Izbira ustreznega rastlinskega promotorja je pomemben način za povečanje izražanja eksogenega gena v rastlini. Trenutno se pri genskem inženiringu rastlin večinoma uporabljajo močni konstitutivni promotorji, npr. CaMV 35S promotor za dvokaličnice, aktinski promotor riža (ACT1) in ubikvitinski promotor koruze (Ubi-1) za enokaličnice. Konstitutivni promotorji navadno povzročijo konstantno in neprekinjeno izražanje tarčnih genov v tkivih rastlin, kar vodi v čezmerno porabo energije in produktov v celici. Konstitutivna ekspresija lahko zato vodi do nezmožnosti učinkovite regulacije izražanja tarčnih genov, tako v časovnem kot v prostorskem smislu. To lahko zmoti notranje metabolno ravnovesje rastline, kar ni ugodno za povečanje količine in izboljšanje kakovosti ekspresije tarčnih genov v transgeni rastlini. Za povečanje pridobivanja cepiv ali drugih medicinsko pomembnih proteinov bi se morali eksogeni geni izražati samo ob določenem času ali v določenih obdobjih in samo v določenih tkivih oz. organih, namesto v celotni rastlini. To se lahko doseže z uporabo inducibilnih ali tkivno-specifičnih promotorjev (Guan in sod., 2013).
5.2 OPTIMIZACIJA KODONOV
Povečanje izražanja tujih genov v transgenih rastlinah se lahko doseže z optimizacijo kodonov. Pri tem pristopu se kodone tujega gena preuči in zamenja s kompatibilnimi kodoni
15
gostiteljske rastline, saj se rastline, živali in mikrobi razlikujejo po vrstno specifičnih kodonih (Shahid in Daniell, 2016). V več raziskavah je bilo dokazano, da se z optimizacijo kodonov lahko občutno izboljša nivo izražanja tujih genov (Guan in sod., 2013), tudi v primeru izražanja antigenov za cepiva, kot je npr. toplotno labilna B podenota enterotoksina E. coli (LT-B). Akumulacija LT-B se je v gomoljih krompirja povečala od 5 do 40-krat ob uporabi gena z optimiziranimi kodoni v primerjavi z nemodificiranim LT-B genom (Mason in sod., 1998).
5.3 UPORABA SIGNALNIH PEPTIDOV
Znotrajcelično okolje, v katerem se rekombinantni protein akumulira, vpliva na njegovo zvijanje in post-translacijske modifikacije. Faktorji, kot je pH in prisotnost šaperonov ali proteaz, lahko vplivajo na stabilnost antigena in s tem na njegovo akumulacijo (Joensuu in sod., 2008). Z uporabo različnih signalnih peptidov lahko protein usmerimo v določen celični del oz. organel.
Endoplazemski retikulum (ER) v rastlinskih celicah eksogeni protein stabilizira in mu nudi relativno stabilno okolje za dozorevanje (Guan in sod., 2013). Okolje je oksidativno, prisotnih pa je veliko molekulskih šaperonov in zelo malo proteaz (Joensuu in sod., 2008). Dodatek ER-retencijskega signala na C-konec, ki protein zadrži v endoplazemskem retikulumu, lahko zato poveča akumulacijo rekombinantnih proteinov v transgenih rastlinah (Guan in sod., 2013). N-terminalni signalni peptid lahko rekombinantne proteine usmeri v sekrecijo. Izločeni proteini so z ER navadno transportirani skozi Golgijev aparat do apoplasta, če pa je prisoten ustrezen signal, so usmerjeni v vakuolo. Proteini se lahko v apoplastu ohranijo v matriksu celične stene ali pa se izločijo iz celice, odvisno od velikosti in strukture proteina. Primerjalna analiza rekombinantnih protiteles je pokazala, da se le-ta akumulirajo bolj učinkovito, če so usmerjena v sekrecijo, kakor pa če so usmerjena v citoplazmo, ki za proteine predstavlja manj ugodno okolje (Schillberg in sod., 1999). Enako je bilo dokazano za antigene cepiv.
