Martina MODIC
VPLIV TANINSKEGA PRIPRAVKA FARMATAN® NA RAST IN ENCIMSKE AKTIVNOSTI BAKTERIJ Butyrivibrio fibrisolvens IN
Clostridium proteoclasticum
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij
INFLUENCE OF TANNIN PREPARATION FARMATAN® ON GROWTH AND ENZYME ACTIVITIES OF BACTERIA Butyrivibrio
fibrisolvens AND Clostridium proteoclasticum
GRADUATION THESIS University studies
Ljubljana, 2007
Diplomsko delo predstavlja zaključek univerzitetnega medoddelčnega dodiplomskega študija mikrobiologije. Opravljeno je bilo na Katedri za mikrobiologijo in mikrobno biotehnologijo Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete v Domžalah.
Študijska komisija univerzitetnega dodiplomskega študija mikrobiologije je dne 20. 10.
2005 odobrila temo in naslov diplomske naloge in za mentorico diplomskega dela imenovala prof. dr. Romano Marinšek Logar. Za recenzenta je bil imenovan prof. dr.
Gorazd Avguštin.
Mentorica: prof. dr. Romana Marinšek Logar
Recenzent: prof. dr. Gorazd Avguštin
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Franc Viktor Nekrep
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Članica: prof. dr. Romana Marinšek Logar
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Gorazd Avguštin
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum zagovora:
Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Martina Modic
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD
DK KG AV SA KZ ZA LI IN
TD OP IJ JI AI
Dn
UDK 579.22:577.15:636.2./3.085 (043) = 863
vampni mikroorganizmi/Butyrivibrio fibrisolvens/Clostridium
proteoclasticum/tanini/Farmatan®/rast bakterij/encimi/encimske aktivnosti MODIC, Martina
MARINŠEK LOGAR, Romana (mentor)/AVGUŠTIN, Gorazd (recenzent) SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medodelčnega študija mikrobiologije
2007
VPLIV TANINSKEGA PRIPRAVKA FARMATAN® NA RAST IN ENCIMSKE AKTIVNOSTI BAKTERIJ Butyrivibrio fibrisolvens IN Clostridium proteoclasticum
Diplomsko delo (Univerzitetni študij) XII, 59 str., 1 pregl., 22 sl., 95 vir.
sl sl/en
Vamp je stabilen in dinamičen ekosistem, v katerem se je izoblikovala kompleksna mikrobna združba, ki omogoča svojemu gostitelju razgradnjo raslinskih polisaharidov, za katere sam nima encimov. V vamp s krmo prihajajo tudi za vampne mikroorganizme škodljive snovi. Med njimi so tudi tanini. To je velika in heterogena skupina polifenolnih molekul. Njihova skupna lastnost je, da so sposobni tvorbe stabilnih kompleksov z raznimi makromolekulami, kar ima na razgradljivost hranil in na vampne mikroorganizme različne vplive. V manjših koncentracijah tanini s tvorbo kompleksov s proteini le-te ščitijo pred neželeno razgradnjo. Na ta način se pri živali poveča oskrba z beljakovinami in posledično tudi prirast živali. Večje koncentracije pa lahko negativno vplivajo na metabolne procese ter tudi na samo zdravje živali. V diplomski nalogi smo preverili vpliv taninskega pripravka Farmatan® na vampni bakteriji, Butyrivibrio fibrisolvens in Clostridium proteoclasticum. Uporabili smo tri koncentracije Farmatana® (0,05 g/l, 0,25 g/l in 1,00 g/l), vpliv smo preverjali pri 7 inkubacijskih časih (5,10, 13,16, 20, 32 in 48 urah). Preverjali smo vpliv na rast in encimske aktivnosti. Rast smo ugotavljali z merjenjem količine celičnih proteinov. Pri encimskih aktivnostih smo spremljali celične in izvencelične aktivnosti amilaz, karboksimetil celulaz (CMC-az), ksilanaz in proteaz. Farmatan® je vplival na rast obeh bakterij, ta se je povečala. Pri B. fibrisolvens smo opazili velik vpliv na celične aktivnosti vseh encimov, predvsem zaviralen. Pri celični amilolitični aktivnosti z večanjem koncentracije taninovaktivnosti prej dosežejo maksimalne vrednosti. Inhibicija se je v največji meri izražala pri proteolitični aktivnosti. Pri C. proteclasticum vpliv ni bil tako izrazit. V večini primerov so tanini inhibirali encimske aktivnosti. Na proteolizo ni bilo opaziti značilnega vpliva. Z naraščanjem koncentracije se je vpliv Farmatana® večal. Obseg vpliva na bakteriji je odvisen od lastnosti posamezne vrste ter od koncentracije njihovih encimov.
KEY WORDS DOCUMENTATION DN
DC CX AU AA PP PB PY TI
DT NO LA AL AB
Dn
UDC 579.22:577.15:636.2./3.085 (043) = 863
rumen microorganisms/Butyrivibrio fibrisolvens/Clostridium
proteoclasticum/tannins/ Farmatan®/bacterial growth/ enzymes/enzyme activity MODIC, Martina
MARINŠEK LOGAR, Romana (supervisor)/AVGUŠTIN, Gorazd (reviewer) SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Interdepartmental Programme in Microbiology
2007
INFLUENCE OF TANNIN PREPARATION FARMATAN® ON GROWTH AND ENZYME ACTIVITIES OF BACTERIA Butyrivibrio fibrisolvens AND Clostridium proteoclasticum
Graduation Thesis (University studies) XII, 59 p., 1 t., 22 fig., 95 ref.
sl sl/en
Rumen is stable and dynamic ecosystem, containing of complex microbial community. Rumen microorganisms can degrade most of the plant polymers present in the food. During the digestion, organisms in rumen get in contact with different substances, some of them acting as antinutrients. Tannins are naturally occuring plant polyphenols with heterogeneous structures and molekular weight.
Their main characteristic is that they can bind and form stable complexes with various macromolecules. This can have an influence on the nutritive value of the feed and also on the digestion processes. Low concentrations of tannins reduce rumen forage protein degradation due to reversible binding to proteins, which can result in increased growth rate and production of ruminants. On the other hand, high cencentrations generally reduce voluntary feed intake, digestibilities and also health status of animal. The main goal of our experiment was to evaluate the influence of tannin preparation Farmatan®on growth and enzyme activities of two rumen bacteria, Butyrivibrio fibrisolvens and Clostridium proteoclasticum. We have tested 3 different concentrations of Farmatan® i.e. 0,05 g/l, 0,25 g/l and 1,00 g/l. The measurements have been taken at 7 different times of incubation – after 5, 10, 13, 16, 20 32 and 48 hours. Cell growth (proteins) and enzyme activities of xylanases, carboxymethylcellulases, amylases and proteases were measured in supernatants and cell extracts. Farmatan® improved growth of both tested bacterial species. B. fibrisolvens and C. proteoclasticum cellular xylanase, CMC- ase and protease activities were significantly reduced, specially at concentrations 0,25 and 1,00 g/l. Proteolytic activity of B. fibrisolvens has been influenced at the highest rate unlike at C. proteoclasticum. The degree of tannins influence on bacteria depends on concentration of tannins and on specific bacterial properties.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO SLIK Error! Bookmark not defined.
KAZALO PRILOG XI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XIV
1 UVOD 1
1.1 GLAVNE HIPOTEZE IN NAMEN DELA 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 VAMPNI EKOSISTEM 3
2.1.1 Zgradba in funkcija želodca 3
2.1.2 Razmere v vampu 3 2.1.3 Proces prebave 4 2.1.4 Mikrobna razgradnja krme 4
2.1.4.1 Škrob in amilolitični mikroorganizmi 5
2.1.4.2 Celuloza in celulolitični mikroorganizmi 5
2.1.4.3 Hemiceluloza in ksilanolitični mikroorganizmi 6 2.1.4.4 Dušikove spojine in proteolitični mikroorganizmi 6
2.2 Butyrivibrio 7 2.2.1 B. fibrisolvens 8 2.3 Clostridium 9
2.3.1 C. proteoclasticum 9 2.4 SEKUNDARNI METABOLITI RASTLIN V PREHRANI PREŽVEKOVALCEV 10
2.4.1 Tanini 10
2.4.1.1 Kondenzirani tanini 11
2.4.1.2 Hidrolizirajoči tanini 12
2.5 VLOGA TANINOV V PREBAVNEM TRAKTU ŽIVALI 12
2.5.1 Vpliv delovanja taninov na prirast živali 12 2.5.2 Vpliv vezave taninov s proteini na proteolizo 13 2.5.3 Vpliv vezave taninov na razgradnjo ogljikovih hidratov 14
2.5.4 Vpliv taninov na rast in encimske aktivnosti mikroorganizmov 14
2.5.4.1 Vpliv taninov na morfologijo mikroorganizmov 15
2.5.5 Vpliv taninov na metabolizem vitaminov in mineralov 15
2.5.6 Vloga taninov pri preprečevanju napenjanja 15
2.5.7 Prilagoditev živali na tanine 16 2.5.8 Prilagoditev mikroorganizmov na tanine 16
2.5.9 Uporabnost taninov 17
3. MATERIALI IN METODE 18
3.1 GOJENJE BAKTERIJ 18
3.1.1 Bakterijski sevi 18
3.1.2 Gojišče 18 3.1.3 Tehnike gojenja in shranjevanja anaerobnih kultur 19
3.1.4 Priprava raztopin Farmatana® ter priprava vzorcev bakterijskih kultur za
določanje rasti in encimskih aktivnosti 19
3.2 SPREMLJANJE RASTI BAKTERIJSKIH KULTUR 20
3.2.1 Ugotavljanje koncentracije proteinov kot mera rasti bakterijskih kultur 20
3.3 KVANTITATIVNO DOLOČANJE ENCIMSKIH AKTIVNOSTI 20
3.3.1 Merjenje amilazne encimske aktivnosti 20 3.3.2 Merjenje CMC-azne encimske aktivnosti 21 3.3.3 Merjenje ksilanazne encimske aktivnosti 22 3.3.4 Merjenje proteazne encimske aktivnosti 22
3.5 SHEMATSKI POTEK DELA 24
4. REZULTATI 25
4.1 RAST IN ENCIMSKE AKTIVNOSTI BAKTERIJE B. fibrisolvens 25 4.2 RAST IN ENCIMSKE AKTIVNOSTI BAKTERIJE C. proteoclasticum 31
5 RAZPRAVA IN SKLEPI 38
5.1 VPLIV FARMATANA® NA RAST BAKTERIJ B. fibrisolvens IN C.
proteoclasticum 38 5.2 VPLIV FARMATANA® NA AMILOLITIČNO AKTIVNOST BAKTERIJ B.
