U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJODIPLOMSKO DELO
Neža Žerjav
Ljubljana, 2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOUNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA
Funkcionalizacija monodisperznih delcev silicijevega dioksida s koronavirusnima proteinoma ORF8 in N
DIPLOMSKO DELO
Neža Žerjav
M
ENTOR: doc. dr. Gregor Gunčar
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega dela
Spodaj podpisana Neža Žerjav sem avtorica diplomskega dela z naslovom:
Funkcionalizacija monodisperznih delcev silicijevega dioksida s koronavirusnima proteinoma ORF8 in N.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr.
Gregorja Gunčarja;
• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje
predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega/magistrskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, 30. 8. 2021 Podpis avtorice:
»Ta stran je namenoma prazna.«
- Igor Mlakar, Enačbe valovanja morja
Zahvala
Mentorju doc. dr. Gregorju Gunčarju se zahvaljujem za nasvete in usmeritve pri izdelavi diplomskega dela, predvsem pa zato, da mi je omogočil eksperimentalno delo na Katedri za biokemijo. Delovni mentorici mag. Mariji Kisilak se zahvaljujem za znanje, usvojeno tekom dela v laboratoriju, ter za njen trud in razumevanje. Članici komisije prof. dr. Brigiti Lenarčič se zahvaljujem za hiter in korekten pregled diplomskega dela.
Eli, Anamariji, Martini in Tini se zahvaljujem za zapiske in spodbude v času študija.
Brez njih bi se moja biokemija končala, še preden se je sploh začela.
Zahvaljujem se tudi vsem profesorjem in asistentom, ki so mi omogočili, da sem študij biokemije lahko usklajevala s športnim udejstvovanjem. Prav tako se zahvaljujem vsem trenerjem, ki so razumeli, da me življenje dirkalnega konja s plašnicami na očeh ne mika preveč.
Navsezadnje se prav klišejsko zahvaljujem svoji družini za vse. Prav vse.
Funkcionalizacija monodisperznih delcev silicijevega dioksida s koronavirusnima proteinoma ORF8 in N
Povzetek:
Virus SARS-CoV-2 je predstavnik koronavirusov, ki se je pojavil konec leta 2019 in povzročil pandemijo covida-19. Monodiperzni delci silicijevega dioksida v raztopinah kažejo zanimive optične lastnosti, ki so uporabne pri izdelavi biosenzorja, s katerim bi lahko zaznali prisotnost virusa. Eden izmed korakov pri izdelavi biosenzorja je tudi funkcionalizacija delcev z molekulami, ki omogočajo zaznavanje tarčnih biomolekul. V diplomskem delu smo se osredotočili na njegov strukturni protein N in pomožni protein ORF8. Oba interagirata z imunskim sistemom gostitelja in sta močno imunogena.
Proteina smo izrazili v bakterijskem sistemu E. coli BL21[DE3]. Iz topne frakcije smo s pomočjo nikljeve afinitetne kromatografije uspeli izolirati le protein N, ki smo mu nato s proteazo TEV odcepili heksahistidinsko oznako in ga dodatno skoncentrirali. Z njim smo funkcionalizirali monodisperzne delce SiO2, ki smo jih sintetizirali na dva različna načina in predhodno aktivirali z aldehidnimi funkcionalnimi skupinami. Pokazali smo, da se je protein vezal na delce, vendar zaradi prevelike občutljivosti testa, s katerim smo preverjali uspešnost funkcionalizacije, nismo uspeli nedvoumno dokazati, da je kovalentna vezava bolj učinkovita od adsorpcije.
Ključne besede: SARS-CoV-2, silicijev dioksid, nanodelci, funkcionalizacija
Functionalization of monodisperse silica particles with coronavirus proteins ORF8 and N
Abstract:
The SARS-CoV-2 virus is a member of the Coronaviridae family that emerged in late 2019 and caused the COVID-19 pandemic. Monodisperse silica particles have interesting optical properties in solutions that could be used in the design of a biosensor for virus detection. One of the most important steps in biosensor production is the functionalization of the particles with molecules that allow the detection of target molecules. In this thesis, the structural N protein and the accessory protein ORF8 were investigated. Both proteins inhibit the host immune response and are highly immunogenic. The proteins were expressed in E. coli BL21[DE3]. Using nickel affinity chromatography, only protein N was isolated from the soluble fraction. Moreover, the hexahistidine tag was cleaved by TEV protease, and the N protein was additionally concentrated. Monodisperse SiO2 particles were synthesized in two ways, activated with aldehyde functional groups, and functionalized with the N protein. Protein binding to the particles was demonstrated, but the high sensitivity of the assay method used did not provide clear evidence that the covalent coating was better than the adsorption.
Keywords: SARS-CoV-2, silicium dioxide, nanoparticles, functionalization
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 SARS-CoV-2 ... 1
1.1.1 Virusni genom in proteini ... 1
1.1.2 Replikacija virusa ... 1
1.2 Protein ORF8 ... 2
1.2.1 Gen orf8 ... 2
1.2.2 Struktura ORF8 ... 2
1.2.3 Inhibicija MHC-I z ORF8 ... 3
1.2.4 Inhibicija IFN-I z ORF8 ... 3
1.3 Protein N ... 4
1.3.1 Struktura proteina N ... 4
1.3.2 Imunogenost proteina N ... 4
1.3.3 Inhibicija imunskega odziva s proteinom N ... 5
1.4 Monodisperzni delci SiO2 ... 5
2 Namen dela ... 7
3 Materiali in metode ... 9
3.1 Materiali ... 9
3.1.1 Materiali pri delu z nukleinskimi kislinami ... 9
3.1.2 Materiali pri delu z bakterijskimi celicami ... 10
3.1.3 Materiali pri delu s proteini ... 12
3.1.4 Materiali pri delu z monodisperznimi delci SiO2 ... 13
3.1.5 Seznam uporabljenih reagentov... 14
3.2 Metode ... 15
3.2.1 Precepljanje celic E. coli DH5α... 15
3.2.2 Izolacija plazmida ... 16
3.2.3 Transformacija celic E. coli BL21[DE3] ... 16
3.2.4 Precepljanje celic E. coli BL21[DE3] v MDG ... 16
3.2.5 Poskusno izražanje ... 16
3.2.6 Izražanje v večjem merilu... 17
3.2.7 Priprava vzorcev za analizo z NaDS-PAGE... 17
3.2.8 Analiza proteinov z NaDS-PAGE ... 18
3.2.9 Izolacija proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo ... 19
3.2.10 Zamenjava pufra z dializo ... 19
3.2.11 Cepitev proteinov s proteazo TEV ... 20
3.2.12 Koncentriranje proteina ... 20
3.2.13 Merjenje absorbance z uporabo naprave Nanodrop ... 20
3.2.14 Sinteza aminofunkcionaliziranih monodisperznih delcev SiO2 ... 21
3.2.15 Funkcionalizacija monodisperznih delcev SiO2 s proteinom N ... 22
3.2.16 Dokazna reakcija z uporabo hitrih antigenskih testov ... 24
4 Rezultati in razprava ... 25
4.1 Transformacija bakterijskih celic ... 25
4.1.1 Izolacija plazmida ... 25
4.1.2 Transformacija E. coli BL21[DE3] ... 25
4.2 Poskusno izražanje ... 26
4.3 Izolacija proteina N iz topne frakcije ... 28
4.4 Cepitev proteina N s proteazo TEV ... 29
4.5 Sinteza monodisperznih delcev SiO2 ... 32
4.6 Funkcionalizacija monodisperznih delcev SiO2 ... 33
5 Zaključek ... 35
6 Literatura ... 37
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
A280 optična gostota pri valovni dolžini 280 nm A600 optična gostota pri valovni dolžini 600 nm
ACE2 angiotenzin pretvarjajoči encim 2 (angl. angiotensin-converting enzyme 2) APS amonijev peroksidisulfat
APTES (3-aminopropil)trietoksisilan Asp asparaginska kislina
BSA goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumin) CBB angl. Coomassie Brilliant Blue
CD označevalec pripadnosti (angl. cluster of differentiation) CTD C-končna domena
CTL citotoksični limfocit
DNA deoksiribonukleinska kislina
ECM zunajcelični matriks (angl. extracellular matrix) EDTA etilendiamintetraacetat
ER endoplazemski retikulum
ERGIC vmesni kompartment med endoplazemskim retikulumom in Golgijevim aparatom (angl. endoplasmic reticulum–Golgi intermediate compartment)
Glu glukoza IFN I interferon I
IMAC afinitetna kromatografija z imobiliziranimi kovinskimi ioni (angl. immobilised metal affinity chromatography)
IPTG izopropil β-D-1-tiogalaktopiranozid
LAMP1 lizosomski membranski protein (angl. lysosomal-associated membrane protein 1)
MERS-CoV angl. Middle East respiratory syndrome coronavirus
MHC-I poglavitni histokompatibilni kompleks I (angl. major histocompatibility complex I)
mRNA informacijska RNA (angl. messenger RNA)
NaDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza z natrijevim dodecil sulfatom NTD N-končna domena
PI3P fosfoinozitol-3-fosfat RNA ribonukleinska kislina
RTC replikazno-transkriptazni kompleks
SARS-CoV angl. severe acute respiratory syndrome coronavirus SARS-CoV-2 angl. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 TEMED N,N,N′,N′-tetrametiletan-1,2-diamin
TEOS tetraetil ortosilikat
TEV virus jedkanja tobaka (angl. tobacco etch virus) Tris tris(hidroksimetil)aminometan
TRS transkripcijsko regulatorno zaporedje
1
1 Uvod
1.1 SARS-CoV-2
Koronaviruse uvrščamo v red Nidovirales, družino Coronaviridae in poddružino Orthocoronaviridae. Družino glede na organizacijo genoma in filogenetsko sorodnost delimo na štiri rodove – Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus in Deltacoronavirus. Virus SARS-CoV-2 uvrščamo v rod Betacoronavirus, kamor spadata tudi SARS-CoV in MERS-CoV. Virusni delci so veliki od 70 nm do 90 nm in so obdani z lipidno membrano, ki izvira iz gostiteljske celice. V membrano so vstavljeni bodičasti proteini, ki dajejo virionom značilno obliko, po kateri je družina tudi dobila ime.
