UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Zala KINK
UPORABA TRANSGENIH RASTLIN ZA SINTEZO VETERINARSKIH CEPIV
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Zala KINK
UPORABA TRANSGENIH RASTLIN ZA SINTEZO VETERINARSKIH CEPIV
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
USE OF TRANSGENIC PLANTS FOR VETERINARY VACCINE SYNTHESIS
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorico diplomskega dela imenovala izr. prof. dr. Zlato Luthar.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednica: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: izr. prof. dr. Zlata LUTHAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum predstavitve: 9. 7. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 604.6:606:614.9:615(043.2)
KG biotehnologija, transgene rastline, sinteza, aktivne sestavine, veterinarska cepiva AV KINK, Zala
SA LUTHAR, Zlata (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN UPORABA TRANSGENIH RASTLIN ZA SINTEZO VETERINARSKIH CEPIV TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)
OP VIII, 21 str., 1 sl., 49 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Raziskave na področju sinteze aktivnih sestavin za cepiva s transgenimi rastlinami intenzivno potekajo že več kot 20 let, saj imajo takšna cepiva v primerjavi s klasičnimi in tradicionalnimi komponentnimi cepivi veliko prednosti. Te vključujejo nižjo ceno, večjo varnost ter enostavnejše shranjevanje. Na področju veterinarskih cepiv je razvoj v zadnjem času usmerjen predvsem v razvoj oralnih cepiv, saj bi ta omogočila veliko enostavnejšo imunizacijo živali, predvsem v živinorejski panogi. Za transformacijo rastlin se najpogosteje uporablja jedrna transformacija, redkeje pa tudi kloroplastna transformacija in viralni ekspresijski sistemi. Najpogostejše ekspresijske platforme so in vitro kulture ter semena žit in stročnic. Uporablja se tudi nekatere sadne rastline, zelenjadnice in krmne rastline. Večina raziskav se osredotoča na razvoj cepiv proti virusnim živalskim boleznim, kot so steklina, parvovirus, goveja virusna diareja, atipična kokošja kuga ter ptičja in prašičja gripa. Kljub zelo spodbudnim rezultatom določenih študij še nobeno veterinarsko cepivo iz transgenih rastlin ni komercialno dostopno. Z razvojem novih tehnik, ki zmanjšujejo potencialna tveganja uporabe takšnih cepiv, in pripravljenostjo regulatornih organov sprejeti cepiva, pridobljena iz transgenih rastlin, se vedno bolj približujemo svetlejši prihodnosti na področju nadzora nad živalskimi boleznimi.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 604.6:606:614.9:615(043.2)
CX biotechnology, transgenic plants, synthesis, active ingredients, veterinary vaccines AU KINK, Zala
AA LUTHAR, Zlata (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI USE OF TRANSGENIC PLANTS FOR VETERINARY VACCINE SYNTHESIS DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VIII, 21 p., 1 fig., 49 ref.
LA sl AL sl/en
AB Studies in the field of active ingredient synthesis for transgenic plant vaccines have been ongoing for more than 20 years, because of the many advantages of plant-made vaccines in comparison to classical and traditional component vaccines. These include lower cost, increased safety and easier storage. In the field of veterinary vaccines, recently the focus has mainly been on the development of oral vaccines, which would enable a much easier immunization of animals, particularly in the livestock industry.
Nuclear transformation is the most commonly used transformation method for plants, chloroplast transformation and viral expression systems are also used, but less frequently. The most common expression platforms are in vitro cultures, as well as cereal and legume seeds. Certain fruit plants, vegetables and fodder crops are also used. The majority of studies is focused on developing vaccines against viral animal diseases, such as rabies, parvovirus, bovine viral diarrhea, Newcastle disease, avian flu and swine flu. Despite very incentive results of some studies, no veterinary transgenic plant vaccine is as of yet commercially available. With the development of new techniques that reduce the potential risks of using such vaccines and willingness of regulatory agencies to accept transgenic plant vaccines, we are approaching a brighter future regarding animal disease control.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VI
1 UVOD ... 1
2 TRANSFORMACIJSKE METODE, UPORABLJENE ZA PRIDOBIVANJE CEPIV 2 2.1 JEDRNA TRANSFORMACIJA ... 2
2.1.1 Biolistika ... 2
2.1.2 Transformacija s pomočjo Agrobacterium tumefaciens ... 2
2.2 KLOROPLASTNA TRANSFORMACIJA ... 3
2.3 VIRALNI EKSPRESIJSKI SISTEM ... 3
3 EKSPRESIJSKE PLATFORME ZA REKOMBINANTNE PROTEINE ... 4
3.1 ZELNATE RASTLINE ... 4
3.2 GOMOLJNICE IN KORENOVKE... 5
3.3 PLODOVKE ... 5
3.4 SADNE RASTLINE... 5
3.5 ŽITA IN STROČNICE ... 5
3.5.1 Semena žit ... 6
3.5.2 Semena stročnic ... 6
3.6 IN VITRO KULTURE ... 6
3.6.1 Celične suspenzije ... 6
3.6.2 Koreninski laski ... 7
4 VETERINARSKA CEPIVA, PRIDOBLJENA S TRANSGENIMI RASTLINAMI ... 7
4.1 BAKTERIJSKE BOLEZNI ... 9
4.1.1 Antraks ... 9
4.1.2 Listerioza ... 10
4.2 VIRUSNE BOLEZNI ... 10
4.2.1 Steklina ... 10
4.2.2 Prašičja gripa ... 11
4.2.3 Ptičja gripa ... 11
VI
4.2.4 Slinavka in parkljevka (FMD) ... 11
4.2.5 Atipična kokošja kuga (Newcastle disease) ... 12
4.2.6 Parvovirus (CPV) ... 12
4.2.7 Prašičji reproduktivni in respiratorni sindrom (PRRSV) ... 13
4.2.8 Goveja virusna diareja (BVD) ... 13
4.3 IMUNOKONTRACEPCIJA ... 13
5 OPTIMIZACIJA IZRAŽANJA ANTIGENOV V TRANSGENIH RASTLINAH ... 14
5.1 OPTIMIZACIJA PROMOTORJEV... 14
5.2 OPTIMIZACIJA KODONOV ... 14
5.3 UPORABA SIGNALNIH PEPTIDOV ... 15
5.4 UPORABA FUZIJSKIH PROTEINOV ... 15
5.5 UPORABA KLOROPLASTNE TRANSFORMACIJE ... 16
6 POTENCIALNA TVEGANJA IN REŠITVE ... 16
6.1 VARNOSTNA TVEGANJA ... 16
6.2 OKOLJSKA TVEGANJA ... 16
6.3 REŠITVE ... 17
7 ZAKLJUČEK ... 17
8 VIRI ... 18 ZAHVALA
VII KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Prikaz mehanizma delovanja rastlinskega cepiva po oralnem vnosu (Chan in
Daniell, 2015) 8
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
DNA - deoxyribonucleic acid, deoksiribonukleinska kislina CaMV - cauliflower mosaic virus, cvetačni mozaični virus
mRNA - messenger ribonucleic acid, informacijska ribonukleinska kislina VLP - virus-like particles, virusom podobni delci
RVF - Rift valley fever, mrzlica vzhodnoafriškega jarka BT - bluetongue disease, bolezen modrikastega jezika
CCHF - Crimean–Congo hemorrhagic fever, krimsko-kongoška hemoragična vročica FMD - foot and mouth disease, slinavka in parkljevka
FMDV - foot and mouth disease virus, virus slinavke in parkljevke
PRRSV- porcine reproductive and respiratory syndrome virus, virus prašičjega reprodukcijskega in respiratornega sindroma
BVD - bovine viral diarrhea, goveja virusna diareja
BVDV - bovine viral diarrhea virus, virus goveje virusne diareje
USDA - United States Department od Agriculture, Ministrstvo za kmetijstvo ZDA GALT - gut-associated lymphoid tissue, mukoza in limfoidno tkivo v prebavnem traktu M celice - microfold cells, mikrofold celice, specializirane epitelne celice mukoznega in limfatičnega tkiva
Th celice - T helper cells, celice T pomagalke IgA - imunoglobulin A
IgG - imunoglobulin G IFN-α - interferon α G protein - glikoprotein N protein - nukleoprotein HPAI virus - virus ptičje gripe HA - hemaglutinin
NDV - Newcastle disease virus, virus atipične kokošje gripe M protein - matrix protein, protein matriksa
VIII P protein - phosphoprotein, fosfoprotein
F protein - fuzijski protein
HN protein - hemagglutinin-neuraminidase protein, hemaglutinin-nevraminidaza protein L protein - large polymerase protein, veliki protein polimeraze
VP - viral protein, virusni protein
CTB - cholera toxin B subunit, B podenota virusa kolere 2L21 - epitop VP2 (viral protein 2) proteina parvovirusa GFP - green fluorescent protein, zeleni fluorescenčni protein TD - tetramerisation domain, tetramerizacijska domena
GP4D, GP5D - proteina virusa prašičjega reproduktivnega in respiratornega sindroma scFv - single-chain variable fragment, enoverižni variabilni fragment, fuzijski protein variabilnih regij lahkih in težkih verig imunoglobulinov
RNA - ribonucleic acid, ribonukleinska kislina E. coli - Escherichia coli
LT-B - temperaturno občutljiva B podenota enterotoksina Escherichia coli
1 1 UVOD
Transgene ali gensko spremenjene rastline so rastline, katerih dedni material je bil spremenjen z uporabo tehnik genskega inženirstva. V večini primerov je cilj modifikacij vnos nove lastnosti, ki v tej rastlini endogeno ni prisotna, na primer odpornost na škodljivce, bolezni, herbicide, neugodne rastne razmere ali pa sinteza določenih farmacevtskih učinkovin. Gensko inženirstvo rastlin se je začelo že leta 1970, ko so se pričele obsežne raziskave novih potencialnih možnosti uporabe rastlin, ne le za prehrano. Po prvih študijah ekspresije biofarmacevtikov v rastlinah so se začele intenzivnejše raziskave izražanja antigenov proti človeškim in živalskim predvsem nalezljivim boleznim (Liew in Hair-Bejo, 2015). Zaradi mnogih pomanjkljivosti klasičnih podenotnih/rekombinantnih cepiv, kot so zapletena in draga proizvodnja ter čiščenje, potreba po shranjevanju pri nizkih temperaturah in potreba po usposobljenemu kadru za vnos cepiva, so se začele pojavljati alternativne metode pridobivanja aktivnih snovi s transgenimi rastlinami (Shahid in Daniell, 2016).