fibrisolvens IN C. proteoclasticum 40 5.3 VPLIV FARMATANA® NA CMC-azno AKTIVNOST BAKTERIJ B. fibrisolvens IN C. proteoclasticum 41 5.4 VPLIV FARMATANA® NA KSILANOLITIČNO AKTIVNOST BAKTERIJ B.
fibrisolvens IN C. proteoclasticum 42 5.5 VPLIV FARMATANA® NA PROTEOLITIČNO AKTIVNOST BAKTERIJ B.
fibrisolvens IN C. proteoclasticum 43
5.6 SKLEPI 47
6 POVZETEK 49
7 VIRI 51
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
STR.
Preglednica 1: Oznake bakterijskih sevov, na katerih smo ugotavljali vpliv taninskega pripravka Farmatan®
18
Slika 1:
Slika 2:
Slika 3:
Slika 4:
Slika 5:
Slika 6:
Slika 7:
Slika 8:
Slika 9:
Slika 10:
Slika 11:
Slika 12:
Slika 13:
Slika 14:
KAZALO SLIK
Shematski prikaz mikrobne razgradnje krmnih proteinov in usoda končnih produktov vampu
Struktura polimernega kondenziranega tanina, ki prikazuje oznake obročev in ogljikovih atomov ter 4-8 in 4-6 interflavonoidnih vezi Strukturni formuli dveh podskupin hidrolizirajočih taninov - galotanina in elagitanina
Shema poteka dela pri preučevanju vpliva taninskega pripravka Farmatan® na rast in encimske aktivnosti vampnih bakterij B.
fibrisolvens in C. proteoclasticum
Rast bakterijske kulture B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Specifična celična amilolitična aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična amilolitična aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična celična CMC-azna aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična CMC-azna aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična celična ksilanolitična aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična ksilanolitična aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Specifična celična proteolitična aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična proteolitična aktivnost B. fibrisolvens pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Rast bakterijske kulture C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
STR.
7 11 12
24
25
26
27
27
28
29
29
30
31
31
Slika 15:
Slika 16:
Slika 17:
Slika 18:
Slika 19:
Slika 20:
Slika 21:
Slika 22:
Specifična celična amilolitična aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična amilolitična aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Specifična celična CMC-azna aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična CMC-azna aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Specifična celična ksilanolitična aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Specifična izvencelična ksilanolitična aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
Specifična celična proteolitična aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina Specifična izvencelična proteolitična aktivnost C. proteoclasticum pri treh različnih dodanih koncentracijah taninskega pripravka Farmatan® (0,05, 0,25 in 1,00 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina
32
33
33
34
35
35
36
37
KAZALO PRILOG PRILOGA A:
PRILOGA B1:
PRILOGA B2:
PRILOGA B3:
PRILOGA C:
PRILOGA D:
PRILOGA E:
PRILOGA F:
PRILOGA G:
PRILOGA H:
PRILOGA I:
PRILOGA J:
PRILOGA K:
PRILOGA L1:
PRILOGAL2:
Vir variabilnosti in statistična značilnost vplivov pri spremljanju rasti in encimskih aktivnosti bakterije B. fibrisolvens
Vpliv Farmatana® na rast bakterije B. fibrisolvens - ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0513) in razlike (SEE = 0.145) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na koncentracijo proteinov v supernatantu bakterijske kulture B. fibrisolvens - ocenjene srednje vrednosti (SEE=0.192) in razlike (SEE=0.542) s statistično značilnostjo razlik.
Koncentracija proteinov v supernatantu bakterijske kulture B.
fibrisolvens pri treh različnih koncentracijah Farmatana® (0,05 g/l, 0,25 g/l in 1 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina.
Vpliv Farmatana® na specifično celično amilolitično aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0151) in razlike (SEE = 0.0426) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično amilolitično aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE=0.0178)in razlike (SEE=0.0501) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično celično CMC-azno aktivnost bakterije B.
fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE=0.0224) in razlike (SEE=0.0632)s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično CMC-azno aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE=0.0026) in razlike (SEE=0.0072)s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično celično ksilanolitično aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.342) in razlike (SEE = 0.964) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično ksilanolitično aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0418) in razlike (SEE = 0.1178) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično celično proteolitično aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 2668.4) in razlike (SEE = 7535.9) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično proteolitično aktivnost bakterije B. fibrisolvens – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 8.82) in razlike (SEE = 24.88) s statistično značilnostjo razlik.
Vir variabilnosti in statistična značilnost vplivov pri spremljanju rasti in encimskih aktivnosti bakterije C. proteoclasticum
Vpliv Farmatana® na rast bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0240) in razlike (SEE = 0.0677) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na koncentracijo proteinov v supernatantu bakterijske kulture C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.076) in razlike (SEE = 0.214) s statistično značilnostjo razlik.
PRILOGA L3:
PRILOGA M:
PRILOGA N:
PRILOGA O:
PRILOGA P:
PRILOGA R:
PRILOGA S:
PRILOGA T:
PRILOGA U:
PRILOGA V:
Koncentracija proteinov v supernatantu bakterijske kulture C.
proteoclasticum pri treh različnih koncentracijah Farmatana® (0,05 g/l, 0,25 g/l in 1 g/l) in kontrolni kulturi brez dodanega tanina.
Vpliv Farmatana® na specifično celično amilolitično aktivnost bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0591) in razlike (SEE = 0.1666) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično amilolitično aktivnost bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.01852) in razlike (SEE = 0.05224) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično celično CMC-azno aktivnost bakterije C.
proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.01200) in razlike (SEE = 0.03378) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično CMC-azno aktivnost bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0025) in razlike (SEE = 0.0069) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično celično ksilanolitično aktivnost bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.1925) in razlike (SEE = 0.5430) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično ksilanolitično aktivnost bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 0.0352) in razlike (SEE = 0.0992) s statistično značilnostjo razlik.
Vpliv Farmatana® na specifično izvencelično proteolitično aktivnost bakterije C. proteoclasticum – ocenjene srednje vrednosti (SEE = 2.28) in razlike (SEE = 6.44) s statistično značilnostjo razlik.
Meritve pH kulture Butyrivibrio fibrisolvens po 24 in 48 urni inkubaciji v modificiranem M2 gojišču z dodanim Farmatanom®s končnimi koncentracijami 0.5, 0.25 ter 1.00 g/l ter pri kontrolni kulturi brez dodanega taninskega pripravka.
Izračunane srednje vrednosti specifične celične proteolitične aktivnosti bakterije C. proteoclasticum
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ΔA AK ATTC
B. fibrisolvens BSA
CMC CMC-aze
C. proteoclasticum Da
DNK DSM DTT h kat mV PAHBAH PEG PROT RS ΔRS
SEE TCA tg
U
Koncentracija razgrajenega azokazeina, ki je posledica delovanja encimov v vzorcih (razlika koncentracije vzorca in negativne kontrole)
aminokisline
ang.: American Type Culture Collection, Rockville; ameriška zbirka tipskih kultur
Butyrivibrio fibrisolvens
ang.: bovine serum albumin, goveji serumski albumin karboksimetil celuloza
karboksimetil celulaze Clostridium proteoclasticum
dalton, enota za molekulsko maso proteinov deoksiribonukleinska kislina
nem.: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig; nemška zbirka mikroorganizmov in celičnih kultur ditiotreitol
ura
katal, enota za količino encima, ki sprosti 1 mol produktov v 1 sekundi
milivolt, enota za električno napetost hidrazid parahidroksibenzojske kisline polietilenglikol
koncentracija proteinov redukcirajoči sladkorji
količina sproščenih reducirajočih sladkorjev zaradi delovanja encimov v vzorcih (razlika koncentracij vzorca in negativne kontrole)
standardna napaka ocene triklorocetna kislina podvojevalni čas
ang.: unit, enota – količina encima, ki razgradi 1 μg azokazeina v 1 uri
1 UVOD
Živinoreja je zaradi naravnih danosti v Sloveniji še vedno prevladujoča kmetijska panoga.
