DIPLOMSKO DELO Sara Stanko

U

L

F

DIPLOMSKO DELO Sara Stanko

Ljubljana, 2021

U

L

F

VISOKOŠOLSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM KEMIJSKA TEHNOLOGIJA

Določevanje nikotinamida mononukleotida v prehranskih dopolnilih

DIPLOMSKO DELO

Sara Stanko

M

: prof. dr. Matevž Pompe

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

Diplomskega dela

Spodaj podpisana Sara Stanko sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Določevanje nikotinamida mononukleotida v prehranskih dopolnilih.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Matevža Pompeta

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, Podpis avtorice:

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Matevžu Pompetu za mentorstvo in asistentu Matjažu Grčmanu za strokovno svetovanje, potrpežljivost in spodbudo pri nastajanju

diplomskega dela.

Hvala tudi sinčku Arronu in tebi Ado, ki me sprejemaš tako kot sem. V veseh mojih vzponih in padcih si verjel vame, me optimistično spodbujal ter mi nesebično pomagal.

Iskrena hvala tudi dragima staršema in bratu za vso podporo in pomoč.

Določevanje nikotinamida mononukleotida v prehranskih dopolnilih

Povzetek: Nikotinamid mononukleotid (NMN), je molekula, ki zaradi svojih farmakoloških učinkov v zadnjem času vzbuja veliko zanimanja na farmacevtskem področju. Ker blagodejno vpliva na potek staranja in z njim povezane bolezni, si številni proizvajalci prizadevajo, da tak prehranski dodatek tudi sami postavijo na trg. Če želijo NMN proizvajati, ga je potrebno znati tudi določiti in meriti njegovo vsebnost, kar je tema moje diplomske naloge.

Želela sem raziskati možnosti določevanja tovrstne spojine z uporabo HPLC tehnike, pri čemer sem se osredotočila na iskanje optimalnih pogojev kromatografske analize.

Preizkušala sem različni kromatografski koloni, mobilne faze z različnimi pH vrednostmi, različne temperature kolone in gradiente. Na podlagi dobljenih razultatov sem določila optimalne pogoje separacije in metodo okarakterizirala s parametroma linearnosti in ponovljivosti.

Ključne besede: NMN, tekočinska kromatografija, HPLC

Determination of nicotinamide mononucleotide in dietary supplements

Abstract: Nicotinamide mononucleotide (NMN) is a molecule that, due to its pharmacological effects, has recently gained a large interest in the pharmaceutical field.

As it has a beneficial effect on aging and related diseases, many manufacturers strive to place such a dietary supplement on the market themselves. However, if they want to produce NMN, it is necessary to be able to determine and measure its content, which is the topic of my thesis.

I wanted to explore the possibilities of determining this type of compound using the HPLC technique, focusing on finding the optimal conditions for chromatographic analysis. I tested different chromatographic columns, mobile phases with different pH values, different column temperatures and gradients. Based on the obtained results, I determined the optimal separation conditions and characterized the method with the parameters of linearity and repeatability.

Keywords: NMN, liquid chromatography, HPLC

Kazalo vsebine

1 Uvod ... 1

1.1 Nikotinamid mononukleotid (NMN) ... 2

1.1.1 Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+) ... 3

1.1.2 Biosinteza NAD+ ... 3

1.1.3 Biosinteza in absorpcija NMN ... 4

1.2 Literaturni pregled določevanja NMN ... 6

1.3 Kromatografija... 7

1.3.1 Kromatogram ... 7

1.3.2 Delitev kromatografije ... 8

1.3.3 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti - HPLC ... 9

1.4 PGC kolona ... 12

1.5 Osnove statistike in validacije metode ... 13

2 Namen dela ... 15

3 Eksperimentalni del ... 17

3.1 Reagenti in kemikalije ... 17

3.2 Vzorci in referenčni materiali ... 17

3.3 Aparature ... 18

3.4 Priprava mobilnih faz ... 19

3.5 Priprava raztopin vzorcev ... 19

3.6 Kromatografski pogoji ... 19

4 Rezultati in razprava ... 21

4.1 Kromatografska analiza ... 21

4.1.1 Osnovna validacija analizne metode ... 23

4.2 Kromatografska analiza vzorca ... 25

5 Zaključek ... 27

6 Literatura ... 29

Kazalo slik

Slika 1: Molekula nikotinamida mononukleotida ... 2

Slika 2: Molekula NAD+ ... 3

Slika 3: Sintezne poti NAD+ ... 4

Slika 4: Pretvorba NMN v NAD+ ... 5

Slika 5: Kromatogram, na katerem je označen mrtvi čas (t0), širina vrha (tw) in retencijski čas vrha (tr). ... 7

Slika 6: Shematski prikaz aparature HPLC ... 11

Slika 7: Uporabljeni HPLC sistem ... 18

Slika 8: UV-VIS spekter NMN ... 21

Slika 9: Primerjava kromatografskih vrhov pri različnih pH vrednostih fosfatnega pufra ... 22

Slika 10: Primerjava kromatografskih vrhov pri različnih temperaturah kromatografske kolone ... 22

Slika 11: Umeritvena premica za NMN... 24

Kazalo enačb

Enačba 2: Enačba za izračun standardnega odklona ... 14

Enačba 3: Enačba za izračun relativnega standardnega odklona ... 14

Kazalo tabel

Tabela 2: Gradient mobilne faze v odvisnosti od časa ... 20

Tabela 3: Ploščine kromatografskih vrhov in RSD ... 23

Tabela 4: Koncentracije NMN in pripadajoče površine kromatografskih vrhov ... 24

Tabela 5: Postopek priprave raztopin vzorcev ... 25

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

ACN acetonitril ATP adenozin trifosfat

C18 oznaka reverznofazne kolone (oktadecil silicijev dioksid) DAD detektor na niz diod

DNA deoksiribonukleinska kislina GLC plinsko-tekočinska kromatografija

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti MF mobilna faza

MQ voda iz sistema Mili-Q MS masna spektrometrija

NAD+ nikotinamid adenin dinukleotid NAM N-acetilmuraminska kislina NAMN mononukleotid nikotinske kisline NAMPT nikotinamid fosforiboziltransferaza NAPRT nikotin fosforiboziltransferaza NMN nikotinamid mononukleotid NR nikotinamid ribozid

NRK1 nikotinamid ribozid kinaza PARP poli (ADP-riboza) polimeraza

PGC porozna grafitna ogljikova kromatografija PRPP fosforibozil pirofosfat

RNA ribonukleinska kislina RSD relativni standardni odmik

SEC velikostna izključitvena kromatografija TBAB tetrabutilamonijev bromid

UV-Vis ultravijolično-vidna spektroskopija σ standardni odmik

1

1 Uvod

Človeško telo je zgrajeno iz celic. Z leti se sposobnost telesa za ustvarjanje novih celic zmanjšuje, zato pride do procesa staranja. S staranjem se znižuje tudi raven nikotinamida adenin dinukleotida ( NAD+).

