DIPLOMSKO DELO

U

L

F

DIPLOMSKO DELO

Mejrema Nuhanović

Ljubljana, 2021

U

L

F

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJSKO INŽENIRSTVO

Uporaba zamreženih encimskih agregatov v biotransformacijah

DIPLOMSKO DELO

Mejrema Nuhanović

M

: prof. dr. Polona Žnidaršič Plazl

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Mejrema Nuhanović sem avtorica diplomskega dela z naslovom:

Uporaba zamreženih encimskih agregatov v biotransformacijah.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Polone Žnidaršič Plazl;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah –uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 20. 8. 2021 Podpis avtorice:

Zahvaljujem se svoji mentorici, prof. dr. Poloni Žnidaršič Plazl, za pomoč pri pisanju diplomske naloge.

Prav tako bi se zahvalila svoji družini in prijateljem, ki so me podpirali tekom študija.

Uporaba zamreženih encimskih agregatov v biotransformacijah

Povzetek: Zamreženi encimski agregati (angl. cross-linked enzyme aggregates, CLEA) so vrsta imobiliziranih encimov, dobljeni z obarjanjem encimov iz vodnih raztopin ter zamreževanjem nastalih skupkov z uporabo ustreznega zamreževalnega sredstva. Pri pripravi CLEA delcev je potrebno upoštevati številne parametre, saj je od narave in količine tako obarjalnega kot tudi zamreževalnega sredstva odvisno, kakšen bo končni produkt. Pri tem je potrebno upoštevati tudi procesne parametre, med katere sodijo temperatura, pH ter čas zamreženja, saj se encimi med seboj razlikujejo in je potrebno določiti ustrezne pogoje priprave CLEA delcev. Ena izmed ključnih lastnosti CLEA delcev je njihova velikost, od katere so odvisni transportni pojavi in s tem dostopnost katalitskih mest. S tovrstno imobilizacijo encimov lahko izboljšamo aktivnost, selektivnost in stabilnost encima ter s tem uspešnost biokatalitskega procesa. CLEA delce je mogoče pridobiti tudiz uporabo magnetnih nanodelcev, pri čemer nastanejo magnetni CLEA delci. Različni encimi se lahko med seboj združijo v kombinirane zamrežene encimske agregate, ki nudijo številne prednosti, predvsem s stališča proizvodnih stroškov na industrijski ravni. Z uporabo CLEA delcev v mikropretočnih reaktorjih dosežemo intenzifikacijo biokatalitskih procesov, kar je posledica boljšega prenosa toplote in snovi ter bolj nadziranih pogojev v miniaturiziranih napravah.

Ključne besede: biotransformacije, zamreženi encimski agregati, mikroreaktorji.

Use of cross-linked enzyme aggregates in biotransformations

Povzetek: Cross-linked enzyme aggregates (CLEA) are a type of immobilized enzyme obtained by precipitating enzymes from aqueous solutions and crosslinking the resulting aggregates using an appropriate crosslinking agent. When preparing CLEA particles, it is necessary to take into account many parameters, as the nature and amount of both precipitating and crosslinking agent depends on what the final product will be. It is also necessary to take into account the process parameters, which include temperature, pH and crosslinking time, as the enzymes differ from each other and it is necessary to determine the appropriate conditions for the preparation of CLEA particles. One of the key properties of CLEA particles is their size, on which transport phenomena depend and thus the availability of catalytic sites. With this kind of immobilization of enzymes, we can improve the activity, selectivity and stability of the enzyme and thus the success of the biocatalytic process. CLEA particles can also be obtained using magnetic nanoparticles to form magnetic CLEA particles. Different enzymes can be combined into combined cross-linked enzyme aggregates, which offer many advantages, especially in terms of production costs at the industrial level. By using CLEA particles in microflow reactors, we achieve the intensification of biocatalytic processes, which is the result of better heat and mass transfer and more controlled conditions in miniaturized devices.

Keywords: biotransformations, cross-linked enzyme aggregates, microreactors.

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Namen naloge ... 1

2 Imobilizacija encimov ... 3

2.1 Tehnike imobilizacije encimov ... 3

2.1.1 Imobilizacija na nosilcu ... 4

2.1.2 Ujetje/inkapsulacija ... 4

2.1.3 Imobilizacija brez nosilca / samoimobilizacija ... 5

3 Priprava zamreženih encimskih agregatov ... 7

3.1 Pomembni parametri pri pripravi CLEA delcev ... 9

3.1.1 Narava in čistost encima ... 9

3.1.2 Narava in količina obarjalnega sredstva ... 10

3.1.3 pH vrednost ... 11

3.1.4 Narava zamreževalnega sredstva ... 11

3.1.5 Količina zamreževalnega sredstva... 12

3.1.6 Čas zamreževanja ... 12

3.1.7 Pranje in separacija CLEA delcev ... 13

4 Lastnosti CLEA delcev ... 15

5 Izboljšava encimskih katalitskih lastnosti s pomočjo CLEA tehnologije ... 17

5.1 Aktivnost ... 17

5.2 Selektivnost ... 17

5.3 Stabilnost... 18

6 Vrste CLEA delcev ... 21

6.1 Magnetni CLEA delci (m-CLEA) ... 21

6.2 Kombinirani CLEA delci (combi-CLEA) ... 22

7 Uporaba CLEA delcev ... 25

7.1 Sinteza farmacevtskih učinkovin... 25

7.2 Sinteza polimerov ... 26

7.3 Sinteza nanodelcev srebra ... 27

7.4 Razbarvanje in razstrupljanje barvil ... 27

7.5 Biokonverzija agroindustrijskih odpadkov ... 27

8 Uporaba CLEA delcev v mikropretočnih reaktorjih ... 29

8.1 Mikropretočni reaktorji ... 29

8.2 Priprava CLEA delcev v mikroreaktorjih ... 30

9 Zaključek ... 33

10 Literatura ... 35

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

6-APA 6-aminopenicilanska kislina (angl. 6-aminopenicillanic acid)

7-ADCA 7-aminodeacetoksicefalosporanska kislina (angl. 7-

aminodeacetoxycephalosporanic acid) (MeO)4Si Metil silikat (angl. methyl silicate) AGG Skupki/agregati (angl. aggregates) APTES (3-aminopropil) trietoksisilan

BSA Goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumine) CLE Zamreženi encimi (angl. cross-linked enzymes)

CLEA Zamreženi encimski agregati (angl. cross-linked enzyme aggregates) CLEC Zamreženi encimski kristali (angl. cross-linked enzyme crystals) CRY Kristali (angl. crystals)

CSDE Zamreženi encimi dobljeni s sušenjem z razprševanjem (angl. cross-linked spray dryed enzymes)

GA Glutaraldehid (angl. Glutarlaldehyde)

MNP Magnetni nanodelci (angl. Magnetic nanoparticles) NAD⁺ Nikotinamid adenin dinukleotid (oksidirana oblika) NADH Nikotinamid adenin dinukleotid (reducirana oblika) PA Penicilin acilaza (angl. penicillin acylase)

p–CLEA Porozni CLEA delci (angl. porous CLEA)

PDMS Polidimetilsiloksan

PEG Polietilen glikol

PEI Polietilenimin

PenG acylase CLEA

CLEA delci Penicilin G acilaze

PTFE Politetrafluoroetilen

PMMA Polimetilmetakrilat

Poly-Lys Polilizin (angl. poly-Lysine)

SDE Encimi dobljeni s sušenjem z rasprševanjem (angl. spray dryed enzymes) SSF Simultana saharifikacija in fermentacija (angl. simultaneous

saccharification and fermentation)

1

1 Uvod

Encimi so biološke molekule (v večini primerov so proteini), ki v živih in neživih celicah opravljajo vlogo biokatalizatorja. To pomeni, da jim je glavna vloga pospeševanje biokemičnih reakcij, pri čemer se skozi reakcijo ne spreminjajo niti porabljajo. Imajo velik potencial za uporabo v industrijskih procesih, vendar so zaradi svoje cene, stabilnosti in katalitske učinkovitosti precej omejeni. Iz teh razlogov se izvaja imobilizacija encimov. Poleg lažjega ravnanja z encimom omogoča imobilizacija lažjo separacijo encima in produkta, kjer so minimalne možnosti za dodatne kontaminacije.

Imobilizirani encimi imajo večjo stabilnost, tako pri shranjevanju kot pri obratovanju.

Imobilizirani encimi se lahko uporabljajo v različnih oblikah ter agregatnih stanjih, kjer zamreženi encimski agregati zaradi številnih prednosti predstavljajo eno obetavnejših.¹ Zamreženi encimski agregati (angl. cross-linked enzyme aggregates, CLEA) so imobilizirani encimi, dobljeni na osnovi obarjanja encimov in nadaljnjega zamreževanja z uporabo ustreznih zamreževalnih sredstev. CLEA delci so bili prvič razviti leta 2000, kjer je uporabljena penicilin G acilaza, obarjena in zamrežena do CLEA delcev peniclin G acilaze ter kot takšna uporabljena za sintezo ampicilina.^{2, 3}

Njihova priprava je precej enostavna, omogoča pa nastanek robustnih biokatalizatorjev z izjemno ohranitvijo katalitske aktivnosti, procesne stabilnosti ter možnosti do ponovne uporabe. Na ta način se izboljšujejo biofizikalne lastnosti encimov, ki znatno znižajo njihove stroške in omogočajo njihovo uporabo v industrijske namene.¹

Njihova uporaba sega od prehrambne, kemijske in farmacevtske industrije, do uporabe v okoljevarstvene namene.