Kot druge gospodarske panoge, se tudi kmetijska dejavnost v današnjem času sooča z velikimi spremembami in novimi izzivi. Po eni strani napredki v tehnologiji omogočajo razvoj modernega in proizvodno učinkovitega kmetijstva, po drugi strani pa se povečujejo zahteve potrošnikov. Z zavedanjem ljudi o pomembnosti ohranjanja naravnega okolja in o skrbi za lastno zdravje, se pojavljajo potrebe po čimbolj naravnem načinu pridelave hrane.
Za dosego teh ciljev je zelo pomembno vzajemno sodelovanje različnih strok, tako iz naravoslovnih kot tudi družboslovnih ved. Delček k temu lahko prispevajo tudi raziskave iz področja mikrobiologije.
Prežvekovalci predstavljajo večinski delež živali, namenjenih za proizvodnjo hrane. Tako kot ostali predstavniki živalskega kraljestva, tudi sami nimajo lastnih encimov za razgradnjo kompleksnih rastlinskih polisaharidov. Pri teh procesih jim pomagajo mikroorganizmi, ki so s svojim gostiteljem v vampu vzpostavili učinkovito simbiozo.
Kljub temu, da mikrobni encimi živali zagotovijo poglavitni vir energije, potrebne za rast in proizvodnjo mesa, mleka in volne, nemalokrat ne dosegamo želenega obsega prireje.
Največkrat vzrok za to najdemo v pomanjkanju beljakovin v prehrani oz. neučinkoviti izrabi le-teh. Večina beljakovin, ki pride v vamp s krmo, se tam tudi razgradi. Večji del razgradnih produktov in nastale energije se porabi za rast in razmnoževanje mikroorganizmov, del pa z ostalimi nerazgrajenimi delci in mikrobno biomaso potuje do pravega želodca in tankega črevesja, kjer jih prebavijo encimi gostitelja. Optimalna sinteza mikrobnih proteinov v vampu poteka, ko je v zaužitem obroku pravo razmerje med energijo in razgradljivimi beljakovinami. V kolikor se to razmerje poruši, se dušik iz proteinov pretvarja v amoniak, ta pa se potem preko sečnine izloči iz organizma. Prevelike, vendar pa tudi prenizke koncentracije amoniaka posledično privedejo do zmanjšane prireje. Med rešitvami za izboljšanje preskrbe oz. zaščito proteinov pred razgradnjo v vampu veliko obetajo tanini.
Tanini so rastlinski sekundarni metaboliti, ki jih uvrščamo med polifenole. Tvorijo zelo veliko in heterogeno skupino, ki še vedno ni povsem jasno kemijsko definirana. Med seboj se razlikujejo po velikost, molekulski zgradbi, po mestu ter po deležu, s katerim se nahajajo v rastlini. Znanstveniki se o vlogi taninov v rastlinah še niso popolnoma zedinili, vendar prevladuje mnenje, da te molekule služijo kot obramba pred mikroorganizmi, insekti in rastlinojedimi živalmi. Vsem vrstam taninov je skupno, da se lahko z beljakovinami, ogljikovimi hidrati, minerali in vitamini povezujejo v komplekse. Zaradi te lastnosti so med rejci veljali za nezaželene, saj z vezavo na sestavine krme lahko zmanjšajo njihovo prebavljivost, dolgotrajno uživanje večjih koncentracij pa lahko privede tudi do zastrupitev. V zadnjem času pa odkrivajo tudi pozitivne značilnosti taninov, ki pripomorejo k boljši presnovi in zdravstvenemu stanju živali. Poleg porasta žive teže, izboljšanja kakovosti mleka in volne, poročajo tudi o pozitivnem vplivu taninov pri
preprečevanju napenjanja ter v boju s črevesnimi zajedalci. Večino od naštetega gre pripisati zmožnosti, da tanini tvorijo komplekse z makromolekulami, predvsem s proteini.
1.1 GLAVNE HIPOTEZE IN NAMEN DELA
Glede na to, da imajo tanini sposobnost reagiranja z makromolekulami, ki se pojavljajo v krmi prežvekovalcev ter s proteini, ki so tudi sestavni deli celične stene mikroorganizmov oz. encimov, ki sodelujejo v temeljnih metabolnih procesih, smo se v naši raziskavi osredotočili prav na te elemente vampnega ekosistema. Naš namen je bil preveriti vpliv taninskega pripravka Farmatan®, ki ga proizvaja slovensko podjetje Tanin Sevnica d.d., na rast ter aktivnosti amilaz, ksilanaz, CMC-az in proteaz pri dveh predstavnikih vampne mikrobne združbe. Prvi, Butyrivibrio fibrisolvens sodi med najštevilčnejše in metabolno najbolj vsestranske vampne bakterije, Clostridium proteoclasticum pa je pomemben predvsem zaradi izrazite proteolitične aktivnosti. Primerjali smo delovanje treh različnih koncentracij taninskega pripravka z negativno kontrolo, pri kateri tanina nismo dodali. Ker je naš postopek potekal na čistih kulturah v in vitro sistemih, rezultatov ne moremo enačiti z rezultati, ki bi jih dobili na vzorcu popolne mikrobne združbe vampnega ekosistema.
Kljub temu pa nam lahko rezultati na posameznih mikrobnih vrstah pomagajo pri razumevanju mehanizmov delovanja taninov tudi v samem sistemu in situ.
V delu smo preverjali sledeče hipoteze:
◦ ali taninski pripravek Farmatan® pospešuje ali zavira rast čistih kultur vampnih bakterij B. fibrisolvens in C. proteoclasticum
◦ ali Farmatan® zavira proteolitično aktivnost B. fibrisolvens in C. proteoclasticum ter hkrati nima negativnega vpliva na ostale encimske aktivnosti; amilolitično, CMC-azno in ksilanolitično
◦ ali ima koncentracija Farmatana® 0,25 g/l, ki jo priporoča proizvajalec, podjetje Tanin Sevnica d.d., najbolj optimalen vpliv tudi na rast in encimske aktivnosti bakterij B. fibrisolvens in C. proteoclasticum
◦ ali se vpliv Farmatana® enako izraža na obeh bakterijskih vrstah
2 PREGLED OBJAV 2.1 VAMPNI EKOSISTEM
Živali tekom evolucije niso razvile lastnih encimov za razgradnjo celuloze in ostalih kompleksnih rastlinskih polisaharidov, ki so v veliki meri prisotni v njihovi prehrani. To pomanjkljivost so uspešno nadomestile z razvojem mutualističnih odnosov z mikroorganizmi. Pojavili so se številni sistemi, kjer mikroorganizmi izkoriščajo določene snovi, ki jih njihovi gostitelji sami niso sposobni. Mikrobne populacije tako najdemo v prebavnem traktu v vseh razredih živalskega sveta. Živali so morale v ta namen prilagoditi del svojega prebavnega sistema. Glede na to, v katerem delu se vrši glavna mikrobna aktivnost, ločimo živali s poželodčno in tiste s predželodčno fermentacijo. Med slednje sodijo tudi prežvekovalci. Njihova edinstvena pridobitev je štiridelen želodec, v katerem so idealne razmere za ohranjanje raznolike in zgoščene združbe bakterij, arhej, protozojev in gliv, ki so odgovorne za procese razgradnje. Tekom teh procesov se biorazgradljivi organski polimeri, ki sestavljajo rastlinske celice, najprej hidrolizirajo do enostavnih sladkorjev, v drugi stopnji pa se spremenijo v hlapne maščobne kisline in mikrobno biomaso, ki zagotavlja zalogo energije in proteinov za gostitelja. Zaradi velikega prehranskega in gospodarskega pomena goveda in ovc je vampni ekosistem najbolj preučevan model tovrstnih simbioz (Atlas in Bartha, 1998; Dehority, 2003).
2.1.1 Zgradba in funkcija želodca
Želodec prežvekovalcev sestavljajo trije predželodci; kapica, vamp in prebiralnik ter pravi želodec ali siriščnik. Leži na levi strani trebušne votline, kjer zavzema okoli ¾ celotnega prostora. Vamp je izmed vseh delov največji, pri govedu njegov volumen znaša od 75 - 190, pri ovcah pa od 5 – 15 litrov (Dehority, 2003). Sestavljen je iz posameznih dorzalnih in ventralnih vreč, ki so med seboj ločene s stebrički. V notranjosti je površina porasla s papilami. Vamp in kapica kljub anatomski različnosti sestavljata funkcionalno razmeroma enoten prostor, ločen je le z dorzalno in ventralno retikularno gubo. Delno prebavljena krma iz predželodcev potuje v siriščnik. Njegove stene pokriva sluznica, ki izloča enake prebavne sokove kot želodci monogastričnih živali (Žgajnar, 1990). Vloga in zgradba predželodcev se s starostjo živali spreminjata. Čeprav so takoj po rojstvu teleta že razviti, še ne vsebujejo mikroorganizmov. Ti začnejo prebavni trakt naseljevati že nekaj ur po skotitivi. Po približno 20 dneh je v vampu že izoblikovano okolje s kompletno mikrobioto (McAllister in sod., 1994).