NAD+ je ena najpomembnejših molekul v telesu. Ker je bistvenega pomena za oskrbo celic z energijo, skoraj ni biološkega procesa, ki je ne bi zahteval. Leta 1906 sta Arthur Harden in William John Young odkrila, da "faktor" v tekočini, pridobljeni iz pivskega kvasa, pospešuje fermentacijo sladkorja v alkohol. Izkazalo se je, da je ta »faktor«, ki se je takrat imenoval »coferment«, NAD+ [1].

Raziskave Arthurja Kornberga [1] o NAD + v 40. in 50. letih so pripomogle k odkrivanju načel replikacije DNA in transkripcije RNA, dveh življenjsko pomembnih procesov. Leta 1958 sta Jack Preiss in Philip Handler [1] odkrila tri biokemijske korake, s katerimi se nikotinska kislina pretvori v NAD+. Ta vrsta korakov, je danes znana kot Preiss-Handler- jeva pot. Leta 1963 so Chambon, Weill in Mandel [1] poročali, da nikotinamid mononukleotid (NMN) zagotavlja energijo, potrebno za aktiviranje pomembnega jedrskega encima. Leta 1976 so Rechsteiner in njegovi kolegi [1] našli prepričljive dokaze o verjetnosti, da ima NAD+ neko drugo pomembno funkcijo v celicah sesalcev, ki presega klasično biokemijsko vlogo molekule za prenos energije. To odkritje je Leonardu Guarenteju in njegovim kolegom [1] omogočilo, da so odkrili, da beljakovine, imenovane sirtuini, uporabljajo NAD+ za podaljšanje življenjske dobe z različnim molčanjem nekaterih genov.

Od takrat narašča zanimanje farmacevtske in kemijske industrije za NAD+ in njegove predhodnike (NMN), za njihov potencial za izboljšanje številnih zdravstvenih težav, povezanih s starostjo.

2

1.1 Nikotinamid mononukleotid (NMN)

Nikotinamid mononukleotid (Slika 1), je polarna organska molekula s kemijsko formulo C11H15N2O8P in molekulsko maso 332,221g/mol. Na molekularni ravni gre za ribo- nukleotid, ki je osnovna strukturna enota nukleinske kisline RNA. Molekula je sestavljena iz dušikove baze (nikotinaminska skupina), fosfatne skupine in sladkorja (riboze) [2].

Slika 1: Molekula nikotinamida mononukleotida

Nastane z reakcijo med fosfatno skupino in nukleozidom, ki vsebuje ribozo in nikotinamid. N-acetilmuraminska kislina (NAM) se neposredno pretvori v NMN z nikotinamid fosoforiboziltransferazo (NAMPT).

Obstaja v dveh anomernih oblikah, alfa in beta, vendar je aktivna oblika le beta anomer.

Nikotinamid mononukleotid je bioaktivni nukleotid in je v človeških celicah na voljo kot vir celične energije. Je intermediat za biosintezo nikotinamid adenin dinukleotida. Deluje kot substrat za specifične encime, kot je nikotinamid mononukleotid adenilil transferaza, ki se v telesu pretvori v NAD+ [2].

NMN se naravno pojavlja v človeških celicah, nahaja pa se tudi v številnih živilih, kot je avokado z vsebnostjo 0,36–1,60 mg NMN/100 g, zelje, ki vsebuje 0,90 mg NMN/100 g, ter paradižnik in goveje meso z vsebnostjo 0,26–0,30 mg NMN/100 g in 0,06–0,42 mg NMN/100 g. Vsebnost NMN je bila izmerjena tako, da so molekulo ekstrahirali iz vsakega živila in določili s HPLC.

Glede na to, da vse človeške rdeče krvne celice, kar jih je v telesu skupaj vsebujejo približno 50 mg NMN, se lahko fiziološko pomembna količina NMN absorbira iz različnih dnevnih virov hrane v naše telo in pomaga ohranjati biosintezo NAD+ in številne fiziološke funkcije v celotnem telesu. Ker pa so koncentracije manjše od 1 mg na kg živila, je NMN možno zaužiti tudi v obliki prehranskega dopolnila [3].

3

1.1.1 Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD+)

NAD+ (Slika 2) je pomemben presnovni koencim, ki ga najdemo v evkariontskih celicah in sodeluje pri številnih encimskih reakcijah. Sestavljen je iz dveh nukleotidov, ki sta povezana preko mostovnih fosfatnih skupin. Prvi nukleotid vsebuje adeninsko bazo, drugi pa nikotinamid. Nikotinamidna skupina je lahko na ogljik pritrjena v dveh usmeritvah, zaradi česar spojina obstaja kot dva diastereomera. V organizmih se pojavlja samo - NAD+ diastereomer. Sodeluje v redoks reakcijah in prenaša elektrone iz ene reakcije v drugo. Ima ključno vlogo pri bioloških procesih kot so popravilo DNK, metabolizem, staranje in smrt celic [1].

Slika 2: Molekula NAD+

1.1.2 Biosinteza NAD+

Telo NAD+ proizvaja naravno iz manjših komponenet, kot so nikotinamid, nikotinska kislina (niacin), nikotinamid ribozid, ki so oblike vitamina B3, ter triptofan in nikotinamid mononukleotid. Vseh 5 snovi lahko pridobimo iz prehrane. Ko pridejo v telo lahko celice sintetizirajo NAD+ po treh različnih poteh (Slika 3):

1. De novo pot: sinteza iz triptofana

Nukleotidi izhajajo iz triptofana, ki večinoma izvira iz živil bogatiih z NMN.

Zaporedje biokemičnih reakcij vodi do nastanka mononukleotida nikotinske kisline, nikotinske kisline adenin dinukleotida in NAD+ [1].