Membrana obdaja nukleokapsido z vijačno simetrijo, ki vsebuje smerno enoverižno RNA.
1.1.1 Virusni genom in proteini
Genom virusa je velik približno 30 000 baznih parov in je organiziran v 15 bralnih okvirjev, ki zapisujejo 29 proteinov. Šestnajst nestrukturnih proteinov je zapisanih v bralnih okvirjih ORF1a in ORF1ab, ki obsegata 67 % genoma. Iz njiju se izrazita dva velika poliproteina, ki tvorita replikazno-transkriptazni kompleks (RTC). Nadalje genom obsega še zapise za štiri strukturne proteine in devet pomožnih proteinov, med katere spada tudi ORF8. Strukturni proteini omogočajo nastanek virusnih delcev ter njihovo pomnoževanje. Protein S (angl. spike) omogoči pritrditev virusnega delca na zunajcelični receptor ACE2, njegov vstop v celico in prenos v endoplazemski retikulum. Protein M (angl. membrane) vzdržuje strukturo virusne ovojnice, stabilizira nukleokapsido in sodeluje pri sestavljanju virusnih delcev. Protein E (angl. envelope) sodeluje pri sestavljanju virusnih delcev in brstenju. Le majhen delež proteina E, ki je prisoten v okuženi celici se nato tudi vključi v membrano virusa. Protein N (angl.
nucleocapsid) se veže na virusno RNA in omogoči sestavljanje virusnih delcev. Zapisi za strukturne in nestrukturne proteine so v genomih družine Coronaviridae organizirani v enakem vzorcu, medtem ko se zapisi za pomožne proteine pri različnih vrstah koronavirusov razlikujejo po svojem številu in razporeditvi.
1.1.2 Replikacija virusa
Replikacija virusa se začne z vezavo virusnega delca na receptor gostiteljske celice. V primeru SARS-CoV-2 se protein S veže na ACE2. Vstop v celico omogoči proteolitična cepitev proteina S z eno od proteaz gostiteljske celice, pri čemer se na proteinu S izpostavi fuzijski peptid, ki omogoči zlivanje virusne in celične membrane. Po vstopu
2
virusne RNA v celico se pričnejo izražati geni za nestrukturne proteine, ki nato tvorijo RTC. RTC pomnoži virusno RNA, obenem pa prepiše tudi mRNA, potrebne za sintezo strukturnih in pomožnih proteinov. Nastali strukturni proteini S, M in E se vstavijo v membrano endoplazemskega retikuluma, od koder se z vezikularnim transportom premaknejo v ERGIC. Tam se skupaj z genomom, enkapsuliranim s proteinom N, sestavijo v virusne delce. Ti se nato z vezikularnim transportom dostavijo do celične površine, kjer se izločijo z eksocitozo1, 2.
1.2 Protein ORF8
Genom virusa SARS-CoV-2 vsebuje zapise za devet pomožnih proteinov, ki ne sodelujejo pri virusni replikaciji ali sestavljanju virusnih delcev, temveč vplivajo na metabolizem in imunski odziv gostiteljskih celic. Protein ORF8 inhibira predstavitev virusnih antigenov v kontekstu poglavitnega histokompatibilnega kompleksa razreda I (MHC-I), prepreči protivirusni odziv z interferonom tipa I (IFN-I) in interagira z gostiteljevimi faktorji, ki sodelujejo pri pljučnem vnetju in fibrogenezi.
1.2.1 Gen orf8
Gen orf8 obsega 366 nukleotidov in se v genomu nahaja med mestoma 27 894 in 28 259. Zapis se nahaja na hipervariabilnem delu genoma, ki je dovzeten za rekombinacije, delecije in substitucije. Tudi homologni proteini ostalih koronavirusov, ki okužijo druge živalske vrste, so podvrženi podobnim mutacijam, kar omogoča preskok virusov med vrstami. Mesta na zapisu, kjer se dogajajo rekombinacije in delecije se prekrivajo z mesti ponovitev nukleotidov in območji, ki na RNA tvorijo lasnične zanke - strukture, povezane z genomsko nestabilnostjo. Zapis za ORF8 je podvržen mutacijam, ki obsegajo rekombinacijske in delecijske dogodke, kar omogoča hitro prilagajanje virusa na svojega gostitelja. Med vsemi pomožnimi proteini SARS-CoV-2 je ORF8 najbolj variabilen. Delecija 382 nukleotidov (Δ382), ki povzroča izgubo funkcionalnega proteina ORF7b in transkripcijskega regulatornega nukleotidnega zaporedja (TRS) pred ORF8, je povezana z blažjim potekom covida-193.
1.2.2 Struktura ORF8
ORF8 je dolg 121 aminokislinskih ostankov in spada v proteinsko naddružino imunoglobulinov. Ima N-končni signalni peptid za prenos proteina v ER ter osrednji del s strukturo β-sendviča. ORF8 za razliko od sorodnih koronavirusnih proteinov iz naddružine imunoglobulinov nima transmembranske domene. Osrednji β-sendvič je sestavljen iz dveh antiparalelnih β-ploskev, ki ju tvori osem β-trakov. Prisotne so tri intramolekularne disulfidne vezi. ORF8 v zreli obliki nastopa kot dimer, v katerem se
3
monomera povežeta z disulfidno vezjo preko Cys20. Intermolekularne nekovalentne interakcije med dvema β-ploskvama monomerov dodatno stabilizirajo dimerizacijo4. Hidrofoben N-končni signalni peptid je značilen za proteine, ki se izločajo iz celice ali pa so lokalizirani v ER. Disulfidne vezi, ki za nastanek potrebujejo oksidirajoče okolje, kakršno najdemo v ER ali zunaj celice, dodatno potrjujejo domnevo, da se ORF8 nahaja v ER. ORF8 velja tudi za enega izmed najbolj imunogenih proteinov virusa SARS- CoV-2, zato je verjetno, da se ne zadržuje v ER, temveč se izloči iz celice. Prisotnost protiteles proti ORF8 je eden od glavnih znakov okužbe s SARS-CoV-23, 4.
