Tvorba CLEA delcev v mikrokanalu ni kompleksen proces, poleg tega pa ima številne prednosti. Raztopina encima se enostavno naloži v mikrokanal, pri čemer se dodajata zamreževalno kot tudi obarjalno sredstvo. Takšen sistem se lahko uporablja dlje časa (več kot 40 dni) in kaže odlično stabilnost proti organskim topilom. Težave se pojavljajo pri kislih encimih, ki nimajo dovolj amino skupin na svoji površini. Kot je že omenjeno, se v ta namen lahko doda polilizin, da bi se povečala učinkovitost zamreženja.15, 18
31
Izkazalo se je, da je na ta način uspešna imobilizacija skoraj vseh encimov, tudi precej kislih.18
V mikropretočnem reaktorju je preverjeno zadrževanje encimske aktivnosti pri optimalni temperaturi sintetiziranja karbocikličnih nukleozidov za prost in zamrežen encim. To je razvidno iz slike 10, kjer je zamrežen encim zadržal 100 % aktivnost po 6 h kontinuirnega procesa, po tem se pa aktivnost začela zniževati in je po 10 h znašala 52 % prvotne aktivnosti. Po drugi strani je pa prost encim pokazal, da po 6 h obdrži le manj kot 20 % izhodne aktivnosti. Rezultati toplotne stabilnosti kažejo, da ima zamrežena γ-laktamaza potencial za nadaljnji razvoj, zlasti v biotransformacijah, kjer je višja temperatura lahko koristna pri povečanju topnosti substrata in hitrosti reakcije.12
Slika 10: Prikaz zadrževanja encimske aktivnosti v odvisnosti od časa reakcije za prost encim (odprti krogci) in zamreženi encimski agregat (polni krogci). Pri procesu je uporabljena encimska raztopina (+)-γ-laktamaze. Uporabljenih je bilo več substratov,
pri čemer je (+/–)-γ-laktam pokazal najboljšo konverzijo. Za preverjanje aktivnosti imobiliziranega encima je izvedena pretvorba benzamida do benzojske kisline.12
33
9 Zaključek
Imobilizirani encimi so pokazali številne prednosti, saj ohranijo svojo katalitsko aktivnost in so v primerjavi s prostimi encimi odpornejši na okoljske spremembe. Izbira primerne imobilizacijske tehnike je odvisna od encima ter njegove uporabe.
Ena izmed prednosti zamreženih encimskih agregatov je njihova priprava, kjer se uporabljata dovolj poceni in dostopni tehniki: obarjanje in zamreževanje. Pri pripravi je potrebno prilagoditi obarjalno in zamreževalno sredstvo vsakemu encimu posebej, saj so nekateri encimi siromašni s primarnimi amino skupinami in je v takšnih primerih potrebna obogatitev/modifikacija prostega encima.
Poleg obarjalnega in zamreževalnega sredstva so pozitiven učinek pri pripravi CLEA delcev imeli aditivi (dodatki), pri čemer je eden izmed takšnih goveji serumski albumin.
CLEA delci favorizirajo nevtralne ali rahlo bazične pH vrednosti obratovanja, ki je posledica interakcij zamreževalnega sredstva in primarnih amino skupin na površini encima.
Z velikostjo zamreženih encimskih agregatov se vpliva na dostop za substrat, ki je povezan z omejitvami pri prenosu snovi. Iz tega razloga stremimo k pridobitvi čim manjših delcev, saj se na ta način izboljšajo njihove katalitske lastnosti in zadržano aktivnost.
Uporaba magnetnih nosilcev pri pripravi CLEA delcev zagotavlja mehansko stabilnost in omogoča lažjo separacijo iz reakcijske zmesi. Kombinirani CLEA delci so pokazali idealno uporabo za katalizo encimskih kaskadnih procesov, njihova uporaba pa lahko znatno zmanjša obratovalne stroške.
Uporaba CLEA delcev je bila široko raziskana v različnih panogah. Z izbiro optimalnih temperatur obratovanja so vsi imobilizirani encimi pokazali visoke konverzije substratov, prav tako pa je bil ugoden vpliv na hitrost kemijske reakcije ter daljše zadržanje prvotne aktivnosti. Dobro katalitsko stabilnost in aktivnost so ti encimi pokazali tudi ob večkratni uporabi.
Mikropretočne naprave ponujajo številne prednosti v primerjavi s konvencionalnimi reaktorji. Ena izmed takšnih prednosti je nadzor in integracija več procesov za izvedbo v eni napravi. Tako je izvedena primerjava imobiliziranega in prostega encima za sintezo
34
farmacevtskih učinkovin, kjer je imobiliziran encim v obliki CLEA delcev izkazal boljše zadržanje encimske aktivnosti med procesom kot prost.
Ugotovitve raziskav obetajo uporabo zamreženih encimskih agregatov kot biokatalizatorjev v industrijskih procesih, nadaljnje študije ter iskanje novih aditivov pa naj bi omogočili izboljšanje stabilnosti CLEA delcev in boljših, okolju prijaznejših zamreževalnih sredstev.
