Kromatografija

Kromatografija je separacijska metoda, ki temelji na različnih hitrostih potovanja posameznih komponent skozi kromatografsko kolono. Pojem kromatografija je uvedel ruski botanik M. Cvet, ko jo je uporabil pri ločevanju klorofila in ksantofila iz rastlin. V zadnjem času je postala ena izmed glavnih analitskih metod za kvantitativno in kvalitativno določevanje, cilj katerega je doseči čim boljšo ločbo komponent v čim krajšem času, na kar lahko vplivamo predvsem z optimizacijo eksperimentalnih parametrov [7].

Vsak kromatografski sistem vsbuje stacionarno in mobilno fazo. Mobilna faza skupaj z vzorcem potuje skozi stacionano fazo, ki je nanesena na steno kolone, na trden nosilec v njej ali pa na kromatografsko ploščo. Posamezne komponente preiskovanega vzorca se med seboj ločijo na podlagi različnih fizikalnih in kemijskih lastnosti, ter na podlagi različnih fizikalnih interakcij z mobilno in stacionarno fazo. Ločitev poteka tako, da mobilna faza stalno potuje vzdolž kolone in prenese komponente vzorca, ki jih injiciramo v kolono. Komponente zmesi se porazdelijo med mobilno in stacionarno fazo, dokler se ločeno ne eluirajo iz kolone, kjer jih zaznamo s specifičnimi detektorji. Signali so podani kot kromatografski vrhovi, celotna krivulja pa kot kromatogram [7, 8].

1.3.1 Kromatogram

Kromatogram (Slika 5) je grafični prikaz ločenih komponent vzorca, s pomočjo katerega lahko identificiramo spojine in določimo njihove relativne koncentracije v vzorcu. Na ordinatni osi se nahaja signal, ki ustreza odzivu analita v detektorju, na abscisni pa čas.

Detektor daje odziv kot vrh, katerega ploščina je proporcionalna koncentraciji določene komponente.

Slika 5: Kromatogram, na katerem je označen mrtvi čas (t0), širina vrha (tw) in retencijski čas vrha (tr).

8

Ločitev, ki se pojavi v koloni, vodi v vrsto različnih vrhov, ki so ločeni na bazni liniji.

To je črta, ki nastane pri odsotnosti analita.Vsak vrh pa predstavlja komponento, ki je prisotna v vzorcu.

Retencijski čas (tr) je časovni interval med vbrizgavanjem vzorca in maksimumom vrha in je konstanten za vsako substanco pri določenih kromatografskih pogojih. Na osnovi primerjanja teh časov z retencijskimi časi znanih spojin določamo kvalitativno sestavo vzorca.

Mrtvi čas (t0) pa predstavlja čas, ki je potreben za prehod mobilne faze od injektorja do detektorja [8].

1.3.2 Delitev kromatografije

Glede na agregatno stanje mobilne faze delimo kromatografijo na plinsko in tekočinsko kromatografijo.

Plinsko kromatografijo delimo na:

 Porazdelitveno kromatografijo plin-tekočina (GLC), kjer se hlapne komponente vzorca selektivno zadržujejo na stacionarni fazi (nehlapna organska tekočina, s katero je prevlečen nosilec ali notranja stena kapilarne kolone) in pod vplivom temperature in mobilne faze (helij, vodik, dušik) potujejo skozi kolono.

 Adsorpcijsko kromatografijo na trdnih sorbentih (GSC), kjer separacija komponent poteka na osnovi sorpcije na trdne adsorbente (molekulska sita iz naravnih zeolitov) in desorpcije v plinsko fazo pri višjih temperaturah.

Tekočinsko kromatografijo delimo na:

 Velikostno izključitveno kromaografijo (SEC)

Stacionarna faza mora biti kemično inertna. Separacija poteče zaradi različnih velikosti molekul vzorca in por v stacionarni fazi: manjše molekule prodrejo (difuzija) v mrežo polimerne stacionarne faze, velike pa skozi kolono hitro potujejo.

 Porazdelitveno kromatografijo (LLC)

Pri tem postopku je vzorec porazdeljen med mobilno fazo in tekočo stacionarno fazo. Pomembno je, da mobilna faza ne raztaplja stacionarne, ki je nanesena na inertnem nosilcu.

9

 Ionsko kromatografijo (IC)

Pri ionski kromatografiji uporabljamo kolono, ki je napolnjena z določenim ionskim izmenjevalcem. Osnova je ionska izmenjava med ionskimi skupinami v izmenjalcu in protiioni vzorca.

Tekočinsko kromatografijo lahko delimo tudi glede na obliko stacionarne faze, in sicer na kolonsko in planarno. Glede na polarnost stacionarne faze pa poznamo

normalno-fazno in reverzno-fazno kromatografijo.

Pri kromatografiji z normalno fazo je stacionarna faza polarna, zato pri kromatografski analizi uporabljamo nepolarno mobilno fazo. Polarna stacionarna faza upočasnjuje potovanje polarnih komponent skozi kolono zaradi tvorbe močnih interakcij.

Normalno-fazno kromatografijo uporabljamo za ločevanje nepolarnih komponent in izomerov ter za ločevanje kompleksnejših vzorcev po pripadajočih funkcionalnih skupinah.