1.2.3 Inhibicija MHC-I z ORF8
Celice, okužene z virusom, v kontekstu svojih MHC-I receptorjev predstavijo peptide, ki izhajajo iz virusnih proteinov. Tovrstne komplekse nato prepoznajo CD8+ T- limfociti, ki se preobrazijo v citotoksične limfocite T (CTL) in prično izločati toksične substance, s katerimi odstranijo okužene celice, ter citokine, ki v celicah sprožijo protivirusni odziv. ORF8 zmanjšuje izražanje MHC-I na površini celice in povzroča njegovo razgradnjo. ORF8 se lahko veže direktno na MHC-I, poleg tega pa interagira tudi z lizosomalnimi proteini (npr. LAMP1) in kalneksinom. Interaktom ORF8 obsega tudi proteine, vključene v kontrolo kakovosti proteinov v ER, glikozilacijo, organizacijo ECM in sintezo glikozaminoglikanov5. Razgradnja MHC-I je oblika specifične avtofagije, ki jo imenujemo ER-fagija. Pri tem se od ER odcepijo omegasomi - vezikli, bogati s PI3P. V njihovi membrani se nahajajo proteini LC3, na katere avtofagni iniciacijski kompleks veže lipide in s tem sproži nastanek avtofagosoma6. Kolokalizacijske študije so pokazale interakcijo avtofagosomalnega LC3 tako z MHC-I kot z ORF8. Uporaba specifičnih avtofagnih inhibitorjev klorokina in E64/pep izražanje MHC-I na celični površini znova poveča. Tudi izbitje genov za proteine, ki sodelujejo pri prenosu tovora v avtofagosome, omogoči ponovno izražanje MHC-I na celični površini. Zaradi odsotnosti MHC-I okužene celice ne morejo predstaviti virusnih peptidov in posledično ne pride do prepoznavanja in eliminacije okuženih celic s pomočjo CTL7.
1.2.4 Inhibicija IFN-I z ORF8
Proteini ORF6, ORF8 in N delujejo kot inhibitorji signalne poti interferonov tipa I (IFN-I). Izmed teh treh proteinov je ORF8 najšibkejši antagonist. Pri virusni infekciji se transkripcijski faktorji (npr. IRF-3 in NF-κB) vežejo na interferonski promotor in
4
stimulirajo izražanje IFN-I (IFN-α, IFN-β). Sintetizirani interferon se izloči iz celice in se veže na interferonski receptor, ki sproži signalno pot JAK/STAT, s katero preko transkripcijskih faktorjev aktivira gene, katerih promotorji vsebujejo odzivne elemente za interferone (ISRE). Izražanje genov, ki ga stimulirajo interferoni, v celici vzpostavi protivirusno stanje. Protein ORF8 lahko inhibira promotorja IFN-β in ISRE ter blokira odzivni element za NF-κB8.
1.3 Protein N
Protein N je strukturni protein, ki je med pripadniki iste družine koronavirusov zelo ohranjen. Homologna proteina virusov SARS-CoV in SARS-CoV-2 imata 90,52 % identično zaporedje. Protein sodeluje pri transkripciji in replikaciji virusne RNA ter njuni regulaciji, omogoča pakiranje virusnega genoma ter posreduje pri modulaciji metabolizma okužene celice. Skupaj z genomsko RNA tvori vijačno nukleokapsido, kar omogoča nastanek urejene strukture ribonukleoproteinskega kompleksa, ki usmerja virusno replikacijo in transkripcijo.
1.3.1 Struktura proteina N
Proteini N različnih koronavirusov imajo podobno strukturo, za katero so značilne tri domene: N-končna domena (NTD), C-končna domena (CTD) in intrinzično neurejen osrednji povezovalni del (LKR, angl. linkage region), ki vsebuje domeno, bogato s serinskimi in argininskimi ostanki (SRD). Tako NTD kot CTD vsebujeta β-ploskve, CTD pa ima tudi nekaj krajših vijačnic. Delež sekundarnih struktur narašča vse do temperature 55 °C. N-končna domena je odgovorna za vezavo na RNA. Vezava poteka predvsem z elektrostatskimi interakcijami bazičnih aminokislinskih ostankov in negativno nabitega ogrodja nukleinske kisline. Protein N se v raztopini nahaja kot dimer, dimerizacija pa poteka prek CTD. Tudi CTD vsebuje pozitivno nabite aminokislinske ostanke, ki omogočajo vezavo na virusno RNA. Velik delež pozitivno nabitih aminokislinskih ostankov v proteinu je verjetno razlog za nespecifično vezavo na dsDNA. Obsežna intrinzično neurejena osrednja domena domnevno omogoča prehodno vezavo na različne interakcijske partnerje in ohranja pravilno konformacijo proteina N9.
1.3.2 Imunogenost proteina N
Protein N je močno imunogen in se pogosto uporablja kot diagnostični marker pri detekciji okužbe s SARS-CoV-2. V serumu pacientov s covidom-19 so prisotna protitelesa IgG, IgA in IgM proti proteinu N. Tovrstna protitelesa so v primerjavi s
5
protitelesi proti drugim strukturnim proteinom SARS-CoV-2 tudi bolj specifična in občutljiva ter so v serumu prisotna dlje časa10.
1.3.3 Inhibicija imunskega odziva s proteinom N
V gostiteljski celici protein N povzroči inhibicijo signalizacije z IFN-I in onemogoči protivirusni odziv celice. Protein N inhibira odzivna promotorja za IFN-β in NF-κB, za razliko od ORF8 pa ne inhibira ISRE8.
Za sesalske celice je značilna tudi protivirusna obramba s pomočjo interferenčne RNA (RNAi). Po okužbi celice z virusom nastane dsRNA, ki jo cepi celična endonukleaza Dicer. Nastala siRNA skupaj s proteinom Argonavt tvori kompleks RISC, ki prepozna tarčna zaporedja na virusni RNA in jo uniči. Protein N deluje kot virusni zaviralec RNAi tako v iniciacijski kot v efektorski fazi. V iniciacijski fazi se veže na dsRNA in proteinu Dicer prepreči cepitev. V kasnejših fazah prepreči sestavljanje kompleksa RISC in cepitev tarčne RNA11.
Za homologni protein N iz virusa SARS-CoV je značilno, da se veže neposredno na elongacijski faktor 1α (EF1α), ki sodeluje pri translaciji, kontroli kakovosti proteinov in njihove razgradnje. Poleg tega se veže tudi na F-aktin in sodeluje pri nastanku kontraktilnega obroča pri citokinezi. Zaradi vezave koronavirusnega proteina na EF1α, ta agregira, posledično pa se ustavita sinteza celičnih proteinov in citokineza, kar inhibira celično proliferacijo. To se sklada z opaženimi nižjimi koncentracijami limfocitov CD3+, CD4+ in CD8+ pri pacientih s SARS, saj so aktivno deleče se populacije limfocitov ena izmed glavnih tarč SARS-CoV12
1.4 Monodisperzni delci SiO
2Silicijev dioksid (SiO2) je najpogostejša spojina v zemeljski skorji, kjer se nahaja v različnih oblikah. Med drugim je SiO2 gradnik opalov, precej posebnih poldragih kamnov. Opali nimajo velike trdote in niso pravilnih geometrijskih oblik. Če se nekolikanj pomudimo pri etimologiji imena »opal,« ugotovimo, da ime izhaja iz latinskega »opalus« ali grškega »opallios,« ki pomenita »videti spremembo barve« in sta verjetno izposojenki iz staroindijščine, v kateri beseda »upala« pomeni (drag) kamen. Redkeje se pojavlja tudi ime »girasol,« ki izhaja iz italijanščine; »girare«
pomeni obračati se in »sol« pomeni Sonce13, 14, 15. A bodi dovolj o jezikoslovju. Za opale je značilna igra barv, ki jo opazimo, ko kamen premaknemo na svetlobi. Ta pojav imenujemo opalescenca in je značilna za fotonske kristale15. To so sistemi s periodično strukturo, ki je reda velikosti valovne dolžine svetlobe, zaradi česar pride do pojava
6
dovoljenih in prepovedanih energijskih pasov za fotone, ki delujejo podobno kot energijski pasovi elektronov v polprevodniških kristalih. Optične lastnosti sistema določata struktura kristalne mreže in lomni količnik, na katera lahko vplivajo zunanji dejavniki, zato je fotonske kristale možno uporabiti kot (bio)senzorje. Delce lahko funkcionaliziramo s protitelesi, lektini ali avidinom in tako detektiramo razne biološko pomembne molekule, delci, funkcionalizirani z encimi, pa omogočajo biokatalizo16.