2. Reševalna pot: sinteza iz nikotinamida ali nikotinske kisline

Reševalna pot je primarni vir NAD+ v celicah sesalcev, saj je najučinkovitejša za sintezo NAD+. Na tej poti se vmesni razgradni produkti NAD+ ponovno uporabijo za proizvodnjo novega NAD+. Razgradnjo NAD+ in nadaljno pretvorbo NAM se doseže z encimi, ki porabljajo NAD+, to so sirtuini, CD38 in PARP. Pot je razdeljena na 2 koraka, hitrost sinteze NAD+ pa določa NAMPT, ki v prvem koraku pretvori NAM in PRPP v NMN, ki se konjugira z ATP in v drugem koraku pretvori v NAD+ [1,4].

4

3. Pretvorba NA (nikotinske kisline)

Ta pot se začne s pretvorbo nikotinske kisline v mononukleotid nikotinske kisline s pomočjo encima nikotin fosforiboziltransferaze (NAPRT). NAMN se nato uporablja za biosintezo adenin dinukleotida nikotinske kisline, ki ga NAD+

sintetaza pretvori v NAD+ [1,5].

Slika 3: Sintezne poti NAD+

1.1.3 Biosinteza in absorpcija NMN

NMN se v telesu proizvaja iz vitaminov B. Encim, odgovoren za njegovo tvorbo je nikotinamid fosforiboziltransferaza (NAMPT), ki veže nikotinamid (vitamin B3) na fosforibozil pirofosfat (PRPP). NMN lahko dobimo tudi iz nikotinamid ribozida ob dodatku fosfatne skupine.

Nikotinamid fosforiboziltransferaza omejuje hitrost proizvodnje NAD+, kar pomeni da nižje ravni NAMPT povzročajo zmanjšano proizvodnjo NMN. Posledično so nižje tudi ravni NAD+ [1].

Biosintezi sledi mehanizem absorpcije po peroralni uporabi.

S pomočjo mišjega modela je bilo ugotovljeno, da se absorpcija NMN iz črevesja v krvni obtok začne v 2-3 min, v 15 min pa se popolnoma absorbira v tkivo. Nato se pretvori

5

(Slika 4) in takoj shrani kot NAD + v tkivih, kot so jetra in skeletne mišice. Preden NMN vstopi v celice sesalcev, opravi defosforilacijo, da proizvede NR. Zunajcelični receptor CD73 s pirofosfatazno in 5’-ektonukleotidazno aktivnostjo izvede reakcijo [6].

NMN se v celice absorbira skozi molekularni transporter v membrani celice. Ker je molekula NMN manjša od NAD +, se lahko učinkoviteje absorbira v celice. NAD + ne more zlahka vstopiti v telo zaradi pregrade, ki jo predstavlja celična membrana.

Membrana ima brezvoden prostor, ki preprečuje vstop ionom, polarnim molekulam in velikim molekulam brez uporabe transporterjev. Celice sesalcev imajo ravnotežni nukleozidni transporter, ki olajša vstop NR. Novonastali NR deluje nato kot eksogeni predhodnik NAD + v celicah sesalcev. Nato povsod izraženi NRK1 pomaga pri nadaljnji pretvorbi NR v NMN [1].

Zunajcelični NMN se cepi s CD73, ki daje NR, ki je vgrajen v celice z uporabo ravnotežnih nukleozidnih transporterjev. NMN se pretvori v NAD+.

Slika 4: Pretvorba NMN v NAD+

Študija Medicinske fakultete Univerze v Washingtonu, objavljena v reviji Nature Metabolism, kaže, da je NMN mogoče dostaviti neposredno v celice brez pretvorbe v NAD+. Ta neposredna in hitrejša dostava je mogoča s pomočjo skrivnostnega transportnega proteina, imenovanega Slc12a8, ker celice samodejno aktivirajo Slc12a8 ko ravni NAD+ padejo [5].

6

1.2 Literaturni pregled določevanja NMN

Glede na farmakološke učinke nikotinamida mononukleotida, postaja njegovo določevanje čedalje bolj aktualna tema, s katero se ukvarja farmacevtska in kemijska industrija. V preiskovani literaturi sem kot metodo za določevanje NMN zasledila reverznofazno HPLC na silicijevem dioksidu s C18 z UV-Vis ali fluorimetrično detekcijo, HPLC sklopljen z masno spektrometrijo in velikostno-izključitveno kromatografijo (SEC-HPLC), vendar se kot edina uspešna določitvena metoda navaja le HPLC skopljena z MS.

V članku »Detection and pharmacological modulation of nicotinamide mononucleotide (NMN) in vitro and in vivo« [7] so ultra čiste NMN standarde določali s HPLC z UV ali fluorimetrično detekcijo. Za UV določanje so uporabili HPLC sistem, sestavljen iz Supelco 25 cm kolone (5 mm) in UV detektorja (PerkinElmer), nastavljenega na 260 nm. Kot mobilno fazo so uporabili 0,1 M fosfatni pufer s pH 6,5, 1% acetonitril in 10 mM tetra butilamonijev bromid (TBAB).

Rezultati so pokazali, da je izokratska HPLC analiza NMN z zaznavanjem UV absorbance praktično nemogoča zaradi izjemno kratkega časa eluiranja. V danih eksperimentalnih pogojih je imel standard NMN retencijski čas 1 min 54 s. Dodajanje tetrabutilamonijevega bromida v mobilno fazo za povečanje zadrževanja NMN je le minimalno vplivalo na ta parameter, zato ni bilo mogoče identificirati nedvoumnega vrha s časom zadrževanja, ki ustreza NMN.

Za fluorimetrično detekcijo se NMN s postopkom derivatizacije (po reakciji z acetofenonom in mravljično kislino) pretvori v visoko fluorescentno spojino. Spektre vzbujanja in emisije fluorescentne spojine se določi s pomočjo spektrofluorofotometra RF5000 (Shimadzu, Milano, Italija). Vzorce se vbrizga v sistem HPLC, ki je bil sestavljen iz mobilne faze 0,1 M fosfatnega pufra pH 6,5, 10 % acetonitrila, Supelco 25 cm kolone (5 mm) in fluorimetričnega detektorja z valovno dolžino vzbujanja in emisije 332 in 454 nm.

Čas eluiranja derivatiziranega NMN standarda se je podaljšal do 4 min 18 s. Optimizacija postopka z derivatizacijo je pokazala, da se je fluorescenca NMN linearno povečala s povečanjem temperature do 100 ºC . Pri tej temperaturi so inkubacije, daljše od 5 min, zmanjšale fluorescenco. Največja učinkovitost bila dosežena s časi derivatizacije 15 min ali več [7].

