Identifikacija izolatov iz izdelkov z metodo MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS je metoda za pridobivanje molekulskega prstnega odtisa analiziranega bakterijskega izolata, ki omogoča identifikacijo mikroorganizmov. Za preiskavo MO z

metodo MALDI-TOF MS smo izdelke nacepili na ustrezna selektivna gojišča in izbrane kolonije obdelali po ustaljenih postopkih.

V izdelkih, ki smo jih analizirali, so prevladovali sevi laktobacilov iz rodov Lacticaseibacillus, Lactiplantibacillus, Ligilactobacillus, Limosilactobacillus po novi taksonomski razvrstitvi, ter predstavnice rodu Bifidobacterium. Poleg teh pa smo zaznali tudi vrste Str. thermophilus, Lactococcus lactis, B. coagulans, kvasovke Sacch. boulardi, E.

faecium. V sedemnajstih analiziranih vzorcih smo z metodo MALDI-TOF MS ugotavljali prisotnost 91 označenih bakterijskih vrst. Uspešno smo detektirali 51 bakterijskih vrst (55 %).

Identifikacija laktobacilov z metodo MALDI-TOF MS je bila zanesljiva (vrednost ujemanja ≥ 2,3). L. gasseri smo zelo zanesljivo identificirali v vseh vzorcih, v katerih je bil naveden. Vrsto L. acidophilus, ki je bila navedena v dvanajstih izdelkih, smo potrdili v 92 %.

V enem izmed štirih izdelkov nismo uspeli potrditi L. salivarius. V štirih izmed šestih vzorcev smo uspešno zaznali L. casei. Prisotnost L. paracasei smo potrdili v treh vzorcih od petih. L. plantarum smo uspešno potrdili v petih vzorcih od devetih (56 % uspešnost). Slabšo kakovost izdelkov smo opazili pri izdelkih z L. reuteri, kjer smo izmed petih potrdili prisotnost zgolj v dveh vzorcih. Tudi pri potrjevanju L. rhamnosus smo zanesljivo potrdili prisotnost le v dveh vzorcih, v treh primerih je bila zanesljivost identifikacije slabša, pri štirih vzorcih pa vrste nismo identificirali, kar kaže na slabšo kakovost izdelkov. V enem vzorcu, kjer je bila navedena prisotnost vrste L. delbrueckii subsp. bulgaricus, te vrste nismo uspeli potrditi. Prisotnosti L. fermentum pa nismo uspeli potrditi v enem vzorcu, ki bi to vrsto moral vsebovati.

Pogosto je bila med zadetki tudi vrsta L. zeae, čeprav ni bila označena pri nobenem izdelku, saj v preteklosti ni nastopala kot samostojna vrsta in so seve te vrste uvrščali v vrsti L.

rhamnosus ali L. casei. Pri identifikaciji rodu Bifidobacterium je uspešnost detekcije precej slaba za nekatere vrste, le 47 %. Bif. animalis subsp. lactis smo potrdili v vseh desetih izdelkih, kjer je naveden. Le v enem izdelku smo identificirali Bif. bifidum, v preostalih treh izdelkih pa te vrste nismo zaznali. Podobno je pri identifikaciji B. breve, ki smo jo zanesljivo potrdili le v enem vzorcu. V drugih dveh smo zaznali kolonije, pri katerih je bila identifikacija z MALDI-TOF MS manj zanesljiva, smo pa ju potrdili z analizo PCR, ki velja za bolj zanesljivo. Prisotnost Bif. infantis smo potrdili le v enem izmed treh izdelkov, medtem ko smo s PRC potrdili prisotnost v dveh izdelkih. Precej težav s potrjevanjem prisotnosti v izdelkih smo imeli tudi z Bif. longum, ki je naveden kar v sedmih izdelkih, vendar je glede na zanesljivost identifikacije potrjen zgolj v enem izdelku. Lc. lactis je glede na navedene podatke na označbah prisoten v treh izdelkih, kar smo tudi potrdili z obema metodama, z MALDI-TOF MS in PCR. Izmed štirih izdelkov, ki glede na označbo vsebujejo Str. thermophilus, je bila identifikacija do vrste zanesljiva zgolj v dveh vzorcih, manj zanesljivo identifikacijo v enem vzorcu pa smo potrdili z PCR analizo. V enem vzorcu smo

uspešno potrdili prisotnost Sacch. boulardii, tako z MALDI-TOF MS, kot tudi z analizo PCR. Trije izdelki po podatkih na označbi vsebujejo E. faecium, vendar smo to vrsto uspešno potrdili le v dveh izdelkih (67 %), medtem ko smo jo s PCR analizo potrdili v vseh treh. Z MALDI-TOF MS nismo potrdili prisotnosti B. coagulans, z analizo PCR pa smo isto vrsto uspešno potrdili. Nekaj rezultatov je bilo manj zanesljivih (rumeno območje, vrednosti ujemanja 1.700 -1.999), vendar smo jih kljub temu upoštevali kot zanesljive rezultate, saj so bili ti potrjeni s PCR, kar pomeni, da rumeno obarvani rezultati niso nepomembni. V rumenem območju so se v nekaj primerih pojavile vrste L. paracasei, L. rhamnosus, Bif.

breve ter Str. thermophilus.

