15
2 Namen dela
Namen diplomskega dela je bil razviti analizno metodo za določevanje vsebnosti NMN-ja z uporabo HPLC tehnike.
16
17
3 Eksperimentalni del
3.1 Reagenti in kemikalije
- voda Milli-Q kvalitete
- dikalijev hidrogenfosfat; Merck; 99%
- fosforjeva kislina; Sigma – Aldrich; 85%
- kalijev hidroksid; ACS reagent; 85%
- acetonitril; Sigma – Aldrich; HPLC kvalitete; 99,9%
3.2 Vzorci in referenčni materiali
- nikotinamid mononukleotid (NMN); C11H15N2O8P; vsebnost (HPLC) 99,0 %/as is, Lot:REBLAB 022
- vzorec NMN; Lot: UJ7009
18
3.3 Aparature
- analizna tehnica; Mettler Toledo; XR2TU
- avtomatska pipeta; Brand, Transferpette ®; 100-1000 µl - pH meter; Iskra; MA 5704
- ultrazvočna kopel, Iskra pio; Sonis 4
- tekočinski kromatograf; Thermo Scientific; Ultimate 3000 (Slika 7) - avtomatski vzorčevalnik: WPS 3000
- termostat za kolono; Dionex; TCC 3000SD - detektor na niz diod; Dionex; DAD 3000 - kvarterna črpalka; Dionex; LPG 3400RS
- računalnik s programom za vrednotenje rezultatov; Chromeleon 7.2; SR4 - kromatografska kolona; Phenomenex; Kinetex 2,6 µm; C18; 100 Å; 150 x 4,6
mm
- kromatografska kolona; Thermo Scientific; Hypercarb 5µ; 150 x 4,6 mm
Slika 7: Uporabljeni HPLC sistem
19
3.4 Priprava mobilnih faz
Kot mobilno fazo A sem uporabila 20 mM fosfatni pufer z različnimi pH vrednostmi (2, 4, in 6). Mobilna faza B je bila acetonitril (ACN). Fosfatni pufer sem pripravila tako, da sem v 1000 ml čašo natehtala ustrezno količino K2HPO4 in raztopila v približno 900 ml vode MQ kvalitete. Z uporabo pH metra sem z ustreznim dodatkom H3PO4 oz. KOH, umerila pH fosfatnega pufra na pH 2, 4 oz. 6. Omenjene raztopine sem kvanitativno prenesla v 1000 mL čaše in razredčila do oznake volumnov z MQ vodo.
3.5 Priprava raztopin vzorcev
S pomočjo analizne tehtnice sem na tehtalno ladjico zatehtala ustrezno količino NMN-ja, ga kvantitativno prenesla v 50 mL bučko in z MQ vodo razredčila do oznake. Za hitrejše raztapljanje sem uporabila ultrazvočno kopel. Tako pripravljeno raztopino standarda (1,0 mg/mL) sem z uporabo avtomatske pipete ustrezno redčila (Tabela 1).
Tabela 1: Priprava raztopin vzorcev
c(NMN) [mg/mL] Vbučke [mL] Vpip. 1,0 mg/mL [mL]
Volumen injiciranja: 10 µL
Pretok mobilne faze: 0,800 mL/min.
Gradient: (Tabela 2)
Mobilna faza A: fosfatni pufer; 20 mM, pH = 4 Mobilna faza B: ACN
20
Tabela 2: Gradient mobilne faze v odvisnosti od časa
t [min] Mobilna faza A [%] Mobilna faza B [%]
0 90 10
2 90 10
10 15 85
12 15 85
13 90 10
17 90 10
Detekcija: detektor na niz diod (DAD); λ = 266 nm
21
4 Rezultati in razprava
4.1 Kromatografska analiza
Pri kromatografski analizi sem uporabila tekočinski kromatograf proizvajalca Thermo Scientific- Ultimate 3000.
Začetek razvoja analitske metode sem začela tako, da sem v HPLC sistem namestila kromatografsko kolono Phenomenex; Kinetex 2,6 µm; C18; 100 Å; 150 x 4,6 mm. Kot mobilno fazo A sem uporabila fosfatni pufer različnih pH in kot mobilno fazo B acetonitril. Kljub uporabi različnih mešanic oz. gradientov omenjenih mobilnih faz z izbrano kromatografsko kolono nisem uspela doseči ustrezne retencije NMN-ja (NMN se je eluiral v mrtvem času). Zaradi polarne narave molekule NMN sem se odločila za PGC kromatografsko kolono; Thermo Scientific; Hypercarb 5µ; 150 x 4,6 mm, ki lažje zadržuje zelo polarne analite, kar se je izkazalo tudi na primeru NMN molekule.
Pretok mobilne faze sem naravnala na 0,800 ml/min.
Na osnovi UV-VIS posnetega spektra (Slika 8) sem določila valovno dolžino za NMN pri 266nm.
Slika 8: UV-VIS spekter NMN
Razvoj analizne metode sem nadaljevala s preverjanjem mobilnih faz in sicer kot mobilno fazo A sem pripravila 20 mM fosfatne pufre s tremi različnimi pH vrednostmi 2, 4 in 6.