7

1.3 Kromatografija

Kromatografija je separacijska metoda, ki temelji na različnih hitrostih potovanja posameznih komponent skozi kromatografsko kolono. Pojem kromatografija je uvedel ruski botanik M. Cvet, ko jo je uporabil pri ločevanju klorofila in ksantofila iz rastlin. V zadnjem času je postala ena izmed glavnih analitskih metod za kvantitativno in kvalitativno določevanje, cilj katerega je doseči čim boljšo ločbo komponent v čim krajšem času, na kar lahko vplivamo predvsem z optimizacijo eksperimentalnih parametrov [7].

Vsak kromatografski sistem vsbuje stacionarno in mobilno fazo. Mobilna faza skupaj z vzorcem potuje skozi stacionano fazo, ki je nanesena na steno kolone, na trden nosilec v njej ali pa na kromatografsko ploščo. Posamezne komponente preiskovanega vzorca se med seboj ločijo na podlagi različnih fizikalnih in kemijskih lastnosti, ter na podlagi različnih fizikalnih interakcij z mobilno in stacionarno fazo. Ločitev poteka tako, da mobilna faza stalno potuje vzdolž kolone in prenese komponente vzorca, ki jih injiciramo v kolono. Komponente zmesi se porazdelijo med mobilno in stacionarno fazo, dokler se ločeno ne eluirajo iz kolone, kjer jih zaznamo s specifičnimi detektorji. Signali so podani kot kromatografski vrhovi, celotna krivulja pa kot kromatogram [7, 8].

1.3.1 Kromatogram

Kromatogram (Slika 5) je grafični prikaz ločenih komponent vzorca, s pomočjo katerega lahko identificiramo spojine in določimo njihove relativne koncentracije v vzorcu. Na ordinatni osi se nahaja signal, ki ustreza odzivu analita v detektorju, na abscisni pa čas.

Detektor daje odziv kot vrh, katerega ploščina je proporcionalna koncentraciji določene komponente.

Slika 5: Kromatogram, na katerem je označen mrtvi čas (t0), širina vrha (tw) in retencijski čas vrha (tr).

8

Ločitev, ki se pojavi v koloni, vodi v vrsto različnih vrhov, ki so ločeni na bazni liniji.

To je črta, ki nastane pri odsotnosti analita.Vsak vrh pa predstavlja komponento, ki je prisotna v vzorcu.

Retencijski čas (tr) je časovni interval med vbrizgavanjem vzorca in maksimumom vrha in je konstanten za vsako substanco pri določenih kromatografskih pogojih. Na osnovi primerjanja teh časov z retencijskimi časi znanih spojin določamo kvalitativno sestavo vzorca.

Mrtvi čas (t0) pa predstavlja čas, ki je potreben za prehod mobilne faze od injektorja do detektorja [8].

1.3.2 Delitev kromatografije

Glede na agregatno stanje mobilne faze delimo kromatografijo na plinsko in tekočinsko kromatografijo.

Plinsko kromatografijo delimo na:

 Porazdelitveno kromatografijo plin-tekočina (GLC), kjer se hlapne komponente vzorca selektivno zadržujejo na stacionarni fazi (nehlapna organska tekočina, s katero je prevlečen nosilec ali notranja stena kapilarne kolone) in pod vplivom temperature in mobilne faze (helij, vodik, dušik) potujejo skozi kolono.

 Adsorpcijsko kromatografijo na trdnih sorbentih (GSC), kjer separacija komponent poteka na osnovi sorpcije na trdne adsorbente (molekulska sita iz naravnih zeolitov) in desorpcije v plinsko fazo pri višjih temperaturah.

Tekočinsko kromatografijo delimo na:

 Velikostno izključitveno kromaografijo (SEC)

Stacionarna faza mora biti kemično inertna. Separacija poteče zaradi različnih velikosti molekul vzorca in por v stacionarni fazi: manjše molekule prodrejo (difuzija) v mrežo polimerne stacionarne faze, velike pa skozi kolono hitro potujejo.

 Porazdelitveno kromatografijo (LLC)

Pri tem postopku je vzorec porazdeljen med mobilno fazo in tekočo stacionarno fazo. Pomembno je, da mobilna faza ne raztaplja stacionarne, ki je nanesena na inertnem nosilcu.

9

 Ionsko kromatografijo (IC)

Pri ionski kromatografiji uporabljamo kolono, ki je napolnjena z določenim ionskim izmenjevalcem. Osnova je ionska izmenjava med ionskimi skupinami v izmenjalcu in protiioni vzorca.

Tekočinsko kromatografijo lahko delimo tudi glede na obliko stacionarne faze, in sicer na kolonsko in planarno. Glede na polarnost stacionarne faze pa poznamo

normalno-fazno in reverzno-fazno kromatografijo.

Pri kromatografiji z normalno fazo je stacionarna faza polarna, zato pri kromatografski analizi uporabljamo nepolarno mobilno fazo. Polarna stacionarna faza upočasnjuje potovanje polarnih komponent skozi kolono zaradi tvorbe močnih interakcij.

Normalno-fazno kromatografijo uporabljamo za ločevanje nepolarnih komponent in izomerov ter za ločevanje kompleksnejših vzorcev po pripadajočih funkcionalnih skupinah.

Reverznofazna kromatografija pa temelji na interakciji med nepolarno stacionarno fazo (silikati, modificirani z različnimi funkcionalnimi skupinami) in polarno mobilno fazo (mešanice metanola, acetonitrila z vodo). Polarni analiti se eluirajo iz kolone prvi, medtem ko nepolarni analiti močneje interreagirajo s hidrofobno stacionarno fazo [8].

1.3.3 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti - HPLC

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je analizna tehnika, ki se uporablja za ločevanje, identifikacijo in kvantifikacijo komponent v zmesi. Zaradi učinkovitosti, popolne avtomatiziranosti, občutljivosti in kratkega analiznega časa (5 do 60 min je najpogosteje uporabljena tehnika tekočinske kromatografije. Primerna je za ločevanje različnih vzorcev, ki vsebujejo ogljikove hidrate, steroide, proteine, aminokisline in organokovinske zvrsti.

