Celične suspenzije so individualne celice ali celični skupki, ki so derivati kalusnega tkiva.
Ločene kalusne celice se goji, da se pridobi stabilno celično suspenzijo. Transgeni izsečki ali
7
enokalusne celice lahko sintetizirajo rekombinantne antigene s predhodno transformacijo s pomočjo Agrobacterium (Shahid in Daniell, 2016). Prednosti celičnih suspenzij pred uporabo celih rastlin za sintezo aktivnih snovi za cepiva vključujejo možnost popolne regulacije rastnih pogojev, veliko manjšo možnost prenosa transgena v okolje, manjšo možnost okužbe s patogeni in krajši cikel kultivacije - en cikel kultivacije celične suspenzije tobaka traja 1-2 tedna, pridelava celotne rastline pa več mesecev (Zagorskaya in Deineko, 2017). Prvo oralno cepivo na svetu, ki ga je odobrila USDA leta 2006, je bilo cepivo proti atipični kokošji kugi, proizvedeno s celično suspenzijo tobaka (Shahid in Daniell, 2016).
V zadnjih letih postajajo celične suspenzije še bolj zanimive in uporabne za pridobivanje cepiv zaradi novih dognanj. Ena izmed najbolj zanimivih novih metod je ''cell pack'', ki je namenjena povečanju učinkovitosti prehodne transformacije z Agrobacterium. Z uporabo te metode se lahko doseže 100 % učinkovitost transformacije. Agrobacterium pri tej metodi transformira celice iz celičnih suspenzij, ki so v skupkih ujete na filter s pomočjo vakuuma in skupki celic so lahko majhni ali veliki. Do izražanja proteinov pride v imobiliziranih celicah v prisotnosti minimalnega tekočega gojišča in ekspresija lahko traja več dni (Rybicki, 2018).
3.6.2 Koreninski laski
Koreninski laski so posebno zanimivi za pridobivanje sekundarnih metabolitov, vendar se jih uporablja tudi za ekspresijo farmacevtskih proteinov, saj imajo v primerjavi s celičnimi suspenzijami določene prednosti, kot sta večja genetska in biokemijska stabilnost, v primerjavi z listi pa manjšo vsebnost ali odsotnost toksičnih komponent (npr. alkaloidov).
Pogosto uporabljeni rastlini za pridobivanje koreninskih laskov sta krompir in paradižnik, vendar se za pridobivanje sekundarnih metabolitov in rekombinantnih proteinov uporablja veliko različnih rastlinskih vrst. Rekombinantni proteini, sintetizirani oz. naloženi v koreninskih laskih, se lahko izločijo v gojišče, kar olajša čiščenje proteinov v zaključnih procesih (Massa in sod., 2019). Koreninski laski užitnih rastlin so ustrezna platforma za razvoj oralnih cepiv. Po tej metodologiji nista potrebna ekstrakcija in čiščenje, zato so stroški pridobivanja nižji, aktivna biomolekula pa je pri prehodu skozi zgornji gastrointestinalni trakt zaščitena pred razgradnjo z rastlinsko celično steno, ki omogoča tudi postopno sproščanje antigena v črevesju in posledično v krvni obtok. Liofilizirane kulture koreninskih laskov, ki izražajo antigene, se lahko dolgoročno hrani pri sobni temperaturi, kar olajša shranjevanje in distribucijo (Skarjinskaia in sod., 2013).
4 VETERINARSKA CEPIVA, PRIDOBLJENA S TRANSGENIMI RASTLINAMI Sinteza veterinarskih cepiv s pomočjo transgenih rastlin ima v primerjavi z ostalimi evkariontskimi produkcijskimi sistemi veliko prednosti. Omogoča sintezo velikih količin proteinov ter je stroškovno učinkovit in varen produkcijski sistem. Antigen je lahko vnesen oralno v obliki rastlinskega tkiva namesto preko injiciranja (Liew in Hair-Bejo, 2015).
8
Antigeni, proizvedeni v rastlinah, po navadi ne vsebujejo toksinov in patogenov, ki so pogosto prisotni v bakterijah in kvasovkah. Rastlinsko tkivo, ki izraža antigen, se lahko liofilizira in shranjuje pri sobni oz. nekoliko nižji temperaturi več let brez negativnega vpliva na učinkovitost zdravila oz. cepiva, medtem ko je klasična in rekombinantna cepiva, proizvedena v celicah drugih organizmov, potrebno shranjevati pri nizkih temperaturah (Shahid in Daniell, 2016).
