Absorbanca [/]

Koncentracija [mg/L]

Vitamin C

24

Slika 17: Prvi poskus določanja vitamina C v vzorcih (K= Kruger, C= Cedevita, S=

Supradyn) 5.2 Določanje vitamina B2

Delo sem začela s pripravo umeritvene premice. Iz standardne raztopine riboflavina s koncentracijo 100 mg/L sem v 10 mL merilnih bučkah pripravila raztopine s koncentracijami: 0, 5, 10, 20, 30 in 40 mg/L in do oznake dopolnila s citratnim pufrom.

Raztopinam sem 3x pomerila absorbance (Slika 18).

Slika 18: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B2

25

Graf 2: Umeritvena premica za vitamin B2, širše območje

Ker je zadnja vrednost nekoliko krivila umeritveno premico (Graf 2) navzdol, sem sklepala, da je zadnja koncentracija že previsoka, zato sem ponovno pripravila raztopine s koncentracijami: 0, 5, 10, 15, 20 in 30 mg/L. Ponovno sem vsem raztopinam 3x pomerila absorbance (Slika 19) in v tem primeru zadnja vrednost ni več tako zelo krivila umeritvene premice navzdol (Graf 3).

Slika 19: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B2

y = 0,0178x + 0,0714 R² = 0,9676

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Absorbanca [/]

Koncentracija [mg/L]

Vitamin B2

26

Graf 3: Umeritvena premica za vitamin B2, ožje območje

Sledila je priprava vzorcev tako, da sem v v 10 mL merilno bučko dala posamezno po 0,5 mL že pripravljenega vzorca (glej poglavje 4.5) Cedevite, Kruger multivitaminskih tablet in Supradyna ter do oznake dopolnila s citratnim pufrom (Slika 20). Pomerila sem absorbance, ki so bile zelo visoke, zato sem se odločila preizkusiti še metodo standardnega dodatka.

Za vsako prehransko dopolnilo sem pripravila dve bučki, v eno sem dala 0,5 mL vzorca in 0,5 mL standardne raztopine s koncentracijo 100 mg/L ter dopolnila do oznake s citratnim pufrom, v drugo pa sem dala le 0,5 mL vzorca in dopolnila do oznake s citratnim pufrom in pomerila absorbance. Končno izračunana koncentracija vitamina B2 v Cedeviti je bila 296,7 mg/L (deklaracija 0,93 mg/L), v Krugerju 90,4 mg/L (deklaracija 1,4 mg/L) in v Supradynu 44,8 mg/L (deklaracija 4,2 mg/L). Vzrok za odstopanje izračunane koncentracije od deklarirane so dodana barvila, ki motijo merjenje absorbance.

y = 0,0196x + 0,0627 R² = 0,9855

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

0 5 10 15 20 25 30 35

Absorbanca [/]

Koncentracija [mg/L]

Vitamin B2

27

Slika 20: Prvi poskus določanja vsebnosti vitamina B2 v vzorcu 5.3 Določanje vitamina B6

Delo sem pričela s pripravo umeritvene premice. Iz standardne raztopine piridoksina s koncentracijo 200 mg/L sem v 10 mL merilnih bučkah pripravila raztopine s koncentracijami: 0,4, 2, 5, 10, 20, 30, 40 in 50 mg/L, dodala 1 mL raztopine NaHCO3, mešala 1 min, dodala 2,5 mL raztopine kloranila in dopolnila do oznake z deionizirano vodo. Dobila sem raztopine precej podobne barve (Slika 21), česar nisem pričakovala, a sem vseeno pomerila absorbance, ki seveda niso bile ustrezne (slepi vzorec je imel previsoko vrednost, razlike v absorbancah so bile zelo majhne, pa tudi vrednosti niso lepo naraščale s koncentracijo).

Slika 21: Prvi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6

Zato sem v drugem poskusu raztopine pripravila podobno, le da sem jih do oznake razredčila z acetonitrilom. V tem primeru se je v bučkah izločila trdna bela snov, sklepala sem, da je to karbonat, ki je slabo topen v acetonitrilu. Počakala sem, da se bo trdna snov posedla na dno bučk, vendar so bile raztopine nad njo še vedno rahlo motne, kar je motilo meritev absorbanc (Slika 22). Slepa vrednost je bila zopet zelo visoka, zato so bile

28

absorbance vzorcev glede na slepo negativne. Sklepala sem, da je težava v motnosti raztopin in pa v tem, da NaHCO3 ni zares 2 M, saj se ni povsem raztopil in zato raztopine niso dovolj bazične.