2.1.2 Razmere v vampu
Vamp je stabilen in dinamičen ekosistem. Vanj s hrano, z vodo in zrakom vsakodnevno pride na milijone mikroorganizmov. Nekateri od njih so zaradi razmer, ki vladajo v vampu, le prehodni člani. Ostali pa kljub dejstvu, da se populacija številčno spreminja glede na vrsto krme, sestavljajo stalno združbo. S preko dvesto opisanimi vrstami in gostoto do 1011
celic/g vampne vsebine so bakterije prevladujoči predstavniki. Molekularne študije pa kažejo, da je teh vrst v vampu precej več, morda tudi več kot 10000. Sledijo praživali s 104 – 105 celic/g ter anaerobne glive, ki jih je od 103 – 105 celic/g. Prisotnost bakteriofagov z gostoto 107 - 109 delcev/ml, prav tako ni zanemarljiva. V vampu se nahajajo tudi metanogene arheje, vendar je bilo kljub številnim raziskavam, opisanih le nekaj vrst (Hobson, 1997). Glavni dejavniki, ki poleg stalnega dovajanja hrane in odstranjevanja fermentacijskih produktov ter nerazgrajenih rastlinskih delcev še vplivajo na rast in aktivnost mikrobne populacije so temperatura, pH, puferska kapaciteta, osmotski pritisk, vsebnost suhe snovi in oksidacijsko-redukcijski potencial. Temperatura znotraj vampa je relativno konstantna in se giblje med 38 in 41 °C. Najbolj spremenljiv dejavnik je pH, ki običajno niha med 5,5 in 7,0. Za ohranjanje znotraj tega okvira je pomembna slina, ki vsebuje velike količine bikarbonata in fosfata. Suha snov v vampu zavzema od 10 do 18
%. Približno tretjino prostornine pa zapolnjuje plinska faza, ki je sestavljena iz 65 % CO2, 27 % CH4, 7 % N2, 0,6 % O2 in 0,2 % H2. Oksidacijsko-redukcijski potencial tekoče faze se giblje med - 350 in – 400 mV (Dehority, 2003; Hobson, 1997).
2.1.3 Proces prebave
Za zadostitev svojih energijskih potreb morajo prežvekovalci pojesti velike količine krme, saj je ta v večini primerov voluminozna. Zaužita hrana se v ustih zadrži le toliko časa, da ob mešanju s slino nastanejo približno 100 g težki zalogaji ali bolusi, ki s pomočjo krčenja v požiralniku preidejo v vamp. V predželodcih poteka časovno usklajen sistem krčenja, ki omogoča mešanje vsebine vampa. Poleg tega je odgovoren tudi za izrigavanje nastalih plinov ter za nemoten potek prežvekovanja (Dehority, 2003; Žgajnar, 1990). Trdni delci krme se v vampu zadržujejo v povprečju dva do trikrat dlje kot tekoča faza.
Mikroorganizmi z vezavo na delce še povečajo ta čas. Krma se tako v vampu zadržuje od 50 – 60 ur, kar je izredno pomembno tudi za počasi rastoče mikroorganizme kot so glive (tg = 24 – 30 h) ter praživali (tg = 5 - 14 h) (McAllister in sod., 1994). Čas zadrževanja je odvisen predvsem od velikosti delcev. Približno 35 % nerazgrajenih delcev, primerne velikosti, preide v siriščnik. V tankem in debelem črevesu se prebava nadaljuje, vendar se glede na energijski doprinos ne more primerjati s prej opisanimi procesi, ki potekajo v vampu (Dehority, 2003).
2.1.4 Mikrobna razgradnja krme
Polisaharidi so najpomembnejši vir energije v rastlinski krmi. Ločimo rezervne in strukturne polisaharide. Med prvimi sta v glavnem prisotna škrob in fruktozan, kot gradniki večjega dela celične stene pa se pojavljajo celuloza, hemiceluloza, pektin in lignin. Poleg omenjenih sestavin so pomembne spojine v krmi tudi dušikove spojine pri katerih prevladujejo proteini (Hobson, 1997). Večina mikroorganizmov v prebavnem traktu ima kompleksne prehranjevalne zahteve in lahko izrabljajo le enega ali dva od glavnih strukturnih polisaharidov, zato je za učinkovito izrabo krme sinergizem med posameznimi organizmi izjemnega pomena (Dehority, 1991).
2.1.4.1 Škrob in amilolitični mikroorganizmi
Škrob je glavni rezervni polisaharid v celicah zelenih rastlin. Molekula škroba je sestavljena iz dveh strukturno različnih glukoznih polimerov, iz amiloze in amilopektina.
Amiloza je linearna veriga nekaj sto glukoznih ostankov, ki so med seboj povezani z α-1,4 glikozidno vezjo. Glukozne enote v amilopektinu se povezujejo tudi z α-1,6 vezmi, kar vodi k razvejanosti škrobne molekule (Chesson in Forsberg, 1997). V vampu se razgradi od 50 do 90 % škroba. V kolikor krma vsebuje velike količine lahko topnih ogljikovih hidratov, lahko zaradi hitre fermentacije pride do znatnega znižanja pH ter spremembe v sestavi mikroflore. Razmnožijo se predvsem mlečno-kislinske bakterije, ki zaradi proizvajanja mlečne kisline še dodatno znižajo pH. Če pH vrednost pade pod 5, lahko pride do acidoze oz. zakisanja vampa. Težje oblike lahko povzročijo tudi smrt živali (Nocek, 1997). Pri razgradnji škroba so vključeni naslednji encimi: glukoamilaze, pululanaze, dekstrinaze, izoamilaze in α-glukozidaze. Imajo jih številne bakterije, praživali ter glive.
Pomembne amilolitične bakterije so Streptococcus bovis, Ruminobacter amylophilus, Prevotella ruminicola, Selenomonas ruminantium, Succinimonas amylolytica, Butyrivibrio fibrisolvens in vrste iz rodu Clostridium (Chesson in Forsberg, 1997).
2.1.4.2 Celuloza in celulolitični mikroorganizmi
Celuloza je najbolj pogosto zastopana sestavina rastlinske biomase. Gradniki celuloze so z β-1,4 glikozidnimi vezmi povezane D-glukozne enote. Nastala vlakna se povezujejo z vodikovimi vezmi in oblikujejo kristalno zgradbo, ki je na določenih mestih tako tesna, da prepreči dostop tako encimom kot tudi manjšim molekulam, kot je npr. voda. V večini primerov so celulozna vlakna vložena v matriks, ki je pretežno iz hemiceluloze in lignina, kar mikroorganizmom pri razgradnji predstavlja še dodatno oviro (Lynd in sod., 2002).
Dodatna plast, ki ovira delovanje encimov so tudi tanini. Bakterije začnejo prodirati skozi lahko razgradljive dele rastlin, npr reže, lenticele, hidatode ter mesta, ki so poškodovana, glive pa z micelijem lahko prodrejo tudi skozi kutikulo in celično steno (Varga in Kolver, 1997). Mikroorganizmi za hidrolizo in metabolizem celuloze potrebujejo zunajcelične encime, ki so bodisi prosti ali celično vezani. Pri anaerobnih bakterijah so celulaze večkrat organizirane v stabilne multiencimske komplekse, imenovane celulosomi. V vampu so pomembni razgrajevalci celuloze prav bakterije, in sicer Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus, nekateri sevi vrste B. fibrisolvens ter Eubacterium cellulosolvens in nekatere vrste iz rodu Clostridium, ki pa jih ne prištevamo med bistvene celulolitične bakterijske predstavnike. Prvi in zelo pomemben korak pri hidrolizi rastlinskih vlaknin je pritrditev bakterij na substrat. S pritrditvijo bakterije zagotovijo, da so celulaze skoncentrirane na substratu in da so drugi mikroorganizmi izločeni iz mesta hidrolize. Močne povezave varujejo bakterije pred praživalmi, encime pa pred vampnimi proteazami (Miron in sod., 2001).
2.1.4.3 Hemiceluloza in ksilanolitični mikroorganizmi
Hemiceluloza je za celulozo drugi najpogostejši sestavni del celične stene. Je kompleksna mešanica polisaharidnih polimerov. Njihova sestava in delež se med različnimi rastlinskimi vrstami, posameznimi tkivi in razvojnimi stopnjami rastline precej spreminjajo (Selinger in sod., 1996; Hespell in sod, 1987). Med polimeri je najbolj zastopan ksilan, heteropolisaharid, katerega osnovno ogrodje tvorijo z 1,4-β glikozidnimi vezani D- ksilopiranozni ostanki. Polimeri ksilana so med seboj prečno povezani z vodikovimi vezmi, s katerimi se povezujejo tudi na lignin ali celulozo. Rezultat teh povezav so semikristalni agregati, ki povečajo netopnost hemiceluloze (Hespell in Cotta, 1995). Zaradi zapletene zgradbe molekul, je za mikrobno razgradnjo ksilana potrebno vzajemno delovanje več encimov. Sposobnost hidrolize ksilana imajo tako bakterije, glive kot tudi praživali, vendar so bakterije glavni razgrajevalci, med njimi pa so najpomembnejše naslednje vrste: B. fibrisovens, F. succinogenes, R. albus, R. flavefaciens, Eubacterium ruminantium ter Prevotella ruminicola. Pri bakteriji B. fibrisolvens so odkrili strukture, primerljive s celulosomi, vendar so jih zaradi ksilanolitične aktivnosti poimenovali ksilanosomi (McAllister in sod., 1994).