Aktivne komponente za cepiva, pridobljene s transgenimi rastlinami, so rezultat ekspresije po vnosu izbranih antigenov proti določenemu patogenu v rastlino in med drugim omogočajo oralen vnos cepiva preko zaužitja tkiva transgene rastline, kar predstavlja enostavnejši in bolj human način vnosa cepiva, predvsem pri cepljenju živali. Virusne in bakterijske nalezljive bolezni so postale velika nevarnost za zdravje živali in ljudi. Izredno velik problem predstavljajo bolezni, ki se širijo med domačimi živalmi, saj povzročajo ekonomske izgube na področju živinoreje, obstaja pa tudi tveganje prenosa bolezni na ljudi, ki so v stiku z okuženimi živalmi ali njihovim mlekom in mesom. Določene bolezni, kot sta npr. steklina in parvovirus, lahko prizadenejo tudi hišne ljubljenčke.
Veterinarska cepiva, proizvedena s transgenimi rastlinami, bi lahko doprinesla k večjemu nadzoru nad živalskimi boleznimi, saj bi bila cepiva cenejša in s tem dostopnejša tudi v državah v razvoju. Vnos cepiva bi bil v primeru oralnih cepiv veliko enostavnejši, prav tako pa bi doprinesla k zmanjšani porabi antibiotikov v živinoreji, ki se trenutno uporabljajo za kontrolo bakterijskih okužb in vodijo do razvoja rezistentnih bakterijskih sevov, kar predstavlja velik problem. Zaradi vseh teh razlogov se že več kot 20 let intenzivno raziskuje in razvija cepiva, katerih aktivne komponente so pridobljene s transgenimi rastlinami.
Ministrstvo za kmetijstvo ZDA (USDA) je leta 2006 odobrilo prvo cepivo, proizvedeno v rastlinah, in sicer cepivo proti atipični kokošji kugi, ki je bilo pridobljeno s celično suspenzijo tobaka in se je izkazalo za 90 % učinkovito, vendar podjetje produkta ni komercializiralo.
Uspeh prvega takšnega cepiva pa je vseeno odprl vrata potencialni komercializaciji cepiv iz transgenih rastlin (Shahid in Daniell, 2016).
Z razvojem novih tehnik, ki bi zmanjšale potencialna tveganja uporabe takšnih cepiv (kot je npr. prenos transgena iz gensko spremenjenih rastlin v okolje ter kontaminacija prehranske
2
verige ljudi z rekombinantnimi proteini), zaradi katerih obstajajo veliki pomisleki o uporabi le-teh, se vedno bolj približujemo svetlejši prihodnosti na področju nadzora nad boleznimi, ki lahko dosežejo občasne epidemiološke razsežnosti.
2 TRANSFORMACIJSKE METODE, UPORABLJENE ZA PRIDOBIVANJE CEPIV Tarčni geni, ki niso endogeno prisotni v rastlinah, se lahko v njih stabilno izrazijo s pomočjo rastlinskih ekspresijskih sistemov, ki so ključni za uspešno sintezo cepiv v transgenih rastlinah. Trije glavni aspekti ekspresijskih sistemov so jedrna transformacija, kloroplastna transformacija in viralni ekspresijski sistem (Guan in sod., 2013).
2.1 JEDRNA TRANSFORMACIJA
Jedrna transformacija je najenostavnejši in najpogosteje uporabljen sistem za pridobivanje gensko spremenjenih rastlin. Pri tem sistemu se eksogeni antigen izrazi iz zapisa jedrnega genoma s pomočjo biolistike ali Agrobacterium tumefaciens in tudi ostalih do sedaj manj uporabljenih metod (elektroporacija, polietilen glikol) (Shahid in Daniell, 2016).
2.1.1 Biolistika
Biolistika je pogosto uporabljena neposredna metoda vnosa tuje DNA v rastline. Temelji na direktnem vnosu DNA v rastlinske celice s pomočjo majhnih kovinskih delcev, najpogosteje iz zlata ali volframa, ki so obdani z DNA. Delce se z veliko hitrostjo izstreli v rastlinsko tkivo, kjer se DNA zadrži, delci pa zapustijo tkivo (Baltes in sod., 2017). Za tarčo se lahko uporabi različna tkiva, pomembno pa je, da so dovzetna za transformacijo in regenerativna, zato se najpogosteje uporablja embriogeni kalus in somatski embriji (Loza-Rubio in sod., 2010). Biolistika ima kot metoda transformacije veliko prednosti. Transformiramo lahko različna tkiva in celice, transformacijski postopek je enostaven, ne potrebujemo binarnega vektorja in vnese se lahko relativno velike DNA fragmente. Njene slabosti vključujejo relativno nizko učinkovitost transformacije, visoko ceno vzpostavitve sistema (Baltes in sod., 2017) in pojav utišanja genov, poleg tega pa se pri obstreljevanju tkivo poškoduje in v povprečju preživi le okoli 50 % celic (Rivera in sod., 2012).
2.1.2 Transformacija s pomočjo Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens je talna Gram negativna bakterija, ki je sposobna vnosa tujega gena v rastlino s pomočjo Ti-plazmida. Pri okužbi rastline bakteriji pomaga zaznavanje fenolnih spojin, ki jih izločajo poškodovane rastline. Fenolne spojine delujejo kot signal za aktivacijo bakterijskih genov za virulenco (vir geni), ki kodirajo vir proteine. Na Ti-plazmidu se nahaja T-DNA, ki se s pomočjo različnih vir proteinov prenese v gostiteljsko celico in vgradi v jedrni genom, kar omogoča kontinuirano sintezo rekombinantnega proteina. Po post- translacijskih modifikacijah se lahko proteini hranijo v različnih organelih ali pa se izločijo iz
3
celice. Slabosti tega sistema pa so utišanje genov, nizek nivo izražanja in možnost prenosa transgena v okolje preko peloda ali semena, kar omejuje komercialni razvoj rekombinantnih cepiv, pridobljenih s transgenimi rastlinami (Shahid in Daniell, 2016).
2.2 KLOROPLASTNA TRANSFORMACIJA
Kloroplastna transformacija ima pred jedrno določene prednosti. Pri tej metodi se transgen z uporabo biolistike vstavi v krožni kloroplastni genom s pomočjo homologne rekombinacije.
Ko se liste obstreljuje z delci iz žlahtnih kovin, prevlečenimi s kloroplastnimi vektorji, se transgeni konstrukt integrira v kloroplastni genom. Značilna je visoka ekspresija eksogenih genov, saj se v vsaki listni celici nahaja do 10 000 kopij kloroplastnega genoma (Shahid in Daniell, 2016). Prednost predstavlja tudi maternalno dedovanje kloroplastne DNA, kar zmanjša možnost prenosa transgena s pelodom med opraševanjem in prepreči pojav utišanja genov v procesu transformacije (Guan in sod., 2013). Pobiranje vegetativnega tkiva (listov) pred cvetenjem prepreči tudi ''uhajanje'' transgena preko semen. Transplastomske rastline, ki izražajo antigene za cepiva ali biofarmacevtske učinkovine, se zato lahko goji na poljih.
Dodatna prednost kloroplastne transformacije je možnost ekspresije več genov pod enim promotorjem zaradi policistronske ekspresije. V kloroplastih so bili izraženi že mnogi antigeni (tako virusni kot bakterijski) proti različnim živalskim boleznim, med drugim proti malariji, parvovirusu, antraksu, rotavirusu in virusu prašičje gripe (Shahid in Daniell, 2016).
2.3 VIRALNI EKSPRESIJSKI SISTEM
Viralni ekspresijski sistem temelji na okužbi rastline z rastlinskim virusom, ki se je sposoben neodvisno podvojevati, prepisovati in prevajati, da proizvede čim več kopij rekombinantnega proteina (Guan in sod., 2013). Pogosto uporabljeni viralni vektorji so cvetačni mozaični virus (CaMV), tobačni mozaični virus, mozaični virus bambusa in alfalfa mozaični virus. Pri tej metodi se rastlinski virus modificira s pomočjo genskega inženiringa tako, da je pod kontrolo subgenomskega mRNA promotorja plaščnega proteina. Plaščni protein se v okuženem gostitelju visoko izraža, zaradi česar je najboljši promotor za izražanje tujih genov. Kopije infektivne nukleinske kisline vnesejo tarčni gen v rastlinsko celico in proizvedejo delce, podobne virusu (VLP), ki dostavijo peptidni epitop (Shahid in Daniell, 2016).