Oralna cepiva, proizvedena v transgenih rastlinah, imajo potencial, da izzovejo imunski odziv brez bolečine, ki ga povzroči vbod z iglo pri injiciranju ostalih cepiv, kar je še posebno zaželeno pri veterinarskih cepivih. Pri neposrednem oralnem vnosu rastlinskega cepiva rastlinska celična stena ščiti tuji antigen, preden jo razgradijo prebavni mikrobi, ki sprostijo antigen in ta izzove imunski odziv. Pri večini živali je za induciranje imunskega odziva odgovorno limfoidno tkivo črevesja (GALT). Antigene prepoznajo M celice, ki nato aktivirajo limfocite B s pomočjo Th celic. B limfociti proizvedejo mukozni imunski odziv in IgA protitelesa, ki ubijejo patogen z vezavo na površinske proteine. Pri drugi metodi absorpcije antigena posredujejo črevesne dendritske celice, ki inducirajo sistemski imunski odziv v obliki IgG protiteles. Th celice aktivirajo citotoksične T limfocite, ki inducirajo močan celično-posredovan imunski odziv. Tako imajo oralna cepiva potencial, da inducirajo mukozni, sistemski in celično-posredovani imunski odziv (Shahid in Daniell, 2016).
Mehanizem delovanja oralnih cepiv iz transgenih rastlin je prikazan tudi na spodnji sliki.
Slika 1: Prikaz mehanizma delovanja rastlinskega cepiva po oralnem vnosu (prirejeno po Chan in Daniell, 2015).
9
Večina raziskav na tem področju se trenutno osredotoča na razvoj cepiv proti virusnim patogenom. Razlog za to je pomanjkanje stroškovno učinkovitih načinov za zdravljenje virusnih okužb. Za bakterijske okužbe se lahko uporabi antibiotike, čeprav ti predstavljajo tveganje za razvoj rezistentnih bakterij in lahko negativno vplivajo na mikrobne združbe, poleg tega pa lahko določen čas ostanejo v živalih in njihovih produktih. Živali izločijo velik del antibiotikov (17-90 %) neposredno v urin in iztrebke, saj se veliko vnešenih antibiotikov v črevesju ne absorbira v celoti. Ti antibiotiki lahko preidejo v vodne in kopenske ekosisteme.
Obstojnost ostankov antibiotikov v okolju je odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti le-teh ter od lastnosti zemlje in klimatskih faktorjev, vpliv na mikrobno združbo pa je odvisen od tipa in količine ostankov ter vrste mikrobov. Antibiotiki v okolju spremenijo strukturo in številčnost mikrobne združbe v prsti. Poleg tega pa vplivajo na vlogo mikroorganizmov z vidika ekoloških funkcij, kot je metanogeneza, redukcija sulfata in transformacija dušika, mikrobi pa lahko na antibiotike razvijejo odpornost. Poleg negativnih vplivov na okolje pa je lahko velika pomanjkljivost uporabe antibiotikov tudi ostanek le-teh v mleku, mesu in jajcih, česar posledica so lahko alergijske reakcije ob zaužitju teh produktov. Zaradi tega se mora antibiotike uporabljati v pravilnih odmerkih in ob ustreznem času (Jayalakshmi in sod., 2017).
Najbolje bi bilo uporabo antibiotikov zmanjšati na minimum, pri čemer bi lahko alternativo predstavljala veterinarska cepiva, sintetizirana s transgenimi rastlinami, zato bi se bilo smiselno v prihodnje bolj osredotočiti tudi na razvoj cepiv proti bakterijskim patogenom.
V nekaterih primerih cepljenje živali ščiti tudi zdravje ljudi. Steklina in ptičja gripa sta primera bolezni, proti katerim se razvija cepiva, katerih aktivne komponente so sintetizirane s transgenimi rastlinami, ki bi lahko nudila zaščito živalim in ljudem (Joensuu in sod., 2008).
Večina veterinarskih cepiv pa bi doprinesla tako k blaginji živalske kot tudi človeške populacije. Živalske bolezni se najhitreje širijo na živinorejskih področjih, kjer lahko pojav bolezni vodi v veliko izgubo prihodka te kmetijske panoge, saj je pridelek (meso, jajca, mleko…) manjši, s tem pa imajo tudi potrošniki na voljo manj izdelkov.
4.1 BAKTERIJSKE BOLEZNI