Streatfield in sod. (2003) so proučevali znotrajcelično usmerjanje LT-B proteina v semenih koruze. Pri usmeritvi rekombinantnih proteinov v apoplast in vakuolo je bil nivo izražanja 3080-krat in 20 000-krat višji v primerjavi z usmeritvijo v citoplazmo. Rekombinantne proteine se lahko usmeri tudi v organele, kot so mitohondriji in plastidi, z dodatkom N-terminalnih tranzitnih peptidov, ki jih prepozna transportni sistem organelov in proteine transportira v organele (Joensuu in sod., 2008).
5.4 UPORABA FUZIJSKIH PROTEINOV
Fuzijski peptidi ali celotni proteini lahko izboljšajo stabilnost izbranega antigena v rastlinskih tkivih in med samim vnosom cepiva. Ta pristop se pogosto uporablja za peptide, proizvedene z viralnim ekspresijskim sistemom, uporablja pa se tudi za optimizacijo izražanja antigena pri stabilno transformiranih rastlinah. Primeri fuzijskih partnerjev za antigene cepiv so zeleni fluorescenčni protein (GFP), β-glukuronidaza (GUS) ter podenoti toksina kolere B in
CT-16
A. Fuzija antigena z markerskimi geni omogoča tudi lažjo kontrolo sinteze antigena (Joensuu in sod., 2008).
5.5 UPORABA KLOROPLASTNE TRANSFORMACIJE
Kloroplastna transformacija lahko omogoči sintezo večje količine rekombinantnih proteinov kot jedrna transformacija. Razlog je v večjem številu kopij transgena - ena celica lahko vsebuje do 10 000 kopij plastidnega genoma. Transgene se vgradi v kloroplastni genom s pomočjo specifične integracije in kljub veliki akumulaciji transkriptov še ni bilo zabeleženo utišanje transgenov. Poleg tega kloroplasti predstavljajo omejeno okolje znotraj celice z ugodnejšimi razmerami za proteine, saj se potencialno toksične snovi iz njih izločijo. Slabost kloroplastne transformacije je, da kloroplasti niso zmožni vseh post-translacijskih modifikacij, zato so najbolj primerni za izražanje proteinov, ki ne potrebujejo zapletenega zlaganja ali glikozilacije (Joensuu in sod., 2008). Primerni so torej za izražanje bakterijskih antigenov, manj pa za izražanje glikoproteinov (Guan in sod., 2013). Pri izražanju humanih ali virusnih genov v kloroplastih je lahko nivo izražanja zelo nizek, vendar si lahko pomagamo z optimizacijo kodonov, pri kateri se odstrani redke kodone in uporabi ustreznejše.
S pomočjo kloroplastne transformacije so bile do sedaj uspešno povečane količine različnih antigenov za cepiva, med drugim za cepivo proti antraksu, parvovirusu, rotavirusu in tetanusu (Shahid in Daniell, 2016).
6 POTENCIALNA TVEGANJA IN REŠITVE
Veterinarska cepiva, proizvedena v transgenih rastlinah, bi lahko imela za našo družbo ogromno ekonomskih in socialnih koristi, vendar je z njimi povezanih tudi več potencialnih tveganj, ki se tičejo zdravja živali in širšega okolja.
6.1 VARNOSTNA TVEGANJA
Oralna cepiva, pridobljena s pomočjo transgenih rastlin, bi lahko pri živalih povzročila alergijski odziv ali oralno toleranco. Post-translacijske modifikacije, kot je N-glikozilacija, bi lahko izzvale alergijsko reakcijo, vnos cepiva z adjuvansom (za povečano stimulacijo mukoznega imunskega sistema) pa hipersenzitiven odziv na druge, ne-tarčne proteine, uživane z navadno, vsakodnevno hrano (Guan in sod., 2013). Reden oralni vnos takšnih cepiv lahko okrepi aktivacijo regulatornih T-celic proti antigenu v cepivu, kot npr. pri hiposenzitizacijski terapiji z oralnim vnosom antigena v primerih alergije na cvetni prah ali določeno hrano (Takeyama in sod., 2015).