1.1 Namen naloge

V diplomski nalogi sem obravnavala zamrežene encimske agregate ter njihovo:

• pripravo,

• lastnosti,

• vrste,

• optimizacijo procesnih parametrov,

• zastopanost njihove uporabe v najrazličnejših panogah.

3

2 Imobilizacija encimov

Imobilizacija encimov je definirana kot zadrževanje encimov v določenem prostoru, ki ohranja njihovo katalitično aktivnost in omogoča njihovo večkratno in neprekinjeno uporabo. Poleg tega mora imobilizacija encimov izpolnjevati druge kriterije za pridobitev robustnih biokatalizatorjev glede oblike in velikosti, ki določajo nadaljnje ločevanje in ponovno uporabo. Imobilizacija encimov vpliva na njihovo konformacijo, togost in agregacijsko stanje, pri čemer se spreminja njihova aktivnost in tudi selektivnost.⁴ Imobilizacija encimov nudi naslednje prednosti:

1. Možnost ponovne uporabe.

2. Zvišanje stabilnosti, kot so odpornost proti visokim temperaturam, ekstremnim pH, visokim koncentracijam substratov, polarnim topilom ter mehanskem strganju.

3. Povišana volumetrična aktivnost.

4. Zvišanje in sprememba selektivnosti, kot so regio-, kemo- in enantioselektivnost.⁴

2.1 Tehnike imobilizacije encimov

Tehnike za imobilizacijo encimov so najpogosteje razdeljene v tri kategorije:

1. Vezava na nosilec.

2. Ujetje/inkapsulacija.

3. Imobilizacija brez nosilca/samoimobilizacija.⁵

Slika 1: Različne tehnike imobilizacije encimov.⁵

4

2.1.1 Imobilizacija na nosilcu

Vezava na nosilec je lahko fizikalne (na primer hidrofobne in van der Waalsove interakcije), ionske ali kovalentne narave. Fizikalna vezava je načeloma prešibka, da bi encim ostal pritrjen v industrijskih pogojih, kjer prevladujejo visoke koncentracije reaktantov in produktov. Kadar so uporabljene fizikalne metode vezave, potem encim ni podvržen strukturnim spremembam in gre le za pritrjevanje na nosilec. Ionska vezava je na splošno močnejša in kovalentna vezava encima na nosilec preprečuje odstranjevanje encima s površine.^{5, 4}

Kemijska imobilizacija, za razliko od fizikalne, lahko spremeni strukturo proteinov, ker so encimi pritrjeni na površino nosilca s pomočjo kemijske vezi ter na ta način vpliva na obliko, togost in agregacijsko stanje encimov. Imobilizacija encimov s pomočjo kovalentne vezave na nosilec je metoda, pri kateri so proteini nepovratno povezani. V procesu imobilizacije se uporabljajo predvsem reaktivne aminokislinske skupine, kot je lizin, ki so prisotne na površini proteinov. S pomočjo vezave reaktivnih aminokislinskih skupin na reaktivne skupine nosilcev se ustvari zelo stabilna kovalentna vez. V primerjavi z drugimi tipi vezave omogoča takšna vez najmočnejšo povezavo med encimom in nosilcem, kjer je sposobna minimizirati uhajanje encima z nosilca.⁴

Kovalentna vezava pa ima to pomanjkljivost, da v primeru, ko je encim deaktiviran, tako encim kot nosilec postaneta neuporabna. Tipični nosilci za imobilizacijo encimov so sintetične smole, biopolimeri, kot so polisaharidi, ali anorganske trdne snovi, kot so (mezoporozni) silicijev dioksid ali zeoliti.^{4, 5}

Poleg tega, da omogočajo ponovno uporabo, je prednost nosilcev tudi ta, da encimom zagotavljajo zaščitno pregrado. Kljub temu imajo nosilci v večini primerov visoke cene, s čimer povečajo proizvodne stroške.⁴

2.1.2 Ujetje/inkapsulacija

Ta način imobilizacije vključuje ''vstavljanje'' encima v polimerno mrežo, običajno organskih ali anorganskih polimernih matrik, kot je poliakrilamid, lahko tudi v votla vlakna ali mikrokapsule. Takšen tip omejitve je načeloma prešibek, da bi popolnoma preprečili uhajanje encimov. Iz tega razloga je pogosto potrebna dodatna kovalentna vezava. Razlika med ujetjem in vezavo na nosilec pogosto ni jasna. Tako je vezava na nosilec možna, ne glede na to, ali se encim nahaja na zunanji ali notranji površini. Ujetje na splošno zahteva sintezo polimerne matrike v prisotnosti encima. Na primer, ko je encim imobiliziran v mezoporoznem silicijevem dioksidu, se lahko encim v veliki meri nahaja v mezoporah, vendar to ne predstavlja ujetje. Po drugi strani, ko je encim prisoten med sintezo silicijevega dioksida, to je v sol-gel postopku njegove priprave, se encim ujame. Glavna prednost je v tem, da imobilizirani encim, ujet ali kapsuliran, skoraj popolnoma ohrani izvorno stanje. Tako je omogočena njegova ponovna uporaba ter, v večini primerov, izboljšava encimske stabilnosti.^{5, 4}

5

2.1.3 Imobilizacija brez nosilca / samoimobilizacija

Poleg prvih dveh metod pa je mogoča imobilizacija brez nosilca ali samoimobilizacija, saj doseže povezovanje dveh encimov s pomočjo bifunkcionalnih zamreževalnih sredstev brez uporabe nosilca. V ta namen je najpogosteje uporabljena bifunkcionalna dialdehidna molekula – glutaraldehid. Temu koraku pravimo zamreževanje.

Nekatere izmed prednosti samoimobilizacije so:

1. večja volumetrična aktivnost na maso biokatalizatorja, 2. povečana specifična aktivnost,

3. preprosta uporaba,

4. zmanjšani proizvodni stroški, 5. višja čistost produkta,

6. manj interferenc in/ali kontaminacij s strani nosilca, 7. zmanjšane omejitve prenosa snovi.

Encimi, ki so imobilizirani brez nosilca, so ugodni katalizatorji v procesih, ki zahtevajo visoke izkoristke in produktivnost, ter niso zmožni imobilizacije s pomočjo nosilcev.⁴ Slika 2 prikazuje različne pristope za pridobitev imobiliziranih encimov brez nosilca. Iz prvotno raztopljenega encima lahko s kristalizacijo dobimo zamrežene encimske kristale (a), z obarjanjem dobimo zamrežene encimske agregate (b), pot (c) predstavlja pridobitev encimov po metodi sušenja z razprševanjem in pot (d) z direktnim zamreženjem encimov.

Slika 2: Različni pristopi pridobivanja zamreženih encimov.⁶

6

Na osnovi doslej povedanega bo izbira imobilizacijske tehnike odvisna od encimskih zahtev glede njegove uporabe, pa tudi od ravnovesja med proizvodnimi stroški in potencialno uporabo tako imobiliziranega biokatalizatorja.⁴

Trije izrazi, ki se najpogosteje uporabljajo za ugotavljanje uspešnosti imobilizacije encimov, so izkoristek imobilizacije, učinkovitost imobilizacije in zadržana aktivnost.⁵ Z izkoristkom imobilizacije (angl. immobilization yield) opredelimo, kakšen delež aktivnosti je zadržan po imobilizaciji, kar zapišemo kot:⁵

𝐼𝑧𝑘𝑜𝑟𝑖𝑠𝑡𝑒𝑘 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 (%) = 100 ∗ 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 𝑝𝑜 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑖

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 (1)

Aktivnost imobiliziranega encima je mogoče pravilno določiti z merjenjem preostale encimske aktivnosti v raztopini po imobilizaciji ter z njenim odštevanjem od aktivnosti pred imobilizacijo. V nekaterih primerih je potrebno pomeriti še slepi vzorec, da bi kompenzirali deaktivacijo prostega encima pri pogojih imobilizacije. Za določitev izkoristka imobilizacije se pogosto uporablja koncentracija proteinov. To je lahko zavajajoče, zlasti če se za imobilizacijo uporablja mešanica proteinov, saj imajo različni proteini različne izkoristke. Koristno pa je spremljati tako encimsko aktivnost kot koncentracijo proteinov v supernatantu, izločiti vsekakršno deaktivacijo prostega encima in določiti način nalaganja proteinov in/ali encimov.⁵

Drugi izraz, ki se pogosto uporablja za opis uspeha imobilizacije, je učinkovitost imobilizacije. Učinkovitost imobilizacije opisuje delež vezane encimske aktivnosti, definiramo jo pa na naslednji način:

𝑈č𝑖𝑛𝑘𝑜𝑣𝑖𝑡𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 (%) = 100 ∗ 𝑜𝑝𝑎𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑖𝑟𝑎𝑛𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 (2)

Teoretično lahko dobimo 100 % izkoristek in 0 % učinkovitost imobilizacije, če je vsa raztopina encima imobilizirana, vendar imobiliziran encim ni aktiven, ker se je encim deaktiviral, ali je iz nekega razloga po imobilizaciji postal nedostopen.⁵

Tretji izraz za opis uspeha imobilizacije je zadržana aktivnost. Zadržana aktivnost je izkoristek pomnožen z učinkovitostjo imobilizacije, ki v enem samem številu prestavi uspešnost celotnega procesa imobilizacije. Na ta način se aktivnost imobiliziranega encima primerja z začetno aktivnostjo prostega encima. Enačba (3) nam pove, na kakšen način lahko izračunamo zadržano aktivnost.⁵

𝑍𝑎𝑑𝑟ž𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 (%) = 100 ∗ 𝑜𝑝𝑎𝑧𝑜𝑣𝑎𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡

𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑔𝑎 𝑒𝑛𝑐𝑖𝑚𝑎 (3)

7

3 Priprava zamrežen ih encimskih agregatov

Priprava zamreženih encimskih agregatov oziroma CLEA delcev je preprosta in stroškovno učinkovita tehnika, ki lahko tvori netopne biokatalizatorje z visoko volumetrično aktivnostjo in izboljšano stabilnostjo.⁷

Tipičen postopek za pripravo zamreženih encimskih agregatov je prikazan na sliki 3.

CLEA se običajno pripravljajo v dveh korakih:

1. obarjanje encimov in nastanek agregatov iz pufrskih raztopin z dodatkom obarjalnega sredstva,

2. zamreževanje nastalih agregatov s pomočjo bifunkcionalnega zamreževalnega sredstva, kot je glutaraldehid. ^{8, 1}

Obarjanje je precej hitrejši korak od zamreževanja, zaradi česar lahko istočasno dodajamo obarjalno in zamreževalno sredstvo, pri čemer oba koraka združimo v eno operacijo.⁸

Slika 3: Preprost proces priprave CLEA delcev.⁴

8

Obarjalno sredstvo je lahko sol, kot sta amonijev in natrijev sulfat; organsko topilo, ki se meša z vodo; neionski polimer, kot je polietilen glikol (PEG). V praksi amonijev sulfat dobro deluje s skoraj vsemi encimi in je v ta namen najpogosteje uporabljen. Po drugi strani pa so organska topila, ki se mešajo z vodo, na splošno manj sprejemljiva in uporabna zaradi njihovega negativnega vpliva na okolje.⁸

Tako kot pri zamreževanju proteinov je glutaraldehid na splošno prva izbira zamreževalnega sredstva, saj je poceni in komercialno dostopen.^{8, 9}

Čeprav je kemija zapletena in ni popolnoma razumljena, zamreževanje vključuje reakcijo prostih amino skupin na površini sosednjih encimskih molekul z oligomeri ali polimeri glutaraldehida, ki so posledica inter- in intramolekularnih kondenzacij aldola.^{8, 9}

Zamreževanje lahko vključuje tvorbo Schiffove baze in Michaelovo 1, 4 adicijo na α, β- nenasičene aldehidne dele, natančen način zamreževanja pa je odvisen od pH.⁹

Pri pripravi CLEA delcev lahko naletimo na nekaj težav. Na prvi pogled bi moralo biti enostavno najti obarjalno sredstvo, ki omogoča obnovitev encimske aktivnosti.

Zamreževanje je lahko problematičen korak, če je encim osiromašen v zunanjih prostih primarnih amino skupinah. Ta problem se da rešiti z uporabo proteinov obogatenih z lizinom, koimobiliziranih encimov in polimerov obogatenih primarno z amini (npr.

polietilenimin, PEI) ali celo obogatitev encima s primarnimi amino skupinami s kemično modifikacijo.⁷

Z nekaterimi encimi, kot so npr. nitrilaze, pri zamreževanju z glutaraldehidom je bila opažena nizka ali nobena obnovitev aktivnosti. Ugotovljeno je, da bi razlog lahko bil v prodiranju glutaraldehida v notranjost proteinov in reakcija z amino skupinami, ki so ključne za aktivnost encima. V takih primerih se lahko uporabi kot zamreževalno sredstvo dekstran polialdehid, zajetni polialdehid, ki ne more prodreti v notranjost encima, čemur bi sledilo zmanjšanje delov Schiffove baze z uporabo natrijevega cianoborohidrida ter tvorba aminske vezi.^{8, 9}

Na ta način se izvaja tudi zamreževanje v prisotnosti monomera, ki je pod temi pogoji podvržen polimerizaciji. Rezultat tega je tvorba kompozitov s prilagodljivimi fizikalnimi lastnostmi. Če se zamreževanje izvede v prisotnosti siloksana, kot na primer (MeO)4Si (metil silikat), se slednji simultano polimerizira, da se dobi CLEA kompozit, zasnovan na silicijevem dioksidu.⁹

Uporabljajo se tudi drugi zamreževalci, ki izvirajo iz lahko dostopnih polisaharidov, npr.

pektin dialdehid, bis-epoksid in glicerol diglicidil eter.⁸

Po kemijskem zamreževanju agregati postanejo trajno netopni, hkrati pa ohranijo svojo strukturo in s tem tudi svojo katalitično aktivnost. Ker se oborine pogosto uporabljajo za čiščenje encimov, imobilizacija encimov s pomočjo CLEA tehnologije združuje čiščenje

9

in imobilizacijo v eno samo procesno enoto. Zato je možno imobilizirani encim izolirati neposredno iz fermentacijske brozge.¹⁰

Tudi pri uporabi CLEA delcev se naleti na nekaj težav. Prva je v tem, da so CLEA delci mehansko krhki, kar otežuje njihovo okrevanje. Druga težava je ta, da so pore zelo majhne, kar lahko vodi do difuzijskih omejitev. Prvi problem je mogoče rešiti z uporabo magnetnih nanodelcev (MNP), ki so združeni z encimom, da omogočijo magnetno obdelavo končnih zamreženih agregatov. Velikost in funkcionalizacija (sprememba površine) magnetnih nanodelcev lahko določita končne lastnosti magnetnega CLEA delca. Sprememba površine magnetnih nanodelcev s 3-aminopropiltrietoksisilanom (APTES), ter uporaba takšnih pri imobilizaciji amilaz, je zagotovila boljšo mehansko stabilnost in učinkovito magnetno ločevanje nastalega CLEA delca. Druge težave se lahko lotimo, če povečamo poroznost končnega agregata. Koagregacija polietilenimina z encimom lahko znatno izboljša učinkovitost zamreženja, preprečuje uhajanje in spodbuja nastajanje hidrofilnega mikrookolja, ki ščiti encim pred organskimi topili, lahko pa tudi poveča velikost por.⁷

Podobno lahko uporaba polimerov, kot je škrob, med agregacijo in zamreževanjem olajša nastanek velikih por. Ker se škrob lahko razgradi s pomočjo α-amilaze in izpere iz agragata, se lahko na ta način zmanjšajo omejitve notranjega prenosa snovi in tako poveča katalitičnaučinkovitost končnega pripravka.^{7, 10}

3.1 Pomembni parametri pri pripravi CLEA delcev

Vsak encim ima edinstveno primarno strukturo (zaporedje aminokislin) in površinsko strukturo (število dostopnih lizinskih ostankov), zato je mogoče CLEA delce optimizirati s spodaj opisanimi parametri za pridobitev končnega produkta z visoko aktivnostjo in stabilnostjo.^{1, 10}

3.1.1 Narava in čistost encima

Ker medsebojno povezovanje agregiranih encimskih molekul vključuje reakcijo bifunkcionalnega sredstva, kot je glutaraldehid, z reaktivnimi amino skupinami (predvsem lizinskimi) na površini encima, bo narava encima ter vsebnost lizina zagotovo vplivala na sam proces imobilizacije. Pričakovati je, da se bo vsak encim razlikoval glede na količino dostopnih lizinskih ostankov. Imobilizacija encimov s pomočjo CLEA tehnologije morda ni tako učinkovita, kot se običajno pričakuje za elektronegativne encime, pri katerih pomanjkuje površinsko reaktivnih amino skupin. CLEA delci takšnih encimov ne obnavljajo celotne proste aktivnosti encima in so med reakcijo mehansko občutljivi. Po drugi strani pa, če so amino skupine, ki sodelujejo pri zamreževanju, ključne za aktivnost encima, potem tudi za encime z ustreznimi reaktivnimi amino skupinami ni mogoče pripraviti aktivnih CLEA delcev. Zaradi tega je predlagana rešitev, pri kateri se zamreževanje izboljšuje z združitvijo (angl. coaggregation) encima z nizko