Princip delovanja HPLC tehnike je, da komponente analita raztopimo v ustreznem topilu in jih vnesemo v mobilno fazo, ki jo črpalka visokotlačno potiska skozi kolono v kateri je stacionarna faza. Ločba temelji na različnem zadrževalnem času snovi v koloni, vsaka komponenta ima nekoliko drugačno interakcijo s stacionarno fazo, kar vodi do ločevanja komponent. Ločene komponente nato zaznamo z ustreznim detektorjem in dobljene podatke obdelamo z računalniškim programom.

Pri HPLC ima bistven pomen izbira mobilne in stacionarne faze. Sestavo mobilne faze lahko med analizo spreminjamo, kar imenujemo gradientno izpiranje. V primeru, ko

10

ostane sestava mobilne faze v času separacije nespremenjena, pa govorimo o izokratskem izpiranju [10].

1.3.3.1 Sestavni deli HPLC sistema

Sistem HPLC (Slika 6) je sestavljen iz posamičnih ločenih enot, ki so med seboj povezane s sistemom cevk iz nerjavnega jekla ali iz polimera polietra.

MOBILNA FAZA

Njena izbira je pri HPLC bistvenega pomena za separacijo, biti mora kompatibilna z detektorjem, imeti mora nizko viskoznost, topiti mora vzorec, biti čista in ne sme vplivati na lastnosti kolone. Da preprečimo okvaro črpalke zaradi prisotnosti morebitnih delcev, je potrebno mobilno fazo pred uporabo filtrirati.

REZERVOAR ZA MOBILNO FAZO

Rezervoar mobilne faze je narejen iz inertnega materiala, v večini primerov je to steklena posoda, zatesnjena s pokrovom, ki omogoča izravnavanje tlaka med črpanjem mobilne faze iz posode in preprečuje kontaminiranje MF s trdnimi delci.

ČRPALKA

Poleg kolone je črpalka najpomembnejši del HPLC sistema. Njena naloga je, da potiska mobilno fazo skozi sistem. Visok tlak, ki ga ustvarijo črpalke, je potreben za premagovanje upora pri pretoku mobilne faze skozi kolono, ki je napolnjena s stacionarno fazo. Najpogosteje se uporabljajo batne črpalke z dvema batoma, ki se gibljeta v nasprotni smeri. Med njima je nameščen povratni ventil, za njima pa mešalna komora, kar omogoča tako izokratsko kot gradientno elucijo. Za zagotavljanje konstantnih kromatografskih pogojev mora črpalka zagotavljati delovanje s čimmanj nihanja ter konstanten pretok mobilne faze.

INJEKTOR

Injektor omogoča vnos vzorca v tok mobilne faze, tik pred vstopom v kolono. Omogoča vnos različnih volumnov injiciranja, zagotavlja ponovljiva injiciranja ter preprečuje, da bi med injiciranji prišlo do kontaminacije.

KOLONA

Za zaščito kolone med injektorjem in kolono včasih uporabljamo predkolono z enako stacionarno fazo, kot je v koloni. S tem preprečimo onesnaženje kolone, v primerih, ko uporabljamo vzorce brez predhodne obdelave.

11

Kolona je jedro vsakega HPLC sistema. Je ravna cevka iz nerjavečega jekla dolžine od 5 do 25 cm z notranjim premerom 2 do 5 mm. Napolnjena je z delci velikosti od 1,8 do 10 μm, ki so prekriti s stacionarno fazo. Čim daljša je kolona in čim manjši so delci, tem večji je upor. Izboljšanje kvalitete ločbe zato dosežemo z zmanjšanjem premera delcev polnila, vendar moramo v tem primeru zagotoviti vedno višji tlak, ker z zmanjšanjem premera delcev narašča upor kolone. Poznamo več različnih kromatografskih kolon, za uporabo katere se bomo odločili, je odvisno od vrste analitov v vzorcu, ki jih želimo separirati.

DETEKTOR

Naloga detektorja je zaznavanje sestavine, ki se eluira iz kolone. Ob tem odda

elektronski signal, ki je sorazmeren s koncentracijo posamezne sestavine. Temeljijo na zaznavi spremembe določene fizikalne količine, ki jo povzroči prehod sestavine skozi pretočno celico detektorja. Detektor mora biti občutljiv, inerten, stabilen in sposoben filtrirati večino šumov ozadja. Lahko jih razdelimo v dve skupini in sicer na univerzalne (detektor na lomni količnik, masno-selektivni detektor), ki zaznajo vse eluirane spojine in specifične (fluorescentni, konduktometrični, UV-VIS) detektorje [9,10].

Slika 6: Shematski prikaz aparature HPLC

12

1.4 PGC kolona

Postopek za pridobivanje sferičnih delcev poroznega grafita za HPLC so razvili Knox et al. leta 1979, sorbent pa je bil nato komercializiran pod trgovskim imenom Hypercarb ™ [11].

Porozni grafitni ogljik (PGC) je edinstvena stacionarna faza v visokozmogljivi tekočinski kromatografiji, sestavljena iz ravnih plasti šesterokotno razporejenih ogljikovih atomov.

Kemijske lastnosti površine ga ločujejo od bolj običajnih LC kolon, kot so vezani silikageli in polimeri. PGC se obnaša kot močno zadrževalni alkil-vezani silikagel za nepolarne analite. Prav tako pa se njegovo zadrževanje in selektivnost do polarnih in strukturno sorodnih spojin zelo razlikuje od običajnih kolon C18 [12].

Značilnosti kolon Hypercarb:

 stabilne pri pH od 0 do 14

 uporaba možna pri visokih temperaturah

 izjemno zadrževanje zelo polarnih analitov

 ločevanje strukturno sorodnih snovi

Mehanizem interakcije Hypercarb je zelo odvisen tako od polarnosti kot od ravnine (oblike) topljene snovi. Ti posebni mehanizmi interakcij omogočajo uspešno zadrževanje in ločevanje analitov, ki jih ni mogoče ločiti s tipično HPLC z reverzno fazo. Ni potrebno uporabljati kompleksnih puferskih sistemov ali reagentov z ionskim parom, se pa lahko uporabi povečana koncentracija organskih modifikatorjev za polarne analite, kar omogoča večjo združljivost s tehnikami zaznavanja [11,12].

Skupno zadrževanje na kolonah Hypercarb je kombinacija dveh mehanizmov:

1) Adsorpcija: Moč interakcij analita s Hypercarb je v veliki meri odvisna od molekularne površine v stiku s površino grafita ter tudi od vrste in položaja funkcionalnih skupin glede na površino grafita na kontaktnih točkah. Moč interakcije je odvisna od velikosti in usmerjenosti molekularne površine, ki lahko pride v stik z ravno grafitno površino. Več ravninskih molekul bo pokazalo več zadrževanja kot toge molekule s tridimenzionalno prostorsko razporeditvijo.

