METODE DELA

V vseh vzorcih tal smo analizirali skupno vsebnost elementov z rentgenskim fluorescenčnim spektrometrom (XRF), izbrane elemente (Pb, Zn, Cu, As) smo določili tudi po razklopu tal z zlatotopko za vrednotenje kakovosti tal glede na Uredbo o mejnih, opozorilnih in kritičnih vrednostih nevarnih snovi v tleh (1996). V vzorcih iz površine tal smo določili tudi biodosegljiv del PTE za človeka (in vitro metoda). V vzorcih tal smo v pedološkem laboratoriju izvedli tudi meritve osnovnih talnih lastnosti: pH, delež organske snovi in kalcijevega karbonata ter rastlinska hranila (dostopni fosfor in kalij). Podatke smo statistično obdelali in vrednotili vsebnost PTE glede na zakonodajo (Uredba o mejnih …, 1996).

3.2.1 Priprava vzorcev

Združene vzorce in podvzorce tal smo posušili v sušilniku pri temperaturi 40 ℃. Suhe vzorce smo nekoliko zdrobili in opravili meritve vsebnosti elementov z nedestruktivno metodo XRF. Nato smo vzorce združili, homogenizirali, dodatno zdrobili v terilnici in jih presejali skozi dvomilimetrsko sito (ISO 11464, 2006). Za določene metodo smo morali vzorce ponovno zdrobiti v manjše frakcije ter jih presejati skozi sita. Za metodo in vitro biodosegljivosti smo vzorce presejali skozi 200 µm sito (USEPA, 2007) ter za metodo kislinskega razklopa z zlatotopko skozi 160 µm sito (ISO 11466, 1996). Vse analize so potekale v Infrastrukturnem centru za pedologijo in varstvo okolja (ICPVO), razen razklop z zlatotopko ter določitev koncentracije Pb, Zn, As, Cd, saj smo vzorce poslali v akreditiran laboratorij Bureau Veritas Commodities Canada Ltd. v Vancouver.

3.2.2 Merjenje karbonatov

Vsebnost karbonatov (CaCO3) smo merili po SIST ISO 10693 (2014) na aparatu za določevanje karbonatov v tleh po Scheiblerju.

3.2.3 Merjenje pH tal

Vrednost pH tal smo merili po metodologiji standarda ISO 10390 (2006) z elektrometrično meritvijo aktivnosti H+ ionov v suspenziji tal z raztopino 0,01 M kalcijevega klorida (CaCl2).

3.2.4 Merjenje ogljika in dušika

Vsebnost organske snovi smo določili po postopku SIST ISO 10694 (1996). Skupni ogljik smo izmerili na Elementar Vario MAX-napravi po principu suhega sežiga (SIST ISO 10694, 1996). Organski ogljik smo izračunali po sledeči formuli:

Organski ogljik (%) = Skupni ogljik (%) – (0,12 x kalcijev karbonat (%)) … (1)

Ker je organska snov sestavljena iz 58 % ogljika (C), moramo organski ogljik pomnožiti s koeficientom 1,724, da dobimo delež organske snovi:

Talna organska snov ali humus = Corg x 1,724 … (2) Razmerje Corg/N dobimo iz podatka o organskem ogljiku (Corg) ter dušiku. Podatek o deležu dušika v vzorcu smo pridobili po principu suhega sežiga (SIST ISO 13878, 1999).

3.2.5 Merjenje fosforja in kalija

Vsebnosti rastlinam dostopnega kalija (K2O) in fosforja (P2O5) smo določili z ekstrakcijo z amon-laktat raztopino po metodi, določeni s standardom ӦNORM L 1087 (1993). Vsebnosti fosforja smo merili sprektrofotometrično z uporabo aparata Gallary Automated Photometric Analyzer (Thermo Scientific, ZDA), vsebnosti kalija pa z atomsko absorpcijsko spektrometrijo (AAS, Varian AA240FS).

3.2.6 Merjenje potencialno toksičnih elementov (PTE)

Za meritev PTE v tleh smo vzorce poslali v Kanado podjetju Bureau Veritas Commodities Canada Ltd., Vancouver. Naredili so razklop z zlatotopko po ISO 11466 (1996) in meritev z induktivno sklopljeno plazmo z masnim detektorjem po ISO 17294-2 (2017).

Koncentracije PTE vrednotimo po Uredbi o mejnih, opozorilnih in kritičnih vrednostih nevarnih snovi v tleh (1996).

Vsebnost PTE v tleh smo merili tudi z uporabo rentgenske fluorescenčne spektrometrije (XRF), kjer z nedestruktivno metodo določimo primerljivo vsebnost elementov na hitrejši in cenejši način. Caporale in sod. (2018) trdijo, da obstaja korelacija med nekaterimi elementi, merjenimi v tleh z XRF-aparatom in zlatotopko, kar omogoča cenejšo in hitrejšo merjenje z več ponovitvami. XRF-metoda rentgenske fluorescence deluje na osnovi X-žarkov (SIST EN ISO 13196, 2015). Sprva smo izvedli kalibracijo oziroma umeritev, ki je potekala 90 sekund. Nato smo analizirali referenčni vzorec, ki je bil analiziran tudi z metodo zlatotopke, za dodatno kontrolo meritev (natančnost in točnost). Vzorci so bili analizirani v intervalu 60 sekund. Podatke pridobljene z XFR meritvami so primerjali z rezultati analiz po razklopu z zlatotopko. Meritve z XRF aparatom ne moremo direktno vrednotiti z vrednostmi, ki so opredeljene v Uredbi o mejnih, opozorilnih in kritičnih imisijskih vrednostih nevarnih snovi v tleh (1996), kjer je predpisana metoda razkroja vzorca z zlatotopko.