35
10 Literatura
[1] H. Yamaguchi, Y. Kiyota, M. Miyazaki: Techniques for Preparation of Cross-Linked Enzyme Aggregates and Their Applications in Bioconversions. Catalysts 2018, 1–12.
[2] R. Noori, M. Perwez, M. Sardar: Cross-Linked Enzyme Aggregates: Current Developments and Applications. Biocatal. Enzym. Basics Appl. 2019, 83–112.
[3] L. Cao, F. Van Rantwijk, R. A. Sheldon: Cross-Linked Enzyme Aggregates: A Simple and Effective Method for the Immobilization of Penicillin Acylase. Org.
Lett. 2000, 2, 1361–1364.
[4] S. Velasco-Lozano, F. López-Gallego, J. C. Mateos-Díaz, E. Favela-Torres: Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEA) in Enzyme Improvement – a Review.
Biocatalysis 2016, 1, 166–177.
[5] R. A. Sheldon, S. Van Pelt: Enzyme Immobilisation in Biocatalysis: Why, What and How †. Chem. Soc. Rev 2013, 42, 6223.
[6] L. Cao, L. Van Langen, R. A. Sheldon Ãyz: Immobilised Enzymes: Carrier-Bound or Carrier-Free? This Review Comes from a Themed Issue on Protein Technologies and Commercial Enzymes Edited by Gjalt Huisman and Stephen Sligar. Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 387–394.
[7] M. Amaral-Fonseca, W. Kopp, R. De Lima, C. Giordano, R. Fernández-Lafuente, P. W. Tardioli: Preparation of Magnetic Cross-Linked Amyloglucosidase Aggregates: Solving Some Activity Problems. Catalysts 2018, 8, 1–4.
[8] R. A. Sheldon: CLEAs, Combi-CLEAs and “Smart” Magnetic CLEAs:
Biocatalysis in a Bio-Based Economy. Catalysts 2019, 9, 1–20.
[9] R. A. Sheldon: Characteristic Features and Biotechnological Applications of Cross-Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011, 92, 467–477.
[10] S. Talekar, S., Joshi, A., Joshi, G., Kamat, P., Haripurkar, R., & Kambale:
Parameters in Preparation and Characterization of Cross Linked Enzyme Aggregates (CLEAs). RSC Adv. 2014, 4, 1–75.
[11] M.-Q. Xu, S.-S. Wang, L.-N. Li, J. Gao, Y.-W. Zhang: Combined Cross-Linked Enzyme Aggregates as Biocatalysts. Catalysts 2018, 1–14.
[12] A. M. Hickey, B. Ngamsom, C. Wiles, G. M. Greenway, P. Watts, J. A. Littlechild:
A Microreactor for the Study of Biotransformations by a Cross-Linked γ-Lactamase Enzyme. Biotechnol. J. 2009, 4, 510–516.
[13] R. Arshad, S. Farooq, N. Iqbal, S. S. Ali: Mutagenic Effect of Acridine Orange on
36
the Expression of Penicillin G Acylase and B-Lactamase in Escherichia Coli. Lett.
Appl. Microbiol. 2006, 42, 94–101.
[14] J. S. Hero, C. M. Romero, J. H. Pisa, N. I. Perotti, C. Olivaro, M. A. Martinez:
Designing Cross-Linked Xylanase Aggregates for Bioconversion of Agroindustrial Waste Biomass towards Potential Production of Nutraceuticals. Int.
J. Biol. Macromol. 2018, 111, 229–236.
[15] Y. Asanomi, H. Yamaguchi, M. Miyazaki, H. Maeda: Molecules Enzyme-Immobilized Microfluidic Process Reactors. Molecules 2011, 16, 6041–6059.
[16] A. M. Hickey, L. Marle, T. McCreedy, P. Watts, G. M. Greenway, J. A. Littlechild:
Immobilization of Thermophilic Enzymes in Miniaturized Flow Reactors.
Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 1621–1623.
[17] P. Žnidaršič-Plazl: Biocatalytic Process Intensification via Efficient Biocatalyst Immobilization, Miniaturization, and Process Integration. Curr. Opin. Green Sustain. Chem. 2021, 32, 100546.
[18] P. Žnidaršič-Plazl: The Promises and the Challenges of Biotransformations in Microflow. Biotechnol. J. 2019, 14, 1800580.
[19] M. Miyazaki, T. Honda, H. Yamaguchi, M. Portia, P. Briones, H. Maeda:
Enzymatic Processing in Microfluidic Reactors. Biotechnol. Genet. Eng. Rev.
2008, 25, 405–428.
[20] H. Yamaguchi, M. Miyazaki, Y. Asanomi, H. Maeda: Poly-Lysine Supported Cross-Linked Enzyme Aggregates with Efficient Enzymatic Activity and High Operational Stability. Catal. Sci. Technol. 2011, 1, 1256–1261.