Prehodni ekspresijski sistemi, ki uporabljajo tako viralne vektorje kot Agrobacterium tumefaciens za vnos genov, so najboljša izbira za doseganje visokih nivojev izražanja tujih genov. Pri takšni transformaciji Agrobacterium spodbudi vstop več kopij rekombinantnih viralnih vektorjev v rastlinsko celico. Tarčni gen se vnese s pomočjo Agrobacterium z eno izmed dveh možnih metod: vbrizgavanjem v listne reže ali vakuumsko infiltracijo. Pri vakuumski infiltraciji se zgornje dele rastlin prelije s kulturo Agrobacterium in uporabi vakuum za odstranitev zraka iz znotrajceličnih prostorov. Po sprostitvi vakuum iz bakterije vnese tarčni gen v rastlinsko celico. Transkripti rekombinantnega viralnega genoma vstopijo v jedro in citoplazmo celice in v nekaj dneh pričnejo rastline proizvajati velike količine tarčnega
4
proteina. Z uporabo prehodnega ekspresijskega sistema so bila proizvedena različna veterinarska cepiva, npr. cepivo proti eboli, mrzlici vzhodnoafriškega jarka (RVF), bolezni modrikastega jezika (BT) in krimsko-kongoški hemoragični vročici (CCHF), z obetavnimi rezultati (Shahid in Daniell, 2016).
3 EKSPRESIJSKE PLATFORME ZA REKOMBINANTNE PROTEINE
Za sintezo rekombinantnih proteinov in antigenov za cepiva je bilo proučevanih in uporabljenih že veliko rastlin. Razdelimo jih lahko na zelenjadnice, gomoljnice, korenovke, plodovke in sadne rastline. Soja, lucerna in koruza spadajo med ekonomsko najbolj učinkovite rastlinske sisteme za komercialno pridobivanje tujih proteinov. V preliminarnih študijah pa se kot modelni rastlini pogosto uporabljata tobak in navadni repnjakovec (Liew in Hair-Bejo, 2015). Za sintezo antigenov se lahko uporabi tudi in vitro kulture, kot sta celična suspenzija in koreninski laski (Massa in sod., 2019).
3.1 ZELNATE RASTLINE
Najpogosteje uporabljeni rastlini za preliminarne študije, navadni repnjakovec in tobak, spadata v skupino zelnatih rastlin. Posekvenciran je bil že celoten genom repnjakovca in na voljo je že veliko linij in mutant z dostopnimi genetskimi informacijami. Transformacijski postopki za navadni repnjakovec so zato dobro uveljavljeni in enostavni za izvedbo, vendar pa ta rastlina ni primerna za komercialno proizvodnjo zaradi nizke biomase (Liew in Hair- Bejo, 2015). Tobak pa je primeren za komercialno proizvodnjo, saj je zanj značilen visok pridelek biomase, poleg tega pa se ne uporablja za hrano ali krmo, zato je možnost kontaminacije krme ali človeške prehranske verige s transgenim materialom ali rekombinantnimi proteini nizka (Fischer in sod., 2004). Pri rasti na polju lahko proizvede več kot 50 000 kg/ha sveže biomase v zgolj eni sezoni (Joensuu in sod., 2008). Slabost tobaka je visoka vsebnost nikotina in drugih toksičnih alkaloidov, ki se jih mora v celoti odstraniti tekom proizvodnega procesa (Fischer in sod., 2004). Možna rešitev te težave je uporaba sort z nizko vsebnostjo alkaloidov (Liew in Hair-Bejo, 2015).
Pri molekulskem kmetovanju se iz skupine zelnatih rastlin uporablja tudi lucerno in deteljo, ki sta krmni rastlini, ter solato in špinačo. Za lucerno in deteljo že obstajajo relativno dobro uveljavljeni transformacijski postopki, sta večletnici in za obe je značilno enostavno gojenje tudi s klonskim razmnoževanjem. Listi rastlin se lahko zaužijejo surovi, kar je posebno uporabno pri veterinarskih cepivih, dosegata lahko visoke pridelke suhe biomase na hektar, za zelnate rastline pa je značilen tudi visok delež proteinov (Liew in Hair-Bejo, 2015). Čeprav je količina proteinov velika, pa so proteini, izraženi v listih, nestabilni, kar pomeni, da je čas shranjevanja omejen in je potrebno procesiranje le-tega takoj po spravilu in tudi shranjevanje listov zahteva posebne postopke, liofilizacijo in globoko zmrzovanje. Pri lucerni je lahko problematična tudi visoka vsebnost oksalne kisline, ki lahko moti procesiranje (Fischer in
5
sod., 2004). Relativno velik problem pri takšnih rastlinah predstavlja možnost križanja z ne- transgenimi rastlinami v primeru gojenja na poljih (Liew in Hair-Bejo, 2015).
3.2 GOMOLJNICE IN KORENOVKE
Najpogosteje uporabljena rastlina iz skupine stebeljnih gomoljnic za sintezo cepiv je krompir.
Transformacijski postopki za pridobivanje transgenega krompirja so dobro proučeni in uveljavljeni (Liew in Hair-Bejo, 2015), razmnoževanje pa je enostavno (Kurup in Thomas, 2020). Zaradi možnosti vegetativnega razmnoževanja je tveganje za križanje z ne-transgenimi rastlinami na prostem majhno. Druge prednosti uporabe krompirja za sintezo cepiv vključujejo stabilnost proizvedenih tujih proteinov in možnost shranjevanja transformiranega tkiva (gomoljev) za dolga obdobja brez potrebe po hladni verigi pod 6 ºC. Glavni slabosti sta relativno nizka vsebnost proteinov v gomolju krompirja in potreba po toplotni obdelavi gomoljev pred uživanjem, kar lahko vodi do denaturacije proteinov in s tem do nizke imunogenosti antigena (Liew in Hair-Bejo, 2015).
Poleg krompirja je aktualno tudi korenje, ki pa se lahko uživa surovo in je primerno za dolgotrajno shranjevanje. Poleg tega producira semena šele v drugem letu rasti, užitno korenino pa poberemo že v prvem letu, zato je možnost prenosa transgena na druge sorodne rastline v okolju zelo majhna (Zhang in sod., 2010).
3.3 PLODOVKE
Najpopularnejša plodovka za sintezo antigenov za cepiva je paradižnik. Plodovi paradižnika so okusni in ne potrebujejo predhodne toplotne obdelave, zato ni tveganja za toplotno denaturacijo proteinov, industrijsko gojenje paradižnika pa je že dobro uveljavljeno (Liew in Hair-Bejo, 2015). Poleg tega bi lahko visoka vsebnost vitamina A dodatno spodbudila imunski odziv (Kurup in Thomas, 2020). Slabost predstavlja nizka vsebnost proteinov in potreba po shranjevanju na hladnem, da se prepreči kvarjenje (Liew in Hair-Bejo, 2015).
3.4 SADNE RASTLINE
Za sintezo oralnih cepiv se uporablja tudi banane, ki prav tako ne potrebujejo predhodne toplotne obdelave. Glavna slabost je počasna rast rastline, traja namreč 2-3 leta, da preide v generativno fazo in sadež se kmalu po tem, ko dozori, pokvari (Kurup in Thomas, 2020).
3.5 ŽITA IN STROČNICE
Glavna prednost žit in stročnic pred ostalimi rastlinami je, da oblikujejo veliko dobro obstojnih semen in s tem možnost dolgotrajnega shranjevanja naloženih tujih proteinov (Liew in Hair-Bejo, 2015). Stabilni lahko ostanejo kar do 3 leta pri shranjevanju na sobni temperaturi in več kot 3 leta pri shranjevanju na nižjih temperaturah do 4 ºC brez znatnega
6
zmanjšanja aktivnosti (Fischer in sod., 2004). Rastlinska semena vsebujejo malo vode - pri večini semen je vsebnost nižja od 10 % biomase, listi pa so v večini primerov sestavljeni iz 90
% vode. Poleg tega semena vsebujejo veliko proteinov (10-40 % sveže mase), pri listih pa je vsebnost manjša od 5 %. Dodatna prednost semen je nizka aktivnost proteaz, zaradi česar so proizvedeni proteini zaščiteni pred proteolitsko razgradnjo. Zaradi vseh teh razlogov predstavljajo dober sistem za nalaganje in shranjevanje stabilnih proteinov. Glavna pomanjkljivost ekspresije v semenih je daljši produkcijski čas, saj morajo transgene rastline skozi celoten vegetativni in generativni življenjski cikel, da nastanejo in dozorijo semena. V primeru zelnatih rastlin pa pridelek poberemo že pred cvetenjem, s čimer se skrajša čas in tudi zmanjša možnost prenosa transgena v okolje s pelodom (Liew in Hair-Bejo, 2015).
3.5.1 Semena žit
Najbolj široko uporabljeno žito za molekulsko kmetovanje je koruza. Koruzna semena so večja in pridelek biomase na hektar je večji v primerjavi z drugimi žiti. Metode in vitro manipulacije, transformacije, komercialnega pridelovanja in procesiranja koruze so dobro uveljavljene (Liew in Hair-Bejo, 2015). Ker je široko uporabljena kot krmno žito, je idealna ekspresijska platforma za veterinarska cepiva.
Poleg koruze se za sintezo rekombinantnih proteinov pogosto uporablja riž (Liew in Hair- Bejo, 2015). Tudi za riž je značilen visok pridelek biomase in uveljavljene metode pridelovanja in procesiranja. Njegova prednost pa je visoka ekspresija antigenov. Slabosti vključujejo počasno rast in zahtevnejše pogoje gojenja, ki je omejeno na ožje pridelovalno območje (Kurup in Thomas, 2020). Raziskuje se tudi sinteza cepiv v ječmenu, ki je perspektiven zaradi samoopraševanja (Liew in Hair-Bejo, 2015).
