Ugotavljanje prisotnosti označenih vrst z metodo PCR

Za reakcije PCR z vrstno specifičnimi začetnimi oligonukleotidi potrebujemo očiščeno izolirano DNA in specifične reagente. Po zaključeni reakciji dobimo podatke, iz katerih odčitamo, ali je je bila reakcija uspešna in če smo potrdili prisotnost bakterijske vrste, ki smo jo potrjevali.

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je metoda, s katero lahko namnožimo določene odseke DNA v zelo kratkem času. Nastale pomnožke DNA lahko pregledamo z elektroforezo ali pa neposredno uporabimo v nadaljnjih analizah. Reakcija poteka s pomočjo encima DNA-polimeraza v termostatu, ki omogoča spreminjanje temperature, glede na cikel reakcije.

Ključni koraki v reakciji po aktivaciji polimeraze v vzorcu so denaturacija DNA molekule, prilagajanje specifičnih začetnih oligonukleotidov in nato podaljšanje molekule DNA. S ponavljajočim se ciklom se koncentracija ciljne DNA eksponentno povečuje. Za uspešno reakcijo je dovolj zgolj ena DNA, saj se že v prvem ciklu podvoji. Rutinsko poteka PCR reakcija 25-35 ciklov in tako lahko z reakcijo pomnožimo količino DNA za 2²⁵-2³⁵ (Waters in Frances, 2014).

Označene vrste smo ugotavljali s PCR, pri čemer smo uporabili bodisi bakterijsko DNA iz izdelka, bodisi DNA iz mešanice kolonij, ki smo jih sprali s trdnega gojišča. Rezultata analize DNA iz izdelka in iz mešanice spranih kolonij se nista vedno ujemala. Če smo določeno vrsto potrdili z DNA iz izdelka, ne pa z DNA iz mešanice kolonij, lahko to pomeni, da so v izdelku bakterije te vrste prisotne, niso pa sposobne tvoriti kolonij. V naši raziskavi, ki je zajemala sedemnajst izdelkov z živimi bakterijami, je bilo glede na navedene bakterijske vrste na označbah ustreznih enajst izdelkov (65 %). V treh izdelkih nismo uspeli potrditi ene označene vrste, v dveh izdelkih nismo potrdili prisotnosti dveh označenih vrst, v enem izmed izdelkov pa treh vrst.

Z metodo PCR smo v naši raziskavi uspešno potrdili prisotnost vrst rodu Lactobacillus in sorodnih rodov (Lactocaseibacillus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus,

Ligilactobacillus), saj smo zaznali 52 vrst izmed 54 navedenih na označbah. Pri potrjevanju vrste nismo bili uspešni v dveh primerih, pri enem sevu L. delbrueckii subsp. bulgaricus in enem sevu L. gasseri. Smo pa v omenjenih dveh primerih z metodo MALDI-TOF MS uspešno potrdili L. gasseri, ne pa L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Z metodo PCR smo v vseh treh izdelkih, ki so navajali prisotnost Lactococcus lactis, to vrsto tudi potrdili. Prav tako smo bili 100 % uspešni pri potrjevanju Streptococcus thermophilus v štirih vzorcih.

Uspešno smo določili tudi prisotnost Saccharomyces boulardii ter Enterococcus faecium ter Bacillus coagulans. Prav tako smo uspešno potrdili prisotnost Saccharomyces boulardii tudi z metodo MALDI-TOF MS, medtem ko smo Enterococcus faecium zaznali v dveh od treh vzorcev. Bacillus coagulans, ki smo ga potrdili s PCR analizo, nismo mogli potrditi z MALDI-TOF MS. Identifikacija rodu Bifidobacterium je bila prav tako učinkovita za večino vrst, kar 76 %. Bifidobakterije so bile navedene na označbah 13 izdelkov. V 8 vzorcih smo potrdili vse navedene vrste, v petih izdelkih pa nismo našli Bif. breve, Bif. infantis, Bif.

bifidum ter Bif. longum. Podobno se je pokazalo pri MALDI-TOF MS.