10

vsebnostjo lizinskih stranskih skupin in proteina, ki je bogat z lizinom. Eden izmed takšnih proteinov je goveji serumski albumin (BSA). V prisotnosti BSA je doseženo 100

% zadrževanje aktivnosti v primeru CLEA-lipaze in 86 % zadrževanje aktivnosti v primeru penicilin acilaze, medtem ko je bilo brez BSA le 0,4 % in 50 % zadrževanja aktivnosti v primeru lipaze oziroma penicilin acilaze. Še eden izmed primerov, kjer je BSA imel pozitiven učinek na ohranitev aktivnosti je pri CLEA-aminoacilaziiz Aspergillus melleus, pri čemer so CLEA-aminoacilaze, pripravljene z 10 mg BSA na 100 mg encima, ohranile kar 82 % zadržane aktivnosti (vzorec je poimenovan CLEA-E- BSA), medtem ko je CLEA pripravljen brez BSA zaradi nizke vsebnosti aminskih ostankov ohranil le 24 % zadržane aktivnosti (vzorec je poimenovan CLEA-E). CLEA- E-BSA je pokazal tudi odlično stabilnost pri samem izvajanju poskusa, pri čemer je visok delež aktivnosti ohranjen tudi po desetih ciklih večkratne uporabe.¹⁰

Zahteva po čistosti encimov je najpomembnejši parameter, pri kateremkoli načinu imobilizacije. Pri vseh imobilizacijskih tehnikah, kjer se uporabljajo trdni nosilci, je pomanjkljivost manjše nalaganje encimov in s tem tudi manjša specifična/volumetrična aktivnost. Eden od načinov za odpravo te pomanjkljivosti je uporaba prečiščenega encima, da se prepreči nalaganje kontaminiranih proteinov oziroma encimov. Cena prečiščenja encimov je visoka, kar dodatno poveča stroške končnega imobiliziranega biokatalizatorja. Čeprav zamreženi encimski kristali (CLEC) podajajo visoko specifično oziroma volumetrično aktivnost, za pridobitev kristalnega encima je potreben prečiščen encim. Ker pri zamreženih encimskih agregatih nadomeščamo kristalizacijo s cenejšim obarjanjem, pri sami pripravi ni potreben prečiščen encim, ki je kompatibilen z večino kontaminiranih proteinov, ker lahko ciljni encim v vsakem primeru obarimo pod ustreznimi pogoji, ki so specifični za določeni encim.¹⁰

3.1.2 Narava in količina obarjalnega sredstva

Obnovitev encimske aktivnosti je zelo pomemben parameter pri pripravi CLEA delcev in po možnosti naj bo ta blizu ali več kot 100 %. Pri obnavljanju aktivnosti predstavlja obarjanje pomemben korak, saj povzroči združevanje encimskih molekul v supramolekularne strukture, ki so nato navzkrižno povezane z zaklepanjem encima v agregat. Zato je treba presejati več vrst obarjalnih sredstev, da bi se povrnila največja encimska aktivnost v CLEA delcu. Encim lahko oborimo v neaktivni konformaciji, če pa ga raztopimo, bo pokazal normalno aktivnost. Po drugi strani pa bo po zamreževanju ostal v neaktivni konformaciji in bo imel nižjo aktivnost. Zato je na začetku priporočljivo izbrati nekaj vrst obarjalnih sredstev, ki prinašajo visoke donose pri agregatih. V nekaterih primerih se uporablja celo več obarjalnih sredstev za en sam encim in razlog za različne biokemične in strukturne lastnosti proteinov. Obarjanje encima z visokimi koncentracijami obarjalnega sredstva je v primeru okrevanja slabe aktivnosti vedno dalo popolnoma aktiven agregat. Razlog za tako visoko zadrževanje aktivnosti je močna sila, ki deluje na terciarno strukturo encima med obarjanjem. Hitrost obarjanja ima vpliv na strukturo encima, in sicer:

11

• če obarjanje poteka počasi, se bo encim denaturiral,

• če obarjanje poteka hitro, pomeni, da bo encimska molekula imela dovolj časa, da najde sosednje molekule, jih obkroži in pri tem ohrani svojo terciarno strukturo.¹⁰

3.1.3 pH vrednost

Povezovanje proteinskih molekul med sabo z uporabo glutaraldehida v veliki meri vključuje reakcijo med zelo reaktivnimi površinsko neprotoniranimi amino skupinami lizinskih ostankov in aldehidnimi skupinami glutaraldehida. Zato naboj površinskih lizinskih amino skupin uravnava medmolekularno zamreževanje. Lizinske amino skupine imajo konstanto disociacije pKa > 9,5, zaradi česar obstaja optimalno pH območje, pri katerem pride do največjega navzkrižnega povezovanja med molekulami proteinov.

Večinoma se priprava CLEA delcev izvaja pri nevtralnem ali rahlo alkalnem pH. Razlog za to je visoka reaktivnost glutaraldehida s proteini pri nevtralnem pH zaradi prisotnosti reaktivnih ostankov iz proteinov in različnih molekularnih oblik glutaraldehida v vodni raztopini, kar vodi do različnih možnih mehanizmov. Glutaraldehid reagira reverzibilno z amino skupinami v širokem območju pH nad 3,0, razen med pH 7,0 do 9,0, kjer je opazna le majhna možnost do reverzibilnosti. Sicer je glutaraldehid v vodni raztopini pri kislem pH prisoten pretežno v monomerni obliki, medtem ko alkalni pH podpira obstoj polimerne oblike.¹⁰

3.1.4 Narava zamreževalnega sredstva

Med številnimi razpoložljivimi sredstvi za pripravo CLEA delcev oziroma za zamreževanje nedvomno najpogosteje uporablja glutaraldehid. Pri nekaterih encimih, kot so nitrilaze, je z uporabo glutaraldehida opažena nizka aktivnost oziroma nobena retencija aktivnosti. Razlog za to bi lahko bil v velikosti delcev glutaraldehida, kar mu omogoča prodiranje v notranjost proteinov in reakcijo med zamreževalcem in amino skupinami, ki so ključne za katalitično aktivnost encima. Da bi se temu izognili, se pogosto kot zamreževalno sredstvo uporablja dekstran polialdehid. Ta zaradi velikih delcev ne more prodreti v notranjost, s čimer se ohrani tudi katalitična aktivnost samega encima. Poleg tega encimski agregati, zamreženi z mikromolekularnim zamreževalcem, kot je glutaraldehid, tvorijo kompaktno supermolekularno strukturo in ovirajo prenos mase substratov znotraj encimskih molekul, kar bi povzročilo nizko aktivnost CLEA delcev, zlasti če bi bili substrati makromolekule. Zato so za pripravo CLEA delcev, pri katerih se uporabljajo encimi z lizinskimi amino skupinami, ki so nujne za njihovo aktivnost in kadar so substrati makromolekule, makromolekularni zamreževalci na splošno boljši od malih dialdehidov, kot je glutaraldehid. Številni raziskovalci so se lotili težave z iskanjem primerne zamenjave za glutaraldehid, ki sicer velja za strupeno kemikalijo ter ustvarjanjem prilagodljive tehnološke osnove za pridobitev robustnih CLEA delcev, namenjenih široki uporabi. Na ta način je uspelo najti rešitev za pripravo CLEA delcev iz lipaz, kjer je dobljena stabilna CLEA z uporabo p-benzokinona kot zamenjava za

12

glutaraldehid. Da bi se izognili škodljivim učinkom na vodne ekosisteme in zdravje ljudi, se uporablja tudi hitozan kot novo zamreževalno sredstvo pri pripravi CLEA delcev z lakazo. Na ta način so amino skupine, prisotne na hitozanu reagirale s karboksilno skupino, ki je prisotna v neesencialni aminokislini encima ter tvorile amidno vez. Čeprav nekateri stremijo k uporabi okolju prijaznejšega sredstva za zamreževanje, mnogi raziskovalci še naprej uporabljajo glutaraldehid, ki ima poleg majhne strupenosti številne pozitivne lastnosti, kot so: komercialna razpoložljivost, nizki stroški ter enostavnost rokovanja, visoka reaktivnost v primerjavi z drugimi zamreževalci. Glutaraldehid reagira tudi z aminskimi skupinami pri nevtralnem pH in je učinkovitejši od drugih aldehidov pri tvorbi zelo stabilnih intra- in intermolekularnih mrež. Zato je priporočljivo izbrati zamreževalno sredstvo na podlagi končne uporabe dobljenih CLEA delcev s čim višjo aktivnostjo in stabilnostjo.¹⁰