3.2.7 Merjenje biodosegljive frakcije PTE

Biodosegljivost PTE (svinca, cinka, arzena in kadmija) v talnih vzorcih smo merili po opravljenem in vitro postopku (USEPA, 2007), ki predstavlja želodčno fazo človeka. Ta metoda za »in vitro« določanje biodostopnosti PTE v tleh upošteva zgolj fiziološko relevanten pH v želodcu in uporablja glicinski pufer kot ekstrakcijski medij. Vsebnost biodosegljivih PTE smo izmerili z atomsko absorpcijsko spektrometrijo (AAS) z uporabo aparata Varian AA240FS (Pb, Zn, Cd) ter aparata Agilent 240Z AA (As).

V procesu pridobivanja podatkov o biodosegljivi frakciji PTE v vzorcu je postopek potekal v naslednjem vrstnem redu:

Priprava reagenta

Za štiri vzorce in tri ponovitve smo pripravili 0,5 l reagenta. V 500-mililtrsko čašo smo natehtali 15,015 g glicina ter dodali 0,4 l deionizirane vode, segrete na 37 °C. Raztopino smo prelili v 500 ml stekleno bučko ter dopolnili z deionizirano vodo do vrha. Čašo smo postavili na magnetno mešalo ter dodajali HCl po kapljicah, tako da smo uravnali pH na 1,5 ± 0,5 pri 37 °C.

Priprava vzorca

Vzorec smo zdrobili s terilnico, presejali skozi 200 µm sito in s tehtnico natehtali maso vzorca (0,4 ± 0,0005 g). Zapisali smo si maso vzorcev, saj pozneje potrebujemo podatek o masi vzorca pri izračunu in vitro biodosegljivosti (IVBA).

Simulacija prebave in ekstrahiranje

V vsako UBM-stekleničko smo dodali 40 ml glicinskega pufra ter stehtan vzorec. Za nekaj sekund smo stekleničko ročno stresali, nato jo položili v kopel na 37 °C za eno uro. Po končani ekstrakciji smo vzorce položili na stojalo ter počakali, da se zemlja posede na dno stekleničke. Izmerili in zapisali smo si pH, ki je moral biti med 1 in 2. Če je bila vrednost pH med 1 in 2, smo lahko nadaljevali proces, sicer smo morali vzorce zavreči in ponoviti postopek. Raztopino z zemljo smo filtrirali čez 0,45 μm celulozno acetatne filtre. Vzorcem smo dodali 0,5 ml 65 % dušikove kisline (HNO3) za stabilizacijo vzorca. Vzorce smo hranili v hladilniku do nadaljnje analize biodosegljive frakcije PTE.

Meritev biodosegljive frakcije elementov in izračun in vitro biodosegljivosti

Po merjenju biodosegljive frakcije PTE v treh ponovitvah smo z uporabo enačbe, ki sestavlja maso vzorca, volumen reagenta (Vekstrakt), začetna koncentracijo PTE po razklopu z zlatotopko (PTEzemlja) ter vsebnost biodosegljivih PTE v reagentu (PTEekstrakt) izračunali IVBA (%) ter pozneje RBA (%) in ABA (%). Deleže RBA in ABA smo računali samo pri svincu.

IVBA (%) = ((PTEekstrakt * Vekstrakt) / (PTEzemlja * masa vzorca))*100 ... (3) IVBA predstavlja potencialni delež in vitro biodosegljive frakcije PTE.

RBASvinec (%) = 0,878 * IVBASvinec (%) – 0,028 (USEPA, 2017) … (4) RBA predstavlja dejansko (relativno) biodostopnost PTE. RBA-linearna premica predstavlja linearno regresijo s korelacijo rezultatov in vivo postopkov na mladih svinjah, opicah, miših itn. (Gluhar in Kaurin, 2019).

ABASvinec (%) = RBASvinec * 0,50 … (5) ABA predstavlja absolutno biodostopnost PTE in nam pove delež absorpcije svinca v telo iz tal. Iz tal v organizem preide polovica celotne relativne biodostopne frakcije, zato imajo tla koeficient 0,5.

Rezultate nato vnesemo v program IEUBK-model, ki s pomočjo ostalih parametrov napoveduje, kolikšna naj bi bila dejanska koncentracija svinca v krvi otroka, ki živi v onesnaženem okolju.

3.2.8 Statistična analiza

Dobljene rezultate smo statistično in grafično obdelali z računalniškim programom Microsoft Excel Office, 2016.