V večini primerov je analiza PCR, tako z DNA iz izdelka, kakor z DNA iz mešanice kolonij, pokazala prisotnost več označenih vrst kot MALDI-TOF MS. Če je PCR narejena z DNA iz izdelka, je neujemanje rezultatov mogoče razložiti s tem, da analiza PCR zazna tudi DNA neživih bakterijskih celic v izdelku. Več pozitivnih rezultatov s PCR lahko pripišemo tudi analizam, ki smo jih naredili na DNA iz mešanice kolonij, saj smo v analizo vključili veliko kolonij naenkrat, medtem ko z MALDI-TOF MS analiziramo le eno kolonijo. Razen tega je potrebno upoštevati, da smo z MALDI-TOF MS pregledali relativno majhno število kolonij, zraslih na gojiščih. Glede na to, da smo vse označene vrste z MALDI-TOF MS potrdili le v dveh izdelkih, rezultati kažejo na to, da število pregledanih kolonij verjetno ni bilo dovolj veliko, da bi zaznali vse vrste, ki so dejansko prisotne – kot žive in kultivabilne bakterije. Je pa metoda MALDI-TOF MS s pregledom kolonij precej hitrejša kot PCR.

Pri pregledu probiotičnih prehranskih dopolnil in zdravil na slovenskem trgu, ki je bil izveden leta 2010, so z metodo PCR ugotovili, da so probiotična zdravila ustrezna tako po vrstni sestavi kot tudi po številu bakterij, medtem ko v prehranskih dopolnilih niso potrdili vseh navedenih vrst, pri čemer je bilo izmed dvajsetih ustreznih le šest izdelkov (75 %). Teh šest vzorcev je vsebovalo več različnih bakterijskih sevov, od 6-8 sevov (Bogovič Matijašić in sod., 2010). Kasnejša raziskava (Mohar Lorberg in Bogovič Matijašić, 2017) ni pokazala izrazitega izboljšanja glede števila živih bakterij in prisotnosti označenih vrst. Izmed devetnajstih izdelkov je namreč v celoti ustrezalo označbam le 42 %. Morovic s sod. (2016) so analizirali 52 izdelkov prehranskih dopolnil s koristnimi bakterijami in ugotovili neskladja med označeno in dejansko sestavo. Za izdelke, ki vsebujejo dve ali več bakterijskih vrst, so ugotovili, da pogosto ni mogoče potrditi prisotnosti ene ali več vrst bakterij, ki so navedene na označbi. V 11 vzorcih (21 %) z več označenimi vrstami ni bilo mogoče potrditi prisotnosti ene ali več navedenih vrst koristnih bakterij. Predvidevajo, da le-ti v izdelkih manjkajo ali pa je njihova koncentracija prenizka, da bi jo bilo mogoče potrditi. Kar v 18

izdelkih (35 %) z več sevi pa so potrdili prisotnost dodatnega organizma, ki ni naveden na označbi izdelka. Pri kar 22 izdelkih (42 %) so se pokazale pomanjkljivosti. Namesto označene B. longum so naprimer ugotovili B. infantis, namesto L. casei so zaznali L.

paracasei in namesto L. acidophilus detektirali L. helveticus. Pri tem pa poudarjajo, da je bilo nekatere od teh vrst v preteklosti težko razlikovati. Patro in sod. (2016) so izvedli raziskavo z desetimi probiotičnimi izdelki, ki so bili najbolj prodajani na spletu v Ameriki.

Večina izdelkov je na označbah vsebovala več kot eno vrsto bakterij. Za analizo PCR so DNA izolirali direktno iz izdelka. Pri polovici izdelkov so potrdili, da se navedbe na označbah ujemajo z rezultati analize. Teh pet izdelkov je vsebovalo pet ali manj bakterijskih vrst. V enem izdelku so navajali B. longum subsp. infantis, vendar so s sekvenciranjem pokazali, da je namesto tega prisoten B. longum subsp. longum. Ti dve podvrsti je težko taksonomsko ločiti med seboj, kar zlahka privede do napačne identifikacije. Shehata in Newmaster (2020) sta testirala kar 182 probiotičnih izdelkov iz ZDA in Kanade, ki vsebujejo skupaj 520 sevov. Z uporabo vrstno specifičnih testov niso zaznali 11 vrst, ki so bile navedene pri desetih analiziranih vzorcih. Potrditi niso uspeli prisotnosti L. casei (v sedmih izdelkih), B. longum (v dveh izdelkih) in B. bifidum (v enem izdelku). V enem izdelku je bila na označbi navedena B. longum subsp. infantis, dejansko pa so našli B. longum subsp.

longum. V enem izdelku so ugotovilii prisotnost B. animalis subsp. lactis, ki na označbi ni bila navedena. Njihovi rezultati kažejo, da metoda PCR omogoča dobro identifikacijo bakterijskih vrst in sevov. Poudarjajo pa tudi, da je potrebno nadaljnje razvijanje testov, specifičnih za seve, saj bodo ti omogočili preverjanje prisotnosti sevov tako v izdelkih z enim sevom kot tudi v izdelkih z več sevi. Tako bodo probiotični izdelki ustrezali trditvam na označbi in zagotavljali učinkovitost.