3.1.5 Količina zamreževalnega sredstva

Eden ključnih parametrov pri proizvodnji CLEA delcev je koncentracija zamreževalnega sredstva, saj vpliva na aktivnost, operativno stabilnost in velikost oziroma morfologijo nastalih CLEA delcev. Opaženo je, da se obnavljanje aktivnosti encimov poveča s povečanjem koncentracije zamreževalnega sredstva, pri čemer doseže maksimalno vrednost in se nato z nadaljnjim višanjem koncentracije zamreževalnega sredstva zmanjša. Pri nižjih koncentracijah zamreževalnega sredstva pride do nepopolnega zamreževanja, kjer posledično nastajajo slabo topni in nestabilni agregati, ki sproščajo proste encime v reakcijsko zmes. Po drugi strani pa, ko je koncentracija zamreževalnega sredstva velika, pride do strjevanja molekule encima zaradi preseženega zamreževanja ter izgube prožnosti encima, ki je bistvenega pomena za njegovo aktivnost. Zaradi strjevanja nastane tudi sterična ovira, ki substratu onemogoča dosego aktivnega mesta. Zato je potrebno pri pripravi CLEA delcev dodati optimalno količino zamreževalnega sredstva, da se ohrani prožnost encima z visoko obnovitvijo encimske aktivnosti in stabilnosti. Za vsak encim obstaja edinstvena optimalna količina zamreževalnega sredstva, saj je število prostih amino skupin na površini encimov različno. Koncentracija zamreževalnega sredstva je pomembna tudi pri določanju morfologije in s tem katalitičnih lastnosti CLEA delcev. Pri višji koncentraciji se dobi CLEA delec z več votlin, medtem ko pri optimalni koncentraciji zamreževalnega sredstva dobimo bolj strukturirane, drobnozrnate agregate z manj votlin. Prav tako so pri povišanih koncentracijah zamreževalnega sredstva neizogibne omejitve prenosa snovi in s tem znižana katalitična aktivnost.¹⁰

3.1.6 Čas zamreževanja

Ker je zamreževanje reakcija, je pomemben čas, potreben za maksimalno obnovitev aktivnosti encimov. Tako kot razmerje med zamreževalcem in encimom je potrebno tudi čas zamreženja določiti tako, da bi pridobili optimalne rezultate. Prekratek čas zamreženja vodi do neustreznih povezav ter posledično tudi slabega obnavljanja encimske aktivnosti in procesne stabilnosti. Razmerje med zamreževalcem in encimom

13

je prav tako pomembno, saj pri višji vrednosti lahko pričakujemo učinkovito povezovanje posameznih molekul v zelo kratkem času. Previsoko razmerje lahko škodi encimski aktivnosti, dolgotrajno zamreženje pa omejuje prožnost encimov in odpravlja njegovo aktivnost. Pri CLEA delcih z lipazami je opažen upad aktivnosti iz 100 % na 50 %, pri čemer se čas zamreženja povečal od 4 h do 8 h, toplotna stabilnost in možnost za ponovno uporabo encima pa se je znatno povečala.¹⁰

3.1.7 Pranje in separacija CLEA delcev

Po zamreževanju se za odstranitev nevezanih proteinov in glutaraldehida celotna reakcijska zmes suspendira v pufru in spere s centrifugiranjem ali filtracijo. Ker so zaradi zamreževanja molekule encimov zložene v majhne volumne, lahko pričakujemo majhno poroznost končnih agregatov in posledično omejitve pri notranjem prenosu snovi. Tudi zaradi občutljivosti in manjše kompresijske odpornosti CLEA delcev bo pranje in ločevanje s centrifugiranjem ali filtracijo povzročilo nadaljnje stiskanje molekul, kar omejuje masni transport do takšne mere, da lahko negativno vpliva na uporabnost CLEA delcev za različne namene. Za premagovanje takšnih težav se je razvila nova tehnologija, poimenovana porozni CLEA delci (p-CLEA). Vključuje dodajanje škroba kot primernega sredstva za ustvarjanje por, zgolj zaradi velikosti molekul škroba. Pri tej tehnologiji se istočasno obarjata encim in škrob, slednji se pa lahko odstrani z dodajanjem α-amilaze, ki hidrolizira škrob v maltozo in glukozo. p-CLEA so tako pokazali boljše transportne zmožnosti v primerjavi z običajnimi CLEA delci, tudi pri nizkih koncentracijah substrata.¹⁰

15

4 Lastnosti CLEA delcev

Pomembna lastnost CLEA delcev, ki določa obseg njihove uporabe, je velikost. Ta neposredno vpliva na omejitve prenosa snovi in sposobnost filtriranja. Običajno se velikost CLEA delcev giblje med 0,1 in 200 µm. V industrijskih procesih, kjer je potrebno izvajati recikliranje encima na osnovi filtracije in centrifugiranja, bo povečanje velikosti delcev vodilo v omejitev prenosa snovi in posledično zmanjšanje aktivnosti biokatalizatorja. Med dejavniki, ki določajo velikost CLEA delcev, imata glavno vlogo količina encima in koncentracija zamreževalca. Oba parametra lahko spremenita končen rezultat delovanja biokatalizatorja tekom celotnega procesa.⁴

Po svoji morfologiji lahko CLEA delce razvrstimo kot:

• tip I: delci merijo približno 1 µm v premeru in nastanejo iz nizko glikoziliranih encimov z velikimi hidrofobnimi površinami, kot je lipaza B iz kvasovke Candida albicans, pri čemer so ti delci sferične oblike,

• tip II: delci merijo v premeru manj kot 0,1 µm in nastajajo iz visoko glikoziliranih encimov z velikimi hidrofilnimi površinami, kot so lipaze iz glive Candida rugosa in oksinitrilaza iz Prunus amygdalus oziroma mandljevca. Formirani agregati so nepravilne oblike in so manjši od tistih pri tipu I. ⁴

Slika 4: (A) Prikaz tipa I CLEA delcev: CLEA delci lipaze B iz kvasovke Candida antarctica (angl. Candida antarctica lipase B) ter (B) prikaz tipa II CLEA delcev:

CLEA delci narejeni iz lipaze iz glive Candida rugosa (angl. Candida rugosa lipase). ⁴

17

5 Izboljšava encimskih katalitskih lastnosti s pomočjo CLEA tehnologije

5.1 Aktivnost

Aktivnost zamreženih encimskih agregatov je odvisna od več dejavnikov kot so sredstvo za obarjanje, aditivi, zamreževalno sredstvo, čas zamreževanja, koncentracije encima, temperature, pH in perturbacije (motnje). Obarjalno sredstvo in pogoji obarjanja so ključnega pomena pri pripravi CLEA delcev, saj lahko naredijo aktivnejšo konformacijo encima. Vendar pa ni mogoče posploševati uporabe enega obarjalnega sredstva za vse encime, saj lahko to sredstvo pri različnih encimih povzroči nezaželene rezultate. Za to je treba oceniti različna obarjalna sredstva z vsakim encimom posamično, pri čemer je treba upoštevati, da optimalno obarjalno sredstvo morda ne bo tisto, ki na koncu ustvari optimalne CLEA delce. Nedavna študija je pokazala, da pri pripravi CLEA delcev časovno obdobje med obarjanjem encimov in zamreževanjem močno vpliva na strukturno organizacijo nastalega encimskega agregata. Za primerjavo so uporabljeni CLEA delci penicilin acilaze (PA): sveži (zamreženi takoj po obarjanju) in dozoreli (zamreženi po 7 dneh bivanja na temperaturi 4 °C), obarjeni s pomočjo polietilenglikola (PEG 6000) in zamreženi s glutaraldehidom. Opaženo je, da ima zrela CLEA večje velikosti kot sveža CLEA. Poleg tega so študije preučevanja kinetike pokazale, da so bili zreli CLEA delci učinkovitejši tako v reakcijah sinteze kot tudi hidrolize. Velikost agregatov lahko uravnava obseg kovalentnih modifikacij penicilin acilaze in tako vpliva na katalitične lastnosti njenih CLEA delcev. Ugotovljeno je bilo tudi, da na velikost CLEA delcev vplivata tudi vrsta in koncentracija uporabljenih soli za obarjanje. Organska topila, ki se uporabljajo kot sredstva za obarjanje, lahko povzročijo denaturacijo encimov. Škoda, ki jo povzročajo taka sredstva, je predvsem posledica tega, da topila odstranijo vodo, vezano na protein, kar zmanjšuje njegovo prožnost. Uporaba surfaktanta Triton X-100, natrijevega dodecil sulfata in kronskih etrov je pokazala njihov vpliv na aktivnost CLEA delcev. Dodatek surfaktanta Triton X-100 poveča aktivnost tistih lipaz, ki po navadi tvorijo dimere. Aktivacija lipaz zaradi aditivov, kot so površinsko aktivne snovi in kronski etri, se na splošno pripisuje zmrzovanju in aktivnejši konformaciji encima v fazi priprave. Ker dodatki niso kovalentno vezani na encim, jih lahko enostavno speremo iz encimskega agregata z uporabo ustreznega organskega topila, pri čemer imobilizirani encim ostane fiksiran v najbolj ugodni konformaciji.⁴

5.2 Selektivnost

Selektivnost encimov je ena izmed lastnosti katalizatorjev, zaradi katerih so encimi močna orodja za pripravo koristnih spojin. Izboljšanje selektivnosti encimov je povezano z več dejavniki. Eden izmed takšnih dejavnikov je koncentracija zamreževalnega sredstva. Na selektivnost biokatalizatorja prav tako vpliva uporaba aditivov med pripravo

18

CLEA delcev. Tako je ocenjena enantioselektivnost CLEA delcev iz lipaze iz bakterij iz rodu Alcaligenes, v prisotnosti polietilenimina in dekstran sulfata kot obarjalnih sredstev.