7
2 Namen dela
Namen dela je bil v bakterijskih celicah izraziti koronavirusna proteina ORF8 in N, ju izolirati ter nato z njima funkcionalizirati monodisperzne delce SiO2, ki smo jih predhodno sintetizirali.
8
9
3 Materiali in metode
3.1 Materiali
3.1.1 Materiali pri delu z nukleinskimi kislinami 3.1.1.1 Vektor pMCSG7
Vektor pMCSG7 je plazmid, ki omogoča kloniranje, neodvisno od ligacije. Vsebuje zapis za N-končni metionin, ki mu sledi zapis za heksahistidinsko oznako, ki omogoča afinitetno čiščenje proteina. Sledi zapis za vmesnik iz osmih aminokislin in cepitveno mesto za proteazo TEV (ENLYFQS). Takoj za zapisom za prepoznavno mesto proteaze se nahaja restrikcijsko mesto za SspI. Plazmidno karto prikazuje slika 1.
Slika 1: Plazmidna karta vektorja pMCSG7. Značilnosti vektorja: lacI – zapis za lac represor; rop – zapis za protein Rop, ki v celici vzdržuje majhno število plazmidov; ori – mesto začetka podvojevanja v bakterijskih celicah; AmpR – zapis za odpornost na ampicilin; T7-terminator – terminator transkripcije za T7 RNA-polimerazo; 6xHis – zapis za heksahistidinsko oznako, TEV site – prepoznavno mesto za proteazo TEV; ATG – začetni kodon; RBS – vezavno mesto za ribosom. Slika je bila ustvarjena s programom SnapGene Viewer.
10
3.1.1.2 Kompleti reagentov za izolacijo DNA
Izolacijo plazmidne DNA iz prekonočnih kultur bakterijskih celic DH5α smo izvedli s kompletom reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, ZDA).
3.1.2 Materiali pri delu z bakterijskimi celicami 3.1.2.1 Bakterijski sevi
1. Escherichia coli DH5α
▪ Genotip: F– φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1
To je klonirni sev, ki smo ga uporabili za pomnoževanje plazmidov.
2. Escherichia coli BL21[DE3]
▪ Genotip: F– ompT hsdSB (rB–, mB–) gal dcm (DE3)
▪ To je ekspresijski sev, ki v genomski DNA vsebuje zapis za RNA-polimerazo T7. Sev smo uporabili za izražanje proteinov.
3.1.2.2 Pufri za pripravo gojišč in resuspenzijo bakterijskih celic Sestava pufrov je podana v
tabeli 1
.Tabela 1: Sestava pufrov, uporabljenih pri delu z bakterijskimi celicami.
Pufer Sestavina Končna koncentracija
50x M Na2HPO4 • 2H2O 1,25 M
KH2PO4 1,25 M
NH4Cl 2,5 M
Na2SO4 0,25 M
10x salts KH2PO4 0,17 M
K2HPO4 0,72 M
pufer za resuspenzijo Na-Tris, pH = 7,5
NaCl 500 mM
Tris 50 mM
3.1.2.3 Gojišča za bakterijske kulture
Sestava bakterijskih gojišč je podana v tabeli 2. Za pripravo trdnih gojišč smo navedenim sestavinam dodali 1 g agarja.
11
Tabela 2: Sestava gojišč za bakterijske kulture.
Gojišče Sestavina Za 100 mL
tekoče gojišče LB pepton 1 g
kvasni ekstrakt 0,5 g
NaCl 1 g
tekoče gojišče LBA pepton 1 g
kvasni ekstrakt 0,5 g
NaCl 1 g
ampicilin (1 M) 100 µL
MDG H2O 95,5
MgSO4 (1 M) 200 µL
glukoza (40 %) 1,25 mL
aspartat (25 %) 1 mL
50x pufer M 2 mL
ampicilin (1 M) 100 µL
TB H2O dopolnimo do 100 mL
pepton 1,2 g
kvasni ekstrakt 2,4 g
glicerol 0,4 mL
TB/Glu/Asp tekoče gojišče TB 79 mL
10x salts 10 mL
glukoza (40 %) 10 mL
MgCl2 (200 mM) 1 mL
ampicilin (1 M) 100 µL
12
3.1.3 Materiali pri delu s proteini 3.1.3.1 Pufri za delo s proteini
Sestava pufrov je podana v tabeli 3.
Tabela 3: Sestava pufrov za delo s proteini.
Pufer Sestavina Končna koncentracija
pufer z ureo NaCl 500 mM
Tris 50 mM
urea 6 M
vezavni pufer Na-Tris, pH = 7,5
NaCl 500 mM
Tris 50 mM
imidazol 20 mM
elujcijski pufer Na-Tris, pH = 7,5
NaCl 500 mM
Tris 50 mM
imidazol 300 mM
dializni pufer, pH = 7,5 NaCl 150 mM
Tris 20 mM
dializni pufer za cepitev s proteazo TEV, pH = 7,4
NaCl 150 mM
Tris 20 mM
EDTA 1 mM
β-merkaptoetanol 2 mM
13
3.1.3.2 Materiali za analizo proteinov z NaDS-PAGE
Za analizo proteinov z NaDS-PAGE smo uporabili 15 % ločevalni in 5 % koncentracijski gel. Sestava obeh gelov je podana v tabeli 4.
Tabela 4: Sestava 15 % in 5 % gela za NaDS-PAGE.
15 % ločevalni gel (10 mL) 5 % koncentracijski gel (5 mL)
dH2O 4,27 mL 3,08 mL
pufer 1,5 M Tris/HCl, pH = 8,8
2,5 mL /
pufer 0,5 M Tris/HCl, pH = 6,8
/ 1,25 mL
akrilamid:bisakrilamid (37:1)
3,13 mL 0,625 mL
NaDS (10 %) 100 µL 50 µL
TEMED 7,5 µL 7,5 µL
APS (10 %) 15 µL 15 µL
Po elektroforezi smo gel čez noč inkubirali v barvalni raztopini. Po barvanju smo gel razbarvali še z razbarvalno raztopino. Sestava obeh raztopin je navedena v tabeli 5.
Tabela 5: Sestava barvalne in razbarvalne raztopine za NaDS-PAGE.
Raztopina Sestavina Za 500 mL
barvalna raztopina Coomassie Brilliant Blue
CBB R250 125 mg
Etanol 150 mL
Ocetna kislina 35 mL
dH20 do 500 mL
razbarvalna raztopina Etanol (30 %) 150 mL Ocetna kislina (10 %) 50 mL
dH20 300 mL
3.1.4 Materiali pri delu z monodisperznimi delci SiO2
Za sintezo aminofunkcionaliziranih delcev smo uporabili naslednje kemikalije:
▪ APTES
▪ etanol (absolutni)
14
▪ TEOS
▪ glutaraldehid
Za vezavo proteina na delce smo uporabili pufre in raztopine, katerih sestava je navedena v tabeli 6.
Tabela 6: Sestava pufrov za delo z monodisperznimi delci SiO2.
Pufer Sestavina Končna koncentracija
PBS, pH = 7,5 NaCl 150 mM
K2HPO4 10,4 mM
NaH2PO4 1,83 mM
dušilna raztopina* Glicin 35 mM
BSA 0,2 % (w/v)
pufer za shranjevanje* BSA 0,04 % (w/v)
Tris 50 mM
*Dušilna raztopina in pufer za shranjevanje sta bila pripravljena z raztapljanjem v PBS.