6 SKLEPI

Glede na rezultate naše raziskave lahko podamo naslednje sklepe:

 Kakovost pregledanih prehranskih dopolnil (15) z živimi bakterijami ni bila v celoti ustrezna, saj smo zasledili določena odstopanja v številu živih mikroorganizmov in v sestavi (potrjena 1. hipoteza).

 Pri dveh pregledanih izdelkih z živimi bakterijami, ki jih tržijo v kategoriji zdravil brez recepta, ni bilo odstopanj od kakovosti.

 Na označbah izdelkov se pogosto (8 od 17 izdelkov) pojavlja poimenovanje probiotik oz. probiotični, ki je prepovedano.

 Na označbah izdelkov pogosto (11 od 17 izdelkov) manjka podatek o številu posameznih sevov, podano je le skupno število vseh bakterij.

 Kakovost prehranskih dopolnil z živimi bakterijami se je v primerjavi s prejšnjo raziskavo (Mohar Lorbeg in Bogovič Matijašić, 2017) precej izboljšala. V omenjeni predhodni raziskavi je bilo neustreznih kar 58 %, v naši raziskavi pa 35 % analiziranih izdelkov.

 Dvanajst od petnajstih analiziranih vzorcev prehranskih dopolnil je bilo skladnih z navedbami na označbi, glede skupnega števila KE v izdelku.

 S pomočjo masne spektrometrije MALDI-TOF smo dovolj zanesljivo ugotovili vrste izolatov mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij iz prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami, z izjemo vrste L. zeae (L. casei, L. zeae, L. rhamnosus). S tem smo potrdili 2. hipotezo,

 Metoda PCR je za identifikacijo izolatov mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij zanesljivejša od metode MALTI-TOF MS, prednost je tudi zmožnost identifikacije podvrst, izvedba pa je zahtevnejša in zahteva več časa.

 Prednost metode PCR je tudi ta, da lahko potrdimo vrsto neposredno v skupni bakterijski DNA iz izdelka, se je pa potrebno zavedati, da ne vemo, ali so ti mikroorganizmi živi.

 Z metodo PCR, izvedeno na DNA iz konzorcija kolonij, smo uspeli potrditi več označenih vrst kot z MALDI-TOF MS, kar kaže na to, da smo z MALDI-TOF MS pregledali premalo kolonij (3 kolonije/označeno vrsto).

7 POVZETEK

Število probiotičnih izdelkov z živimi bakterijami, ki zagotavljajo pozitivne učinke na zdravje posameznika, iz leta v leto narašča. Prehranska dopolnila so namenjena dopolnjevanju običajne prehrane posameznika, vendar je nadzor nad kakovostjo prepuščen samim nosilcem živilske dejavnosti, saj spadajo v kategorijo živil. Ker nadzor kakovosti ni izveden s strani Zdravstvenega inšpektorata RS (ZIRS) smo se odločili, da te izdelke pregledamo v okviru magistrske naloge. Podoben pregled izdelkov na slovenskem trgu je že bil izveden v okviru magistrske naloge leta 2018, kjer so pregledali 19 probiotičnih izdelkov.

V raziskavi so zaključki pokazali, da je kakovost prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami na našem trgu večkrat vprašljiva, do neskladja je prišlo pri navedbah na označbah, glede navedb bakterijskih vrst in skupnega števila KE. Novembra 2018 je Uprava RS za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin (UVHVVR) dodatno pojasnila uredbo, ki je v veljavo stopila leta 2006 v EU ter prepovedala uporabo besede »probiotik«. Od takrat je uporaba besede prepovedana na živilih ter tudi na prehranskih dopolnilih, česar pa glede na trenutni nadzor nihče ne preverja. Za nadzor kakovosti prehranskih dopolnil z živimi bakterijami bi bilo potrebno uvesti stalno kontrolo kakovosti, ki bi vključevala preverjanje živosti, identifikacijo bakterij do nivoja seva ter preverjanje navedb na označbah.