Kot aditiv je bil uporabljen Triton X-100, ki vpliva na aktivnost in enantioselektivnost pri hidrolizi glicidil butirata.⁴

5.3 Stabilnost

Pogosto je nizka stabilnost naravnih encimov v obsežnih reakcijskih pogojih glavna pomanjkljivost, ki ovira njihovo hitro vključitev v industrijske bioprocese. Stabilnost encima proti denaturacijskim temperaturam je povezana s stopnjo togosti molekule. In sicer večje je število inter- in intramolekularnih kovalentnih vezi, večja je toplotna selektivnost. Zato je kovalentna imobilizacija encimov močno povezana s stabilizacijo encimov proti temperaturi. Med pripravo zamreženih encimskih agregatov so učinek časa zamreževanja, koncentracija in vrsta zamreževalnega sredstva neposredno vpleteni v termostabilnost končnega produkta. Termostabilnost je lahko odvisna tudi od vrste obarjalnega sredstva, ki se uporablja za pridobivanje CLEA delcev. Druga slabost naravnih encimov je negativni učinek visokih koncentracij substrata ali produkta. V zvezi s tem je bila CLEA tehnologija uporabljena kot učinkovito orodje za reduciranje inhibicije substrata ali izdelka. Poleg temperature in inhibicije substrata/produkta so pri stabilizaciji encimov pomembni tudi kisli ali alkalni pogoji. Encimi so bolj aktivni v določenih pH intervalih in kažejo največjo aktivnost pri določeni pH vrednosti. Številne hidrolitične in sintezne reakcije se izvajajo pri kislih ali alkalnih pogojih, ki pogosto denaturirajo encime, kar predstavlja oviro za njihovo neposredno uporabo.⁴

Slika 5 prikazuje, kako pH okolje vpliva, na kakšen način bo zamreževalno sredstvo vplivalo na strukturo proteina.

Slika 5: Reakcija zamreževalnega sredstva glutaraldehida z lizinskimi ostanki proteina pod (A) bazičnimi in (B) kislimi pogoji.¹¹

Hidrolitični encimi katalizirajo veliko število sinteznih reakcij v organskih topilih. CLEA tehnologija omogoča pripravo biokatalizatorjev, odpornih na ta topila. Dodatek nabitih polimerov, kot je PEI med pripravo CLEA delcev, ima zaščitne učinke pred denaturacijo

19

topila, saj ovira stik topila in encima. Tudi industrijski biokatalizatorji morajo imeti visoko stabilnost pri skladiščenju. V ta namen so CLEA delci pokazali visoko stopnjo stabilnosti pri skladiščenju. Na primer, CLEA delci z amiloglukozidazo so po 60 dneh ohranili 98 % začetne aktivnosti pri temperaturi 4 °C, medtem ko je sam encim pri enakih pogojih skladiščenja po 5 dneh izgubil več kot 50 % začetne aktivnosti.⁴

21

6 Vrste CLEA delcev

6.1 Magnetni CLEA delci (m-CLEA)

Napredek na področju imobilizacije je odprl pot za razvoj nove tehnologije, ki je bila doslej uporabljena za imobilizacijo le nekaj encimov. Nekateri raziskovalci so CLEA tehnologijo, kjer se pri imobilizaciji uporabljajo nosilci, razvili v nadgrajeno in izboljšano verzijo CLEA tehnologije. Izkazalo se je kot ugoden nadomestek za premagovanje omejitev, ki so jih pokazali CLEA delci. Zamreževanje encimov se pri tej metodi izvaja na površini nanodelcev (MNP, angl. magnetic nanoparticles). Posebno pozornost s strani raziskovalcev so nanodelci pridobili zaradi svojih lastnosti. Magnetni nanodelec je zelo majhen, njegova velikost se giblje med 1 in 100 nm, kar predstavlja dodatno prednost zaradi večje površine v bolj kompaktni obliki. Magnetni material kot nosilec ima nekaj prednosti, zaradi česar so dobra izbira za imobilizacijo. Veliko razmerje med površino in prostornino nanodelcev je pokazalo večjo učinkovitost vezave encima, kjer se encim v veliki količini prevleče na njihovi površini. Še ena prednost je ta, da je takšne materiale mogoče enostavno nadzorovati in odstraniti iz reakcijske zmesi, ko pridejo v stik z zunanjim magnetnim poljem, poleg tega pa zagotavljajo stabilnost ob večkratni uporabi in izboljšajo katalitične lastnosti CLEA delca. Izjemno paramagnetno vedenje omogoča enostavno ločevanje in selektivno predelavo, prav tako pa zaradi nizke toksičnosti predstavljajo dobre kandidate za nosilce pri imobilizaciji encimov. Za pripravo magnetno zamreženih encimskih agregatov (m-CLEA) se kot aditiv doda amino-funkcionalizirani magnetni nanodelec. Agregati nastanejo z obarjanjem encimov, po tem pa pride do zamreženja encimskih agregatov in nanodelcev. Encimi z majhnim številom lizinskih ostankov pa bodo z dodatkom nanodelcev dosegli visoko stopnjo zamreženja, s tem pa bodo postali tudi mehansko stabilnejši in neuničljivi. Magnet lahko enostavno veže CLEA delec iz reakcijske zmesi in tako odpravi potrebo po filtraciji in centrifugiranju.²

22

Slika 6: Prikaz pridobivanja CLEA delcev brez nanodelcev (zgornja pot) in z uporabo nanodelcev (spodnja pot).²

Uporaba magnetnih nanodelcev omogoča encimu, da ohrani večino svoje prvotne aktivnosti. MNP skupaj s 3-aminopropiltrietoksisilanom (APTES) pomagajo zagotoviti učinkovita vezavna mesta na encim in povečajo stabilnost encima. Dodatek APTES poveča koncentracijo aminskih skupin na površini nanodelcev, kar pomaga vezati encimske agregate. Vezava kovine z aminokislinskim ostankom encima stabilizira njegovo aktivno konformacijo. Kovine, ki se lahko nahajajo v magnetnih nanodelcih, so železo, nikelj, kobalt in njihovi oksidi, kot je magnetit.²

6.2 Kombinirani CLEA delci (combi-CLEA)

S stališča okoljske in ekonomske učinkovitosti, je cilj združiti katalitične korake v kaskadni proces brez potrebe po ločevanju vmesnih produktov. Katalitski kaskadni procesi imajo številne potencialne prednosti: manj obratovnih enot, manjšo prostornino reaktorja, večji volumetrični in prostorsko-časovni izkoristek, krajši čas cikla in manj odpadkov. Sinteza kemikalij zahteva veliko število korakov v kaskadnih reakcijah.

Takšne večstopenjske reakcije imajo včasih za rezultat nizke izkoristke, kar je posledica usedanja nestabilnih intermediatov ali nepotrebnih stranskih reakcij. S soobarjanjem in zamreževanjem dveh ali več encimov nastanejo delci, ki jih imenujemo kombinirani CLEA delci.^{2, 5}

Kombinirani CLEA delci so koristna tehnologija v mnogih pogledih, saj zmanjšujejo proizvodne stroške na industrijski ravni in dajejo večji izkoristek v primerjavi z

23

večstopenjskimi reakcijami. Pri pripravi kombiniranih CLEA delcev se pogosto uporabljajo magnetni nanodelci, katerih vloga je pomoč pri enostavnem odstranjevanju encimov iz reakcijske mešanice ter možnost do ponovne/večkratne uporabe.²

Encimi iz različnih virov zahtevajo optimizacijo parametrov padavin in zamreženja.