2.1.4.4 Dušikove spojine in proteolitični mikroorganizmi
V vamp pride s krmo tudi več različnih dušikovih spojin (nukleinske kisline, etanolamin, nitrat, N2, holin), ki pa imajo v prehrani manjši pomen. Kot glavni vir dušika za mikroorganizme namreč služijo proteini, ki so prisotni v krmi. Po znanih podatkih ti v vampu razgradijo tudi do 80 % razpoložljivih krmnih proteinov (Cotta in Hespell, 1986;
Selinger in sod., 1996). Proteolitično aktivnost so zaznali pri vseh skupinah vampnih mikroorganizmov. Glive so med vsemi najmanj pomembne, njihova vloga se kaže predvsem v začetnih stopnjah razgradnje. Praživali s požiranjem rastlinskih proteinov, bakterijskih in glivnih celic ter celo manjših praživali prispevajo velik delež h kroženju dušika znotraj vampnega ekosistema, saj zagotavljajo stalen vir topnih proteinov potrebnih za mikrobno rast. Med vampnimi bakterijami je proteolitična aktivnost razmeroma pogosta, opazili so jo pri približno polovici preučenih bakterij (Bach in sod., 2005; Wallace in sod., 1997). Med prevladujoče predstavnike uvrščamo naslednje vrste: P. ruminicola, Ruminobacter amylophilus, B. fibrisolvens, aktivni pa so tudi izolati iz rodov Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Lachnospira, Selenomonas, Succinivibrio, Peptostreptococcus ter Streptococcus (Attwood in sod., 1996; Wallace in sod., 1997).
Slika 1: Shematski prikaz mikrobne razgradnje krmnih proteinov in usoda končnih produktov vampu (Bach in sod., 2005).
Tudi pri metabolizmu proteinov je zelo pomemben prvi korak, t.j. pritrjevanje različnih mikrobnih celic na delce krme. Sledi aktivnost s strani izvenceličnih proteaz, ki pa so povečini pritrjene na celice. Produkti teh encimov so peptidi in aminokisline (AK), ki se transportirajo v notranjost mikrobne celice. Peptide lahko peptidaze nadalje razgradijo do AK. Te se vgradijo v mikrobne proteine ali pa so deaminirane v hlapne maščobne kisline, CO2 in amoniak. Usoda absorbiranih peptidov in AK je odvisna od razpoložljive energije v obliki ogljikovih hidratov. Če je energije dovolj, se AK direktno porabijo za sintezo proteinov. V kolikor pa je vir energije omejen, se AK deaminirajo, njihovo ogljikovo ogrodje pa se fermentira v hlapne maščobne kisline. Nekatere vampne bakterije nimajo sistema za prenos AK iz citoplazme v ekstracelularno okolje, zato se odvečno absorbirane AK iz citoplazme izločijo kot amoniak. Glavni vir dušika za večino vampnih bakterij je ravno amoniak, vendar razgradnja proteinov v vampu pogosto poteka hitreje kot mikroorganizmi porabljajo produkte razgradnje, kar lahko vodi do prekomernega kopičenja amoniaka in posledično do prekomerne absorbcije iz vampa v jetra, kjer se pretvori v sečnino, ta pa se nato izloči z urinom (Bach in sod., 2005). Zaradi proteolize v vampu se na ta način lahko izgubi velik delež visoko kakovostnih proteinov. Po rezultatih, ki jih je leta 1998 objavil Attwood s sodelavci, lahko ta številka doseže tudi 80 %.
2.2 Butyrivibrio
Butirivibriji so med najpogostejšimi izolati vampne mikrobiote. V preteklosti je uvrstitev med butirivibrije temeljila na fenotipskih kriterijih, vendar so že relativno zgodaj opazili velike morfološke, fiziološke in serološke razlike znotraj skupine (Margherita in Hungate, 1963). Z razvojem molekularnih metod je klasifikacija dobila nove razsežnosti. Analize rDNK ter hibridizacijske metode nakazujejo, da rod Butyrivibrio sestavljajo vsaj tri precej
oddaljene skupine (Forster in sod., 1997). Številni avtorji priporočajo preureditev rodu, z opisom novih vrst pa so opazni tudi napredki v taksonomiji teh anaerobnih bakterij (Kopečny in sod., 2003).
Po Bergeyevem priročniku sistematske bakteriologije rod Butyrivibrio uvrščamo med G+
bakterije z nizko vsebnostjo G+C baznih parov, preostala uvrstitev je sledeča; deblo:
Firmicutes, razred: Clostridia, red: Clostridiales, družina: Lahnospiraceae ter rod:
Butyrivibrio.
V rodu sta poleg tipske vrste B. fibrislovens še B. hungatei in B. crossotus (Madigan in sod., 2000).
2.2.1 B. fibrisolvens
Mnogi avtorji so to bakterijo opazili že v začetku 50-tih let prejšnjega stoletja, prvi jo je izoliral Hungate, opisala in poimenovala pa sta jo Bryant in Small leta 1955. Ime Butyrivibrio izhaja iz opažanja, da pri fermentaciji glukoze nastajajo velike količine maslene kisline, fibrisolvens pa nakazuje pomembno vlogo pri razgradnji vlaknin v krmi.
To so anaerobne, rahlo ukrivljene palčke s topo zaobljenimi konci. Ne tvorijo endospor.
Celice v dolžino merijo od 2 do 5 μm, široke so od 0,4 do 0,6 μm. So gibljive, imajo en polaren biček (Bryant in Small, 1956). S standardnimi tehnikami se barvajo po Gramu negativno, vendar celična stena vsebuje derivate tejhojske kisline, ki so drugače tipični sestavni deli Gram pozitivnih celičnih sten. Poleg kemijske sestave Gram pozitivni celični steni v prid govori tudi molekularna zgradba. Zakaj potem Gram negativno barvanje?
Glavni razlog se skriva v debelini celične stene. Ta namreč namesto običajnih 30-50 nm znaša le od 12 do 18 nm, kar je premalo, da bi se v celicah ohranil netopni kompleks kristalno vijoličnega barvila z jodom (Cheng in Costerton, 1976).
Zaradi opaznih razlik med sevi znotraj vrste B. fibrisolvens naslednje lastnosti veljajo za tipski sev DSM 3071, ki smo ga uporabljali pri našem raziskovalnem delu. Celice so običajno organizirane v kratke verižice, sestavljene iz dveh do treh celic, lahko pa se pojavljajo tudi kot samostojne ali v dolgih verižicah. Kolonije na agarju po prvotni izolaciji so rahlo konveksne, prosojne svetlo rjave barve. V premeru merijo od 2 do 4 mm. Po nekaj zaporednih precepljanjih kolonije postanejo bolj ploske, svetlejše in s filamentoznimi robovi. Pri rasti v tekoči kulturi nastajajo flokuli in granularni sedimenti. Rastejo pri temperaturah med 30 in 45 °C, pri 22 in 50 °C rast ni opazna. Glavni produkti pri fermentaciji glukoze so maslena, mravljična in mlečna kislina, CO2 ter H2. Končni pH v tekočem glukoznem gojišču je 5,1. Poleg glukoze B. fibrisolvens fermentira tudi D-ksilozo, L-arabinozo, galaktozo, fruktozo, maltozo, celobiozo, saharozo, laktozo, dekstrin, inulin, salicin, eskulin, pektin in ksilan. Ne raste na trehalozi, glicerolu, manitolu in celulozi. Ne reducira nitrata, prav tako ne tvori indola, H2S ter ne sintetizira katalaze. Želatina se ne utekočini (Bryant in Small, 1956). Razmerje G+C baznih parov je 41,2 % (Kopečny in sod., 2003). Zaradi svoje metabolne vsestranskosti pripisujemo tem bakterijam v vampu pomembno vlogo pri razgradnji škroba, proteinov ter polisaharidov z izjemo celuloze.
2.3 Clostridium
Za razliko od butirivibrijev, vrste iz rodu Clostridium ne sodijo med dominantne vampne bakterije, čeprav so pogosto izolirane iz tega okolja (Stewart in sod., 1997). Prisotne so v številnih anaerobnih habitatih, najdemo jih mrzlih, zmernih, toplih razmerah, v tleh, vodi, razpadajočem organskem materialu, v hrani ter tudi pri živalih in človeku. Od leta 1880, ko je bil rod poimenovan, je bilo opisanih že preko dvesto vrst. Glavne značilnosti, ki so definirale to veliko in zelo heterogeno skupino, so bile anaerobna rast, pozitivno barvanje po Gramu, nesposobnost disimilatorne redukcije sulfata ter tvorba temperaturno obstojnih endospor. Uporaba molekularnih metod je razkrila, da fenotipske lastnosti, ki so bile glavno orodje pri tradicionalni klasifikaciji, ne odražajo visoke stopnje genomske nesorodnosti in filogenetske oddaljenosti (Stackebrandt in sod., 1999). Analize 16S rDNK in zgradba DNK (mol % G + C) so namreč pokazale, da rod filogenetsko vključuje bakterije iz različnih rodov, ki niso opisane z lastnostmi značilnimi za klostridije ter, da so mnoge vrste bolj sorodne z neklostridijskimi vrstami, kot pa so sorodne med seboj (Keis in sod., 1995). V sedanjosti klasifikacija temelji tako na genotipskih kot tudi na fenotipskih lastnostih, kar vedno znova privede do protislovja med filogenetsko različnostjo in fenotipskimi podobnostmi mikroorganizmov, ki jim pravimo klostridiji. Danes klostridijske vrste najdemo v devetnajstih gručah v skupini Clostridium, osnovanih glede na homolognost sekvenc 16S rDNK. Največja in filogenetsko najbolj definirana linija je tista, ki tvori I. gručo. V tej skupini je tudi tipska vrsta Clostridium butyricum. Vse to nakazuje, da bo v prihodnosti potrebna temeljita taksonomska preureditev, ki pa jo še dodatno otežuje dejstvo, da je v rodu Clostridium okoli štirideset patogenih vrst, kar bi v medicinski mikrobiologiji povzročilo veliko zmedo (Keis in sod., 1995). Zaenkrat še velja naslednja uvrstitev v bakterijski sistem: G+ bakterije z nizko vsebnostjo G + C, Bacteria, deblo: Firmicutes, razred: Clostridia, red: Clostridiales, družina: Clostridiaceae, rod:
Clostridium (Madigan in sod., 2000).