0
190 210 230 250 270 290 310 330 350
Abs [mAu]
λ[nm]
266
22
Glede na najdaljši retencijski čas in ustrezno simetrijo kromatografskega vrha za NMN sem kot optimalno mobilno fazo A določila fosfatni pufer s pH vrednostjo 4 (Slika 9).
Slika 9: Primerjava kromatografskih vrhov pri različnih pH vrednostih fosfatnega pufra
V nadaljevanju razvoja analizne metode sem kromatografsko analizo izvajala še pri različnih temperaturah kolone 40 C, 50 C in 60 C. Ugotovila sem, da temperatura v izbranem intervalu bistveno ne vpliva na obliko kromatografskega vrha za naš analit. S poviševanjem temperature kolone prihaja do skrajševanja retencijskega časa kromatografskega vrha za NMN, zato sem kot optimalno temperaturo izbrala 40 C (Slika 10).
Slika 10: Primerjava kromatografskih vrhov pri različnih temperaturah kromatografske kolone
0 50 100 150
6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5
A [mAu×min]
t [min]
23
4.1.1 Osnovna validacija analizne metode 4.1.1.1 Ponovljivost
Za preverjanje ustreznosti dane metode sem preverila ponovljivost meritev. Izračunala sem standardni odklon šestih zaporednih meritev pri kromatografskih pogojih, ki sem jih določila kot najbolj ustrezne. S tem sem ugotavljala razpršenost meritev okoli srednje vrednosti. Rezultati meritev so podani v Tabeli 3.
Tabela 3: Ploščine kromatografskih vrhov in RSD
Ponovljivost injiciranja RS 0,100 mg/ml št. inj. A [mAu × min]
1 8,8447
2 8,7866
3 8,8553
4 8,6662
5 8,6487
6 8,7588
povprečje 8,76
σ 0,087
RSD [%] 1,0
Vrednost RSD znaša 1 %, kar nakazuje, da je določevanje NMN s Hypercarb kromatografsko kolono in izbranimi kromatografskimi pogoji dobro ponovljiv proces.
24
4.1.1.2 Linearnost
Z optimalnim gradientom sem preverila linearnost v območju koncentacij NMN od 0,050 do 0,150 mg/ml, ki poda zmožnost analize, da v določenem koncentracijskem območju daje linearno odvisen odziv od koncentracije analita.
Iz povprečnih vrednosti ploščin vrha NMN pri analiziranih raztopinah s koncentracijami NMN od 0,050 do 0,150 mg/ml sem z metodo najmanjših kvadratov izračunala regresijsko premico. Povprečne ploščine kromatografskih vrhov so podane v Tabeli 4.
Korelacijski koeficient umeritvene premice (R2) je kriterij za vrednotenje linearnosti analizne metode. V mojem primeru znaša 0,999 (Slika 11), zato lahko potrdimo, da ima metoda linearen odziv v območju koncentracij NMN od 0,050 so 0,150 mg/ml.
Tabela 4: Koncentracije NMN in pripadajoče površine kromatografskih vrhov
št. inj. 1 2 3 povprečje
Slika 11: Umeritvena premica za NMN
y = 84,104x + 0,119
0,025 0,050 0,075 0,100 0,125 0,150 0,175
A [mAu×min]
C(NMN)[mg/ml]
25
4.2 Kromatografska analiza vzorca
Vzorec sem pripravila tako, da sem na tehtalno ladjico natehtala ustrezno maso vzorca NMN; Lot: UJ7009, ki sem ga prenesla v 10 ml bučko in z vodo MQ razredčila do oznake.
1 ml tako pripravljene raztopine vzorca sem kvantitativno prenesla v 10 ml bučko in ponovno razredčila do oznake. Analizo sem delala v dveh paralelkah A in B (Tabela 5).
Tabela 5: Postopek priprave raztopin vzorcev
Paralelka mVZ
Vsebnost NMN v vzorcu: 0,0985 mg/mL ÷0,1005 mg/mL ×100 = 98,01 %
26
PARALELKA B:
𝑦 = 84,104 𝑥 + 0,119 8,3511 = 84,104 𝑥 + 0,119 8,2321 = 84,104 𝑥
0,0979 = 𝑥
CRVZ2 (NMN) = 0, 0979 mg/mL
Vsebnost NMN v vzorcu: 0,0979mg/mL ÷0,0995 mg/mL ×100 = 98,33 % POVPREČJE REZULTATOV: 98,2 %
Pripravljenim vzorcem sem nato posnela absorbance. Z uporabo umeritvene krivulje, ki sem jo dobila pri validaciji končne analizne metode, sem izračunala vsebnosti NMN-ja v vsaki paralelki. Na podlagi povprečne vrednosti sem dobila končni rezultat in tako določila vsebnost NMN-ja v vzorcu, ki je 98,2 %.