Čeprav sta padavina in zamreževalec prednostni nalogi pri pripravi combi-CLEA, je treba vse parametre skrbno pretehtati zaradi medsebojnega delovanja. Na splošno lahko combi- CLEA delci izboljšajo stabilnost encimov in navidezno katalitično hitrost. To bo zagotovo koristilo biotransformaciji v industrijskih aplikacijah, zlasti v sistemih za regeneracijo kofaktorjev. Ker večina oksidoreduktaz zahteva stehiometrične količine dragih kofaktorjev, kot je NAD⁺, lahko combi-CLEA delci z oksidoreduktazami zagotovijo ponovno uporabo kofaktorjev za zmanjšanje stroškov. To je robusten regeneracijski sistem, ki ga je mogoče pripraviti na preprost, hiter in ekonomičen način.¹¹

25

7 Uporaba CLEA delcev

CLEA delci imajo številne prednosti, med katere sodita netopnost in vrhunska procesna stabilnost. Zato se uporaba CLEA delcev kot biokatalizatorjev v različnih panogah nenehno povečuje, zlasti pri sintezah in za okoljske namene.¹

7.1 Sinteza farmacevtskih učinkovin

(-)-γ-laktam je bistveni gradnik pri sintezi karbocikličnih nukleozidov, ki imajo močno protivirusno delovanje zaradi zaviralne zmožnosti proti virusni reverzni transkriptazi. (+)- γ-laktamaza lahko katalizira pretvorbo samo (+)-γ-laktama v racemni zmesi, kar kaže, da je mogoče (-)-γ-laktam iz reakcijske zmesi obnoviti s preprosto reakcijo.¹

Zamrežena (+)-γ-laktamaza je posušena, zdrobljena in zapakirana v razmerju 1 : 1 s poroznim steklom v epruvete. Ko je encim imobiliziran, je testirana njegova aktivnost z merjenjem konverzije substrata. Na sliki 7 je prikazano, kako je ta konverzija odvisna od temperature. Razvidno je, da se je najboljšo konverzija substrata pri danih pogojih dosegla pri temperaturi 80 °C.¹²

Slika 7: Vpliv temperature na stopnjo konverzije pri sintezi karbocikličnih nukleozidov, katalizirano s (+)-γ-laktamazo v obliki CLEA delcev.¹²

26

Še eden izmed pomembnih encimov je penicilin G acilaza, ki se uporablja za proizvodnjo polsintetičnih β-laktamskih antibiotikov, predvsem v sintezi 6-aminopenicilanske kisline (6-APA) z encimsko deacilacijo penicilina G. Slika 8 prikazuje pot sinteze ampicilina iz 6-APA (zgornja pot) in cefaleksina iz 7-ADCA (spodnja pot), kjer so kot biokatalizator uporabljeni CLEA delci peniclin G acilaze. Prosti encim ima omejeno toplotno stabilnost in zelo majhno toleranco na organska topila.^{13, 3}

Slika 8: Sinteza ampicilina in cefaleksina s pomočjo penicilin G acilaze.⁹

Za preverjanje delovanja pripravljenih agregatov so uporabljena tri različna obarjalna sredstva: amonijev sulfat, terc-butanol in polietilen glikol. S tem eksperimentom je pokazano, da so zamreženi encimski agregati, ki nastanejo s fizikalno agregacijo in zamreženjem, zelo aktivni in stabilni biokatalizatorji. Pri sintezi ampicilina so agregati peniclin G acilaze pokazali boljšo katalitsko učinkovitost kot zamreženi kristali istega encima. Podobno kot kristali so tudi agregati ohranili svojo aktivnost v organskih topilih.³

7.2 Sinteza polimerov

Sintetični poliamidi imajo visoko mehansko trdnost in dobro toplotno odpornost ter se pogosto uporabljajo v industriji. Industrijska sinteza teh polimerov običajno vključuje postopek taljenja. Zaradi visokih temperatur taljenja in razmeroma nizkih temperatur razgradnje poliamidov z alifatsko-aromatičnimi strukturami je sinteza poliamidov s postopki taljenja običajno težka. Sinteza oligoamidov, ki vsebujejo alifatsko-aromatske obroče, s pomočjo katalizatorja CLEA delcev z imobilizirano kutinazo premaga to težavo. Čeprav je komercialno dostopna imobilizirana lipaza dala večjo učinkovitost

27

pretvorbe kot kutinaza v CLEA delcih, so CLEA delci s kutinazo dosegli najvišjo stopnjo polimerizacije v enostopenjski in dvostopenjski sintezi.¹

7.3 Sinteza nanodelcev srebra

Nanodelci srebra so v središču mnogih raziskav zaradi njihovih katalitičnih, protimikrobnih in optičnih lastnosti. Sinteza nanodelcev srebra po običajnih metodah je energetsko zahtevna in okolju neprijetna zaradi uporabe strupenih topil ali dodatkov, ki jih je težko odstraniti in razgraditi v industrijskih razsežnostih. Poleg tega nanodelcev srebra, sintetiziranih s temi običajnimi metodami, ni mogoče uporabiti za in vivo biomedicinske namene, ker so strupene kemikalije iz sintetičnega procesa nezdružljive z biološkimi sistemi. Za premagovanje teh težav so razvite NADH – odvisne CLEA nitrat- reduktaze. Sinteza nanodelcev srebra je bila zavirana v prisotnosti natrijevega azida, zaviralca nitrat-reduktaze, kar je potrdilo, da CLEA delci nitratnih reduktaz katalizirajo sintezo nanodelcev srebra z redukcijo srebrovega nitrata. Poleg tega so ti CLEA delci po petih ciklih pokazali 80 % ohranitev katalitske aktivnosti, kar kaže, da imajo dobro procesno stabilnost.¹

7.4 Razbarvanje in razstrupljanje barvil

Za varstvo okolja bi morale tekstilna, barvna, tiskarska in sorodne industrije odstraniti ali obdelati odpadne vode, ki so onesnažene pri proizvodnji sintetičnih barvil. Uporaba encimov potencialno omogoča učinkovito in poceni razgradnjo onesnaževal, zato je bila raziskana za čiščenje odpadnih voda. Eden izmed takšnih encimov je lakaza, ki kaže zelo dobre katalitske lastnosti pri čiščenju industrijskih odpadnih voda. Prav tako pa se uporabljajo magnetni CLEA delci z lakazo, ki kažejo dobro toplotno in procesno stabilnost, ter hitro razgradnjo sintetičnih barvil.¹

7.5 Biokonverzija agroindustrijskih odpadkov

Zasnova imobiliziranih biokatalizatorjev je pomembna predvsem pri proizvodnji dragocenih bioizdelkov iz lignocelulozne biomase. Med njimi je imobilizacija brez nosilca s pomočjo zamreženih encimskih agregatov preprosta in poceni alternativa.¹⁴ Biokonverzija lignocelulozne biomase je pomembna tehnologija pri proizvodnji čiste energije.¹

Pri tem eksperimentu je encimska aktivnost ocenjena z uporabo sladkornega trsa kot substrata. Medtem ko je prosti encim kot glavni produkt sproščal ksilozo, je imobilizirana ksilanaza proizvajala ksilo-oligosaharide. Nastali imobilizirani biokatalizator, CLEA delci s ksilanazo, je bil značilno stabilnejši (25 do 45%) pri temperaturah do 50 °C glede na prosti encim in je po 5 zaporednih ciklih ponovne uporabe ohranil več kot 50 % začetne aktivnosti.¹⁴

28

V agroindustrijske namene se uporabljajo magnetni CLEA delci, ki se jih lahko pripravi iz različnih encimov. Za industrijske namene je njihova uporaba usmerjena predvsem za pretvorbo polisaharidov, kot sta škrob in zlasti lignoceluloza za proizvodnjo biogoriv prve in druge generacije, ter živil in pijač. Eden izmed takšnih primerov so magnetni CLEA delci α-amilaze za uporabo pri hidrolizi škroba. Obnovitev aktivnosti je bila 100 % z izboljšano toplotno stabilnostjo in možnostjo shranjevanja v primerjavi s prostim encimom in 100 % zadrževanjem aktivnosti po 6 ciklih. Najbolj zahteven korak pri uporabi magnetnih CLEA delcev je v kompleksni hidrolizi lignoceluloze in povezavi s proizvodnjo biogoriv druge generacije ter kemikalij iz biomase. Stroški encimov na kg proizvoda so ključnega pomena za ekonomsko upravičenost teh procesov, zlasti v primeru lignoceluloznih surovin. Pri proizvodnji biogoriv prve in druge generacije, da bi bila stroškovno učinkovitejša, encimsko katalizirana hidroliza škroba ali lignoceluloze je pogosto kombinirana s kasnejšo stopnjo fermentacije, v tako imenovanih postopkih simultane saharifikacije in fermentacije (SSF). Večkratno recikliranje encima z uporabo imobiliziranega, trdnega encima, ki ga je mogoče enostavno pridobiti in ponovno uporabiti, predstavlja jasno priložnost za zmanjšanje stroškov procesa ter spodbujanje konkurenčnosti in trajnosti. Potreba po separaciji trdnega imobiliziranega encima od velike količine drugih trdnih snovi, na primer vlaken in/ali kvasovk (v postopkih SSF), suspendiranih v reakcijski mešanici, preprečuje uporabo standardnih imobiliziranih encimov. Doslej je bila pozornost osredotočena na hidrolizo škroba in lignoceluloze, magnetne CLEA delce pa je mogoče uporabiti tudi pri hidrolizi drugih polisaharidov v procesih za njihovo pretvorbo v biogoriva in druge izdelke iz biomase. Tako se za razbistritev sadnih sokov lahko uporabijo triencimske magnetne kombinirane CLEA delce, ki so sestavljeni iz α-amilaze, pektinaze in celulaze.⁸