6.2 OKOLJSKA TVEGANJA
Drugo potencialno tveganje uporabe cepiv, proizvedenih v transgenih rastlinah, je njihov vpliv na okolje. Pri gojenju transgenih rastlin na prostem bi lahko prišlo do kontaminacije
ne-17
transgenih rastlin, namenjenih za prehrano ljudi ali živali. Rekombinantni geni se lahko razširijo na druge rastline preko peloda in s tem se nenamerno povzroči genske modifikacije ne-tarčnih rastlin. Genetsko modificirane rastline bi lahko zaužile divje živali ali pa bi jih po nesreči pobrali ljudje. Transgeni bi se lahko razširili tudi preko žuželk ali izpusta kontaminirane vode v okolje (Takeyama in sod., 2015). S širjenjem transgenov v okolje bi lahko prišlo do porušenja ekološkega ravnovesja, kontaminacije naravnega genskega sklada in nepričakovanih negativnih vplivov na okolje (Guan in sod., 2013), predvsem v primeru, da bi se transgen razširil nad divjim tipom. Vse negativne posledice bi lahko vodile v zmanjšanje naravne biodiverzitete. Verjetnost in resnost posameznih tveganj se razlikuje in je odvisna od rastlinske vrste in antigena, zato morajo biti tveganja preučena za vsak primer posebej (Takeyama in sod., 2015).
6.3 REŠITVE
Številne potencialne negativne učinke na okolje in zdravje živali se lahko z različnimi metodami zmanjša oz. prepreči. Potencialna varnostna tveganja se lahko zmanjša z izbiro ustreznih ekspresijskih platform, ki imajo sposobnost ustreznih post-translacijskih modifikacij in ne producirajo toksinov. Prenosu transgenov v okolje preko peloda se lahko izognemo z uporabo kloroplastne transformacije, kjer se transgen vstavi v kloroplastni genom, kloroplastna DNA pa se deduje maternalno, zato se transgen ne bo nahajal v pelodu (Guan in sod., 2013). Pobiranje listov gensko spremenjene rastline s pomočjo kloroplastne transformacije pred cvetenjem prepreči tudi ''uhajanje'' transgena v okolje preko semen (Shahid in Daniell, 2016). Smiselno je tudi uporabljati rastline, ki imajo možnost vegetativnega razmnoževanja, saj se s tem zmanjša tveganje za križanje z ne-transgenimi rastlinami na prostem (Liew in Hair-Bejo, 2015). Poleg tega se lahko določene rastline za pridobivanje cepiv goji tudi v rastlinjakih in drugih zaprtih prostorih in se s tem zmanjša možnost prenosa genskega materiala na ne-transgene rastline, lahko pa se aktivne komponente za cepiva pridobiva s pomočjo in vitro kultur.
Razvija se tudi nove napredne metode za zmanjšanje potencialnih negativnih vplivov na okolje, kot je npr. tehnika odstranjevanja eksogenega gena. Gre za posebno tehniko, pri kateri se v tarčne transgene rastline vstavi poseben gen pod kontrolo promotorja DNA regulatornega fragmenta. Vstavljeni posebni gen nato spontano odstrani eksogeni gen ob določenem času ali na določenem mestu v rastlini. Tako pelod, plodovi in semena transgenih rastlin ne vsebujejo transgena. S pomočjo te tehnike se lahko iz gensko spremenjenih rastlin po določeni razvojni fazi pridobiva ne-transgene rastline (Guan in sod., 2013).
7 ZAKLJUČEK
Kljub intenzivnim raziskavam, ki potekajo že več kot 20 let, veterinarska cepiva iz transgenih rastlin še vedno niso dosegla trga, vendar novi napredki na tem področju dajejo upanje, da se
18
bo to zgodilo že v bližji prihodnosti. Razvita tehnologija je učinkovita, količine sintetiziranih rekombinantnih proteinov so dovolj velike, stestiranih je bilo že veliko cepiv za zelo različne patogene, obstajajo nove tehnike za povečanje varnosti takšnih cepiv in regulatorni organi so končno pripravljeni sprejeti idejo cepiv, pridobljenih iz transgenih rastlin. Takšna veterinarska cepiva bi predvsem v živinorejski proizvodnji bistveno olajšala proces cepljenja in znižala stroške zaradi enostavnejšega shranjevanja in transporta cepiva, zaradi česar bi bila cepiva dostopnejša. To je še posebej pomembno za države v razvoju, kjer se trenutno živalske bolezni širijo veliko hitreje kot v razvitejših državah ravno zaradi vseh pomanjkljivosti cepiv, ki se trenutno uporabljajo za nadzor nad živalskimi boleznimi. Omejitev širjenja živalskih bolezni bi doprinesla tako k blaginji živalske kot tudi človeške populacije.