2.3.1 C. proteoclasticum
Bakterijo C. proteoclasticum so prvič izolirali leta 1995 iz goveda na Novi Zelandiji. Sprva so jo poimenovali kot butirivibrijem podobno, saj so poleg fenotipske podobnosti sekvence16S rRNK tudi več kot 96 % podobne s sekvencami nekaterih sevov B.
fibrisolvens (Reilly in Attwood, 1998). Dodatne fenotipske in filogenetske analize pa so potrdile, da gre za novo vrsto iz rodu Clostridium. Od B. fibrisolvens se v glavnem razlikuje po nižji vsebnosti G + C baznih parov (28 %), ker ne raste na dekstrinu ter po gibljivosti, saj kljub subterminalnemu bičku v tekočem gojišču ni gibljiva. Obe vampni bakteriji uvrščamo v t.i. XIVa klostridijsko gručo. Pod mikroskopom jih vidimo kot ravne do rahlo ukrivljene palčke, ki v dolžino merijo od 1,3 do 3,0 μm, široke pa so od 0,4 do 0,6 μm. Celice se združujejo v kratke verižice. Ne tvorijo endospor. Prekonočne kulture na trdnem glukoznem gojišču tvorijo gladke konveksne kolonije z nepravilnimi robovi in s premerom 0,5 mm. Po 2-3 dneh inkubacije kolonije v premeru dosežejo 1 mm ter dobijo
granularen izgled. V enodnevnih tekočih kulturah nastaja vlaknasta usedlina, ki že ob rahlem tresenju razpade, v starejših kulturah pa so opazni sferoplasti. Čeprav se stare kulture barvajo po Gramu negativno, imajo značilno Gram pozitivno zgradbo celične stene. Rast poteka pri 39 °C, pri 25 in 45 °C rasti ni. Za rast lahko uporablja arabinozo, fruktozo, galaktozo, glukozo, glikogen, inulin, laktozo, maltozo, manozo, melibiozo, ramnozo, salicin, škrob, saharozo, ksilan in ksilozo. Ne raste na celulozi, adonitolu, eritritolu, galaktouronski kislini, glicerolu, inozitolu, manitolu, sorbitolu, sorbozi, trehalozi in kot že rečeno na dekstrinu. Razgrajuje želatino, kazein in eskulin. Ne tvori indola in ne proizvaja katalaze, lipaze in lecitinaze. Ne reducira nitrata. pH po končani inkubaciji v glukoznem gojišču znaša 5,8. Končni produkti fermentacije v enakem gojišču so mravljična, maslena, ocetna, propionska, jantarna kislina ter vodik. Zmožnost uporabe različnih ogljikovih hidratov kaže, da je v vampu udeležena pri fermentaciji topnih ogljikovih hidratov, ki se sprostijo po razgradnji rastlinskih vlaken (Attwood in sod., 1996). Zaradi visoke proteolitične aktivnosti je verjetno pomembnejša njena vloga pri razgradnji rastlinskih proteinov. Pri fermentaciji ne tvori dušika, poleg tega pa ni sposobna rasti zgolj na peptonu in kvasnem ekstraktu, kar nakazuje, da C. proteoclasticum sodeluje pri primarni hidrolizi proteinov do peptidov (Attwood in sod., 1996; Reilly in Attwood, 1998).
2.4 SEKUNDARNI METABOLITI RASTLIN V PREHRANI PREŽVEKOVALCEV Rastline so za obrambo pred bakterijami, glivami, insekti in rastlinojedimi živalmi razvile številne obrambne mehanizme. Ti vključujejo posebne strukture, ki preprečijo vstop in širjenje po rastlini ter biokemijske reakcije v rastlinskih celicah in tkivih, kjer nastajajo in se kopičijo organske snovi, ki imajo bodisi neprijeten okus, vonj, delujejo kot antinutrienti ali celo kot toksini. Ker so vse te snovi produkt sekundarnega metabolizma in ker njihova sinteza zahteva velik vložek energije, se običajno kopičijo v najbolj izpostavljenih delih rastline kot so listi in plodovi. V rastlinah, ki se uporabljajo za živalsko krmo, so ti presnovki pogosto prisotni. Obstaja dolg seznam poznanih spojin, pri vrhu pa se nahajajo fenoli, cianogeni glikozidi, glikoalkaloidi, floroacetati, saponini, oksalati, lektini, mimozin, glukozinolati,… (Caygill, 1999; Harborne, 1999).
2.4.1 Tanini
Po Horvathu so tanini vse fenolne snovi s primerno veliko molekulsko maso, ki vsebujejo dovolj fenolnih hidroksilnih in ostalih skupin (predvsem karboksilnih) za nastanek učinkovito močnih kompleksov s proteini in ostalimi makromolekulami v določenih razmerah (Reed, 1995). Že sama definicija nakazuje, da je to zelo heterogena skupina, v kateri najdemo molekule različnih kemijskih struktur in velikosti. Nahajajo se v lesu, steblih, listih, koreninah in semenih mnogih višjih rastlinskih vrst. Največkrat jih najdemo v dvokaličnicah, še posebno v stročnicah (Jansman, 1993). Količina taninov med posameznimi vrstami močno variira, v povprečju pa se giblje nekje med 1,5 – 30 % suhe
snovi (Mueller-Harvey, 1999). Poleg rastlinske vrste je vsebnost odvisna tudi od genotipa, faze rasti, dela rastline, letnega časa ter od okoljskih razmer (Norton, 2000).
Tanine v osnovi razdelimo na hidrolizirajoče, kondenzirane in kompleksne tanine oz. t.i.
flavanoelagitanine, ki združujejo lastnosti obeh skupin.. Razdelitev je narejena na osnovi strukturnih razlik, različnih prehranskih in toksičnih učinkov ter reaktivnosti z raznimi hidrolitičnimi reagenti. Čeprav tanine po eni strani ločujejo velike razlike, jih po drugi strani povezuje pomembna lastnost, in sicer tvorba stabilnih kompleksov z beljakovinami, ogljikovimi hidrati, vitamini in minerali (Khanbabaee in van Ree, 2001).
2.4.1.1 Kondenzirani tanini
Kondenzirani tanini so kompleksi oligomerov in polimerov flavonoidnih enot, in sicer flavan-3-olov in flavan-3,4-diolov, ki so med seboj povezani s C - C vezjo (Min in sod., 2003). Imenujemo jih tudi proantocianidini, saj pri segrevanju v kislih alkoholnih raztopinah nastanejo rdeče obarvani antocianidini (Hagerman in Butler, 1981; Reed, 1995).
V naravi so takoj za ligninom druga najbolj pogosta skupina naravnih fenolov. Imajo različne kemijske sestave in molekulske mase, ki se gibljejo od 800 do preko 28000 (Norton, 2000).
Slika 2: Struktura polimernega kondenziranega tanina, ki prikazuje oznake obročev in ogljikovih atomov ter 4 – 8 in 4 – 6 interflavonoidne vezi. (Schofield in sod., 2001).
Pri polimerizacijskih reakcijah je možen nastanek več raznovrstnih struktur. Dve enoti povezuje bodisi vez med 4. in 8. ali med 4. in 6. ogljikovim atomom. V prvem primeru je rezultat linearna molekula, pri večjem številu drugih pa te postanejo razvejane. Dimere s tem tipom vezi označujemo kot tip B. Pri tipu A je poleg omenjenih vezi prisotna še dodatna eterska vez, ki povezuje 2. C atom in hidroksilno skupino na A obroču. Velikost molekule je določena s stopnjo polimerizacije, razlikujejo pa se tudi po številu hidroksilnih
skupin na aromatskih obročih ter po stereokemiji ogljikovih atomov (Prior in Gu, 2005).
Sinteza polimerov je lahko posledica encimatske oksidacije s strani polifenolnih oksidaz ali pa poteka s spontano oksidacijo (Tanner in sod., 2000). Znanstvenikom zaenkrat še ni uspelo dokazati encimatske razgradnje kondenziranih taninov v anaerobnih razmerah, zaradi česar sklepajo, da ta proces v vampu najverjetneje ne poteka (McSweeney in sod., 2001).
2.4.1.2 Hidrolizirajoči tanini
Hidrolizirajoči tanini so estri kislin in monosaharidov. Od sladkorjev je najpogosteje prisotna glukoza, od kislin pa galna, digalna in elagna kislina. Od tega, katera kislina je prisotna, je odvisno ali nastanejo t.i. galotanini ali elagitanini (Reed, 1995).