Slika 22: Drugi poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6

Odločila sem se, da bom NaHCO3 zaradi te težave zamenjala z NaOH z istim pH.

Pomerila sem pH NaHCO3, ki je bil 8,5 in glede na to preračunala, da moram v raztopine dodati 30 μL 0,001 M NaOH (naredila sem ga iz že pripravljenega 2 M NaOH, tako da sem v 100 mL bučki 0,05 mL 2 M NaOH razredčila do oznake). V posamezno raztopino sem nato najprej dodala 30 μL, nato pa še 50 μL raztopine NaOH, vendar pH raztopine ni bil dovolj bazičen, pa tudi absorbance niso bile ustrezne, zato sem se odločila uporabiti kar 1 mL 2 M NaOH. Pripravila sem 2 paralelki raztopin in dobila 2 umeritveni premici, pri obeh pa so bila odstopanja pri nižjih koncentracijah (Slika 23, Graf 4).

Slika 23: Tretji poskus določanja umeritvene premice za vitamin B6

29

Graf 4: Umeritvena premica za vitamin B6, širše območje

Zato sem se odločila, da bom prve 3 točke na umeritveni premici izpustila in tako sem dobila linearno umeritveno premico (Graf 5).

y = 0,0037x + 0,0947 R² = 0,774

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

0 10 20 30 40 50 60

Absorbanca [/]

Koncentracija [mg/L]

Vitamin B6

30

Graf 5: Umeritvena premica za vitamin B6, ožje območje

Sledila je priprava vzorcev tako, da sem v 10 mL merilno bučko posamezno dala po 2,5 mL že pripravljenega vzorca (glej poglavje 4.5) Cedevite in Kruger multivitaminskih tablet, 1 mL NaOH in 2,5 mL kloranila in dopolnila do oznake z acetonitrilom. Pri tem pa sta se pojavili 2 težavi:

- nastali sta 2 fazi, saj se zaradi prenasičenja vode s solmi acetonitril v njej ni več dobro raztapljal in se je zato ločil;

- pri Cedeviti se je med tema dvema fazama pojavila še plast bele usedline;

sklepala sem, da je to karbonat iz vzorca.

Težavo s karbonatom sem poskusila rešiti z dodatkom mravljične kisline (predhodno sem koncentrirano kislino razredčila z deionizirano vodo v razmerju 1:10): v raztopine Cedevite 11 kapljic, v raztopine Kruger pa 3 kapljice, dokler pH vzorca ni bil enak 3.

Težavo z ločenimi fazami sem poskusila rešiti z razredčevanjem do oznake z deionizirano vodo namesto z acetonitrilom.

Pri vzorcih zaradi teh sprememb ni prišlo do pričakovanega vijoličnega obarvanja.

Sklepala sem, da zaradi dodatka mravljične kisline vzorec ni bil dovolj bazičen za tvorbo kompleksa. Že pri pripravi umeritvenih premic pa sem lahko ugotovila, da v primeru uporabe vode namesto acetonitrila ne dobimo do pravih rezultatov.

y = 0,0055x + 0,0282 R² = 0,9835

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

0 10 20 30 40 50 60

Absorbanca [/]

Koncentracija [mg/L]

Vitamin B6

31

Določitev v vzorcu je bila torej neuspešna zaradi kompleksne matrice analiziranih vitaminskih pripravkov. Ti namreč vsebujejo veliko polnil, ki so v vodi topna in jo nasitijo z različnimi solmi.

32

33

6 Zaključek

Vitamini so bistvena hranila, ki jih naše telo potrebuje za svoje delovanje. Ker jih telo samo ne more zgraditi, je pomembno, da jih z uravnoteženo prehrano dnevno zaužijemo dovolj, saj pomanjkljiv vnos lahko povzroči hude motnje presnove, poškodbe organov in številne bolezni. Pri tem si lahko pomagamo tudi z jemanjem vitaminov v obliki vitaminskih napitkov ali dopolnil. Ravno zaradi tega pa je pomembno, da znamo določiti pravilno vsebnost vitaminov v tovrstnih izdelkih, da lahko vnos prilagajamo glede na dnevne potrebe vnosa posameznih vitaminov.

V diplomskem delu sem poskusila spektrofotometrično določiti vitamin C, B2 in B6 v nekaj realnih vzorcih. Pri vseh treh metodah so se že ob določanju umeritvene premice ali pa kasneje ob določanju vitamina v realnem vzorcu pojavile težave.

Pri vitaminu C sem pri določanju umeritvene premice opazila časovno spreminjanje obarvanja raztopin, ki se tudi po 1 h ni ustalilo, pri določanju v vzorcih pa se je takoj ob dodatku porabil ves KMnO4 zaradi prisotnosti drugih primesi, ki jih je oksidant oksidiral in se pri tem porabil.