8 VIRI
Aguirreburualde M. S. P., Gómez M. C., Ostachuk A., Wolman F., Albanesi G., Pecora A., Odeon A., Ardila F., Escribano J. M., Dus Santos M. J., Wigdorovitz A. 2013. Efficacy of a BVDV subunit vaccine produced in alfalfa transgenic plants. Veterinary Immunology and Immunopathology, 151, 3-4: 315-324
An C. H., Nazki S., Park S. C., Jeong Y. J., Lee J. H., Park S. J., Khatun A., Kim W. I., Park Y. I., Jeong J. C., Kim C. Y. 2018. Plant synthetic GP4 and GP5 proteins from porcine reproductive and respiratory syndrome virus elicit immune responses in pigs. Planta, 247, 1: 973–985
Baltes N. J., Gil-Humanes J., Voytas D. F. 2017. Chapter One - Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science, 149, 1: 1-26
Berinstein A., Vazquez-Rovere C., Asurmendi S., Gómez E., Zanetti F., Zabal O., Tozzini A., Conte Grand D., Taboga O., Calamante G., Barrios H., Hopp E., Carrillo E. 2005. Mucosal and systemic immunization elicited by Newcastle disease virus (NDV) transgenic plants as antigens. Vaccine, 23, 48-49: 5583-5589
Ceballo Y., Lopez A., Tiel K., Hernandez A. 2018. Plant-produced avian influenza antigens.
V: Prospects of Plant-Based Vaccines in Veterinary Medicine. MacDonald J. (ur.).
Springer, Cham: 189-208
Chan H. T., Daniell H. 2015. Plant-made oral vaccines against human infectious diseases - Are we there yet? Plant Biotechnology, 13, 8: 1056-1070
FDA. 2020. Get the Facts About Listeria. U.S. Food and Drug Administration.
https://www.fda.gov/ (20. apr. 2021)
Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Twyman R. M. 2004. Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 2: 152-158
Ganar K., Das M., Sinha S., Kumar S. 2014. Newcastle disease virus: Current status and our understanding. Virus Research, 184, 1: 71-81
19
Guan Z. J., Guo B., Huo Y. L., Guan Z. P., Dai J. K., Wei Y. H. 2013. Recent advances and safety issues of transgenic plant-derived vaccines. Applied Microbiology and Biotechnology, 97, 7: 2817–2840
Hahn B.S., Jeon I. S., Jung Y. J., Kim J. B., Park J. S., Ha S. H., Kim K. H., Kim H. M., Yang J. S., Kim Y. H. 2007. Expression of hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus in transgenic tobacco. Plant Biotechnology Reports, 1, 1: 85–92
Hu J., Ni Y., Dryman B. A., Meng X. J., Zhang C. 2012. Immunogenicity study of plant-made oral subunit vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Vaccine, 30, 12: 2068-2074
Hugh-Jones M. E. 2015. Overview of Anthrax. MSD Veterinary Manual.
https://www.msdvetmanual.com/ (20. apr. 2021)
Jayalakshmi K., Paramasivam M., Sasikala M., Tamilam T. V., Sumithra A. 2017. Review on antibiotic residues in animal products and its impact on environments and human health.
Journal of Entomology and Zoology Studies, 5, 3: 1446-1451
Joensuu J. J., Niklander-Teeri V., Brandle J. E. 2008. Transgenic plants for animal health:
plant-made vaccine antigens for animal infectious disease control. Phytochemistry Reviews, 7, 1: 553–577
Jung M., Shin Y. J., Kim J., Cha S. B., Lee W. J., Shin M. K., Shin S. W., Yang M. S., Jang Y. S., Kwon T. H., Yoo H. S. 2014. Induction of immune responses in mice and pigs by oral administration of classical swine fever virus E2 protein expressed in rice calli.
Archives of Virology, 159, 1: 3219-3230
Kamel M., El-Sayed A., Castañeda Vazquez H. 2019. Foot-and-mouth disease vaccines:
recent updates and future perspectives. Archives of Virology, 164, 1: 1501-1513
Koya V., Moayeri M., Leppla S. H., Daniell H. 2005. Plant-based vaccine: Mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge.