V okviru magistrske naloge smo želeli preveriti kakovost prehranskih dopolnil in zdravil z živimi bakterijami na našem trgu ter preveriti skladnost navedb in potrditi prisotnost posameznih vrst, ki so označene na izdelkih. Predpostavili smo, da kakovost izdelkov ne bo vedno ustrezna glede števila in pravilnosti navedenih bakterijskih vrst. V pregled smo, izmed več kot 60 izdelkov na trgu (januar 2019), izbrali 15 izdelkov prehranskih dopolnil in 2 izdelka zdravil z živimi bakterijami. Pri vzorcih smo preverili navedbe na označbah in skladnost skupnega števila bakterij, glede na navedbe na označbi. Skupno število KE v vzorcih smo določali s standardno metodo štetja na ploščah, pri kateri smo uporabili selektivna gojišča, ki so bila optimalna za rast označenih bakterij. Za potrjevanje označenih bakterijskih vrst smo uporabili dve metodi, MALDI-TOF MS in PCR, ter ju primerjali, glede na končne rezultate.

Nepravilnosti smo odkrili že ob pregledu označb vzorcev, saj le te izdelke še vedno pogosto opisujejo kot »probiotični«, kar pa je v Evropski uniji prepovedano. Vsi izdelki so imeli potrebne navedbe o skupnem številu bakterijskih vrst, vsebujoče bakterijske vrste, priporočeno dnevno količino, podatke o hranjenju ter o roku uporabnosti izdelka. Pri večini izdelkov je bil na označbi naveden podatek katere seve izdelek vsebuje, pogosto pa na označbah izdelkov manjka podatek o številu posameznih sevov.

Skupno število KE v vzorcih smo preverjali s standardno metodo štetja zraslih kolonijskih enot, nacepljenih na selektivna gojišča. S to metodo preverjamo le bakterije, ki so zmožne razmnoževanja in tvorjenja kolonije, ne pa neaktivnih ter neživih celic. Izmed analiziranih

sedemnajstih vzorcev so le trije, ki niso ustrezali navedbam na označbi, kakšno je skupno število koristnih bakterij.

Prisotnost bakterijskih vrst smo določali z metodo MALDI-TOF MS in PCR. MALDI-TOF MS je novejša metoda, ki je precej enostavna, hitra in cenovno ugodna. Vzorce smo pripravili iz izraslih kolonij, vendar smo analizirali premajhno število kolonij, da bi lahko identificirali vse prisotne vrste. Najboljšo zanesljivost identifikacije je metoda pokazala pri ugotavljanju laktobacilov (62 % uspešnost), medtem ko je precej slaba identifikacija bifidobakterij (45 % uspešnost). V nekaterih izdelkih nismo zanesljivo dokazali prisotnosti L. paracasei, L. rhamnosus, Bif. breve ter Str. thermophilus. Sklepamo, da bi bilo potrebno za večjo uspešnost identifikacije z metodo MALDI-TOF MS analizirati večje število kolonij iz gojišča, saj smo v našem primeru nekatere zgoraj omenjene vrste potrdili z metodo PCR.

Metoda PCR je v primerjavi z metodo MALDI-TOF MS bolj zanesljiva, saj gre za starejšo, dobro razvito metodo, vendar je dražja ter časovno daljša. Za analizo smo uporabili bodisi DNA direktno iz vzorca bodisi DNA iz mešanice kolonij, ki smo jih sprali iz trdnega gojišča.

Pri tem se moramo zavedati, da ob analiziranju DNA izolirane direktno iz vzorca ne vemo ali gre za žive ali nežive mikroorganizme. Ima pa metoda odlično uspešnost potrjevanja prisotnosti laktobacilov v vzorcih, kar v 96 % je prisotnost potrjena. Slabše identifikacije prav tako ni pri drugih bakterijskih vrstah, med drugim smo v vseh primerih potrdili prisotnost laktokokov, streptokokov, enterokokov, bacilusov ter kvasovk. Uspešnost pri ugotavljanju bifidobakterij je prav tako pri metodi PCR precej višja kot pri MALDI-TOF MS, saj je le ta kar 76 %.