Za dokazno reakcijo smo uporabili hitre antigenske teste Immupass VivaDiag™ SARS- CoV-2 Ag Rapid Test.
3.1.5 Seznam uporabljenih reagentov
V tabeli 7 so navedeni vsi uporabljeni reagenti in njihovi proizvajalci.
Tabela 7: Seznam reagentov in njihovih proizvajalcev.
Reagent Proizvajalec
agar Sigma-Aldrich
akrilamid : bisakrilamid (37 : 1) Fluka
ampicilin Fisher Scientific
APS Invitrogen
APTES Sigma-Aldrich
asparaginska kislina Sigma-Aldrich
BSA Fisher Scientific
CBB R250 Sigma-Aldrich
EDTA Sigma-Aldrich
etanol Gram-Mol
glicerol Fisher Scientific
glicin Sigma-Aldrich
15
glukoza Sigma-Aldrich
glutaraldehid Sigma-Aldrich
IMAC Sepharose™ 6FastFlow GE Healthcare
imidazol Sigma-Aldrich
K2HPO4 Gram-Mol
KH2PO4 Merck
kvasni ekstrakt Biolife
MgCl2 Sigma-Aldrich
MgSO4 Honeywell
Na2HPO4 • 2H2O Merck
Na2SO4 Fluka Analytical
NaCl Gram-Mol
NaDS Sigma-Aldrich
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
NH4Cl Acros Organics
ocetna kislina Gram-Mol
pepton Sigma-Aldrich
proteinski standard Thermo Scientific
TEMED Invitrogen
TEOS Sigma-Aldrich
Tris Sigma-Aldrich
urea Honeywell
β-merkaptoetanol Sigma-Aldrich
3.2 Metode
3.2.1 Precepljanje celic E. coli DH5α
Celice bakterije E. coli so bile transformirane s plazmidom pMCSG7, ki je vseboval zapis bodisi za protein ORF8 bodisi za protein N (Gašper Žun, IJS). Celice so bile konfluentne, zato smo izvedli cepitev do posameznih kolonij na sveži plošči LBA, ki smo jo na 37 °C inkubirali čez noč. Po eno kolonijo smo nato prenesli v tekoče gojišče LBA in celice na 37 °C pri stresanju 130 rpm inkubirali čez noč.
16
3.2.2 Izolacija plazmida
Celice bakterije E. coli DH5α, ki so zrastle v tekočem gojišču LBA smo centrifugirali 10 minut na 4 °C pri hitrosti 5400 g. Supernatant smo zavrgli. Za izolacijo plazmida smo uporabili komplet reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Bakterije smo najprej resuspendirali in lizirali, čemur je sledilo obarjanje genomske DNA, ki smo jo nato odstranili s centrifugiranjem. Preostanek smo prenesli na kolono, ki vsebuje silikatni nosilec, na katerega se ujame plazmidna DNA. Plazmidno DNA smo nato sprali s pufrom za spiranje in eluirali s 30 µL deionizirane vode. Koncentracijo plazmidne DNA smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm, njeno čistost pa iz razmerja: 𝐴260
𝐴280. 3.2.3 Transformacija celic E. coli BL21[DE3]
Alikvot celic bakterije E. coli BL21[DE3] smo odmrznili na ledu in v mikrocentrifugirko dodali 1 µL plazmida pMCSG7 z zapisom za protein ORF8 ali protein N. Celice smo 20 minut inkubirali na ledu in jih občasno pretresli. Sledil je temperaturni šok, ko smo bakterije in plazmid 45 sekund inkubirali pri 42 °C. Bakterije smo nato vrnili na led in jim nato pri sobni temperaturi aseptično dodali 800 µL tekočega gojišča LB. Sledilo je enourno inkubiranje bakterij na 37 °C pri stresanju 130 rpm. 50 µL bakterijske kulture smo nato aseptično prenesli na ploščo LBA, ki smo jo nato inkubirali na 37 °C čez noč.
3.2.4 Precepljanje celic E. coli BL21[DE3] v MDG
Po eno kolonijo bakterije E. coli BL21[DE3] z zapisom za enega od rekombinantnih proteinov, ki je zrastla na trdnem gojišču LBA, smo aseptično precepilli z nastavkom pipete v 30 mL tekočega gojišča MDG v 100 mL stresalni erlenmajerici. Naredili smo tudi kontrolo, pri kateri smo uporabili prazen nastavek pipete. Stresalne erlenmajerice smo nato inkubirali na 37 °C pri stresanju 130 rpm čez noč.
3.2.5 Poskusno izražanje
V šestih 100 mL stresalnih erlenmajericah smo pripravili 50 mL tekočega gojišča TB/Glu/Asp. Vanje smo odpipetirali 100 µL bakterijske kulture iz tekočega gojišča MDG. Tri paralelke smo pripravili z bakterijsko kulturo E. coli BL21[DE3] z zapisom za protein ORF8, tri pa z zapisom za protein N. Bakterije smo inkubirali na 37 °C pri stresanju 130 rpm 3 do 4 ure. Nato smo bakterijski kulturi izmerili absorbanco pri 600 nm, ki smo jo nato merili na vsakih 15 do 30 minut, dokler ni dosegla vrednosti med 0,6 in 0,8, kar je pomenilo, da so celice dosegle logaritemsko fazo rasti. Takrat smo izvedli indukcijo in bakterijam dodali 50 µL 1M IPTG. Bakterijske kulture smo nato inkubirali pri 18 °C, 25 °C in 37 °C čez noč.
17
Prekonočnim bakterijskim kulturam v gojišču TB/Glu/Asp smo izmerili absorbanco.
Kot slepo vrednost smo uporabili gojišče TB, bakterijske kulture pa smo 10-kratno redčili – 100 µL bakterijske kulture smo dodali 900 µL gojišča TB. S pomočjo vrednosti absorbance smo izračunali volumen pufra Na-Tris, potreben za resuspendiranje bakterijskih celic. Upoštevali smo enačbi 𝑓 = 270 µL
150 µL × 𝐴600 ×10 in 𝑉𝑟𝑒𝑠.= 4 × 𝑉𝑜𝑑𝑣.
5 ×𝑓 , pri katerih je:
A600 – vrednost absorbance, izmerjene pri 600 nm, f - faktor, odvisen od absorbance,
Vres. - volumen pufra, potreben za resuspendiranje celic, Vodv. - volumen odvzete bakterijske kulture.
Bakterijske kulture v tekočem gojišču TB/Glu/Asp smo centrifugirali 10 minut pri 8000 g. Supernatant smo zavrgli, pelet pa resuspendirali v ustreznem volumnu pufra Na-Tris. Bakterijske celice smo nato shranili pri −80 °C.
3.2.6 Izražanje v večjem merilu
V osmih 2 L stresalnih erlenmajericah smo pripravili 400 mL tekočega gojišča TB/Glu/Asp. V štiri erlenmajerice smo iz tekočega gojišča MDG nacepili 800 µL bakterijske kulture z zapisom za ORF8, v štiri pa za N. Erlenmajerice smo inkubirali pri 37 °C in stresanju 130 rpm 3 do 4 ure, nato pa pričeli z merjenjem absorbance pri 600 nm. Ko je vrednost absorbance prenehala naraščati, smo v vsako erlenmajerico dodali 400 µL IPTG in jih prekonočno inkubirali pri 37 °C in stresanju 130 rpm. Po enakem postopku kot pri poskusnem izražanju smo 10-krat redčenim vzorcem prekonočnih kultur izmerili absorbanco in jih centrifugirali. Pelet smo resuspendirali v 40 mL pufra Na-Tris in ga shranili pri −80 °C.
3.2.7 Priprava vzorcev za analizo z NaDS-PAGE
Vzorce bakterijskih celic smo odmrznili na ledu in odpipetirali 1 mL vzorca v mikrocentrifugirko. Bakterijske celice smo lizirali s sonifikatorjem, tako da smo vsak vzorec sonificirali trikrat po 30 sekund. Delali smo v hladni sobi, vzorci so bili ves čas na ledu, s čimer smo morebitno prisotnim proteazam preprečili razgradnjo proteina.