Infection and Immunity, 73, 12: 8266-8274
Kurup V. M., Thomas J. 2020. Edible vaccines: Promises and challenges. Molecular Biotechnology, 62, 2: 79–90
Lee G., Na Y. J., Yang B. G., Choi J. P., Seo Y. B., Hong C. P., Yun C. H., Kim D. H., Sohn E. J., Kim J. H., Sung Y. C., Kim Y. K., Jang M. H., Hwang I. 2014. Oral immunization of haemaggulutinin H5 expressed in plant endoplasmic reticulum with adjuvant saponin protects mice against highly pathogenic avian influenza A virus infection. Plant Biotechnology Journal, 13, 1: 62-72
Lentz E. M., Segretin M. E., Morgenfeld M. M., Wirth S. A., Dus Santos M. J., Mozgovoj M.
V., Wigdorovitz A., Bravo-Almonacid F. F. 2010. High expression level of a foot and mouth disease virus epitope in tobacco transplastomic plants. Planta, 231, 2: 387-395 Liew P. S., Hair-Bejo M. 2015. Farming of plant-based veterinary vaccines and their
applications for disease prevention in animals. Advances in Virology, 2015: 1-12
Loza-Rubio E., Rojas-Anaya E. 2014. Edible rabies vaccines. V: Commercial Plant-Produced Recombinant Protein Products. Howard J., Hood E. (ur.). Berlin, Springer: 153-177
20
Loza-Rubio E., Rojas-Anaya E., Lopez J., Olivera-Flores M.T., Gomez-Lim M., Tapia-Perez G. 2010. Induction of a protective immune response to rabies virus in sheep after oral immunization with transgenic maize, expressing the rabies virus glycoprotein. Vaccine, 30, 37: 5551-5556
Mason H. S., Haq T. A., Clements J. D., Arntzen C. J. 1998. Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene. Vaccine, 16, 13: 1336-1343
Massa S., Paolini F., Marino C., Franconi R., Venuti A. 2019. Bioproduction of a therapeutic vaccine against human papillomavirus in tomato hairy root cultures. Frontiers in Plant Science, 10, 452: 1-15
McGarvey, P., Hammond, J., Dienelt, M., Hooper D. C., Fu Z. F., Dietzschold B., Koprowski H., Michaels F. H. 1995. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes. Nature Biotechnology, 13, 1: 1484–1487
Meyers A. 2018. Diseases with Limited Research of Plant-Based Vaccines. V: Prospects of plant-based vaccines in veterinary medicine. MacDonald J. (ur.). Ontario, Western University: 347–367
Molina A., Hervás-Stubbs S., Daniell H., Mingo-Castel A. M., Veramendi J. 2004. High-yield expression of a viral peptide animal vaccine in transgenic tobacco chloroplasts. Plant Biotechnoly Journal, 2, 2: 141-153
Molina A., Veramendi J., Hervás-Stubbs S. 2005. Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope from canine parvovirus.
Virology, 342, 2: 266-275
Nelson G., Marconi P., Periolo O., La Torre J., Alvarez M. A. 2012. Immunocompetent truncated E2 glycoprotein of bovine viral diarrhea virus (BVDV) expressed in Nicotiana tabacum plants: a candidate antigen for new generation of veterinary vaccines. Vaccine, 30, 30: 4499-4504
Ohya K., Matsumura T., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C. 2005. Ability of orally administered ifn-α-containing transgenic potato extracts to inhibit Listeria monocytogenes infection. Journal of Interferon & Cytokine Research, 25, 8: 459-466 Ortigosa S. M., Fernández-San Millán A., Veramendi J. 2010. Stable production of peptide
antigens in transgenic tobacco chloroplasts by fusion to the p53 tetramerisation domain.
Transgenic Research, 19, 4: 703-709
Phan H. T., Pham V. T., Ho T. T., Pham N. B., Chu H. H., Vu T. H, Abdelwhab E. M., Scheibner D., Mettenleiter T. C., Hanh T. X., Meister A., Gresch U., Conrad U. 2020.