27
5 Zaključek
V diplomskem delu sem z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti, sklopljene z detektorjem na niz diod, razvijala metodo za določevanje spojine NMN v prehranskih dopolnilih. Poudarek je bil na iskanju optimalnih pogojev kromatografske analize, ki bi pripomogli k nadalnjemu raziskovanju pozitivnih farmakoloških učinkov, ki jih molekula NMN ponuja.
Po pričakovanjih, kljub uporabi različnih gradientov MF, z uporabo separacijske kolone C18 ni bilo mogoče doseči ustrezne retencije, zaradi izrazite polarnosti molekule. Zato sem se odločila za uporabo PGC kromatografske kolone, saj je ta primerna za kromatografske analize pri razponu pH od 0 do 14, pri visokih temperaturah in za zelo polarne analite. Z uporabo te kolone sem dosegla želeno retencijo. Po izboru ustrezne kromatografske kolone sem preizkušala še različne pH vrednosti mobilne faze in različne temperature kolone.
Ugotovila sem, da s poviševanjem temperature kolone prihaja do skrajševanja retencijskega časa, vendar to v izbranem intervalu ni bistveno vplivalo na obliko kromatografskega vrha, zato sem kot optimalno temperaturo izbrala 40 C. Kot najbolj ustrezno pH vrednost fosfatnega pufra sem izbrala pH 4, saj je pri tej vrednosti dosežena ustrezna simetrija kromatografskega vrha za NMN.
Izračunan relativni standardni odklon in linearnost v območju koncentacij NMN od 0,050 do 0,150 mg/ml sta pokazala, da je uporaba PGC kolone v HPLC sisemu relativno ponovljiv proces, zato sem na podlagi razvite metode določila vsebnost spojine NMN v vzorcu. Na podlagi dobljenih rezultatov analize sem ugotovila, da se vsebnost spojine NMN v vzorcu bistveno ne razlikuje od vrednosti, podane na deklaraciji vzorca, zato lahko metodo, ki sem jo tekom diplomskega dela razvijala označim kot uspešno.
28
29
6 Literatura
[1] What in NMN? https://www.nmn.com/precursors/what-is-nmn (pridobljeno 10 maj 2021)
[2] Poddar, S. K., Sifat, A. E., Haque, S., Nahid, N. A., Chowdhury, S., & Mehedi, I.
(2019). Nicotinamide mononucleotide: exploration of diverse therapeutic applications of a potential molecule. Biomolecules. 2019. https://www.mdpi.com/2218-273X/9/1/34 ( pridobljeno 9. maj 2021)
[3] Mills, K. F., Yoshida, S., Stein, L. R., Grozio, A., Kubota, S., Sasaki, Y., & Imai, S.
I. (2016). Long-term administration of nicotinamide mononucleotide mitigates age-associated physiological decline in mice. Cell metabolism. 2016.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5668137/ (pridobljeno 10. maj 2021) [4] Hong, W., Mo, F., Zhang, Z., Huang, M., & Wei, X. (2020). Nicotinamide
mononucleotide: a promising molecule for therapy of diverse diseases by Targeting NAD+ metabolism. Frontiers in cell and developmental biology, 8, 246.
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00246/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCELL_XXXXXXXX_auto-dlvrit (pridobljeno 11.maj 2021)
[5] Latest Anti-Aging Drugs: Nicotinamide Mononucleotide
(NMN).https://www.phcoker.com/anti-aging-drugs-came/ (pridobljeno 11. maj 2021)
[6] How Does High Performance Liquid Chromatography Work?. Waters the science of what's possible. https://www.waters.com/waters/en_US/How-Does-High-
Performance-Liquid-Chromatography-
Work%3F/nav.htm?locale=en_US&cid=10049055 (pridobljeno 11. maj 2021)
[7] Formentini, L., Moroni, F., & Chiarugi, A. (2009). Detection and pharmacological modulation of nicotinamide mononucleotide (NMN) in vitro and in vivo. Biochemical pharmacology, 77(10), 1612-1620.
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000629520900118X (pridobljeno 5.
maj 2021)
[8] Z. Pflaum: Osnove HPLC. Lek d.d. Orbios. 1999, str. 1-24.
30
[9] Meyer, Veronika R., Practical high – performance liquid chromatography, Fourth edition, Chichester: John John Wiley, 2004.
[10] B. Pihlar, H. Prosen: Osnove analizne kemije. Ljubljana: UL, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2019.
[11] Kot, D., Macko, T., Arndt, J. H., & Brüll, R. (2019). Porous graphite as platform for the separation and characterization of synthetic polymers–an overview. Journal of Chromatography A, 1606, 360038.
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0021967319301608 (pridobljeno 20. maj 2021)
[12] Törnkvist, A. (2003). Aspects of porous graphitic carbon as packing material in capillary liquid chromatography. Doktorska dizertacija, Acta Universitatis Upsaliensis.
https://www.diva-portal.org/smash/record.jsf?pid=diva2%3A162365&dswid=-655 (pridobljeno 15. maj 2021)
[13] M. Šadl: Statistika. Celje: Fakulteta za komercialne in poslovne vede, 2021.