2) Induciran dipol: predstavlja močno zadrževanje, ki ga kažejo polarni analiti. Ko se polarna skupina s stalnim dipolom približa površini, nastane inducirani dipol, ki poveča privlačnost med analitom in površino grafita. Dipolni mehanizem, ki ga

13

povzroča naboj, je posledica interakcije elektrostatičnega naboja polarne molekule s površino grafita.

Povečano zadrževanje polarnih analitov:

V tipični reverzno-fazni kromatografiji je zadrževanje analita neposredno povezano z njegovo hidrofobnostjo: bolj kot je analit hidrofoben, daljše je njegovo zadrževanje.

Nasprotno, ko se polarnost analita poveča, začnejo prevladovati interakcije analit-topilo in zadrževanje se zmanjša. HypercarbTM pa je izjema tega pravila, ker se lahko zadrževanje v nekaterih primerih poveča s povečanjem polarnosti analita. Ta pojav se imenuje "polarni zadrževalni učinek na grafitu". Zaradi te lastnosti so kolone Hypercarb še posebej uporabne za ločevanje zelo polarnih spojin, ki jih je običajno težko zadržati na osnovi silicijevega dioksida [11].

1.5 Osnove statistike in validacije metode

Vsak analizni postopek je podvržen napakam, kar se kaže pri končnem rezultatu.

Pravimo, da je vsak eksperimentalno določen rezultat le približek neke prave vrednosti.

Zato je potrebno za vsako anlizno metodo vedeti, kakšne so možnosti odstopanja rezultatov. Znati moramo prepoznati vrsto napake in njihov izvor, da jih lahko minimiziramo. Analize je potrebno večkrat ponoviti in preveriti, če se rezultati ujemajo, zato kot rezultat podamo povprečje vseh meritev. Ponovljivost tega rezultata pa opredelimo s standardnim odklonom oziroma relativnim standardnim odklonom [13].

Povprečna vrednost

Povprečna vrednost je kvocient vsote vseh vrednosti statistične spremenljivke s številom vseh vrednosti.

Enačba 1: Enačba za izračun povprečne vrednosti

14

Standardni odklon

Pove nam, za koliko dobljene vrednosti odstopajo od povprečne vrednosti. Pravimo tudi, da je standardni odklon mera za razpršenost porazdelitve vrednosti. Večji kot je, bolj so posamezne vrednosti različne med sabo.

Enačba 2: Enačba za izračun standardnega odklona

Relativni standardni odklon

Relativni standardni odklon je definiran kot kvocient standardnega odklona in povprečne vrednosti. Podajamo ga v odstotkih.

Enačba 3: Enačba za izračun relativnega standardnega odklona

15

2 Namen dela

Namen diplomskega dela je bil razviti analizno metodo za določevanje vsebnosti NMN-ja z uporabo HPLC tehnike.

16

17

3 Eksperimentalni del

3.1 Reagenti in kemikalije

- voda Milli-Q kvalitete

- dikalijev hidrogenfosfat; Merck;  99%

- fosforjeva kislina; Sigma – Aldrich;  85%

- kalijev hidroksid; ACS reagent;  85%

- acetonitril; Sigma – Aldrich; HPLC kvalitete;  99,9%

3.2 Vzorci in referenčni materiali

- nikotinamid mononukleotid (NMN); C11H15N2O8P; vsebnost (HPLC) 99,0 %/as is, Lot:REBLAB 022

- vzorec NMN; Lot: UJ7009

18

3.3 Aparature

- analizna tehnica; Mettler Toledo; XR2TU

- avtomatska pipeta; Brand, Transferpette ^®; 100-1000 µl - pH meter; Iskra; MA 5704

- ultrazvočna kopel, Iskra pio; Sonis 4

- tekočinski kromatograf; Thermo Scientific; Ultimate 3000 (Slika 7) - avtomatski vzorčevalnik: WPS 3000

- termostat za kolono; Dionex; TCC 3000SD - detektor na niz diod; Dionex; DAD 3000 - kvarterna črpalka; Dionex; LPG 3400RS

- računalnik s programom za vrednotenje rezultatov; Chromeleon 7.2; SR4 - kromatografska kolona; Phenomenex; Kinetex 2,6 µm; C18; 100 Å; 150 x 4,6

mm

- kromatografska kolona; Thermo Scientific; Hypercarb 5µ; 150 x 4,6 mm

Slika 7: Uporabljeni HPLC sistem

19

3.4 Priprava mobilnih faz

Kot mobilno fazo A sem uporabila 20 mM fosfatni pufer z različnimi pH vrednostmi (2, 4, in 6). Mobilna faza B je bila acetonitril (ACN). Fosfatni pufer sem pripravila tako, da sem v 1000 ml čašo natehtala ustrezno količino K2HPO4 in raztopila v približno 900 ml vode MQ kvalitete. Z uporabo pH metra sem z ustreznim dodatkom H3PO4 oz. KOH, umerila pH fosfatnega pufra na pH 2, 4 oz. 6. Omenjene raztopine sem kvanitativno prenesla v 1000 mL čaše in razredčila do oznake volumnov z MQ vodo.

3.5 Priprava raztopin vzorcev

S pomočjo analizne tehtnice sem na tehtalno ladjico zatehtala ustrezno količino NMN-ja, ga kvantitativno prenesla v 50 mL bučko in z MQ vodo razredčila do oznake. Za hitrejše raztapljanje sem uporabila ultrazvočno kopel. Tako pripravljeno raztopino standarda (1,0 mg/mL) sem z uporabo avtomatske pipete ustrezno redčila (Tabela 1).

Tabela 1: Priprava raztopin vzorcev

c(NMN) [mg/mL] Vbučke [mL] Vpip. 1,0 mg/mL [mL]

0,050 10 0,500

0,075 10 0,750

0,100 10 1,000

0,125 20 0,625

0,150 20 0,750

3.6 Kromatografski pogoji

 Temperatura kolone: 40 C

 Volumen injiciranja: 10 µL

 Pretok mobilne faze: 0,800 mL/min.