Slika 3: Strukturni formuli dveh podskupin hidrolizirajočih taninov – galotanina in elagitanina (Khanbabaee in van Ree, 2001).
Njihova zastopanost v naravi je v primerjavi s kondenziranimi tanini znatno manjša, v medsebojni primerjavi obeh skupin hidrolizirajočih taninov pa imajo elagitanini večji delež. V nasprotju z večinskim mnenjem, da se tanini nahajajo v vakuolah, Grundhöfer s sod. (2001) poroča, da se hidrolizirajoči sestavljajo in odlagajo v celičnih stenah mezofilnih celic. Molekulska masa, ki se navaja v literaturi, se giblje med 500 in 3000.
Hidrolizirajoči tanini so potencialno toksični, predvsem za monogastrične živali, saj se v vampu lahko razgradijo s kislo hidrolizo ali z encimsko razgradnjo. Če pa koncentracija preseže kapaciteto razgradnje v vampu, lahko povzročijo nekroze jeter in ledvic, zlatenico, v resnih primerih pa tudi smrt (Norton, 2000).
2.5 VLOGA TANINOV V PREBAVNEM TRAKTU ŽIVALI 2.5.1 Vpliv delovanja taninov na prirast živali
V vzreji goveda oz. v živinoreji nasploh stremimo k čim večjemu prirastu živali. To poskušajo stroka in rejci doseči na različne načine (Orešnik, 2001). Ena od metod vključuje tudi tanine, vendar je pri njihovi uporabi v živalski prehrani potrebna tudi pazljivost, saj lahko poleg koristnih lastnosti povzročajo tudi nevšečnosti. Znanstveniki se še niso zedinili, katera koncentracija taninov naj bi predstavljala mejo med pozitivnimi in negativnim vplivom (Waghorn in McNabb, 2003). V zvezi s prednostmi, ki jih pri vzreji prežvekovalcev prinašajo tanini, se v literaturi največkrat omenjajo povečana rast volne, proizvodnje in kakovosti mleka, večji odstotek rodnosti, izboljšano zdravstveno stanje živali ter porast žive teže. Tanini po eni strani zaradi neokusnosti zmanjšajo vnos krme, po drugi strani pa se zaradi tvorjenja kompleksov s proteini, polisaharidi, minerali in vitamini omeji mikrobna prebava energetsko bogatih snovi (Barry in McNabb, 1999; Min in sod., 2003; Reed, 1995; Silanikove in sod., 2001; Waghorn in McNabb, 2003).
Dodatna lastnost, ki taninom daje negativno oznako, je njihova toksičnost. Dolgotrajno uživanje krme z visoko vsebnostjo taninov namreč lahko povzroči zastrupitve živali. Te so največkrat povezane s poškodbami različnih delov prebavnega trakta, poškodbami ledvic in jeter (Kumar in Vaithiyanathan, 1990; Lowry in sod., 1996; Reed, 1995; Scalbert, 1991).
2.5.2 Vpliv vezave taninov s proteini na proteolizo
Vezava s proteini je ena izmed bistvenih lastnosti, ki tanine definira. Beljakovine v krmi namreč v največji meri pogojujejo intenzivnost rasti in obseg prireje (Lavrenčič, 2001).
Nastanek kompleksov med proteini in molekulami taninov je pogojen z mnogimi dejavniki. Odvisen je od velikosti molekul tanina in proteinov, beljakovinske sestave in strukture, upoštevati pa je potrebno še pH, temperaturo, ionsko jakost, čas inkubacije, vrsto medija (Hagerman in Butler, 1981; Jansman, 1993; Waterman, 2000). Kompleksi nastajajo v pH območju med 3,5 – 8, pod oz. nad temi vrednostmi pa razpadejo (Ben Salem in sod., 2005; Chung in sod., 1998; Orešnik, 1996). Maksimalna stabilnost je dosežena pri pH vrednosti, ki je v bližini izoelektrične točke proteina, pri rastlinskih proteinih se ta giblje med 3,5 in 5,5, kar pomeni, da taninsko – beljakovinski kompleksi razpadejo pri pH vrednostih, ki so v siriščniku in tankem črevesju (Perez – Maldonado in sod., 1995).
Tanini se z beljakovinami povezujejo na osnovi vodikovih, hidrofobnih, ionskih in kovalentnih vezi. Glavne vezi, ki stabilizirajo kompleks, so vodikove vezi med fenolno hidroksilno in karboksilno skupino na proteinu. Delež hidrofobnih povezav se povečuje z višanjem ionske jakosti in temperature. Kovalentne vezi so irreverzibilne, do tvorbe pride v aerobnih razmerah, pri segrevanju, izpostavitvi UV sevanju in delovanju polifenol oksidaz (Hagerman in Butler, 1981; Jansman, 1993; Oh in sod., 1980).
Po vseh zgoraj naštetih lastnostih je razvidno, da tanini s tvorbo kompleksov lahko zaščitijo beljakovine pred mikrobno razgradnjo v predželodcih. Takšni kompleksi začnejo nastajati že v gobcu med prežvekovanjem krme, proces pa se nadaljuje v vampu. Uspeh
zaščite je odvisen od količine taninov v krmi, vrste tanina in vrste živali. Številne raziskave so pokazale, da so tanini, kljub omenjenim razlikam, v splošnem zmanjšali razgradnjo proteinov v vampu, povečali njihov pretok do tankega črevesa, znižali topnost proteinov v in vitro sistemih ter zmanjšali proteolitično aktivnost in populacijo proteolitičnih bakterij v in vivo ter v in vitro sistemih (Barry in McNabb, 1999; Min in sod., 2003; Perez – Maldonado in Norton, 1996). Priporočene koncentracije taninov, ki imajo še pozitiven vpliv na razgradnjo proteinov, se zaradi že omenjenih razlogov med avtorji precej razlikujejo.
2.5.3 Vpliv vezave taninov na razgradnjo ogljikovih hidratov
Tanini lahko reagirajo in tvorijo komplekse tudi z ogljikovimi hidrati, vendar je afiniteta za vezavo bistveno nižja kot pri proteinih. Kljub manjši težnji k povezovanju pa so v mnogih primerih ugotovili negativne vplive taninov, ki se kažejo kot zmanjšanje oz. upočasnitev prebave vseh vrst ogljikovih hidratov (Barry in McNabb, 1999; Butter in sod., 1999;
Waghorn in McNabb, 2003). Učinek na razgradnjo ni zgolj posledica neposredne vezave taninov na ogljikove hidrate, pač pa se kaže tudi posredno preko drugih načinov delovanja.
V zvezi s tem največkrat omenjajo mikroorganizme, ki so udeleženi v procesih presnove ogljikovih hidratov. Kondenzirani tanini namreč po poročanju večih znanstvenikov znižujejo delež populacije omenjenih bakterij oz. zavirajo aktivnost njihovih CMC-az, ksilanaz , pektinaz (Acamovic in sod., 2000; Barry in McNabb, 1999; Makkar in sod., 1988; McSweeney in sod., 2000; McSweeney in sod., 2001; Min in sod., 2005).
Nižja stopnja presnove rastlinskih polisaharidov, ne glede na način, ki privede do tega, zmanjša zaloge energije, ki je na razpolago vampnim mikroorganizmom, kar upočasni njihovo rast in sintezo mikrobnih proteinov ter s tem tudi zalogo proteinov, ki je na voljo živali v siriščniku in tankem črevesu (Butter in sod., 1999).
2.5.4 Vpliv taninov na rast in encimske aktivnosti mikroorganizmov
Protimikrobno delovanje taninov je že dolgo poznano. Mehanizmi delovanja pa kljub številnim raziskavam še vedno niso v celoti pojasnjeni. V literaturi se pojavlja nekaj možnih razlag. Domnevno je glavni cilj delovanja taninov celična stena mikroorganizmov.
Pri povezovanju taninov in sestavnih delov celične stene se lahko spremeni prepustnost membrane, kar zavira prenos hranil v celico in posledično tudi rast. Prerazporeditev membrane lahko prekine tudi prenos elektronov in s tem povezane reakcije (Min in sod., 2003; McSweeney in sod., 2001; Reed, 1995). Po do sedaj opisanih raziskavah, kondenzirani tanini različnega izvora zavirajo rast številnih populacij vampnih bakterij (McSweeney in sod., 2000; Min in sod., 2005). Tanini ne delujejo bakteriostatično le na vampne bakterije, pač pa tudi na nekatere patogene vrste kot so S. aureus, S. pneumoniae, B. anthracis, B. subtilis, S. dysenteriae, C. botulinum. Zasledili pa so tudi inaktivacijo virulence različnih virusnih vrst (Chung in sod., 1998).
Razgradnja rastlinskih polimerov poteka s pomočjo izvenceličnih encimov, ki jih mikroorganizmi izločajo v okolje ali pa ti ostanejo vezani na zunanji površini celic. Tanini lahko reagirajo s temi encimi, spremenijo njihovo konformacijo in zmanjšajo njihovo aktivnost. Poleg direktnega delovanja na encime pa je zaviranje možno tudi preko substrata, ki po vezavi na tanine postane nedostopen za vezavo na encime. Opazili so zmanjšanje aktivnosti CMC-az, proteaz, glutamat dehidrogenaze, alanin aminotransferaze, pektinaz, celulaz, endoglukanaz, ksilanaz (Acamovic in sod., 2000; Chung in sod., 1998;
McSweeney in sod., 2001).
