Imobilizacija brez nosilca / samoimobilizacija

Poleg prvih dveh metod pa je mogoča imobilizacija brez nosilca ali samoimobilizacija, saj doseže povezovanje dveh encimov s pomočjo bifunkcionalnih zamreževalnih sredstev brez uporabe nosilca. V ta namen je najpogosteje uporabljena bifunkcionalna dialdehidna molekula – glutaraldehid. Temu koraku pravimo zamreževanje.

Nekatere izmed prednosti samoimobilizacije so:

1. večja volumetrična aktivnost na maso biokatalizatorja, 2. povečana specifična aktivnost,

3. preprosta uporaba,

4. zmanjšani proizvodni stroški, 5. višja čistost produkta,

6. manj interferenc in/ali kontaminacij s strani nosilca, 7. zmanjšane omejitve prenosa snovi.

Encimi, ki so imobilizirani brez nosilca, so ugodni katalizatorji v procesih, ki zahtevajo visoke izkoristke in produktivnost, ter niso zmožni imobilizacije s pomočjo nosilcev.⁴ Slika 2 prikazuje različne pristope za pridobitev imobiliziranih encimov brez nosilca. Iz prvotno raztopljenega encima lahko s kristalizacijo dobimo zamrežene encimske kristale (a), z obarjanjem dobimo zamrežene encimske agregate (b), pot (c) predstavlja pridobitev encimov po metodi sušenja z razprševanjem in pot (d) z direktnim zamreženjem encimov.

Slika 2: Različni pristopi pridobivanja zamreženih encimov.⁶

6

Na osnovi doslej povedanega bo izbira imobilizacijske tehnike odvisna od encimskih zahtev glede njegove uporabe, pa tudi od ravnovesja med proizvodnimi stroški in potencialno uporabo tako imobiliziranega biokatalizatorja.⁴

Trije izrazi, ki se najpogosteje uporabljajo za ugotavljanje uspešnosti imobilizacije encimov, so izkoristek imobilizacije, učinkovitost imobilizacije in zadržana aktivnost.⁵ Z izkoristkom imobilizacije (angl. immobilization yield) opredelimo, kakšen delež aktivnosti je zadržan po imobilizaciji, kar zapišemo kot:⁵

𝐼𝑧𝑘𝑜𝑟𝑖𝑠𝑡𝑒𝑘 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 (%) = 100 ∗ 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 𝑝𝑜 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑖

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 (1)

Aktivnost imobiliziranega encima je mogoče pravilno določiti z merjenjem preostale encimske aktivnosti v raztopini po imobilizaciji ter z njenim odštevanjem od aktivnosti pred imobilizacijo. V nekaterih primerih je potrebno pomeriti še slepi vzorec, da bi kompenzirali deaktivacijo prostega encima pri pogojih imobilizacije. Za določitev izkoristka imobilizacije se pogosto uporablja koncentracija proteinov. To je lahko zavajajoče, zlasti če se za imobilizacijo uporablja mešanica proteinov, saj imajo različni proteini različne izkoristke. Koristno pa je spremljati tako encimsko aktivnost kot koncentracijo proteinov v supernatantu, izločiti vsekakršno deaktivacijo prostega encima in določiti način nalaganja proteinov in/ali encimov.⁵

Drugi izraz, ki se pogosto uporablja za opis uspeha imobilizacije, je učinkovitost imobilizacije. Učinkovitost imobilizacije opisuje delež vezane encimske aktivnosti, definiramo jo pa na naslednji način:

𝑈č𝑖𝑛𝑘𝑜𝑣𝑖𝑡𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 (%) = 100 ∗ 𝑜𝑝𝑎𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑖𝑟𝑎𝑛𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 (2)

Teoretično lahko dobimo 100 % izkoristek in 0 % učinkovitost imobilizacije, če je vsa raztopina encima imobilizirana, vendar imobiliziran encim ni aktiven, ker se je encim deaktiviral, ali je iz nekega razloga po imobilizaciji postal nedostopen.⁵

Tretji izraz za opis uspeha imobilizacije je zadržana aktivnost. Zadržana aktivnost je izkoristek pomnožen z učinkovitostjo imobilizacije, ki v enem samem številu prestavi uspešnost celotnega procesa imobilizacije. Na ta način se aktivnost imobiliziranega encima primerja z začetno aktivnostjo prostega encima. Enačba (3) nam pove, na kakšen način lahko izračunamo zadržano aktivnost.⁵

𝑍𝑎𝑑𝑟ž𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 (%) = 100 ∗ 𝑜𝑝𝑎𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 (3)

7

3 Priprava zamrežen ih encimskih agregatov

Priprava zamreženih encimskih agregatov oziroma CLEA delcev je preprosta in stroškovno učinkovita tehnika, ki lahko tvori netopne biokatalizatorje z visoko volumetrično aktivnostjo in izboljšano stabilnostjo.⁷

Tipičen postopek za pripravo zamreženih encimskih agregatov je prikazan na sliki 3.

