Legenda
Slika A prikazuje nepoškodovano jedro kontrolne celice, slike B, C in D prikazujejo različno poškodovana jedra celic, pobarvano z etidijevim bromidom, 400 povečava.
7.2.2.4 Določanje neplanirane sinteze DNK
Za določanje genotoksičnega potenciala in vivo so v preteklosti uporabljali neplanirano sintezo DNK v jetrnih celicah izpostavljenih podgan. To metodo so uporabljali kot potrditev rezultatov in vitro študij genskih mutacij v sesalskih celicah. V primeru, da je testna snov povzročila poškodbe DNK je prišlo do popravljanja le-teh, kar je bilo moč zaznati zaradi vgrajevanja s tritijem označenega timina v genom jetrnih celic.
Na podlagi pozitivnega rezultata ali rezultatov študij genotoksičnosti in vivo zaključimo, da je snov genotoksična in vivo, v kolikor so rezultati študij in vivo negativni pa, da snov ni genotoksična in vivo. V kolikor so rezultati študij nejasni, je potrebno študijo ponoviti. V primeru nasprotujočih si rezultatov študij, ki so narejene s primernimi odmerki, v skladu s smernicami OECD zaključimo, da genotoksičnega potenciala snovi ne moremo popolnoma izključiti in jo obravnavamo kot genotoksično in vivo.
121
7.2.2.5 Določanje genotoksičnosti v zarodnih celicah
Določanje genotoksičnega delovanja v zarodnih celic pravzaprav ni potrebno. Snov, ki v telesnih celicah organizma deluje genotoksično, zelo verjetno pride tudi do zarodnih celic in tako sklepamo, da deluje tudi nanje genotoksično ter je potencialno nevarna za sledeče genaracije. Velja tudi nasprotno, da snov, ki ni genotoksična v somatskih celicah, tudi ni genotoksična v zarodnih celicah, saj zaenkrat ne poznamo nobene snovi, ki bi bila specifično mutagena za zarodne celice (EFSA, 2011).
Seveda pa obstajajo tudi metode za določanje genotoksičnega delovanja na zarodne celice v organizmih. Določamo lahko ali preiskovana snov povzroča prelome kromosomov spermatogonijskih celic ali spermatocitov in deluje klastogeno, ali pa spremeni število kromosomov spermatogonijev in spermatocitov ter tako deluje anevgeno. Omenjena učinka opazujemo z analizo celic v metafazi ali z določanjem števila nastalih mikrojeder, dominantnim letalnim testom in s transgenimi živalmi (COM, 2000).
7.2.3 Interpretacija rezultatov študij genotoksičnosti
Pri interpretaciji rezultatov študij genotoksičnosti moramo upoštevati sledeče (ECHA, 2014a):
- ali je učinek odvisen od odmerka,
- ali so bile uporabljene dovolj visoke koncentracije testne snovi; kar pri in vitro študijah pomeni, da so opazili določeno mero citotoksičnosti, ali je odmerek omejen s topnostjo testne snovi, v in vivo študijah pa dokaze o izpostavljenosti opazovanega tkiva,
- ali je bil uporabljen primeren test, glede pričakovanega vpliva na DNK,
- ali je bilo v študijo vključeno zadostno število odmerkov testne snovi, živali, ponovitev in pregledano dovolj celic,
- pri in vitro študijah je pomembno, ali je potekel metabolizem testne snovi in je bil pravilno uporabljen učinkovit zunanji metabolni sistem,
- pri in vivo študijah je potrebno vedeti, ali je bilo vzorčenje tkiva ustrezno izvedeno, ob primernem času, da bi lahko zaznali morebitni učinek.
Lahko se zgodi, da opravljeni indikatorski testi kažejo, da snov reagira z DNK (vezava ali poškodbe DNK, vpliv na popravljanje DNK, izmenjava sestrskih kromatid), teh učinkov pa ne zaznamo v pravilno izvedenih študijah genotoksičnosti in vitro in in vivo. V takem primeru imajo rezultati in vitro oz. in vivo študij večjo težo. V kolikor so rezultati študij in vitro pozitivni, in vivo pa negativni, zaključimo o genotoksičnosti za ljudi na podlagi rezultatov študij in vivo, pri čemer je potrebno oceniti ali je bilo za študijo uporabljeno primerno tkivo in ali je prišlo do izpostavljenosti tega tkiva.