3.5.2 Semena stročnic
Soja in grah sta najpogosteje uporabljeni stročnici za sintezo antigenov za cepiva. Glavna prednost stročnic pred žiti je bistveno višja vsebnost proteinov. Skupna vsebnost proteinov pri žitih niha od 8 do 13 %, soja in grah pa lahko vsebujeta do 40 % proteinov. Poleg tega sta soja in grah samoprašnici, kar znižuje možnost kontaminacij z genetskim tokom. Pomanjkljivost stročnic v primerjavi z žiti pa je zahtevna in neučinkovita transformacija, nižji letni pridelki semen ter višja cena proizvodnje in možnost kratko- oz. srednjeročnega shranjevanja (Liew in Hair-Bejo, 2015).
3.6 IN VITRO KULTURE 3.6.1 Celične suspenzije
Celične suspenzije so individualne celice ali celični skupki, ki so derivati kalusnega tkiva.
Ločene kalusne celice se goji, da se pridobi stabilno celično suspenzijo. Transgeni izsečki ali
7
enokalusne celice lahko sintetizirajo rekombinantne antigene s predhodno transformacijo s pomočjo Agrobacterium (Shahid in Daniell, 2016). Prednosti celičnih suspenzij pred uporabo celih rastlin za sintezo aktivnih snovi za cepiva vključujejo možnost popolne regulacije rastnih pogojev, veliko manjšo možnost prenosa transgena v okolje, manjšo možnost okužbe s patogeni in krajši cikel kultivacije - en cikel kultivacije celične suspenzije tobaka traja 1-2 tedna, pridelava celotne rastline pa več mesecev (Zagorskaya in Deineko, 2017). Prvo oralno cepivo na svetu, ki ga je odobrila USDA leta 2006, je bilo cepivo proti atipični kokošji kugi, proizvedeno s celično suspenzijo tobaka (Shahid in Daniell, 2016).
V zadnjih letih postajajo celične suspenzije še bolj zanimive in uporabne za pridobivanje cepiv zaradi novih dognanj. Ena izmed najbolj zanimivih novih metod je ''cell pack'', ki je namenjena povečanju učinkovitosti prehodne transformacije z Agrobacterium. Z uporabo te metode se lahko doseže 100 % učinkovitost transformacije. Agrobacterium pri tej metodi transformira celice iz celičnih suspenzij, ki so v skupkih ujete na filter s pomočjo vakuuma in skupki celic so lahko majhni ali veliki. Do izražanja proteinov pride v imobiliziranih celicah v prisotnosti minimalnega tekočega gojišča in ekspresija lahko traja več dni (Rybicki, 2018).
3.6.2 Koreninski laski
Koreninski laski so posebno zanimivi za pridobivanje sekundarnih metabolitov, vendar se jih uporablja tudi za ekspresijo farmacevtskih proteinov, saj imajo v primerjavi s celičnimi suspenzijami določene prednosti, kot sta večja genetska in biokemijska stabilnost, v primerjavi z listi pa manjšo vsebnost ali odsotnost toksičnih komponent (npr. alkaloidov).
Pogosto uporabljeni rastlini za pridobivanje koreninskih laskov sta krompir in paradižnik, vendar se za pridobivanje sekundarnih metabolitov in rekombinantnih proteinov uporablja veliko različnih rastlinskih vrst. Rekombinantni proteini, sintetizirani oz. naloženi v koreninskih laskih, se lahko izločijo v gojišče, kar olajša čiščenje proteinov v zaključnih procesih (Massa in sod., 2019). Koreninski laski užitnih rastlin so ustrezna platforma za razvoj oralnih cepiv. Po tej metodologiji nista potrebna ekstrakcija in čiščenje, zato so stroški pridobivanja nižji, aktivna biomolekula pa je pri prehodu skozi zgornji gastrointestinalni trakt zaščitena pred razgradnjo z rastlinsko celično steno, ki omogoča tudi postopno sproščanje antigena v črevesju in posledično v krvni obtok. Liofilizirane kulture koreninskih laskov, ki izražajo antigene, se lahko dolgoročno hrani pri sobni temperaturi, kar olajša shranjevanje in distribucijo (Skarjinskaia in sod., 2013).
4 VETERINARSKA CEPIVA, PRIDOBLJENA S TRANSGENIMI RASTLINAMI Sinteza veterinarskih cepiv s pomočjo transgenih rastlin ima v primerjavi z ostalimi evkariontskimi produkcijskimi sistemi veliko prednosti. Omogoča sintezo velikih količin proteinov ter je stroškovno učinkovit in varen produkcijski sistem. Antigen je lahko vnesen oralno v obliki rastlinskega tkiva namesto preko injiciranja (Liew in Hair-Bejo, 2015).
8
Antigeni, proizvedeni v rastlinah, po navadi ne vsebujejo toksinov in patogenov, ki so pogosto prisotni v bakterijah in kvasovkah. Rastlinsko tkivo, ki izraža antigen, se lahko liofilizira in shranjuje pri sobni oz. nekoliko nižji temperaturi več let brez negativnega vpliva na učinkovitost zdravila oz. cepiva, medtem ko je klasična in rekombinantna cepiva, proizvedena v celicah drugih organizmov, potrebno shranjevati pri nizkih temperaturah (Shahid in Daniell, 2016).
Oralna cepiva, proizvedena v transgenih rastlinah, imajo potencial, da izzovejo imunski odziv brez bolečine, ki ga povzroči vbod z iglo pri injiciranju ostalih cepiv, kar je še posebno zaželeno pri veterinarskih cepivih. Pri neposrednem oralnem vnosu rastlinskega cepiva rastlinska celična stena ščiti tuji antigen, preden jo razgradijo prebavni mikrobi, ki sprostijo antigen in ta izzove imunski odziv. Pri večini živali je za induciranje imunskega odziva odgovorno limfoidno tkivo črevesja (GALT). Antigene prepoznajo M celice, ki nato aktivirajo limfocite B s pomočjo Th celic. B limfociti proizvedejo mukozni imunski odziv in IgA protitelesa, ki ubijejo patogen z vezavo na površinske proteine. Pri drugi metodi absorpcije antigena posredujejo črevesne dendritske celice, ki inducirajo sistemski imunski odziv v obliki IgG protiteles. Th celice aktivirajo citotoksične T limfocite, ki inducirajo močan celično-posredovan imunski odziv. Tako imajo oralna cepiva potencial, da inducirajo mukozni, sistemski in celično-posredovani imunski odziv (Shahid in Daniell, 2016).
Mehanizem delovanja oralnih cepiv iz transgenih rastlin je prikazan tudi na spodnji sliki.
Slika 1: Prikaz mehanizma delovanja rastlinskega cepiva po oralnem vnosu (prirejeno po Chan in Daniell, 2015).
9
Večina raziskav na tem področju se trenutno osredotoča na razvoj cepiv proti virusnim patogenom. Razlog za to je pomanjkanje stroškovno učinkovitih načinov za zdravljenje virusnih okužb. Za bakterijske okužbe se lahko uporabi antibiotike, čeprav ti predstavljajo tveganje za razvoj rezistentnih bakterij in lahko negativno vplivajo na mikrobne združbe, poleg tega pa lahko določen čas ostanejo v živalih in njihovih produktih. Živali izločijo velik del antibiotikov (17-90 %) neposredno v urin in iztrebke, saj se veliko vnešenih antibiotikov v črevesju ne absorbira v celoti. Ti antibiotiki lahko preidejo v vodne in kopenske ekosisteme.
Obstojnost ostankov antibiotikov v okolju je odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti le-teh ter od lastnosti zemlje in klimatskih faktorjev, vpliv na mikrobno združbo pa je odvisen od tipa in količine ostankov ter vrste mikrobov. Antibiotiki v okolju spremenijo strukturo in številčnost mikrobne združbe v prsti. Poleg tega pa vplivajo na vlogo mikroorganizmov z vidika ekoloških funkcij, kot je metanogeneza, redukcija sulfata in transformacija dušika, mikrobi pa lahko na antibiotike razvijejo odpornost. Poleg negativnih vplivov na okolje pa je lahko velika pomanjkljivost uporabe antibiotikov tudi ostanek le-teh v mleku, mesu in jajcih, česar posledica so lahko alergijske reakcije ob zaužitju teh produktov. Zaradi tega se mora antibiotike uporabljati v pravilnih odmerkih in ob ustreznem času (Jayalakshmi in sod., 2017).
Najbolje bi bilo uporabo antibiotikov zmanjšati na minimum, pri čemer bi lahko alternativo predstavljala veterinarska cepiva, sintetizirana s transgenimi rastlinami, zato bi se bilo smiselno v prihodnje bolj osredotočiti tudi na razvoj cepiv proti bakterijskim patogenom.
V nekaterih primerih cepljenje živali ščiti tudi zdravje ljudi. Steklina in ptičja gripa sta primera bolezni, proti katerim se razvija cepiva, katerih aktivne komponente so sintetizirane s transgenimi rastlinami, ki bi lahko nudila zaščito živalim in ljudem (Joensuu in sod., 2008).
Večina veterinarskih cepiv pa bi doprinesla tako k blaginji živalske kot tudi človeške populacije. Živalske bolezni se najhitreje širijo na živinorejskih področjih, kjer lahko pojav bolezni vodi v veliko izgubo prihodka te kmetijske panoge, saj je pridelek (meso, jajca, mleko…) manjši, s tem pa imajo tudi potrošniki na voljo manj izdelkov.