Glede na rezultate lahko potrdimo hipotezo, da kakovost prehranskih dopolnil z živimi bakterijami ni vedno ustrezna, saj smo ugotovili neskladnosti tako pri skupnem številu KE v vzorcih, kot tudi v prisotnosti bakterijskih vrst. Odstopanj pri kakovosti ni bilo zaznanih pri pregledanih dveh izdelkih, ki spadata med zdravila brez recepta. Ustrezata tako po skupnem številu kot tudi označenih bakterijskih vrstah. Potrdimo lahko tudi hipotezo, pri kateri smo predvidevali, da bomo lahko s pomočjo MALDI-TOF MS zanesljivo potrdili vrsto izolata. Identifikacija je bila precej zanesljiva in le ta se lahko še dodatno izboljša z dopolnjevanjem baze podatkov z mlečnokislinskimi bakterijami ter bifidobakterijami.

Po rezultatih sodeč se je kakovost prehranskih dopolnil z živimi bakterijami izboljšala, vendar bi bilo glede na povečevanje ponudbe na trgu potrebno uvesti stalni nadzor in kontrolo kakovosti izdelkov. S stalnim nadzorom in preverjanjem kakovosti bi poskrbeli, da na trgu ne bi bilo izdelkov, ki so neustrezni, in kot taki nevarni in zavajujoči za potrošnike.

8 VIRI

Angelakis E., Million M., Henry M., Raoult D. 2011. Rapid and accurate bacterial identification in probiotics and yoghurts by MALDI-TOF mass spectrometry.

Journal of Food Science, 76, 8: 568-572

Ansari J. M., Colasacco C., Emmanouil E., Kohlhepp S., Harriott O. 2019. Strain-level diversity of commercial probiotic isolates of Bacillus, Lactobacillus, and Saccharomyces species illustrated by molecular identification and phenotypic profiling. PloS One, 14, 3: e0213841, doi:10.1371/journal.pone.0213841: 19 str.

Ashraf R., Shah N. P. 2011. Selective and differential enumerations of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium spp. in yoghurt—A review.

International Journal of Food Microbiology, 149, 3: 194-208

Azad M. A. K., Sarker M., Li T., Yin J. 2018. Probiotic species in the modulation of gut microbiota: an overview. BioMed Research International, 2018: ID 9478630, doi: 10.1155/2018/9478630: 8 str.

Barakat R. K., Griffiths M. W., Harris L. J. 2000. Isolation and characterization of Carnobacterium, Lactococcus, and Enterococcus spp. from cooked, modified atmosphere packaged, refrigerated, poultry meat. International Journal of Food Microbiology, 62, 1-2: 83-94

Bogovič Matijašić B., Zorič Peternel M., Rogelj I. 2010. Ugotavljanje deklariranih bakterij v probiotičnih prehranskih dopolnilih in zdravilih na slovenskem trgu.

Farmacevtski vestnik, 61, 5/6: 263-269

Chagnaud P., Machinis K., Coutte L.A., Marecat A., Mercenier A. 2001. Rapid PCR-based procedure to identify lactic acid bacteria: Application to six common Lactobacillus species. Journal of Microbiological Methods, 44, 2: 139-148

Celandroni F., Vecchione A., Cara A., Mazzantini D., Lupetti A., Ghelardi E. 2019.

Identification of Bacillus species: Implication on the quality of probiotic formulations. Plos One, 14, 3: e0217021. doi: 10.1371/journal.pone.0217021: 13 str.

Chang C. J., Lin T. L., Tsai Y. L., Wu T. R., Lai W. F., Lu C. C., Lai H. C. 2019. Next generation probiotics in disease amelioration. Journal of Food and Drug Analysis, 27, 3: 615-622

de Simone C. 2019. The unregulated probiotic market. Clinical Gastroenterology and Hepatology, 17, 5: 809-817

Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. 1995. Detection of glycopeptide resistance

genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 33, 1: 24-27

FAO/WHO. 2001. Report of the Joint FAO/ WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. 1-4 October 2001, Córdoba, Argentina. Rome, Food and Agriculture Organization: 56 str.

Hill C., Guarner F., Reid G., Gibson G. R., Merenstein D. J., Pot B., Morelli L., Canani R.

B., Flint H. J., Salminen S., Calder P. C. 2014. The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Gastroenterology and Hepatology, 11, 8: 506-514

ISO 19344. Milk and milk starter cultures, probiotics and fermented products-quantification of lactic acid bacteria by flow cytometry. 2015: 32 str.

ISO 20128. Milk products — Enumeration of presumptive Lactobacillus acidophilus on a selective medium — Colony-count technique at 37 °C. 2006: 18 str.