Pri določanju genotoksičnega potenciala snovi moramo vedno upoštevati težo dokazov. Potrebno je upoštevati (EFSA, 2011; ECHA, 2014a):
- kakovost in zanesljivost podatkov o genotoksičnem delovanju, - ponovljivost rezultatov,
- upoštevati tudi druge podatke, kot so fizikalno kemijske lastnosti snovi, povezava med strukturo in delovanjem (vključno s strukturnimi opozorili in navzkrižnim branjem rezultatov študij s kemijsko
122
podobnimi snovmi), biološka razpoložljivost, toksikokinetika in metabolizem ter opažanja v toksikoloških študijah s ponavljajočo izpostavljenostjo in študijah rakotvornosti.
7.2.4 Razvrščanje in označevanje kemikalij glede na genotoksični potencial
Na osnovi rezultatov študij genotoksičnosti in vitro in in vivo snov razvrstimo v razred nevarnosti v skladu s kriteriji Uredbe 1272/2009 o razvrščanju in označevanju snovi in zmesi (Uredba 1272/2008).
Ločimo sledeče kategorije mutagenosti za zarodne celice:
- kategorija 1: snovi, ki povzročajo dedne mutacije ali se obravnavajo kot povzročitelji dednih mutacij v zarodnih celicah ljudi.
- kategorija 1A: razvrstitev v kategorijo 1A temelji na pozitivnem dokazu epidemioloških študij na ljudeh. Snovi, ki se obravnavajo kot povzročitelji dednih mutacij v zarodnih celicah ljudi.
- kategorija 1B: razvrstitev v kategorijo 1B temelji na:
pozitivnih rezultatih testov mutagenosti dednih zarodnih celic na sesalcih in vivo ali
pozitivnih rezultatih testov mutagenosti somatskih celic na sesalcih in vivo v povezavi z nekaterimi dokazi, da lahko snov povzroči mutacije zarodnih celic. Ti podporni dokazi lahko izhajajo iz testov mutagenosti/genotoksičnosti zarodnih celic in vivo ali s prikazom zmožnosti snovi ali njenega(-ih) metabolita(-ov), da medsebojno vpliva(-jo) na genski material zarodnih celic ali
pozitivni rezultati testov, ki kažejo mutagene učinke v zarodnih celicah ljudi, brez prikaza prenosa na potomce; na primer pogostejša aneuploidija v moških spolnih celicah izpostavljenih oseb.
- kategorija 2: snovi, ki vzbujajo skrb zaradi morebitnega povzročanja dednih mutacij v zarodnih celicah ljudi. Razvrstitev v kategorijo 2 temelji na:
pozitivnih dokazih testov na sesalcih in/ali v nekaterih primerih poskusov in vitro,
testov mutagenosti somatskih celic na sesalcih in vivo ali
drugih testov genotoksičnosti somatskih celic in vivo, ki jih podpirajo pozitivni rezultati testov mutagenosti in vitro.
Opomba: Snovi, ki so pozitivne pri testih mutagenosti na sesalcih in vitro, in ki kažejo tudi razmerje med kemijsko strukturo in aktivnostjo opaženo pri znanih mutagenih snoveh za zarodne celice, se obravnavajo pri razvrstitvi kot mutagene snovi kategorije 2.
7.3 KO NIMAMO ŠTUDIJ GENOTOKSIČNOSTI
Za številne kemikalije nimamo podatkov o njihovem genotoksičnem potencialu.
Leta 1991 sta Ashby in Tennant (1991) objavila članek o primerjavi med strukturo snovi ter njenim mutagenim in rakotvornim delovanjem. V raziskavi sta preučila 301 kemikalijo in določila kemijske skupine, ki jih lahko povežemo z genotoksičnim delovanjem snovi, t.im. strukturna opozorila. To so alkilni estri fosfonske ali sulfonske kisline (a), aromatske nitro skupine (b), aromatske azo skupine (c),
123
aromatski obroč N-oksidov (d), aromatske mono- in dialkil amino skupine (e), alkilhidrazini (f), alkilaldehidi (g), derivati N-metilola (h), monohaloalkeni (i), N-kloroetil)i- in S-kloroetil (j), N-kloramini (k), propiolaktoni in propiosulfoni (l), artomatski in alifatski aziridinil derivati (m), aromatski in alifatski substituirani alikilhalidi(n), uretanski derivati (karbamati) (o), alikil-N-nitrozamini (p), aromatski amini in njihovi N-hidroksi derivati (q), alifatski in aromatski epoksidi (r) (Slika 7.4).