Pri vitaminu B2 se je pojavila težava pri določanju v vzorcih zaradi dodanih barvil, ki motijo spektrofotometrične meritve.

Pri vitaminu B6 pa določanje v vzorcih ni bilo možno zaradi prenasičenja vzorca s solmi, ki so onemogočile potek reakcije nastanka obarvanega kompleksa.

Ustrezen način določanja bi torej bil z uporabo HPLC tehnike. Druga možnost pa je, da bi iz vzorcev odstranila problematične primesi, kot so polnila in barvila, oziroma bi poskusila iz vzorcev izolirati posamezen vitamin, nato pa bi sledila spektrofotometrična določitev.

34

35

7 Viri

[1] “Kaj so vitamini.” https://www.ezdravje.com/zdravje-in-dobro-pocutje/vitamini- in-minerali/vitamini/ (accessed Jul. 03, 2021).

[2] “Vitamin - Regulatory role.”

https://www.britannica.com/science/vitamin/Regulatory-role (accessed Jul. 03, 2021).

[3] “Zakaj je Vitamin C esencialno mikrohranilo?” https://www.zdravo.si/vitamin-c/

(accessed Jul. 03, 2021).

[4] “Varnostni list: vitamin C.” https://www.carlroth.com/medias/SDB-3525-SI- SL.pdf?context=bWFzdGVyfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0c3wyMzU1NT Z8YXBwbGljYXRpb24vcGRmfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0cy9oMTUv aGNhLzg5NzYyMTkwMTMxNTAucGRmfGNmMmM4MDllNjRhMWFkMjU 1NDU2ZTA4ZjQzMjQ2YWU5NDhmMzRiMjQxZmNlNDkxYzI2MDM0 (accessed Jul. 03, 2021).

[5] D. J. Zanini, M. H. Silva, E. Aguiar-Oliveira, M. R. Mazalli, E. S. Kamimura, R.

R. Maldonado, SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS OF VITAMIN C IN DIFFERENT MATRICES UTILIZING POTASSIUM PERMANGANATE, Eur.

Int. J. Sci. Technol. 2018, 7(1): 70-84.

[6] Z. Gazdik, Ondrej Zitka, Determination of Vitamin C (Ascorbic Acid) Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with Electrochemical Detection, Sensors 2008, 8(11): 7097–7112. doi: 10.3390/s8117097

[7] “Vitamin B2 | Riboflavin | Esencialno hranilo je pomembno za rast in plodnost.”

https://www.zdravo.si/vitamin-b2-riboflavin/ (accessed Jul. 03, 2021).

[8] R. Bartzatt, M. L. Follis, Detection and Assay of Riboflavin (Vitamin B2) Utilizing UV/VIS Spectrophotometer and Citric Acid Buffer, J. Sci. Res. Reports 2014, 3(6):

799–809. doi: 10.9734/jsrr/2014/8598

[9] R. Bartzatt, T. Wol, Detection and Assay of Vitamin B-2 (Riboflavin) in Alkaline Borate Buffer with UV/Visible Spectrophotometry, Int. Schol. Res. Not. 2014, Article ID 453085, 7 str. doi: 10.1155/2014/453085

[10] “Vitamin B6 | Piridoksin | Zakaj je pomembno to esencialno hranilo?”

https://www.zdravo.si/vitamin-b6-piridoksin/ (accessed Jul. 03, 2021).

[11] “Varnostni list: piridoksin hidroklorid.” https://www.carlroth.com/medias/SDB- T914-SI-

SL.pdf?context=bWFzdGVyfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0c3wzMjk1NzZ 8YXBwbGljYXRpb24vcGRmfHNlY3VyaXR5RGF0YXNoZWV0cy9oMzcvaG RjLzg5NzE0Njk2ODQ3NjYucGRmfGJiOGI4NDRhMTZkMGQ2NjUyNWE3Y zMxMmEzMGMwZGE0ZmU3MGRmM2EwYTFmMGZjNjAwOTI3 (accessed

36

Jul. 03, 2021).

[12] A. Raza, A. Rehman, S. B. Niazi, T. M. Ansari, Spectrophotometric Determination of Pyridoxine Hydrochloride (Vitamin B6) in Bulk and Tablets by Charge-Transfer Complexation with Chloranil, J. Chem. Soc. Pakistan 2007, 29(6): 33-36.

[13] B. Pihlar, H. Prosen, Osnove analizne kemije. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2019.

[14] D. Černe, B. Ostanek, Biomedicinska analitika I. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2012.