Cikel sonifikatorja je bil 0,8, amplituda pa 80 %. Lizat smo nato centrifugirali 10 minut na 4 °C pri hitrosti 15 000 g. Po centrifugiranju je prišlo do ločitve topne in netopne frakcije proteinov. Slednjo smo resuspendirali v 800 µL pufra z ureo.
Pripravili smo 12 mikrocentrifugirk z nikljevimi kroglicami. V vsako mikrocentrifugirko smo odpipetirali 50 µL v etanolu resuspendiranih nikljevih kroglic.
18
Po 15-minutnem posedanju kroglic smo odpipetirali supernatant in kroglice sprali z deionizirano vodo. Kroglicam smo dodali 200 µL deionizrane vode in jih centrifugirali 1 minuto na 4 °C pri 700 g ter zavrgli supernatant. Postopek smo ponovili dvakrat.
Sledila je inkubacija kroglic v pufru – tistim, namenjenim vezavi netopne frakcije smo dodali 200 µL pufra z ureo, tistim, namenjenim vezavi topne frakcije pa 200 µL pufra Na-Tris. Kroglice smo centrifugirali 1 minuto na 4 °C pri 700 g ter zavrgli supernatant.
Postopek smo ponovili dvakrat. V vsako mikrocentrifugirko z nikljevimi kroglicami smo dodali 200 µL vzorca in jih inkubirali 20 minut na 4 °C. Vzorce smo nato centrifugirali 1 minuto na 4 °C pri 700 g ter zavrgli supernatant. Vse vzorce smo po prej opisanem postopku še enkrat sprali s pufrom Na-Tris. Po spiranju smo vzorcem dodali 10 µL štirikratnega nanašalnega pufra z reducentom in 30 µL pufra Na-Tris. Vzorce smo nato 5 minut inkubirali pri 100 °C.
Vzporedno smo pripravili tudi vzorce brez nikljevih kroglic. Odpipetirali smo 18 µL vzorca topne ali netopne frakcije in mu dodali 6 µL štirikratnega nanašalnega pufra z reducentom. Vzorce smo nato 5 minut prekuhavali pri 100 °C.
3.2.8 Analiza proteinov z NaDS-PAGE
Pripravili smo gele za analizo proteinov z NaDS-PAGE. V model smo najprej ulili ločevalni gel, ko se je ta zamrežil, pa še koncentracijskega. Reagenta TEMED in APS, ki sprožita zamreževanje akrilamida ter bisakrilamida smo dodali šele, ko je bila mešanica preostalih reagentov že ulita v modele. Za hitrejšo polimerizacijo smo dodali dvakratno količino APS. Polimerizacija posameznega gela je trajala približno 20 minut.
Stekelca z geli smo nato iz modelov prenesli v kadičko s pufrom za elektroforezo in v žepke na gelu nanesli 12 µL vzorca in 8 µL proteinskega standarda. Kadičko smo priključili na električno napetost 200 V, tok pa je znašal 35 mA/gel. Elektroforeza je tekla tako dolgo, da je linija barvila dosegla spodnji rob gela.
Za barvanje gela smo uporabili barvalno raztopino. Gel smo v petrijevki s pokrovom prelili s približno 20 mL barvalne raztopine in ga pustili na stresalniku čez noč.
Po barvanju smo iz petrijevke odlili barvalno raztopino in gele prelili z razbarvalno raztopino. Gele smo v petrijevki stresali še 20 minut in nato razbarvalno raztopino odlili ter gele splaknili z deionizirano vodo in jih v njej tudi hranili.
19
3.2.9 Izolacija proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo
Inducirane in resuspendirane bakterijske celice, ki so bile shranjene pri –80 °C smo odmrznili in prelili v 100 mL čašo, ki smo jo ves čas hranili na ledu. Celice smo nato lizirali s sonifikacijo. Sonificirali smo s sonifikatorjem Hielscher UP100H v petih triminutnih intervalih, med katerimi je bila minuta premora, da smo preprečili pregrevanje vzorca. Iz istega razloga smo vzorec tudi neprestano hranili na ledu in sonificiranje izvajali v hladni sobi. Cikel sonifikatorja je bil 0,8, amplituda pa 80 %. Po sonifikaciji smo lizat prelili v 50 mL centrifugirko in ga centrifugirali 20 minut pri 16 000 g na 4 °C. Supernatant smo nato filtrirali najprej skozi 0,45 µm filter in nato še skozi 0,2 µm filter. V dve mikrocentrifugirki smo shranili 50 µL topne frakcije in pelet, ki smo ga resuspendirali v 50 µL deionizirane vode.
Za afinitetno čiščenje smo uporabili kolono z imobiliziranimi nikljevimi ioni HisTrap™
FF s kapaciteto 1 mL. Za nanos vzorca smo uporabili peristaltično črpalko. Kolono smo najprej sprali z 10 mL destilirane vode, nato pa še z 10 mL vezavnega pufra. Pretok je bil 1 mL/min. Sledil je nanos topne frakcije vzorca na kolono, pretok smo upočasnili na 0,5 mL/min, da je bila vezava proteinov učinkovitejša. Pri nanosu vzorca na kolono se protein s heksahistidinsko oznako veže na imobilizirane dvovalentne nikljeve ione, preostali proteini pa se ne vežejo ali pa se vežejo zgolj nespecifično. Ko je preko kolone stekel ves vzorec, smo odvzeli 50 µL nevezane frakcije in ga shranili v mikrocentrifugirko. Kolono smo nato sprali z 10 mL vezavnega pufra, da smo odstranili nespecifično vezane proteine. Shranili smo tudi 50 µL sprane frakcije. Vezani protein smo s kolone odstranili z izokratsko elucijo. Na kolono smo nanašali elucijski pufer z imidazolom, ki se veže na nikljeve ione in z njih izpodrine protein. V mikrocentrifugirke smo zbrali deset frakcij po 1 mL. Kolono smo sprali najprej z 10 mL destilirane vode in nato z 10 mL 20 % etanola.
Frakcijam smo izmerili absorbanco in tako določili, v katerih frakcijah se nahaja protein. Dobljene vzorce smo analizirali tudi z NaDS-PAGE.
3.2.10 Zamenjava pufra z dializo
Protein N je velik 45,6 kDa, zato smo za dializo uporabili celulozno dializno črevo s porami velikosti 14 K. Črevo smo čez noč inkubirali v 3 L dializnega pufra ob stalnem mešanju z magnetnim mešalom pri 4 °C. S tem smo odstranili imidazol, ki je ostal v vzorcu po čiščenju na nikljevi afinitetni koloni. Po koncu dialize smo vzorec
odpipetirali v 15 mL centrifugirko in ga centrifugirali 20 minut na 4 °C pri 16 000 g.
Supernatant smo odpipetirali v svežo centrifugirko, pelet pa zavrgli. Vzorcu smo izmerili absorbanco in ga nato shranili pri –80 °C.
20
3.2.11 Cepitev proteinov s proteazo TEV
S proteazo TEV smo odcepili histidinsko oznako na proteinu, kar nam je omogočilo dodatno stopnjo čiščenja. Vzorec smo čez noč dializirali v pufru, v dializno črevo smo skupaj z vzorcem dodali proteazo TEV. Masa proteaze TEV je bila 100-krat manjša od predvidene mase proteina, ki smo jo izračunali iz njegove koncentracije, določene z merjenjem absorbance. Koncentracija proteaze TEV je bila 4,5 mg/mL. Po dializi smo vzorec odpipetirali v 15 mL centrifugirko in centrifugirali 20 minut na 4 °C pri 16 000 g. Supernatant smo odpipetirali v svežo centrifugirko, pelet pa zavrgli. Vzorec smo nanesli na kolono za nikljevo afinitetno kromatografijo na enak način kot pri čiščenju proteina s pomočjo heksahistidinske oznake. Nevezane frakcije smo v mikrocentrifugirkah zbrali v mililitrskih alikvotih. Ko je zmanjkalo vzorca, smo kolono sprali še z vezavnim pufrom, tako da smo dobili 15 alikvotov. Sledil je nanos elucijskega pufra na kolono, pri čemer smo zbrali osem mililitrskih alikvotov eluirane frakcije. Vsem alikvotom smo z merjenjem absorbance določili koncentracijo proteina in jih analizirali z NaDS-PAGE. Vzorce smo čez noč shranili na ledu v hladni sobi.