4.1 BAKTERIJSKE BOLEZNI 4.1.1 Antraks
Antraks se širi preko bakterije Bacillus anthracis. Je živalska bolezen, najpogosteje opažena pri govedu, ovcah in srnjadi, a se z njo okužijo tudi ljudje preko neposrednega stika z živalmi, pri lovu ali preko kontaminirane hrane (Shahid in Daniell, 2016). Pri živalih se bolezenski znaki pojavijo z nenadno vročino, obdobjem razdraženosti, depresijo, težavami z dihanjem in srcem, pogosto pa je potek bolezni tako hiter, da se bolezni ne odkrije in so živali najdene mrtve (Hugh-Jones, 2015). Trenutno dostopna cepiva proti antraksu imajo več slabosti, med drugim je potrebno večkratno spodbujevalno cepljenje (do 8x), pogosto pa pride tudi do odpoklica določenih serij cepiva zaradi kontaminacije s toksini (Shahid in Daniell, 2016).
Koya in sod. (2005) so pridobili transplastomski tobak, ki izraža protektivni antigen (PA) antraksa in pri imuniziranih miših je prišlo do zaščitnega imunskega odziva. Proizvedle so
10
visok titer IgG protiteles in ugotovljena je bila 100 % zaščita proti letalni dozi Bacillus anthracis.
4.1.2 Listerioza
Listerioza je bolezen, za katero lahko zbolijo ljudje in živali. Povzroča jo bakterija Listeria monocytogenes (Shahid in Daniell, 2016). Znaki bolezni se največkrat pojavijo pri govedu, kozah in ovcah, slednje pa so na bakterijo najbolj občutljive. Relativno pogosta je tudi pri zajcih in činčilah. Najpogosteje pride do okužbe zaradi kontaminirane krme. Simptomi listerioze so vročina, zmanjšan apetit, izguba ravnotežja, lahko pride tudi do splava pri brejih živalih (FDA, 2020). Listerioza je zapostavljena bolezen, kar se tiče razvoja cepiv, čeprav lahko pri živalih in ljudeh vodi do hudih zapletov, najpogosteje encefalitisa (Shahid in Daniell, 2016). Ohya in sod. (2005) so razvili cepivo proti listeriozi s pomočjo gensko spremenjenega krompirja, ki je izražal rekombinantni interferon α protein (IFN-α) za sprožitev imunskega odziva. Oralno so imunizirali miši s transgenim krompirjem in dosegli obetavne rezultate - cepivo je ob izpostavitvi miši bakteriji Listeria monocytogenes občutno zmanjšalo vsebnost bakterij v vranici in jetrih.
4.2 VIRUSNE BOLEZNI 4.2.1 Steklina
Steklina je bolezen, ki kroži med psi, lisicami in netopirji. Letno povzroči smrt milijonov živali in povzroča velike ekonomske izgube v živinorejski panogi. Živali se okužijo s steklino preko ugrizov netopirjev. Posebno razširjena je v Latinski Ameriki. Virus, ki povzroča steklino, spada v družino Rhabdoviridae. Trenutno dostopna cepiva so zadovoljiva, vendar jih je potrebno shranjevati pri 4 °C, poleg tega pa imajo visoko ceno, zato v razvijajočih se državah niso dovolj dostopna. Cepiva, proizvedena v transgenih rastlinah, nudijo potencialne rešitve (Shahid in Daniell, 2016). Pri pridobivanju cepiv proti steklini je zaželena vsebnost obeh virusnih antigenov - glikoproteina (G protein) in nukleoproteina (N protein). G protein je glavni antigen, odgovoren za vzbuditev zaščitne imunosti, N protein pa sproži delovanje T- celic, ki so specifične za virus stekline, in te inducirajo produkcijo nevtralizirajočih protiteles ter sodelujejo pri drugih imunskih mehanizmih (Guan in sod., 2013). McGarvey in sod.
(1995) so že leta 1995 razvili prvo cepivo proti steklini s pomočjo transgene rastline - G protein virusa se je izrazil v paradižniku. Od takrat je bil antigen izražen še v mnogih drugih rastlinah, npr. v tobaku, špinači, koruzi, korenju… Oralna cepiva, pridobljena v koruzi in korenju, so v nekaterih primerih pri živalih nudila 100 % zaščito pred virusom (Loza-Rubio in Rojas-Anaya, 2014).
11 4.2.2 Prašičja gripa
Virus prašičje gripe spada v družino Flaviviridae in povzroča veliko škode v živinorejski panogi, čeprav okužene živali po navadi izražajo le blage simptome. V določenih primerih se lahko virus prenese tudi na ljudi. Trenutno se za zaščito pred virusom prašičje gripe večinoma uporabljajo cepiva z živim atenuiranim virusom, ki pa imajo določene slabosti, med drugim visoko ceno proizvodnje, inverzijo virusa in potrebo po shranjevanju pri nizkih temperaturah (Shahid in Daniell, 2016). Shao in sod. (2008) je uspela sinteza E2 strukturnega proteina virusa v kloroplastih tobaka in po oralni imunizaciji miši je bil dosežen zaščitni imunski odziv. Jung in sod. (2014) so pridobili transgeni kalus riža, ki je izražal E2 protein. Pri oralni imunizaciji miši je prišlo do zaščitnega imunskega odziva, nato pa so oralno imunizirali še prašiče, pri katerih se je razvil (za E2 specifičen) sistemski, mukozni in celično posredovan imunski odziv.
4.2.3 Ptičja gripa
Ptičja gripa je izredno nalezljiva bolezen, za katero je značilna visoka stopnja smrtnosti pri živalih, prizadene pa lahko tudi ljudi. Trenutno uporabljena veterinarska cepiva so učinkovita pri preprečevanju okužbe z virusom ptičje gripe (Ceballo in sod., 2018), ker pa se bolezen po navadi širi na velikih farmah, so za nadzor nad boleznijo potrebne velike količine cepiv, zato bi bila cepiva iz transgenih rastlin dobra rešitev (Shahid in Daniell, 2016). Lee in sod. (2015) so v endoplazemskem retikulumu navadnega repnjakovca sprožili sintezo hemaglutinina (HA) H5 iz HPAI virusa, ki povzroča ptičjo gripo, in dosegli visok nivo izražanja.
Imunogenost transgenega repnjakovca so preverili z oralno imunizacijo miši, ki so razvile visok titer IgG in IgA HA-specifičnih protiteles, proizvedle IgG2b in razvile močan Th1 odziv, kar 72 % imuniziranih miši pa je bilo zaščitenih ob izpostavitvi virusu. Phan in sod.
(2020) so prehodno povzročili izražanje trimer hemaglutinina (H5) v rastlinah Nicotiana benthamiana. Trimere so nato očistili in z njimi imunizirali kokoši, ki so izkazale popolno odpornost pri izpostavitvi visoko patogenemu virusu ptičje gripe HPAIV H5N1.
4.2.4 Slinavka in parkljevka (FMD)
Slinavka in parkljevka je bolezen, ki jo povzroča RNA virus FMDV. Njegov genom kodira 4 proteine, ki sestavljajo virusno kapsido - VP1, VP2, VP3 in VP4. Poznamo 7 serotipov FMDV: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 in Asia-1. Serotipi SAT1-3, A, O in C se pojavljajo v Afriki, serotipi A, O in C v Južni Ameriki, serotipi Asia-1, A, O in C pa v Aziji. Bolezen se pojavlja pri govedu, konjih, ovcah, kozah in prašičih ter povzroča visoko vročino, izgubo teže ter razjede na nogah in v ustih. Pri odraslih živalih okužba po navadi izzveni po dveh tednih, pri mladih pa je smrtnost relativno visoka (Kamel in sod., 2019). V živinorejski prireji torej predstavlja velik problem (Shahid in Daniell, 2016). Trenutno se za zaščito pred slinavko in parkljevko večinoma uporablja klasična cepiva z inaktiviranim virusom, ki nudijo le kratkotrajno zaščito ter za shranjevanje in distribucijo zahtevajo hladno verigo (Kamel in sod.,
12
2019). Rao in sod. (2012) so razvili bivalentno cepivo proti FMDV v rastlinah Crotalaria juncea, ki izražajo VP1 strukturni protein serotipov A in O. Hranjenje prašičev s transgenimi rastlinami je izzvalo specifičen humoralni imunski odziv. Serum imuniziranih prašičev so nato izpostavili FMDV in serum je nevtraliziral virus. Lentz in sod. (2010) so VP1 protein izrazili v kloroplastih tobaka in dosegli obetavne rezultate. Izvedenih je bilo še več drugih študij, pri katerih so bili kot ekspresijske platforme za cepivo proti FMD uporabljeni tobak, lucerna in paradižnik (Kamel in sod., 2019).
4.2.5 Atipična kokošja kuga (Newcastle disease)
Atipična kokošja kuga je bolezen, ki jo povzroča RNA virus, ki kodira 6 pomembnih proteinov: N (nukleokapsidni protein), M (protein matriksa), P (fosfoprotein), F (fuzijski protein), HN (hemaglutinin-neuraminidaza protein) in L (veliki protein polimeraze) (Ganar in sod., 2014). Atipična kokošja kuga se pojavlja pri perutnini in pticah. Simptomi vključujejo kašljanje, diarejo, zmanjšan apetit in depresijo (UK Government, 2014). Prvo cepivo, proizvedeno v rastlinah in odobreno s strani FDA, je bilo cepivo proti atipični kokošji kugi, ki je bilo pridobljeno s celično kulturo tobaka (Joensuu in sod., 2008). Poleg tega je bilo opravljenih še več drugih poskusov razvoja cepiva proti NDV v transgenih rastlinah.