29

8 Uporaba CLEA delcev v mikropretočnih reaktorjih

8.1 Mikropretočni reaktorji

Mikropretočne reakcijske naprave so reakcijske naprave z majhnimi dimenzijami, velikimi razmerji med površino in prostornino ter dobro določenimi reakcijskimi časi. Ti sistemi izkoriščajo prednosti mikrofluidike ali nanofluidike, ki omogočajo uporabo mikro- ali nanolitrskih količin raztopin reaktantov ter ponujajo prednosti, predvsem visoka učinkovitost in ponovljivost. Ključne prednosti mikrosistemov vključujejo hitro izmenjavo toplote in hiter prenos snovi, ki ga ni mogoče doseči s konvencionalnim šaržnim sistemom. Za razliko od raztopin v makro merilih, raztopine v mikrofluidnem sistemu večinoma tvorijo laminarni tok, ki omogoča nadzor nad reakcijskimi pogoji in časom. Poleg tega mikrokanalni reakcijski sistemi zagotavljajo velike površine, kar je ugodno za številne kemijske procese, kot so ekstrakcije in katalitične reakcije.¹⁵

Mikroreaktorji ponujajo številne prednosti pred običajnimi serijskimi reaktorskimi sistemi. Njihova velikost v primerjavi s standardnimi šaržnimi reaktorji pomeni, da so prenosni, kar je nedvomno prednost za različne analize.¹⁶

Mikrofluidika omogoča nastanek kapljic na pikolitrskem in nanolitrskem merilu, ki jih lahko v kombinaciji z ustreznimi detektorji in razvrščevalci kapljic uporabimo za visokozmogljivostno presejanje in razvoj encimov. Biokatalizatorji, razdeljeni v posamezne kapljice, skupaj s substrati (in inhibitorji) podpirajo zelo hitro in učinkovito pridobivanje kinetičnih podatkov o encimih v pretočnih reaktorjih z ustreznimi senzorji vzdolž mikroreaktorja, ki je v korelaciji z reakcijskim časom.¹⁷

To je koristno tudi pri sinteznih reakcijah, kjer lahko majhne spremembe povzročijo znatna odstopanja pri tvorbi in čistosti končnega produkta. Za analizo encimov ponujajo številne prednosti, nenazadnje so manjše količine encimov, substratov in kofaktorjev, potrebne za doseganje podobnih rezultatov kot pri serijskih reaktorjih.¹⁶

Poleg krajših obratovalnih časov in nizke porabe materiala, mikrofluidne naprave omogočajo tudi in operando vrednotenje biokatalizatorja, ki ga z uporabo mikrotitrskih plošč ni mogoče spremljati.¹⁸

Danes se mikropretočne naprave lahko razdelijo v dve vrsti: mikroreaktorske naprave na čipu in mikrokapilarne naprave. Mikroreaktorji na čipu imajo številne prednosti, med katere sodita enostaven nadzor mikrofluidnih mehanizmov ter integracija številnih procesov v eno reakcijsko napravo. V glavnem se takšen tip mikroreaktorjev uporablja za bioanalitske namene ter razvoj bioanalitskih naprav, predvsem so pa bili prilagojeni za industrijo mikroelektronike. Polimerni materiali se lahko uporabljajo za pripravo encimskih mikroreaktorjev, ker se večina encimskih reakcij izvaja v vodni raztopini,

30

zlasti za bioanalitčne namene. Za pripravo mikroreakcijskih naprav se zato lahko uporabi polidimetilsiloksan (PDMS), polimetilmetakrilat (PMMA), polikarbonat in teflon.^{15, 17} Druga vrsta mikropretočnih naprav je sestavljena iz mikrokapilar. To je najpreprostejši sistem, ki ne zahteva nobenega nadzora mikrofluidnih mehanizmov, saj se kot reakcijski prostor uporablja mikrokanal. Največja prednost te vrste mikroreaktorjev je v scale up koraku, ki ga je mogoče doseči s preprosto vezavo več mikrokapilar. Za pripravo te vrste mikroreaktorjev se uporabljajo predvsem določeni deli aparature za plinsko in tekočinsko kromatografijo.^{15, 17}

Slika 9: Priprava CLEA delcev na notranji steni cevke iz politetrafluoroetilena (PTFE) in zamreževanje pod laminarnim tokom. (a) prikazuje standardno metodo priprave, (b) pa predstavlja zamreževanje podprto s poly-Lys. Dodatek polilizina je primeren za vse

elektronegativne encime, kjer manjka amino skupin in je tvorba CLEA delcev neučinkovita.¹²

8.2 Priprava CLEA delcev v mikroreaktorjih

Tvorba CLEA delcev v mikrokanalu ni kompleksen proces, poleg tega pa ima številne prednosti. Raztopina encima se enostavno naloži v mikrokanal, pri čemer se dodajata zamreževalno kot tudi obarjalno sredstvo. Takšen sistem se lahko uporablja dlje časa (več kot 40 dni) in kaže odlično stabilnost proti organskim topilom. Težave se pojavljajo pri kislih encimih, ki nimajo dovolj amino skupin na svoji površini. Kot je že omenjeno, se v ta namen lahko doda polilizin, da bi se povečala učinkovitost zamreženja.^{15, 18}

31

Izkazalo se je, da je na ta način uspešna imobilizacija skoraj vseh encimov, tudi precej kislih.¹⁸

V mikropretočnem reaktorju je preverjeno zadrževanje encimske aktivnosti pri optimalni temperaturi sintetiziranja karbocikličnih nukleozidov za prost in zamrežen encim. To je razvidno iz slike 10, kjer je zamrežen encim zadržal 100 % aktivnost po 6 h kontinuirnega procesa, po tem se pa aktivnost začela zniževati in je po 10 h znašala 52 % prvotne aktivnosti. Po drugi strani je pa prost encim pokazal, da po 6 h obdrži le manj kot 20 % izhodne aktivnosti. Rezultati toplotne stabilnosti kažejo, da ima zamrežena γ-laktamaza potencial za nadaljnji razvoj, zlasti v biotransformacijah, kjer je višja temperatura lahko koristna pri povečanju topnosti substrata in hitrosti reakcije.¹²

Slika 10: Prikaz zadrževanja encimske aktivnosti v odvisnosti od časa reakcije za prost encim (odprti krogci) in zamreženi encimski agregat (polni krogci). Pri procesu je uporabljena encimska raztopina (+)-γ-laktamaze. Uporabljenih je bilo več substratov,

pri čemer je (+/–)-γ-laktam pokazal najboljšo konverzijo. Za preverjanje aktivnosti imobiliziranega encima je izvedena pretvorba benzamida do benzojske kisline.¹²

33

9 Zaključek

Imobilizirani encimi so pokazali številne prednosti, saj ohranijo svojo katalitsko aktivnost in so v primerjavi s prostimi encimi odpornejši na okoljske spremembe. Izbira primerne imobilizacijske tehnike je odvisna od encima ter njegove uporabe.

Ena izmed prednosti zamreženih encimskih agregatov je njihova priprava, kjer se uporabljata dovolj poceni in dostopni tehniki: obarjanje in zamreževanje. Pri pripravi je potrebno prilagoditi obarjalno in zamreževalno sredstvo vsakemu encimu posebej, saj so nekateri encimi siromašni s primarnimi amino skupinami in je v takšnih primerih potrebna obogatitev/modifikacija prostega encima.

Poleg obarjalnega in zamreževalnega sredstva so pozitiven učinek pri pripravi CLEA delcev imeli aditivi (dodatki), pri čemer je eden izmed takšnih goveji serumski albumin.

CLEA delci favorizirajo nevtralne ali rahlo bazične pH vrednosti obratovanja, ki je posledica interakcij zamreževalnega sredstva in primarnih amino skupin na površini encima.

Z velikostjo zamreženih encimskih agregatov se vpliva na dostop za substrat, ki je povezan z omejitvami pri prenosu snovi. Iz tega razloga stremimo k pridobitvi čim manjših delcev, saj se na ta način izboljšajo njihove katalitske lastnosti in zadržano aktivnost.

Uporaba magnetnih nosilcev pri pripravi CLEA delcev zagotavlja mehansko stabilnost in omogoča lažjo separacijo iz reakcijske zmesi. Kombinirani CLEA delci so pokazali idealno uporabo za katalizo encimskih kaskadnih procesov, njihova uporaba pa lahko znatno zmanjša obratovalne stroške.

Uporaba CLEA delcev je bila široko raziskana v različnih panogah. Z izbiro optimalnih temperatur obratovanja so vsi imobilizirani encimi pokazali visoke konverzije substratov, prav tako pa je bil ugoden vpliv na hitrost kemijske reakcije ter daljše zadržanje prvotne aktivnosti. Dobro katalitsko stabilnost in aktivnost so ti encimi pokazali tudi ob večkratni uporabi.

Mikropretočne naprave ponujajo številne prednosti v primerjavi s konvencionalnimi reaktorji. Ena izmed takšnih prednosti je nadzor in integracija več procesov za izvedbo v eni napravi. Tako je izvedena primerjava imobiliziranega in prostega encima za sintezo

34

farmacevtskih učinkovin, kjer je imobiliziran encim v obliki CLEA delcev izkazal boljše zadržanje encimske aktivnosti med procesom kot prost.

Ugotovitve raziskav obetajo uporabo zamreženih encimskih agregatov kot biokatalizatorjev v industrijskih procesih, nadaljnje študije ter iskanje novih aditivov pa naj bi omogočili izboljšanje stabilnosti CLEA delcev in boljših, okolju prijaznejših zamreževalnih sredstev.