CLEA se običajno pripravljajo v dveh korakih:

1. obarjanje encimov in nastanek agregatov iz pufrskih raztopin z dodatkom obarjalnega sredstva,

2. zamreževanje nastalih agregatov s pomočjo bifunkcionalnega zamreževalnega sredstva, kot je glutaraldehid. ^{8, 1}

Obarjanje je precej hitrejši korak od zamreževanja, zaradi česar lahko istočasno dodajamo obarjalno in zamreževalno sredstvo, pri čemer oba koraka združimo v eno operacijo.⁸

Slika 3: Preprost proces priprave CLEA delcev.⁴

8

Obarjalno sredstvo je lahko sol, kot sta amonijev in natrijev sulfat; organsko topilo, ki se meša z vodo; neionski polimer, kot je polietilen glikol (PEG). V praksi amonijev sulfat dobro deluje s skoraj vsemi encimi in je v ta namen najpogosteje uporabljen. Po drugi strani pa so organska topila, ki se mešajo z vodo, na splošno manj sprejemljiva in uporabna zaradi njihovega negativnega vpliva na okolje.⁸

Tako kot pri zamreževanju proteinov je glutaraldehid na splošno prva izbira zamreževalnega sredstva, saj je poceni in komercialno dostopen.^{8, 9}

Čeprav je kemija zapletena in ni popolnoma razumljena, zamreževanje vključuje reakcijo prostih amino skupin na površini sosednjih encimskih molekul z oligomeri ali polimeri glutaraldehida, ki so posledica inter- in intramolekularnih kondenzacij aldola.^{8, 9}

Zamreževanje lahko vključuje tvorbo Schiffove baze in Michaelovo 1, 4 adicijo na α, β- nenasičene aldehidne dele, natančen način zamreževanja pa je odvisen od pH.⁹

Pri pripravi CLEA delcev lahko naletimo na nekaj težav. Na prvi pogled bi moralo biti enostavno najti obarjalno sredstvo, ki omogoča obnovitev encimske aktivnosti.

Zamreževanje je lahko problematičen korak, če je encim osiromašen v zunanjih prostih primarnih amino skupinah. Ta problem se da rešiti z uporabo proteinov obogatenih z lizinom, koimobiliziranih encimov in polimerov obogatenih primarno z amini (npr.

polietilenimin, PEI) ali celo obogatitev encima s primarnimi amino skupinami s kemično modifikacijo.⁷

Z nekaterimi encimi, kot so npr. nitrilaze, pri zamreževanju z glutaraldehidom je bila opažena nizka ali nobena obnovitev aktivnosti. Ugotovljeno je, da bi razlog lahko bil v prodiranju glutaraldehida v notranjost proteinov in reakcija z amino skupinami, ki so ključne za aktivnost encima. V takih primerih se lahko uporabi kot zamreževalno sredstvo dekstran polialdehid, zajetni polialdehid, ki ne more prodreti v notranjost encima, čemur bi sledilo zmanjšanje delov Schiffove baze z uporabo natrijevega cianoborohidrida ter tvorba aminske vezi.^{8, 9}

Na ta način se izvaja tudi zamreževanje v prisotnosti monomera, ki je pod temi pogoji podvržen polimerizaciji. Rezultat tega je tvorba kompozitov s prilagodljivimi fizikalnimi lastnostmi. Če se zamreževanje izvede v prisotnosti siloksana, kot na primer (MeO)4Si (metil silikat), se slednji simultano polimerizira, da se dobi CLEA kompozit, zasnovan na silicijevem dioksidu.⁹

Uporabljajo se tudi drugi zamreževalci, ki izvirajo iz lahko dostopnih polisaharidov, npr.

pektin dialdehid, bis-epoksid in glicerol diglicidil eter.⁸

Po kemijskem zamreževanju agregati postanejo trajno netopni, hkrati pa ohranijo svojo strukturo in s tem tudi svojo katalitično aktivnost. Ker se oborine pogosto uporabljajo za čiščenje encimov, imobilizacija encimov s pomočjo CLEA tehnologije združuje čiščenje

9

in imobilizacijo v eno samo procesno enoto. Zato je možno imobilizirani encim izolirati neposredno iz fermentacijske brozge.¹⁰

Tudi pri uporabi CLEA delcev se naleti na nekaj težav. Prva je v tem, da so CLEA delci mehansko krhki, kar otežuje njihovo okrevanje. Druga težava je ta, da so pore zelo majhne, kar lahko vodi do difuzijskih omejitev. Prvi problem je mogoče rešiti z uporabo magnetnih nanodelcev (MNP), ki so združeni z encimom, da omogočijo magnetno obdelavo končnih zamreženih agregatov. Velikost in funkcionalizacija (sprememba površine) magnetnih nanodelcev lahko določita končne lastnosti magnetnega CLEA delca. Sprememba površine magnetnih nanodelcev s 3-aminopropiltrietoksisilanom (APTES), ter uporaba takšnih pri imobilizaciji amilaz, je zagotovila boljšo mehansko stabilnost in učinkovito magnetno ločevanje nastalega CLEA delca. Druge težave se lahko lotimo, če povečamo poroznost končnega agregata. Koagregacija polietilenimina z encimom lahko znatno izboljša učinkovitost zamreženja, preprečuje uhajanje in spodbuja nastajanje hidrofilnega mikrookolja, ki ščiti encim pred organskimi topili, lahko pa tudi poveča velikost por.⁷

Podobno lahko uporaba polimerov, kot je škrob, med agregacijo in zamreževanjem olajša nastanek velikih por. Ker se škrob lahko razgradi s pomočjo α-amilaze in izpere iz agragata, se lahko na ta način zmanjšajo omejitve notranjega prenosa snovi in tako poveča katalitičnaučinkovitost končnega pripravka.^{7, 10}