Reverznofazna kromatografija pa temelji na interakciji med nepolarno stacionarno fazo (silikati, modificirani z različnimi funkcionalnimi skupinami) in polarno mobilno fazo (mešanice metanola, acetonitrila z vodo). Polarni analiti se eluirajo iz kolone prvi, medtem ko nepolarni analiti močneje interreagirajo s hidrofobno stacionarno fazo [8].

1.3.3 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti - HPLC

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti je analizna tehnika, ki se uporablja za ločevanje, identifikacijo in kvantifikacijo komponent v zmesi. Zaradi učinkovitosti, popolne avtomatiziranosti, občutljivosti in kratkega analiznega časa (5 do 60 min je najpogosteje uporabljena tehnika tekočinske kromatografije. Primerna je za ločevanje različnih vzorcev, ki vsebujejo ogljikove hidrate, steroide, proteine, aminokisline in organokovinske zvrsti.

Princip delovanja HPLC tehnike je, da komponente analita raztopimo v ustreznem topilu in jih vnesemo v mobilno fazo, ki jo črpalka visokotlačno potiska skozi kolono v kateri je stacionarna faza. Ločba temelji na različnem zadrževalnem času snovi v koloni, vsaka komponenta ima nekoliko drugačno interakcijo s stacionarno fazo, kar vodi do ločevanja komponent. Ločene komponente nato zaznamo z ustreznim detektorjem in dobljene podatke obdelamo z računalniškim programom.

Pri HPLC ima bistven pomen izbira mobilne in stacionarne faze. Sestavo mobilne faze lahko med analizo spreminjamo, kar imenujemo gradientno izpiranje. V primeru, ko

10

ostane sestava mobilne faze v času separacije nespremenjena, pa govorimo o izokratskem izpiranju [10].

1.3.3.1 Sestavni deli HPLC sistema

Sistem HPLC (Slika 6) je sestavljen iz posamičnih ločenih enot, ki so med seboj povezane s sistemom cevk iz nerjavnega jekla ali iz polimera polietra.

MOBILNA FAZA

Njena izbira je pri HPLC bistvenega pomena za separacijo, biti mora kompatibilna z detektorjem, imeti mora nizko viskoznost, topiti mora vzorec, biti čista in ne sme vplivati na lastnosti kolone. Da preprečimo okvaro črpalke zaradi prisotnosti morebitnih delcev, je potrebno mobilno fazo pred uporabo filtrirati.

REZERVOAR ZA MOBILNO FAZO

Rezervoar mobilne faze je narejen iz inertnega materiala, v večini primerov je to steklena posoda, zatesnjena s pokrovom, ki omogoča izravnavanje tlaka med črpanjem mobilne faze iz posode in preprečuje kontaminiranje MF s trdnimi delci.

ČRPALKA

Poleg kolone je črpalka najpomembnejši del HPLC sistema. Njena naloga je, da potiska mobilno fazo skozi sistem. Visok tlak, ki ga ustvarijo črpalke, je potreben za premagovanje upora pri pretoku mobilne faze skozi kolono, ki je napolnjena s stacionarno fazo. Najpogosteje se uporabljajo batne črpalke z dvema batoma, ki se gibljeta v nasprotni smeri. Med njima je nameščen povratni ventil, za njima pa mešalna komora, kar omogoča tako izokratsko kot gradientno elucijo. Za zagotavljanje konstantnih kromatografskih pogojev mora črpalka zagotavljati delovanje s čimmanj nihanja ter konstanten pretok mobilne faze.

INJEKTOR

Injektor omogoča vnos vzorca v tok mobilne faze, tik pred vstopom v kolono. Omogoča vnos različnih volumnov injiciranja, zagotavlja ponovljiva injiciranja ter preprečuje, da bi med injiciranji prišlo do kontaminacije.

KOLONA

Za zaščito kolone med injektorjem in kolono včasih uporabljamo predkolono z enako stacionarno fazo, kot je v koloni. S tem preprečimo onesnaženje kolone, v primerih, ko uporabljamo vzorce brez predhodne obdelave.

11

Kolona je jedro vsakega HPLC sistema. Je ravna cevka iz nerjavečega jekla dolžine od 5 do 25 cm z notranjim premerom 2 do 5 mm. Napolnjena je z delci velikosti od 1,8 do 10 μm, ki so prekriti s stacionarno fazo. Čim daljša je kolona in čim manjši so delci, tem večji je upor. Izboljšanje kvalitete ločbe zato dosežemo z zmanjšanjem premera delcev polnila, vendar moramo v tem primeru zagotoviti vedno višji tlak, ker z zmanjšanjem premera delcev narašča upor kolone. Poznamo več različnih kromatografskih kolon, za uporabo katere se bomo odločili, je odvisno od vrste analitov v vzorcu, ki jih želimo separirati.

DETEKTOR

Naloga detektorja je zaznavanje sestavine, ki se eluira iz kolone. Ob tem odda

elektronski signal, ki je sorazmeren s koncentracijo posamezne sestavine. Temeljijo na zaznavi spremembe določene fizikalne količine, ki jo povzroči prehod sestavine skozi pretočno celico detektorja. Detektor mora biti občutljiv, inerten, stabilen in sposoben filtrirati večino šumov ozadja. Lahko jih razdelimo v dve skupini in sicer na univerzalne (detektor na lomni količnik, masno-selektivni detektor), ki zaznajo vse eluirane spojine in specifične (fluorescentni, konduktometrični, UV-VIS) detektorje [9,10].

Slika 6: Shematski prikaz aparature HPLC

12