ISO 6887-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1:

General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions.

1999: 14 str.

Jackson S. A., Schoeni J. L., Vegge C., Pane M., Stahl B., Bradley M., Goldman V. S., Burguière P., Atwater J. B., Sanders M. E. 2019. Improving end-user trust in the quality of commercial probiotic products. Frontiers in Microbiology, 10: 739, doi: 10.3389/fmicb.2019.00739: 15 str.

Jalali M., Zaborowska J., Jalali M. 2017. The polymerase chain reaction: PCR, qPCR, and RT-PCR. V: Basic science methods for clinical researchers. Jalali M., Saldanha F.

Y. L., Jalali M. (ur.). London, Academic Press: 1-18

Jeršek B. 2009. Higiena živil: Laboratorijske vaje za študente živilstva in prehrane.

Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 25-29 Josepa S., Guillamon J. M., Cano J. 2000. PCR differentiation of Saccharomyces cerevisiae from Saccharomyces bayanus/Saccharomyces pastorianus using specific primers.

FEMS Microbiology Letters, 193, 2: 255-259

Junick J., Blaut M. 2012. Quantification of human fecal bifidobacterium species by use of quantitative real-time PCR analysis targeting the groEL gene. Applied and Environmental Microbiology, 78, 8: 2613-2622

Kim E., Yang S. M., Cho E. J., Kim H. Y. 2020. Novel real-time PCR assay for Lactobacillus casei group species using comparative genomics. Food Microbiology, 90: 103485, doi: 10.1016/j.fm.2020.103485: 9 str.

Kolaček S., Hojsak I., Berni Canani R., Guarino A., Indrio F., Orel R., Pot B., Szajewska H., Vandenplas Y., Goudoever J., Weizman Z. 2017. Commercial probiotic products: a call for improved quality control, a position paper by the ESPGHAN working group for probiotics and prebiotics. Journal for Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 65, 1: 117-124

Kotnik Zdešar K., Jurak G., Starc G., Golja P. 2017. Faster, stronger, healthier: adolescent-stated reasons for dietary supplementation. Journal of Nutrition Education and Behavior, 49, 10: 817-826

Kramer M., Obermajer N., Matijašić Bogović B., Rogelj I., Kmetec V. 2009. Quantification of live and dead probiotic bacteria in lyophilised product by real-time PCR and by flow cytometry. Applied Microbiology and Biotechnology, 84, 6: 1137-1147 Kwon H. S., Yang E.H., Lee S.H., Yeon S.W., Kang B.H., Kim Y.T. 2005. Rapid

identification of potentially probiotic Bifidobacterium species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiology Letters, 250: 55-62

Lee G. R., Maarouf M., Hendricks A. J., Lee D. E., Shi V. Y. 2019. Topical probiotics: the unknowns behind their rising popularity. Dermatology Online Journal, 25, 5: 4 str.

https://escholarship.org/content/qt2v83r5wk/qt2v83r5wk.pdf (5. jan. 2021)

Liu D. D., Gu C. T. 2020. Proposal to reclassify Lactobacillus zhaodongensis, Lactobacillus zeae, Lactobacillus argentoratensis and Lactobacillus buchneri subsp. silagei as Lacticaseibacillus zhaodongensis comb. nov., Lacticaseibacillus zeae comb. nov., Lactiplantibacillus argentoratensis comb. nov. and Lentilactobacillus buchneri subsp. silagei comb. nov., respectively and Apilactobacillus kosoi as a later heterotypic synonym of Apilactobacillus micheneri. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 70, 12: 6414-6417

Liu Y. G., Liu S. S., Zhou F. T., Yang D. W., Wana J. G. 2010. Study on rapid detection of Bacillus coagulans by PCR. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 20, 4: 712-717

Malinen E., Kassinen A., Rinttilä T., Palva A. 2003. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology, 149, 1: 269-277

Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H. 1999. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers. Applied and Environmental Microbiology,

Matsuki T., Watanabe K., Tanaka R., Fukuda M., Oyaizu H. 1999. Distribution of bifidobacterial species in human intestinal microflora examined with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers. Applied and Environmental Microbiology,

In document DOLOČANJE KAKOVOSTI PREHRANSKIH DOPOLNIL Z ŽIVIMI BAKTERIJAMI Z MASNO SPEKTROMETRIJO (MALDI-TOF) (Strani 64-87)