Z metodo MALDI-TOF MS smo zgolj v treh primerih potrdili prisotnost vseh MO, ki so navedeni na označbah izdelkov. Predpostavljamo, da je bila identifikacija sevov slabša, ker smo pregledali majhno število kolonij – po tri na vsako označeno vrsto, ker označene vrste niso enakomerno zastopane v izdelku. To pride do izraza predvsem pri izdelkih z veliko sevi, iz česar sklepamo, da bi ob večjem številu pregledanih kolonij verjetno ugotovili tudi druge označene vrste. Je pa metoda precej hitrejša, enostavnejša in tudi cenejša, ko upoštevamo ves porabljen material v vseh fazah in vloženi čas, kot pa metoda PCR. Metoda je dobra alternativa vrstno specifični metodi PCR.

Številne študije kažejo, da je identifikacija z MALDI-TOF MS hitra in zanesljiva metoda za rutinsko identifikacijo bakterij, kvasovk in gliv. Glavna ovira, ki je omenjena v večih študijah, pa je premalo obširna baza podatkov za identifikacijo (Pavlovic in sod., 2013;

Angelakis in sod., 2011). Posodabljanje baze podatkov z referenčnimi spektri je nujno za izboljšano identifikacijo (Treven in sod., 2019).

Angelakis in sod. (2011) so identificirali bakterije v funkcionalnih živilih (probiotičnih napitkih in jogurtih). Z masno spektrometrijo MALDI-TOF so pravilno identificirali kar 92

% analiziranih izolatov. Rezultate so primerjali z navedbami na označbah in rezultati PCR analize. Prav tako so opazili neskladja med bakterijskimi vrstami, ki so bile navedene na označbi, in tistimi dejansko zaznanimi. V enem izmed izdelkov so namesto L. casei ugotovili L. paracasei, kar se je zgodilo tudi pri preiskavah naših vzorcev. Neskladje rezultata so obrazložili z dejstvom, da skupina L. casei vključuje številne vrste (L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. zeae), ki jih ni mogoče razlikovati po običajnih fenotipskih lastnostih, imajo pa tudi zelo podobne spektre (Angelakis in sod., 2011). Uporabnost metode pri identifikaciji probiotičnih bakterij so potrdili tudi Vecchione s sod. (2018), ki so identificirali vse organizme, ki so jih vsebovali probiotični izdelki (10 izdelkov). Težave pri identifikaciji jim je povzročala le vrsta L. delbrueckii subsp. bulgaricus, kar so razložili z domnevo, da je v bazi rezultatov MALDI-TOF MS bolj malo spektrov te vrste. Predpostavili so, da so zbirke podatkov večinoma namenjene identifikaciji vrst, ki se pojavljajo v klinični praksi (Vecchione in sod., 2018). Ansari in sod. (2019) so preverili 21 komercialno dostopnih probiotičnih prehranskih dopolnil in pijač, ki so vsebovali B. coagulans, B. subtilis, L.

plantarum, L. rhamnosus in Sacch. boulardii. Z MALDI-TOF MS so uspešno identificirali kar 71 % izolatov iz analiziranih izdelkov. Manj zanesljive rezultate identifikacije so opisali pri B. coagulans ter pri nekaterih laktobacilih (L. acidophilus, L. gasseri in L. plantarum).

Pri ugotavljanju B. coagulans so tudi Celandroni in sod. (2019) zaznali manjšo zanesljivost rezultatov identifikacije. Z dodatnimi ponovitvami so prisotnost vrste uspeli potrdili, zato so zaključili, da bi lahko pri identifikaciji rodu Bacillus upoštevali tudi podatke z nižjo vrednostjo ujemanja (< 2). V naši raziskavi smo v določenih primerih dobili po dva zadetka s približno enako vrednostjo ujemanja oz. zanesljivostjo identifikacije, za L. zeae in za L.

casei, kar dokazuje, da je vrsti težko razlikovati. Na drugi strani pa smo uspeli razlikovati L.

paracasei od L. casei in L. rhamnosus od L. casei.