Immunization with plant-derived multimeric H5 hemagglutinins protect chicken against highly pathogenic avian influenza virus H5N1. Vaccines, 8, 4: 593
Polkinghorne I., Hamerli D., Cowan P., Duckworth J. 2005. Plant-based immunocontraceptive control of wildlife—“potentials, limitations, and possums”. Vaccine, 23, 15: 1847-1850
Rao J. P., Agrawal P., Mohammad R., Rao S . K., Reddy G. R., Dechamma H. J., S Suryanarayana V. V. 2012. Expression of VP1 protein of serotype A and O of
foot-and-21
mouth disease virus in transgenic sunnhemp plants and its immunogenicity for guinea pigs.
Acta Virologica, 56, 2: 91-99
Rivera A. L., Gómez-Lim M., Fernández F., Loske A. M. 2012. Physical methods for genetic plant transformation. Physics of Life Reviews, 9, 3: 308-345
Rybicki E. 2018. History and promise of plant-made vaccines for animals. V: Prospects of Plant-Based Vaccines in Veterinary Medicine. 2018. MacDonald J. (ur.). Springer, Cham:
1-22
Schillberg S., Zimmermann S., Voss A., Fischer R. 1999. Apoplastic and cytosolic expression of full-size antibodies and antibody fragments in Nicotiana tabacum. Transgenic Research, 8, 4: 255-623
Shahid N., Daniell H. 2016. Plant‐based oral vaccines against zoonotic and non‐zoonotic diseases. Plant Biotechnology Journal, 14, 11: 2079-2099
Shahid N., Samiullah T. R., Shakoor S., Latif A., Yasmeen A., Azam S., Shahid A. A., Husnain T., Rao A. Q. 2020. Early stage development of a Newcastle disease vaccine candidate in corn. Frontiers in Veterinary Science, 7, 499: 1-12
Shao H. B., He D. M., Qian K. X., Shen G. F., Su Z. L. 2008. The expression of classical swine fever virus structural protein E2 gene in tobacco chloroplasts for applying chloroplasts as bioreactors. Comptes Rendus Biologies, 331, 3: 179-184
Skarjinskaia M., Ruby K., Araujo A., Taylor K., Gopalasamy-Raju V., Musiychuk K., Chichester J. A., Palmer G. A., de la Rosa P., Mett V., Ugulava N., Streatfield S. J., Yusibov V. 2013. Hairy roots as a vaccine production and delivery system. V:
Biotechnology of Hairy Root Systems, Doran P. M. (ur). Berlin, Springer: 115-134
Streatfield S. J., Lane J. R., Brooks C. A., Barker D. K., Poage M. L., Mayor J. M., Lamphear B. J., Drees C. F., Jilka J. M., Hood E. E., Howard J. A. 2003. Corn as a production system for human and animal vaccines. Vaccine, 21, 7-8: 812-815
Takeyama N., Kiyono H., Yuki Y. 2015. Plant-based vaccines for animals and humans: recent advances in technology and clinical trials. Therapeutic Advances in Vaccines and Immunotherapy, 3, 5-6: 139-154
UK Government. 2014. Newcastle disease: how to spot and report it. Department for Environment, Food & Rural Affairs and Animal and Plant Health Agency.
https://www.gov.uk/ (20. apr. 2021)
Yang Z. Q., Liu Q. Q., Pan Z. M., Yu H. X., Jiao X. A. 2007. Expression of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus in transgenic rice and its immunogenicity in mice.
Vaccine, 8, 4: 591-598
Zagorskaya A. A., Deineko E. V. 2017. Suspension-cultured plant cells as a platform for obtaining recombinant proteins. Russian Journal of Plant Physiology, 62, 6: 795-807 Zhang H., Liu M., Li Y., Zhao Y., He H., Yang G., Zheng C. 2010. Oral immunogenicity and
protective efficacy in mice of a carrot-derived vaccine candidate expressing UreB subunit against Helicobacter pylori. Protein Expression and Purification, 69, 2: 127-131
22 ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorici izr. prof. dr. Zlati Luthar za pomoč pri izbiri tematike diplomske naloge, za prijaznost, stalno razpoložljivost in nasvete pri pisanju naloge.
Svoji družini in fantu, ki so me med pisanjem naloge spodbujali in mi svetovali, se iz srca zahvaljujem za podporo, ki mi jo vsakodnevno izkazujejo na vseh življenjskih področjih in verjamejo vame bolj kot jaz sama.
Zahvaljujem se tudi Brinu, moji antistresni bunkici, saj mi je med pisanjem naloge vedno delal družbo in bil moja moralna podpora v stresnih trenutkih.