2.5.4.1 Vpliv taninov na morfologijo mikroorganizmov
Poleg že omenjenega delovanja taninov na mikroorganizme velja omeniti tudi vpliv, ki ga imajo na morfologijo. Ta se različno izraža pri različnih bakterijskih vrstah oz. sevih, odvisen pa je tudi od vrste in koncentracije taninov. Kondenzirani tanini iz turške detelje (Onobrychis viciifolia) povzročajo flokulacijo in podaljšanje celic B. fibrisolvens (McAllister in sod., 1994). Prav tako pri B. fibrisolvens, vendar pri sevu A38, so Min in sod. (2005) opazili, da so se ob prisotnosti taninov iste rastlinske vrste, drugače samostojne palčke, začele združevati v nitke, inhibirano pa je bilo tudi ločevanje celic po delitvi.
Celice bakterij S. bovis se običajno pojavljajo kot diplokoki, s povečevanjem koncentracije dodane taninske kisline se je povečevale tudi dolžina verižic. Pri 4 % taninski kislini je bilo v verižici 40 - 50 celic (Goel in sod., 2005). Po opažanjih Jonesa in sod. (1994) so celice v verižici nepravilnih oblik, prav tako so opazili flokulacijo in nalaganje elektronsko gostega materiala, po vsej verjetnosti precipitiranega tanina na površini celic. Isti avtorji so opisali tudi spremembe pri P. ruminicola, pri kateri se celice zaradi kondenziranih taninov z ekstracelularnim materialom med seboj povezujejo v verižice.
2.5.5 Vpliv taninov na metabolizem vitaminov in mineralov
Tanini tvorijo komplekse z vitaminom A, B12 in tiaminom, s čimer se zmanjša njihova absorptivnost v tankem črevesju (Jansman, 1993). Pri povezovanju taninov s kovinskimi ioni kot so Fe, Co, Cu in Cr prav tako nastajajo netopni kompleksi, ki omejijo razpoložljivost teh ionov, tako za žival kot tudi za predstavnike mikrobne združbe (Okuda, 2005). Scalbert (1991) predlaga, da je sposobnost vezave s kovinskimi ioni lahko učinkovit mehanizem, s katerim naj bi tanini inhibirali delovanje metaloencimov kot sta glivna peroksidaza in lakaza.
2.5.6 Vloga taninov pri preprečevanju napenjanja
Napenjanje vampa je razmeroma razširjen pojav pri prežvekovalcih, predvsem pri tistih, ki se hranijo s krmo, ki vsebuje velike količine topnih proteinov (Butter in sod., 1999).
Proteini povzročajo nastajanje stabilne penaste mase, ki napolni dorzalno vrečo vampa. Če se razmere ne spremenijo, pride pri živali do hude kompresije srca, ožilja in pljuč, kar
lahko vodi do anoksije in hitre smrti. Napenjanje se preprečuje zlasti s protipenilnimi olji in z neionskimi detergenti, s katerimi poškropijo krmo. Vse te metode predstavljajo velike stroške in zahtevajo veliko dela, zato si prizadevajo najti nadomestne postopke, ki bi učinkovito zmanjševali nastanek pene (Mangan, 1988). Med obetavnimi kandidati so se znašle tudi rastline, ki vsebujejo tanine. Večje koncentracije taninov namreč zmanjšujejo nastanek plinov, poleg tega pa tanini, ki tvorijo komplekse s proteini, preprečujejo tudi nastanek pene. Minimalna koncentracija kondenziranih taninov, ki je potrebna za pozitivni vpliv, po mnenju različnih raziskovalcev znaša 5 g kondenziranih taninov/kg suhe snovi (Barry in McNabb; 1999, Mangan, 1988; Butter in sod., 1999).
2.5.7 Prilagoditev živali na tanine
Nekateri rastlinojedci se hranijo s krmo, ki vsebuje večje količine taninov, pa vendar pri njih ni opaziti toksičnih vplivov, kar kaže na to, da so se živali v določeni meri prilagodile na prisotnost teh antinutrientov (Jansman, 1993). V prvi vrsti se omenja proteine z visoko vsebnostjo prolina, ki se izločajo s slino. Zaradi visoke vezavne afinitete naj bi ti proteini predstavljali prvo linijo obrambe pri kozah, saj s tvorbo kompleksov s tanini že v ustni votlini preprečijo reakcijo taninov z drugimi proteini kot so encimi, proteini v sluznici in epitelu, poleg tega pa tanine ščitijo tudi pred razgradnjo do škodljivih produktov (Kumar in Vaithiyanathan, 1990; Shimada, 2006). Pri govedu in ovcah teh proteinov v slini zaenkrat še niso odkrili. Pri njih pa najdemo ostale vrste obrambnih mehanizmov; izogibanje hrane z visoko koncentracijo tanina, povečana proizvodnja sluzi v prebavnem traktu, razgradnja, detoksifikacija taninov in njihovih razgradnih produktov, nastanek surfaktantov (Brooker in sod., 2000; Goel in sod., 2005; Makkar in Becker, 1998).
2.5.8 Prilagoditev mikroorganizmov na tanine
Kljub antimikrobnim lastnostim taninov mnogi mikroorganizmi lahko rastejo in se delijo v prisotnosti rastlin, ki vsebujejo večje količine teh fenolnih snovi. Obstaja več razlag, zakaj so bakterije tolerantne na tanine. Pri nekaterih bakterijah so ob dodatku taninov zaznali podaljšanje lag faze. V tem času se celice s sintezo encimov in glikokaliksa pripravijo na potrebne prilagoditve za rast v spremenjenem okolju. Izvencelični polimeri imajo visoko afiniteto do taninov, s čimer si bakterije zagotovijo "poceni" tarčo, na katero se lahko vežejo tanini in s tem postanejo nedostopni za vezavo na druge molekule (Brooker in sod., 2000; O`Donovan in Brooker, 2001; Pell in sod., 2000; Scalbert, 1991). Drugi taktika je povezana s sposobnostjo razgradnje taninov. Po dosedanjih odkritjih so mikroorganizmi sposobni v anaerobnih pogojih razgraditi le hidrolizirajoče tanine. Glavne reakcije pri tem procesu vključujejo hidrolizo in redukcijo, ključni encimi pa naj bi bili tanaza oz. tanin acilhidrolaza ter esteraze. Do sedaj znane bakterije, ki razgrajujejo tanine so S.
ruminantium, S. caprinus, S. bovis, Eubacterium oxidoreductans, Syntrophococcus
sucromutans, B. fibrisolvens, vrste iz Caprococcus, nekatere vrste iz rodu Clostridium in nekatere enterobakterije (Brooker in sod., 2000; McSweeney in sod., 2001; Odenyo in sod., 2001). Glavni metaboliti pri razgradnji hidrolizirajočih taninov so galat, pirogalol, rezorcinol, floroglucinol, ki so tudi lahko toksični. Za nevtralizacijo teh produktov sta pomembni metilacija in hidroksilacija (Skubic in Vengušt, 1993; Pell in sod., 2000). Tanini z vezavo na kovinske ione zmanjšajo njihovo razpoložljivost. Nekatere bakterije in glive so pomanjkanje premostile s pomočjo sideroforjev (Lowry in sod., 1996). Pell s sod.
(2000) omenja še eno izmed možnih razlag, in sicer naj bi mikroorganizmi ključne membranske encime varovali s strateško razporeditvijo lipidov.
Podnebne razmere, geografska širina ali gostiteljska žival nimajo vpliva na bakterijsko toleranco. Ta je odvisna predvsem od vrste hranil, s katerimi se žival prehranjuje (Nelson in sod., 1998).
2.5.9 Uporabnost taninov
Začetki uporabe taninov segajo že v obdobje pred našim štetjem, ko so takratna plemena s pomočjo taninov iz živalskih kož pridobivala usnje (Khanbabaee in van Ree, 2001). Poleg usnjarstva so tanini dolga leta oz. tisočletja nevede prisotni tudi v t.i. etnomedicini, predvsem vzhodni, kjer so prisotni v pripravkih za preprečevanje diareje, črevesnih tumorjev, kot diuretiki, protivnetna in antiseptična sredstva,… (Khanbabaee in van Ree, 2001). Taninom se pripisuje antikancerogeno in antimutageno delovanje (Chung in sod., 1998; Okuda, 2005). Zaviralni vplivi, ki jih imajo na širok izbor mikroorganizmov, tanine uvršča med potencialna antivirusna, antihelmintna, bakteriostatična, bakteriocidna sredstva (Chung in sod., 1998; Grundhöfer in sod., 2001; Mueller-Harvey, 1999). Z vse večjo zavednostjo ljudi za varovanje okolja, se ponujajo dodatne možnosti za uporabo taninov.
Njihova prisotnost v prehrani živali lahko pripomore k zmanjšanju nastanka metana ter posledično k zmanjšanju emisij tega toplogrednega plina (Waghorn in McNabb, 2003).
Nekateri tanini so že vrsto let prisotni v prehranski industriji. Taninska kislina velja za GRAS in se uporablja kot prehranski aditiv. Poleg omenjenega so tanini udeleženi tudi pri proizvodnji črnila, barv za tekstil, kot koagulanti pri pridelavi gume, v elektronski mikroskopiji za fiksacijo membran,…(Chung in sod., 1998; Khanbabaee in van Ree, 2001)