Berinstein in sod. (2005) so glikoproteine NDV izrazili v transgenem krompirju, Molina in sod. (2007) v listih tobaka ter Yang in sod. (2007) v riževih semenih. Antigeni so se po oralnem vnosu cepiva v kokoši izkazali za imunogene in izkazana je bila zaščita proti virusu.
Shahid in sod. (2020) pa so izrazili F (fuzijski) in NH (hemaglutinin-neuraminidaza) proteine virusa v listih in semenih koruze ter dokazali prisotnost specifičnih protiteles v serumu oralno imuniziranih kokoši.
4.2.6 Parvovirus (CPV)
Parvovirus je široko razširjen virus z eno-verižno DNA in kapsido, ki jo sestavlja več proteinov: VP1, VP2 in VP3, od katerih je daleč največ VP2 proteina. Parvovirus okužuje pse, najpogosteje mladiče. Povzroči akutni gastroenteritis in miokarditis. Trenutno so za preprečevanje okužb s parvovirusom na voljo zgolj klasična cepiva, ki vsebujejo virus, ta pa so lahko nevarna za pse z zelo šibkim imunskim sistemom in pri njih povzročijo hude bolezni, prav tako pa so lahko v njih prisotni toksini, kar jih lahko naredi manj varne (Molina in sod., 2005). Opravljenih je bilo že veliko raziskav na področju zdravil in cepiv proti CPV, proizvedenih s transgenimi rastlinami, da bi se našlo alternativo klasičnim cepivom (Shahid in Daniell, 2016). Molina in sod. (2004) so imunizirali miši s CTB-2L21 in GFP-2L21 peptidom iz CPV VP2 proteina, Ortigosa in sod. (2010) pa z 2L21-TD peptidom, izraženim v kloroplastih tobaka. Rezultat je bil visok titer IgA in IgG1 protiteles proti viralnemu VP2 proteinu.
13
4.2.7 Prašičji reproduktivni in respiratorni sindrom (PRRSV)
Prašičji reproduktivni in respiratorni sindrom je bolezen, ki povzroči največ škode v prašičereji po celem svetu. Virus se hitro širi in bolezen prizadene prašiče vseh starosti. Z reproduktivnega vidika prizadene prašičje samice, pri vseh prašičih pa se pojavijo respiratorne težave (An in sod., 2018). Trenutno se za nadzor nad boleznijo uporabljajo samo klasična cepiva, ki vsebujejo mrtev ali atenuiran živ virus, ta cepiva pa so nizko učinkovita in njihova varnost je vprašljiva (Hu in sod., 2012). Hu in sod. (2012) so proizvedli cepivo proti PRRSV s pomočjo genetsko spremenjenega kalusa koruze, ki je izražal M protein ovojnice virusa. S transgenim kalusom so oralno imunizirali miši, ki so proizvedle visok titer IgA in IgG protiteles, inducirana protitelesa pa so imela tudi nevtralizacijsko aktivnost. An in sod. (2018) so v navadnem repnjakovcu izrazili GP4D in GP5D proteine PRRSV. Pri prašičih, imuniziranih s transgenimi rastlinami, je prišlo do humoralnega in celično-posredovanega imunskega odziva.
4.2.8 Goveja virusna diareja (BVD)
Goveja virusna diareja je nalezljiva bolezen, za katero večinoma zboleva govedo. Povzročitelj bolezni, virus goveje virusne diareje (BVDV), spada v družino Flaviviridae in ima enoverižni RNA genom, ki kodira vsaj 4 strukturne proteine: kapsidni protein (C), Erns (glikoprotein ovojnice z RNAzo) in dva zunanja glikoproteina (E1 in E2). Bolezen pri govedu povzroči imunosupresivne simptome ter vpliva na respiratorne funkcije in plodnost. Posebna vrsta BVD povzroči mukozno bolezen, ki se lahko preko maternice prenese na fetus preko matere, ki ne kaže simptomov. Trenutno uporabljana cepiva vsebujejo modificirane žive viruse ali mrtve viruse. Cepiva z živimi virusi nudijo daljšo zaščito, vendar imajo tudi veliko slabosti.
Zaradi tega se je začelo proučevati rekombinantna cepiva, primarno osredotočena na E2 protein, poleg tega pa tudi rekombinantna cepiva, proizvedena v rastlinah (Meyers, 2018).
Nelson in sod. (2012) so transformirali tobak za sintezo skrajšane verzije imunogenega E2 proteina (tE2). V listih se je akumuliralo do 20 µg tE2 na gram svežih listov. V serumu morskih prašičkov, podkožno imuniziranih z 20 µg tE2, zmešanega z adjuvansom, je bila dokazana prisotnost nevtralizirajočih protiteles. Aguirreburualde in sod. (2013) so transformirali lucerno, ki je izražala rekombinantni fuzijski protein (tE2 združen s scFv). Po uspešnem preizkusu na morskih prašičkih je sledila imunizacija goveda s 3 µg produkta in prišlo je do nastanka nevtralizacijskih protiteles ter pri izpostavitvi živemu virusu do popolne zaščite pred le-tem.
4.3 IMUNOKONTRACEPCIJA
Nadzorovanje razmnoževanja živali je pomembno tako pri živalih v ujetništvu (npr. na kmetijah), kakor tudi v naravi v primeru prekomernega množenja določenih (invazivnih) vrst živali. Perspektivna strategija za nadzor nad populacijami vretenčarjev je imunokontracepcija, ki predstavlja bolj human in živalim prijazen način nadzorovanja množenja živali. Pri
14
imunokontracepciji se uporabi cepivo, ki sproži nastanek protiteles proti lastnim reproduktivnim antigenom, kar zmanjša plodnost živali. V večini primerov tarčni antigen predstavlja cona pelucida (ZP), ki obdaja oocito in je sestavljena iz treh glikoproteinov. Eden od glikoproteinov, ZP3, predstavlja primarno vezavno mesto za spermije, zato je zanimiva tarča pri imunokontracepciji (Guan in sod., 2013). Polkinghorne in sod. (2005) so izvedli poskus na samicah oposumov, tako da so jih imunizirali z injekcijo sintetičnih ZP antigenov in samicam se je plodnost zmanjšala za 75-80 %. Reproduktivni antigeni, kot je ZP, izraženi v visokih nivojih v užitnih transgenih rastlinskih tkivih, bi torej lahko predstavljali učinkovit, enostaven, varen in poceni način imunokontracepcije, tako domačih kot divjih živali (Polkinghorne in sod., 2005).
5 OPTIMIZACIJA IZRAŽANJA ANTIGENOV V TRANSGENIH RASTLINAH
V preteklih raziskavah se je za glavni problem pri sintezi cepiv s transgenimi rastlinami izkazal nizek nivo izražanja antigenov v rastlinskem tkivu, zato je veliko znanstvenikov začelo raziskovati načine za izboljšanje ekspresijskih nivojev z namenom doseganja višjih koncentracij antigenov in pridobivanje cepiv z učinkovito imunološko funkcijo (Guan in sod., 2013). Na končno vsebnost antigena v ekspresijski platformi vpliva veliko različnih faktorjev, zato je potrebno premišljeno načrtovanje vseh faz genske ekspresije, od transkripcije do stabilnosti proteinov (Joensuu in sod., 2008).
5.1 OPTIMIZACIJA PROMOTORJEV
Izbira ustreznega rastlinskega promotorja je pomemben način za povečanje izražanja eksogenega gena v rastlini. Trenutno se pri genskem inženiringu rastlin večinoma uporabljajo močni konstitutivni promotorji, npr. CaMV 35S promotor za dvokaličnice, aktinski promotor riža (ACT1) in ubikvitinski promotor koruze (Ubi-1) za enokaličnice. Konstitutivni promotorji navadno povzročijo konstantno in neprekinjeno izražanje tarčnih genov v tkivih rastlin, kar vodi v čezmerno porabo energije in produktov v celici. Konstitutivna ekspresija lahko zato vodi do nezmožnosti učinkovite regulacije izražanja tarčnih genov, tako v časovnem kot v prostorskem smislu. To lahko zmoti notranje metabolno ravnovesje rastline, kar ni ugodno za povečanje količine in izboljšanje kakovosti ekspresije tarčnih genov v transgeni rastlini. Za povečanje pridobivanja cepiv ali drugih medicinsko pomembnih proteinov bi se morali eksogeni geni izražati samo ob določenem času ali v določenih obdobjih in samo v določenih tkivih oz. organih, namesto v celotni rastlini. To se lahko doseže z uporabo inducibilnih ali tkivno-specifičnih promotorjev (Guan in sod., 2013).
5.2 OPTIMIZACIJA KODONOV
Povečanje izražanja tujih genov v transgenih rastlinah se lahko doseže z optimizacijo kodonov. Pri tem pristopu se kodone tujega gena preuči in zamenja s kompatibilnimi kodoni
15
gostiteljske rastline, saj se rastline, živali in mikrobi razlikujejo po vrstno specifičnih kodonih (Shahid in Daniell, 2016). V več raziskavah je bilo dokazano, da se z optimizacijo kodonov lahko občutno izboljša nivo izražanja tujih genov (Guan in sod., 2013), tudi v primeru izražanja antigenov za cepiva, kot je npr. toplotno labilna B podenota enterotoksina E. coli (LT-B). Akumulacija LT-B se je v gomoljih krompirja povečala od 5 do 40-krat ob uporabi gena z optimiziranimi kodoni v primerjavi z nemodificiranim LT-B genom (Mason in sod., 1998).