 Gradient: (Tabela 2)

Mobilna faza A: fosfatni pufer; 20 mM, pH = 4 Mobilna faza B: ACN

20

Tabela 2: Gradient mobilne faze v odvisnosti od časa

t [min] Mobilna faza A [%] Mobilna faza B [%]

0 90 10

2 90 10

10 15 85

12 15 85

13 90 10

17 90 10

 Detekcija: detektor na niz diod (DAD); λ = 266 nm

21

4 Rezultati in razprava

4.1 Kromatografska analiza

Pri kromatografski analizi sem uporabila tekočinski kromatograf proizvajalca Thermo Scientific- Ultimate 3000.

Začetek razvoja analitske metode sem začela tako, da sem v HPLC sistem namestila kromatografsko kolono Phenomenex; Kinetex 2,6 µm; C18; 100 Å; 150 x 4,6 mm. Kot mobilno fazo A sem uporabila fosfatni pufer različnih pH in kot mobilno fazo B acetonitril. Kljub uporabi različnih mešanic oz. gradientov omenjenih mobilnih faz z izbrano kromatografsko kolono nisem uspela doseči ustrezne retencije NMN-ja (NMN se je eluiral v mrtvem času). Zaradi polarne narave molekule NMN sem se odločila za PGC kromatografsko kolono; Thermo Scientific; Hypercarb 5µ; 150 x 4,6 mm, ki lažje zadržuje zelo polarne analite, kar se je izkazalo tudi na primeru NMN molekule.

Pretok mobilne faze sem naravnala na 0,800 ml/min.

Na osnovi UV-VIS posnetega spektra (Slika 8) sem določila valovno dolžino za NMN pri 266nm.

Slika 8: UV-VIS spekter NMN

Razvoj analizne metode sem nadaljevala s preverjanjem mobilnih faz in sicer kot mobilno fazo A sem pripravila 20 mM fosfatne pufre s tremi različnimi pH vrednostmi 2, 4 in 6.

0 50 100 150 200 250 300 350

190 210 230 250 270 290 310 330 350

Abs [mAu]

λ[nm]

266

22

Glede na najdaljši retencijski čas in ustrezno simetrijo kromatografskega vrha za NMN sem kot optimalno mobilno fazo A določila fosfatni pufer s pH vrednostjo 4 (Slika 9).

Slika 9: Primerjava kromatografskih vrhov pri različnih pH vrednostih fosfatnega pufra

V nadaljevanju razvoja analizne metode sem kromatografsko analizo izvajala še pri različnih temperaturah kolone 40 C, 50 C in 60 C. Ugotovila sem, da temperatura v izbranem intervalu bistveno ne vpliva na obliko kromatografskega vrha za naš analit. S poviševanjem temperature kolone prihaja do skrajševanja retencijskega časa kromatografskega vrha za NMN, zato sem kot optimalno temperaturo izbrala 40 C (Slika 10).

Slika 10: Primerjava kromatografskih vrhov pri različnih temperaturah kromatografske kolone

0 50 100 150

6,5 6,6 6,7 6,8 6,9 7 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5

A [mAu×min]

t [min]

23

4.1.1 Osnovna validacija analizne metode 4.1.1.1 Ponovljivost

Za preverjanje ustreznosti dane metode sem preverila ponovljivost meritev. Izračunala sem standardni odklon šestih zaporednih meritev pri kromatografskih pogojih, ki sem jih določila kot najbolj ustrezne. S tem sem ugotavljala razpršenost meritev okoli srednje vrednosti. Rezultati meritev so podani v Tabeli 3.

Tabela 3: Ploščine kromatografskih vrhov in RSD

Ponovljivost injiciranja RS 0,100 mg/ml št. inj. A [mAu × min]

1 8,8447

2 8,7866

3 8,8553

4 8,6662

5 8,6487

6 8,7588

povprečje 8,76

σ 0,087

RSD [%] 1,0

Vrednost RSD znaša 1 %, kar nakazuje, da je določevanje NMN s Hypercarb kromatografsko kolono in izbranimi kromatografskimi pogoji dobro ponovljiv proces.

24

4.1.1.2 Linearnost

Z optimalnim gradientom sem preverila linearnost v območju koncentacij NMN od 0,050 do 0,150 mg/ml, ki poda zmožnost analize, da v določenem koncentracijskem območju daje linearno odvisen odziv od koncentracije analita.

Iz povprečnih vrednosti ploščin vrha NMN pri analiziranih raztopinah s koncentracijami NMN od 0,050 do 0,150 mg/ml sem z metodo najmanjših kvadratov izračunala regresijsko premico. Povprečne ploščine kromatografskih vrhov so podane v Tabeli 4.

Korelacijski koeficient umeritvene premice (R²) je kriterij za vrednotenje linearnosti analizne metode. V mojem primeru znaša 0,999 (Slika 11), zato lahko potrdimo, da ima metoda linearen odziv v območju koncentracij NMN od 0,050 so 0,150 mg/ml.

Tabela 4: Koncentracije NMN in pripadajoče površine kromatografskih vrhov

št. inj. 1 2 3 povprečje

c(NMN) [mg/ml] A [mAu × min]

0,050 4,1782 4,3238 4,2897 4,26

0,075 6,4519 6,3304 6,4513 6,41

0,100 8,6662 8,6487 8,7588 8,69

0,125 10,5909 10,5831 10,6053 10,59

0,150 12,6839 12,6878 12,6862 12,69

Slika 11: Umeritvena premica za NMN

y = 84,104x + 0,119 R² = 0,999

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0

0,025 0,050 0,075 0,100 0,125 0,150 0,175

A [mAu×min]

C_(NMN)[mg/ml]

25

4.2 Kromatografska analiza vzorca

Vzorec sem pripravila tako, da sem na tehtalno ladjico natehtala ustrezno maso vzorca NMN; Lot: UJ7009, ki sem ga prenesla v 10 ml bučko in z vodo MQ razredčila do oznake.

1 ml tako pripravljene raztopine vzorca sem kvantitativno prenesla v 10 ml bučko in ponovno razredčila do oznake. Analizo sem delala v dveh paralelkah A in B (Tabela 5).