3.2.12 Koncentriranje proteina
Za koncentriranje smo uporabili centrifugirni filter Amicon Ultra-4, ki smo ga najprej sprali s 4 mL deionizirane vode. Naenkrat smo skozi membrano centrifugirali 3 mL vzorca, centrifugirali smo 10 minut na 4 °C pri 7500 g. Med vsakim centrifugiranjem smo skoncentrirani vzorec premešali s pipetiranjem. Po koncentriranju smo vzorcu zamenjali pufer z dializnim pufrom, tako da smo dodali 2 mL dializnega pufra in ponovno centrifugirali. Ta postopek smo ponovili štirikrat. Na koncu smo dobili približno 250 µL vzorca, ki smo ga shranili pri –80 °C.
3.2.13 Merjenje absorbance z uporabo naprave Nanodrop
Z merjenjem absorbance smo določali koncentracijo plazmidne DNA in proteinov.
Koncentracijo plazmidne DNA smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm, določili pa smo tudi razmerje absorbanc pri 260 nm in 280 nm, s čimer smo preverili čistost vzorca. Kot slepi vzorec smo uporabili 4 µL deionizirane vode, analizirali smo 2,5 µL vzorca.
Koncentracijo proteinov smo določili z merjenjem absorbance pri 280 nm, kjer imajo svoj absorpcijski maksimum aromatske aminokisline. Spektrofotometer Nanodrop smo umerili s 4 µL pufra, v kakršnem smo hranili proteine. Absorbanco smo izmerili 2,5 µL posameznega vzorca.
21
3.2.14 Sinteza aminofunkcionaliziranih monodisperznih delcev SiO2
Metodo sinteze monodisperznih delcev SiO2 so pred skoraj pol stoletja razvili Werner Stöber, Arthur Fink in Ernst Bohn17. Kontrolirana rast sferičnih delcev silicijevega dioksida enake velikosti poteka s hidrolizo alkil silikatov in sledečo kondenzacijo silicijeve kisline v raztopinah alkoholov. Reakcijo katalizira amonijak. Primer rekcije je hidroliza tetraetil ortosilikata (TEOS) v etanolu:
Si(OC2H5)4 + 4H2O → Si(OH)4 + 4C2H5OH, ki ji sledi polimerizacija ortosilikata:
nSi(OH)4 → (SiO2)n + 2nH2O18.
Kondenzacija silicijeve kisline povzroči vidno spremembo. Po dodatku tetraetil ortosilikata mešanici etanola in amonijaka ali amonijevega hidroksida v nekaj minutah reakcijska mešanica postane opalescentna, nato pa v roku desetih minut postane mlečno bela. V tem delu sinteze se iz tekoče faze izločijo majhna kondenzacijska jedra, velika približno 10 nm, ki nato rastejo z nadaljnjo polimerizacijo ortosilikata. Vrsta alkohola vpliva na hitrost reakcije (reakcija poteka hitreje pri nižjih alkoholih) in velikost delcev (višji alkoholi povzročijo sintezo večjih delcev). Enako vpliva tudi vrsta alkil silikata.
Amonijak katalizira reakcijo in vpliva na morfologijo delcev – pri reakcijah brez amonijaka nastanejo delci nepravilnih oblik. Večja koncentracija amonijaka omogoča nastanek večjih delcev17.
Delce smo sintetizirali na dva načina, s čimer smo dobili sva seta delcev različnih velikosti. Za delce, velike 200 nm, smo uporabili direktno metodo, pri kateri smo v 100 mL bučki zmešali 49 mL etanola in 10 mL raztopine amonijaka. Posebej smo zmešali 1 mL etanola in 1 mL TEOS, ter ju počasi dodali v bučko. Mešanico smo pustili mešati dve uri in jo nato očistili po spodaj navedenem postopku. Delce, velike 80 nm, smo pripravili po Stöberjevi metodi, kjer smo v 100 mL bučki zmešali 47 mL etanola, 3,3 mL amonijevega hidroksida in 4 mL TEOS ter mešanico pustili mešati 24 ur.
Aminofunkcionalizacijo delcev smo izvedli tako, da smo mešanicama dodali 0,3 mL APTES in ju pustili mešati 24 ur.
Po 24 urah funkcionalizacije z APTES smo delce očistili. Vsebino bučke smo v dveh 50 mL centrifugirkah centrifugirali 5 minut pri hitrosti 8000 g na 4 °C. Supernatant smo zavrgli in peletu dodali približno 10 mL etanola, v katerem smo delce nato resuspendirali z ultrazvokom. Sledilo je ponovno centrifugiranje. Ta postopek smo ponovili šestkrat.
22
3.2.15 Funkcionalizacija monodisperznih delcev SiO2 s proteinom N
Za kovalentno vezavo proteina na monodisperzne delce SiO2 morajo imeti ti na svoji površini aktivne skupine. Najprimernejše so aminske in karboksilne funkcionalne skupine. Sami delci SiO2 imajo na površini proste hidroksilne skupine, na katere lahko s kondenzacijo vežemo aminofunkcionaliziran alkoksisilan19. Primer reakcije z APTES prikazuje slika 2.
Slika 2: Aminofunkcionalizacija delcev SiO2 s (3-aminopropil)trietoksisilanom19.
Na nastale aminofunkcionalizirane delce nato uvedemo homobifunkcionalni prečni povezovalec, ki reagira z aminskimi skupinami, preko katerih lahko na delce vežemo protein20. Primer tovrstne funkcionalizacije z glutaraldehidom in nadaljnji proces vezave liganda s prosto aminsko skupino na delec prikazuje slika 3.
Slika 3: Funkcionalizacija aminofunkcionaliziranih delcev SiO2 z glutaraldehidom in kovalentna vezava liganda20.
Aminofunkcionalizirane delce smo pred funkcionalizacijo posušili, s čimer smo odstranili etanol. V mikrocentrifugirke smo odpipetirali 1 mL suspenzije in
23
mikrocentrifugirke pustili odprte čez noč. Funkcionalizirali smo 10 mg delcev, velikih 80 nm ali 200 nm. V 1 mL pufra za spiranje (PBS) smo z ultrazvokom resuspendirali posušene delce, nato pa jih centrifugirali 5 minut pri hitrosti 7500 g in temperaturi 4 °C.
Supernatant smo zavrgli. To smo ponovili dvakrat. Po spiranju smo delce resuspendirali v 1 mL 10 % raztopine glutaraldehida in jih na sobni temperaturi pustili mešati 2 uri. S tem smo nanje uvedli karbonilne funkcionalne skupine. Delce smo nato s pufrom za spiranje dvakrat sprali po prej navedenem postopku in jih na koncu resuspendirali v 50 µL PBS.
Količino proteina N, potrebno za funkcionalizacijo delcev, smo izračunali po enačbi:
𝑆 = 𝐶 × 6
𝜌𝑆 × 𝑑, pri kateri so:
S – količina proteina, potrebna za površinsko nasičenost delcev (mg proteina/g delcev), C – vezavna kapaciteta površine monodisperznih delcev za dani protein,
ρS – gostota monodisperznega delca (za SiO2 ta znaša 2,0 g/cm3), d – premer delcev.
Za funkcionalizacijo smo uporabili desetkratnik izračunane potrebne mase proteina. Za funkcionalizacijo 80 nm delcev bi za monosloj potrebovali 0,1125 mg proteina N/g delcev. Končna koncentracija proteina N je bila 0,075 mg/mL, zato smo za funkcionalizacijo z 10-kratnim prebitkom uporabili 150 µL raztopine proteina. Za funkcionalizacijo 200 nm delcev bi za monosloj potrebovali 0,045 mg proteina/g delcev, desetkratniku te vrednosti za 10 mg delcev ustreza 60 µL raztopine proteina.