5.3 UPORABA SIGNALNIH PEPTIDOV
Znotrajcelično okolje, v katerem se rekombinantni protein akumulira, vpliva na njegovo zvijanje in post-translacijske modifikacije. Faktorji, kot je pH in prisotnost šaperonov ali proteaz, lahko vplivajo na stabilnost antigena in s tem na njegovo akumulacijo (Joensuu in sod., 2008). Z uporabo različnih signalnih peptidov lahko protein usmerimo v določen celični del oz. organel.
Endoplazemski retikulum (ER) v rastlinskih celicah eksogeni protein stabilizira in mu nudi relativno stabilno okolje za dozorevanje (Guan in sod., 2013). Okolje je oksidativno, prisotnih pa je veliko molekulskih šaperonov in zelo malo proteaz (Joensuu in sod., 2008). Dodatek ER-retencijskega signala na C-konec, ki protein zadrži v endoplazemskem retikulumu, lahko zato poveča akumulacijo rekombinantnih proteinov v transgenih rastlinah (Guan in sod., 2013). N-terminalni signalni peptid lahko rekombinantne proteine usmeri v sekrecijo. Izločeni proteini so z ER navadno transportirani skozi Golgijev aparat do apoplasta, če pa je prisoten ustrezen signal, so usmerjeni v vakuolo. Proteini se lahko v apoplastu ohranijo v matriksu celične stene ali pa se izločijo iz celice, odvisno od velikosti in strukture proteina. Primerjalna analiza rekombinantnih protiteles je pokazala, da se le-ta akumulirajo bolj učinkovito, če so usmerjena v sekrecijo, kakor pa če so usmerjena v citoplazmo, ki za proteine predstavlja manj ugodno okolje (Schillberg in sod., 1999). Enako je bilo dokazano za antigene cepiv.
Streatfield in sod. (2003) so proučevali znotrajcelično usmerjanje LT-B proteina v semenih koruze. Pri usmeritvi rekombinantnih proteinov v apoplast in vakuolo je bil nivo izražanja 3080-krat in 20 000-krat višji v primerjavi z usmeritvijo v citoplazmo. Rekombinantne proteine se lahko usmeri tudi v organele, kot so mitohondriji in plastidi, z dodatkom N- terminalnih tranzitnih peptidov, ki jih prepozna transportni sistem organelov in proteine transportira v organele (Joensuu in sod., 2008).
5.4 UPORABA FUZIJSKIH PROTEINOV
Fuzijski peptidi ali celotni proteini lahko izboljšajo stabilnost izbranega antigena v rastlinskih tkivih in med samim vnosom cepiva. Ta pristop se pogosto uporablja za peptide, proizvedene z viralnim ekspresijskim sistemom, uporablja pa se tudi za optimizacijo izražanja antigena pri stabilno transformiranih rastlinah. Primeri fuzijskih partnerjev za antigene cepiv so zeleni fluorescenčni protein (GFP), β-glukuronidaza (GUS) ter podenoti toksina kolere CT-B in CT-
16
A. Fuzija antigena z markerskimi geni omogoča tudi lažjo kontrolo sinteze antigena (Joensuu in sod., 2008).
5.5 UPORABA KLOROPLASTNE TRANSFORMACIJE
Kloroplastna transformacija lahko omogoči sintezo večje količine rekombinantnih proteinov kot jedrna transformacija. Razlog je v večjem številu kopij transgena - ena celica lahko vsebuje do 10 000 kopij plastidnega genoma. Transgene se vgradi v kloroplastni genom s pomočjo specifične integracije in kljub veliki akumulaciji transkriptov še ni bilo zabeleženo utišanje transgenov. Poleg tega kloroplasti predstavljajo omejeno okolje znotraj celice z ugodnejšimi razmerami za proteine, saj se potencialno toksične snovi iz njih izločijo. Slabost kloroplastne transformacije je, da kloroplasti niso zmožni vseh post-translacijskih modifikacij, zato so najbolj primerni za izražanje proteinov, ki ne potrebujejo zapletenega zlaganja ali glikozilacije (Joensuu in sod., 2008). Primerni so torej za izražanje bakterijskih antigenov, manj pa za izražanje glikoproteinov (Guan in sod., 2013). Pri izražanju humanih ali virusnih genov v kloroplastih je lahko nivo izražanja zelo nizek, vendar si lahko pomagamo z optimizacijo kodonov, pri kateri se odstrani redke kodone in uporabi ustreznejše.
S pomočjo kloroplastne transformacije so bile do sedaj uspešno povečane količine različnih antigenov za cepiva, med drugim za cepivo proti antraksu, parvovirusu, rotavirusu in tetanusu (Shahid in Daniell, 2016).
6 POTENCIALNA TVEGANJA IN REŠITVE
Veterinarska cepiva, proizvedena v transgenih rastlinah, bi lahko imela za našo družbo ogromno ekonomskih in socialnih koristi, vendar je z njimi povezanih tudi več potencialnih tveganj, ki se tičejo zdravja živali in širšega okolja.
6.1 VARNOSTNA TVEGANJA
Oralna cepiva, pridobljena s pomočjo transgenih rastlin, bi lahko pri živalih povzročila alergijski odziv ali oralno toleranco. Post-translacijske modifikacije, kot je N-glikozilacija, bi lahko izzvale alergijsko reakcijo, vnos cepiva z adjuvansom (za povečano stimulacijo mukoznega imunskega sistema) pa hipersenzitiven odziv na druge, ne-tarčne proteine, uživane z navadno, vsakodnevno hrano (Guan in sod., 2013). Reden oralni vnos takšnih cepiv lahko okrepi aktivacijo regulatornih T-celic proti antigenu v cepivu, kot npr. pri hiposenzitizacijski terapiji z oralnim vnosom antigena v primerih alergije na cvetni prah ali določeno hrano (Takeyama in sod., 2015).
6.2 OKOLJSKA TVEGANJA
Drugo potencialno tveganje uporabe cepiv, proizvedenih v transgenih rastlinah, je njihov vpliv na okolje. Pri gojenju transgenih rastlin na prostem bi lahko prišlo do kontaminacije ne-
17
transgenih rastlin, namenjenih za prehrano ljudi ali živali. Rekombinantni geni se lahko razširijo na druge rastline preko peloda in s tem se nenamerno povzroči genske modifikacije ne-tarčnih rastlin. Genetsko modificirane rastline bi lahko zaužile divje živali ali pa bi jih po nesreči pobrali ljudje. Transgeni bi se lahko razširili tudi preko žuželk ali izpusta kontaminirane vode v okolje (Takeyama in sod., 2015). S širjenjem transgenov v okolje bi lahko prišlo do porušenja ekološkega ravnovesja, kontaminacije naravnega genskega sklada in nepričakovanih negativnih vplivov na okolje (Guan in sod., 2013), predvsem v primeru, da bi se transgen razširil nad divjim tipom. Vse negativne posledice bi lahko vodile v zmanjšanje naravne biodiverzitete. Verjetnost in resnost posameznih tveganj se razlikuje in je odvisna od rastlinske vrste in antigena, zato morajo biti tveganja preučena za vsak primer posebej (Takeyama in sod., 2015).
6.3 REŠITVE
Številne potencialne negativne učinke na okolje in zdravje živali se lahko z različnimi metodami zmanjša oz. prepreči. Potencialna varnostna tveganja se lahko zmanjša z izbiro ustreznih ekspresijskih platform, ki imajo sposobnost ustreznih post-translacijskih modifikacij in ne producirajo toksinov. Prenosu transgenov v okolje preko peloda se lahko izognemo z uporabo kloroplastne transformacije, kjer se transgen vstavi v kloroplastni genom, kloroplastna DNA pa se deduje maternalno, zato se transgen ne bo nahajal v pelodu (Guan in sod., 2013). Pobiranje listov gensko spremenjene rastline s pomočjo kloroplastne transformacije pred cvetenjem prepreči tudi ''uhajanje'' transgena v okolje preko semen (Shahid in Daniell, 2016). Smiselno je tudi uporabljati rastline, ki imajo možnost vegetativnega razmnoževanja, saj se s tem zmanjša tveganje za križanje z ne-transgenimi rastlinami na prostem (Liew in Hair-Bejo, 2015). Poleg tega se lahko določene rastline za pridobivanje cepiv goji tudi v rastlinjakih in drugih zaprtih prostorih in se s tem zmanjša možnost prenosa genskega materiala na ne-transgene rastline, lahko pa se aktivne komponente za cepiva pridobiva s pomočjo in vitro kultur.
Razvija se tudi nove napredne metode za zmanjšanje potencialnih negativnih vplivov na okolje, kot je npr. tehnika odstranjevanja eksogenega gena. Gre za posebno tehniko, pri kateri se v tarčne transgene rastline vstavi poseben gen pod kontrolo promotorja DNA regulatornega fragmenta. Vstavljeni posebni gen nato spontano odstrani eksogeni gen ob določenem času ali na določenem mestu v rastlini. Tako pelod, plodovi in semena transgenih rastlin ne vsebujejo transgena. S pomočjo te tehnike se lahko iz gensko spremenjenih rastlin po določeni razvojni fazi pridobiva ne-transgene rastline (Guan in sod., 2013).