Tabela 5: Postopek priprave raztopin vzorcev

Paralelka mVZ

[mg]

VRVZ1

[mL]

Vpip. RVZ1

[mL]

VRVZ2

[mL]

konc. VZ v RVZ2 [mg/mL]

ARVZ2

[mAu × min]

CRVZ2

(NMN) [mg/mL]

Rezultat v %

A 10,154 10 1,0 10 0,1005 8,4052 0,0985 98,0

B 10,055 10 1,0 10 0,0995 8.3511 0,0979 98,3

PARALELKA A:

𝑦 = 84,104 𝑥 + 0,119 8,4052 = 84,104 𝑥 + 0,119 8,2862 = 84,104 𝑥

0,0985 = 𝑥

CRVZ2 (NMN) = 0, 0985 mg/mL

Vsebnost NMN v vzorcu: 0,0985 mg/mL ÷0,1005 mg/mL ×100 = 98,01 %

26

PARALELKA B:

𝑦 = 84,104 𝑥 + 0,119 8,3511 = 84,104 𝑥 + 0,119 8,2321 = 84,104 𝑥

0,0979 = 𝑥

CRVZ2 (NMN) = 0, 0979 mg/mL

Vsebnost NMN v vzorcu: 0,0979mg/mL ÷0,0995 mg/mL ×100 = 98,33 % POVPREČJE REZULTATOV: 98,2 %

Pripravljenim vzorcem sem nato posnela absorbance. Z uporabo umeritvene krivulje, ki sem jo dobila pri validaciji končne analizne metode, sem izračunala vsebnosti NMN-ja v vsaki paralelki. Na podlagi povprečne vrednosti sem dobila končni rezultat in tako določila vsebnost NMN-ja v vzorcu, ki je 98,2 %.

27

5 Zaključek

V diplomskem delu sem z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti, sklopljene z detektorjem na niz diod, razvijala metodo za določevanje spojine NMN v prehranskih dopolnilih. Poudarek je bil na iskanju optimalnih pogojev kromatografske analize, ki bi pripomogli k nadalnjemu raziskovanju pozitivnih farmakoloških učinkov, ki jih molekula NMN ponuja.

Po pričakovanjih, kljub uporabi različnih gradientov MF, z uporabo separacijske kolone C18 ni bilo mogoče doseči ustrezne retencije, zaradi izrazite polarnosti molekule. Zato sem se odločila za uporabo PGC kromatografske kolone, saj je ta primerna za kromatografske analize pri razponu pH od 0 do 14, pri visokih temperaturah in za zelo polarne analite. Z uporabo te kolone sem dosegla želeno retencijo. Po izboru ustrezne kromatografske kolone sem preizkušala še različne pH vrednosti mobilne faze in različne temperature kolone.

Ugotovila sem, da s poviševanjem temperature kolone prihaja do skrajševanja retencijskega časa, vendar to v izbranem intervalu ni bistveno vplivalo na obliko kromatografskega vrha, zato sem kot optimalno temperaturo izbrala 40 C. Kot najbolj ustrezno pH vrednost fosfatnega pufra sem izbrala pH 4, saj je pri tej vrednosti dosežena ustrezna simetrija kromatografskega vrha za NMN.

Izračunan relativni standardni odklon in linearnost v območju koncentacij NMN od 0,050 do 0,150 mg/ml sta pokazala, da je uporaba PGC kolone v HPLC sisemu relativno ponovljiv proces, zato sem na podlagi razvite metode določila vsebnost spojine NMN v vzorcu. Na podlagi dobljenih rezultatov analize sem ugotovila, da se vsebnost spojine NMN v vzorcu bistveno ne razlikuje od vrednosti, podane na deklaraciji vzorca, zato lahko metodo, ki sem jo tekom diplomskega dela razvijala označim kot uspešno.

28

29

6 Literatura

[1] What in NMN? https://www.nmn.com/precursors/what-is-nmn (pridobljeno 10 maj 2021)

[2] Poddar, S. K., Sifat, A. E., Haque, S., Nahid, N. A., Chowdhury, S., & Mehedi, I.

(2019). Nicotinamide mononucleotide: exploration of diverse therapeutic applications of a potential molecule. Biomolecules. 2019. https://www.mdpi.com/2218-273X/9/1/34 ( pridobljeno 9. maj 2021)

[3] Mills, K. F., Yoshida, S., Stein, L. R., Grozio, A., Kubota, S., Sasaki, Y., & Imai, S.

I. (2016). Long-term administration of nicotinamide mononucleotide mitigates age- associated physiological decline in mice. Cell metabolism. 2016.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5668137/ (pridobljeno 10. maj 2021) [4] Hong, W., Mo, F., Zhang, Z., Huang, M., & Wei, X. (2020). Nicotinamide

mononucleotide: a promising molecule for therapy of diverse diseases by Targeting NAD+ metabolism. Frontiers in cell and developmental biology, 8, 246.

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2020.00246/full?utm_source=S- TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCELL_XXXXXXXX_auto-dlvrit (pridobljeno 11.maj 2021)

[5] Latest Anti-Aging Drugs: Nicotinamide Mononucleotide

(NMN).https://www.phcoker.com/anti-aging-drugs-came/ (pridobljeno 11. maj 2021)

[6] How Does High Performance Liquid Chromatography Work?. Waters the science of what's possible. https://www.waters.com/waters/en_US/How-Does-High-

Performance-Liquid-Chromatography-

Work%3F/nav.htm?locale=en_US&cid=10049055 (pridobljeno 11. maj 2021)

[7] Formentini, L., Moroni, F., & Chiarugi, A. (2009). Detection and pharmacological modulation of nicotinamide mononucleotide (NMN) in vitro and in vivo. Biochemical pharmacology, 77(10), 1612-1620.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000629520900118X (pridobljeno 5.

maj 2021)

[8] Z. Pflaum: Osnove HPLC. Lek d.d. Orbios. 1999, str. 1-24.

30

[9] Meyer, Veronika R., Practical high – performance liquid chromatography, Fourth edition, Chichester: John John Wiley, 2004.

[10] B. Pihlar, H. Prosen: Osnove analizne kemije. Ljubljana: UL, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2019.

[11] Kot, D., Macko, T., Arndt, J. H., & Brüll, R. (2019). Porous graphite as platform for the separation and characterization of synthetic polymers–an overview. Journal of Chromatography A, 1606, 360038.

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0021967319301608 (pridobljeno 20. maj 2021)

[12] Törnkvist, A. (2003). Aspects of porous graphitic carbon as packing material in capillary liquid chromatography. Doktorska dizertacija, Acta Universitatis Upsaliensis.

https://www.diva-portal.org/smash/record.jsf?pid=diva2%3A162365&dswid=-655 (pridobljeno 15. maj 2021)

[13] M. Šadl: Statistika. Celje: Fakulteta za komercialne in poslovne vede, 2021.