7 ZAKLJUČEK
Kljub intenzivnim raziskavam, ki potekajo že več kot 20 let, veterinarska cepiva iz transgenih rastlin še vedno niso dosegla trga, vendar novi napredki na tem področju dajejo upanje, da se
18
bo to zgodilo že v bližji prihodnosti. Razvita tehnologija je učinkovita, količine sintetiziranih rekombinantnih proteinov so dovolj velike, stestiranih je bilo že veliko cepiv za zelo različne patogene, obstajajo nove tehnike za povečanje varnosti takšnih cepiv in regulatorni organi so končno pripravljeni sprejeti idejo cepiv, pridobljenih iz transgenih rastlin. Takšna veterinarska cepiva bi predvsem v živinorejski proizvodnji bistveno olajšala proces cepljenja in znižala stroške zaradi enostavnejšega shranjevanja in transporta cepiva, zaradi česar bi bila cepiva dostopnejša. To je še posebej pomembno za države v razvoju, kjer se trenutno živalske bolezni širijo veliko hitreje kot v razvitejših državah ravno zaradi vseh pomanjkljivosti cepiv, ki se trenutno uporabljajo za nadzor nad živalskimi boleznimi. Omejitev širjenja živalskih bolezni bi doprinesla tako k blaginji živalske kot tudi človeške populacije.
8 VIRI
Aguirreburualde M. S. P., Gómez M. C., Ostachuk A., Wolman F., Albanesi G., Pecora A., Odeon A., Ardila F., Escribano J. M., Dus Santos M. J., Wigdorovitz A. 2013. Efficacy of a BVDV subunit vaccine produced in alfalfa transgenic plants. Veterinary Immunology and Immunopathology, 151, 3-4: 315-324
An C. H., Nazki S., Park S. C., Jeong Y. J., Lee J. H., Park S. J., Khatun A., Kim W. I., Park Y. I., Jeong J. C., Kim C. Y. 2018. Plant synthetic GP4 and GP5 proteins from porcine reproductive and respiratory syndrome virus elicit immune responses in pigs. Planta, 247, 1: 973–985
Baltes N. J., Gil-Humanes J., Voytas D. F. 2017. Chapter One - Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science, 149, 1: 1-26
Berinstein A., Vazquez-Rovere C., Asurmendi S., Gómez E., Zanetti F., Zabal O., Tozzini A., Conte Grand D., Taboga O., Calamante G., Barrios H., Hopp E., Carrillo E. 2005. Mucosal and systemic immunization elicited by Newcastle disease virus (NDV) transgenic plants as antigens. Vaccine, 23, 48-49: 5583-5589
Ceballo Y., Lopez A., Tiel K., Hernandez A. 2018. Plant-produced avian influenza antigens.
V: Prospects of Plant-Based Vaccines in Veterinary Medicine. MacDonald J. (ur.).
Springer, Cham: 189-208
Chan H. T., Daniell H. 2015. Plant-made oral vaccines against human infectious diseases - Are we there yet? Plant Biotechnology, 13, 8: 1056-1070
FDA. 2020. Get the Facts About Listeria. U.S. Food and Drug Administration.
https://www.fda.gov/ (20. apr. 2021)
Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Twyman R. M. 2004. Plant-based production of biopharmaceuticals. Current Opinion in Plant Biology, 7, 2: 152-158
Ganar K., Das M., Sinha S., Kumar S. 2014. Newcastle disease virus: Current status and our understanding. Virus Research, 184, 1: 71-81
19
Guan Z. J., Guo B., Huo Y. L., Guan Z. P., Dai J. K., Wei Y. H. 2013. Recent advances and safety issues of transgenic plant-derived vaccines. Applied Microbiology and Biotechnology, 97, 7: 2817–2840
Hahn B.S., Jeon I. S., Jung Y. J., Kim J. B., Park J. S., Ha S. H., Kim K. H., Kim H. M., Yang J. S., Kim Y. H. 2007. Expression of hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus in transgenic tobacco. Plant Biotechnology Reports, 1, 1: 85–92
Hu J., Ni Y., Dryman B. A., Meng X. J., Zhang C. 2012. Immunogenicity study of plant-made oral subunit vaccine against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Vaccine, 30, 12: 2068-2074
Hugh-Jones M. E. 2015. Overview of Anthrax. MSD Veterinary Manual.
https://www.msdvetmanual.com/ (20. apr. 2021)
Jayalakshmi K., Paramasivam M., Sasikala M., Tamilam T. V., Sumithra A. 2017. Review on antibiotic residues in animal products and its impact on environments and human health.
Journal of Entomology and Zoology Studies, 5, 3: 1446-1451
Joensuu J. J., Niklander-Teeri V., Brandle J. E. 2008. Transgenic plants for animal health:
plant-made vaccine antigens for animal infectious disease control. Phytochemistry Reviews, 7, 1: 553–577
Jung M., Shin Y. J., Kim J., Cha S. B., Lee W. J., Shin M. K., Shin S. W., Yang M. S., Jang Y. S., Kwon T. H., Yoo H. S. 2014. Induction of immune responses in mice and pigs by oral administration of classical swine fever virus E2 protein expressed in rice calli.
Archives of Virology, 159, 1: 3219-3230
Kamel M., El-Sayed A., Castañeda Vazquez H. 2019. Foot-and-mouth disease vaccines:
recent updates and future perspectives. Archives of Virology, 164, 1: 1501-1513
Koya V., Moayeri M., Leppla S. H., Daniell H. 2005. Plant-based vaccine: Mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge.
Infection and Immunity, 73, 12: 8266-8274
Kurup V. M., Thomas J. 2020. Edible vaccines: Promises and challenges. Molecular Biotechnology, 62, 2: 79–90
Lee G., Na Y. J., Yang B. G., Choi J. P., Seo Y. B., Hong C. P., Yun C. H., Kim D. H., Sohn E. J., Kim J. H., Sung Y. C., Kim Y. K., Jang M. H., Hwang I. 2014. Oral immunization of haemaggulutinin H5 expressed in plant endoplasmic reticulum with adjuvant saponin protects mice against highly pathogenic avian influenza A virus infection. Plant Biotechnology Journal, 13, 1: 62-72
Lentz E. M., Segretin M. E., Morgenfeld M. M., Wirth S. A., Dus Santos M. J., Mozgovoj M.
V., Wigdorovitz A., Bravo-Almonacid F. F. 2010. High expression level of a foot and mouth disease virus epitope in tobacco transplastomic plants. Planta, 231, 2: 387-395 Liew P. S., Hair-Bejo M. 2015. Farming of plant-based veterinary vaccines and their
applications for disease prevention in animals. Advances in Virology, 2015: 1-12
Loza-Rubio E., Rojas-Anaya E. 2014. Edible rabies vaccines. V: Commercial Plant-Produced Recombinant Protein Products. Howard J., Hood E. (ur.). Berlin, Springer: 153-177
20
Loza-Rubio E., Rojas-Anaya E., Lopez J., Olivera-Flores M.T., Gomez-Lim M., Tapia-Perez G. 2010. Induction of a protective immune response to rabies virus in sheep after oral immunization with transgenic maize, expressing the rabies virus glycoprotein. Vaccine, 30, 37: 5551-5556
Mason H. S., Haq T. A., Clements J. D., Arntzen C. J. 1998. Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic LT-B gene. Vaccine, 16, 13: 1336-1343
Massa S., Paolini F., Marino C., Franconi R., Venuti A. 2019. Bioproduction of a therapeutic vaccine against human papillomavirus in tomato hairy root cultures. Frontiers in Plant Science, 10, 452: 1-15
McGarvey, P., Hammond, J., Dienelt, M., Hooper D. C., Fu Z. F., Dietzschold B., Koprowski H., Michaels F. H. 1995. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes. Nature Biotechnology, 13, 1: 1484–1487
Meyers A. 2018. Diseases with Limited Research of Plant-Based Vaccines. V: Prospects of plant-based vaccines in veterinary medicine. MacDonald J. (ur.). Ontario, Western University: 347–367
Molina A., Hervás-Stubbs S., Daniell H., Mingo-Castel A. M., Veramendi J. 2004. High-yield expression of a viral peptide animal vaccine in transgenic tobacco chloroplasts. Plant Biotechnoly Journal, 2, 2: 141-153
Molina A., Veramendi J., Hervás-Stubbs S. 2005. Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope from canine parvovirus.
Virology, 342, 2: 266-275
Nelson G., Marconi P., Periolo O., La Torre J., Alvarez M. A. 2012. Immunocompetent truncated E2 glycoprotein of bovine viral diarrhea virus (BVDV) expressed in Nicotiana tabacum plants: a candidate antigen for new generation of veterinary vaccines. Vaccine, 30, 30: 4499-4504
Ohya K., Matsumura T., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C. 2005. Ability of orally administered ifn-α-containing transgenic potato extracts to inhibit Listeria monocytogenes infection. Journal of Interferon & Cytokine Research, 25, 8: 459-466 Ortigosa S. M., Fernández-San Millán A., Veramendi J. 2010. Stable production of peptide
antigens in transgenic tobacco chloroplasts by fusion to the p53 tetramerisation domain.
Transgenic Research, 19, 4: 703-709
Phan H. T., Pham V. T., Ho T. T., Pham N. B., Chu H. H., Vu T. H, Abdelwhab E. M., Scheibner D., Mettenleiter T. C., Hanh T. X., Meister A., Gresch U., Conrad U. 2020.
Immunization with plant-derived multimeric H5 hemagglutinins protect chicken against highly pathogenic avian influenza virus H5N1. Vaccines, 8, 4: 593
Polkinghorne I., Hamerli D., Cowan P., Duckworth J. 2005. Plant-based immunocontraceptive control of wildlife—“potentials, limitations, and possums”. Vaccine, 23, 15: 1847-1850
Rao J. P., Agrawal P., Mohammad R., Rao S . K., Reddy G. R., Dechamma H. J., S Suryanarayana V. V. 2012. Expression of VP1 protein of serotype A and O of foot-and-