Delcem, resuspendiranim v PBS, smo dodali protein in jih v hladni sobi pustili mešati 3 ure. Po inkubaciji delcev s proteinom smo jih centrifugirali 5 minut pri hitrosti 7500 g in temperaturi 4 °C, odstranili supernatant, jih še enkrat sprali s PBS in nato z mešanjem resuspendirali v 1 mL dušilne raztopine s 35 mM glicinom, ki je s svojimi primarnimi aminskimi skupinami reagiral s prostimi aldehidnimi skupinami na delcih, in govejim serumskim albuminom, ki je deloval kot molekula za blokiranje in preprečil nespecifične interakcije delcev in netarčnih molekul. Mešanico smo nato inkubirali v hladni sobi 30 minut pri stalnem mešanju. Po inkubaciji smo delce centrifugirali 5 minut pri hitrosti 7500 g in temperaturi 4 °C, odstranili supernatant in delce z mešanjem resuspendirali v 1 mL pufra za shranjevanje.
24
3.2.16 Dokazna reakcija z uporabo hitrih antigenskih testov
Za dokaz prisotnosti proteina N v vzorcu smo uporabili hitre antigenske teste Immupass VivaDiag™ SARS-CoV-2 Ag Rapid Test. Po navodilih proizvajalca smo na vzorčno območje testnega pripomočka (označeno s S) nanesli 60 µL vzorca in počakali 15 minut, da je vzorec s kapilarnim vlekom potoval skozi membrano in reagiral z antigeni na testni in kontrolni liniji. Vijolično obarvanje na kontrolni liniji je potrdilo veljavnost testa, vijolično obarvanje na testni liniji pa prisotnost proteina N v vzorcu.
25
4 Rezultati in razprava
4.1 Transformacija bakterijskih celic
4.1.1 Izolacija plazmida
Iz celic E. coli DH5α smo z uporabo kompleta reagentov izolirali plazmid pMCSG7 z zapisom za protein N ali ORF8. Po izolaciji smo z merjenjem A280 določili koncentracijo plazmida in z izračunom razmerja 𝐴260
𝐴280 določili čistost vzorca. Vrednost razmerja 𝐴260
𝐴280 za raztopino čiste dvoverižne DNA je 1,8. Kontaminacija vzorca z RNA to vrednost poviša, saj je razmerje 𝐴260
𝐴280 za čisto RNA 2,0. Kontaminacija s proteini ali fenoli pa vrednost zniža. Izmerjene vrednosti so znašale:
A280 (N) = 73,2 ng/µL
𝐴260
𝐴280 (N) = 2,14
A280 (ORF8) = 60,5 ng/µL
𝐴260
𝐴280 (ORF8) = 1,96 Razmerje 𝐴260
𝐴280 je bilo v obeh primerih večje od 1,8, torej je bila v obeh vzorcih prisotna še RNA, kar pa bistveno ne vpliva na transformacijo.
4.1.2 Transformacija E. coli BL21[DE3]
Celice smo transformirali z vektorjem pMCSG7 z zapisom za protein N ali ORF8.
Uporabili smo ekspresijski sev bakterije Escherichia coli BL21[DE3], ki v svojem genomu že vsebuje zapis za RNA-polimerazo T7 iz bakteriofaga λ. Bakterijski sev prav tako ne vsebuje endogenih proteaz Lon in OmpT, kar zmanjša razgradnjo rekombinantnih proteinov21. Po transformaciji smo bakterijske celice razmazali na trdno LBA gojišče. Na plošči smo nanesli 100 µL kulture bakterijskih celic z zapisom za ORF8 ali N. Na obeh ploščah so zrastle kolonije, izmed katerih smo nato eno precepili v tekoče gojišče MDG.
26
4.2 Poskusno izražanje
Proteina ORF8 in N smo poskusno izražali pri treh različnih temperaturah. V 100 mL stresalne erlenmajerice smo pripravili 50 mL tekočega gojišča TB/Glu/Asp in iz tekočega gojišča MDG vanj prenesli 100 µL kulture bakterijskih celic E. coli BL21[DE3], transformiranih s plazmidom pMCSG7-ORF8 ali pMCSG7-N. Celice smo preko noči inkubirali pri temperaturah 18 °C, 25 °C in 37 °C. Nato smo celicam izmerili A600. Uporabili smo 10-krat redčen vzorec, kot slepo vrednost pa smo uporabili gojišče TB. Vrednosti absorbance prikazuje tabela 8.
Tabela 8: Vrednosti absorbance 10-krat redčenega vzorca celic E. coli BL21[DE3] v gojišču TB/Glu/Asp, ki izražajo protein ORF8 ali N, pri različnih temperaturah.
Temperatura A600 (ORF8) A600 (N)
18 °C 0,058 0,262
25 °C 0,288 0,280
37 °C 0,388 0,449
Bakterijske celice smo lizirali s sonifikacijo, nato pa ločili topno in netopno frakcijo ter ju analizirali z NaDS-PAGE. Obe frakciji smo analizirali bodisi z dodanimi nikljevimi kroglicami IMAC Sepharose™ 6FastFlow bodisi brez njih. S tem smo preverili sposobnost vezave proteinov na dvovalentne nikljeve ione. Rezultati elektroforeze so vidni na slikah 4-6. V vseh vzorcih vidimo na gelu veliko število lis, kar pomeni, da je prisotnih še mnogo drugih proteinov, torej bo izolacija želenega proteina nekoliko otežena. Protein N je skupaj s heksahistidinsko oznako velik 46,4 kDa. Na elektroforeznih gelih pri vseh netopnih frakcijah proteina N opazimo intenzivno črto nekoliko nad oznako standarda, ki ustreza 45 kDa. Na enaki višini pri topnih frakcijah opazimo šibkejšo liso. Protein se očitno nahaja predvsem v netopni frakciji, možno pa je, da se ga nekaj nahaja tudi v topni obliki. Iz intenzitete lis ne moremo sklepati, pri kateri temperaturi se je izrazilo največ proteina. Protein ORF8 je skupaj s heksahistidinsko oznako velik 14,6 kDa, Črto, ki bi ustrezala tej velikosti vidimo v vseh netopnih frakcijah, vendar ni intenzivna. V primeru topnih frakcij črte ne vidimo, torej se protein nahaja predvsem v netopni obliki. Zaradi tega smo se odločili, da proteina ORF8 ne bomo skušali izolirati iz topne frakcije in smo delo nadaljevali le še s proteinom N.
27
Slika 4: Analiza poskusnega izražanja proteinov v E. coli BL21[DE3] z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: st. – proteinski standard, 1 – topna frakcija proteina N, izražena pri 18 °C, na Ni-kroglicah, 2 – topna frakcija proteina N, izražena pri 18 °C, 3 – topna frakcija proteina N, izražena pri 25 °C, na Ni- kroglicah, 4 – topna frakcija proteina N, izražena pri 25 °C, 5 – topna frakcija proteina N, izražena pri 37
°C, na Ni-kroglicah, 6 – topna frakcija proteina N, izražena pri 37 °C, 7 – netopna frakcija proteina N, izražena pri 18 °C, na Ni-kroglicah, 8 – netopna frakcija proteina N, izražena pri 18 °C.
Slika 5: Analiza poskusnega izražanja proteinov v E. coli BL21[DE3] z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: 1 – netopna frakcija proteina N, izražena pri 25 °C, na Ni-kroglicah, 2 – netopna frakcija proteina N, izražena pri 25 °C, st. – proteinski standard, 3 – netopna frakcija proteina N, izražena pri 37
°C, na Ni-kroglicah, 4 – netopna frakcija proteina N, izražena pri 37 °C, 5 – topna frakcija proteina ORF8, izražena pri 18 °C, na Ni-kroglicah, 6 – topna frakcija proteina ORF8, izražena pri 18 °C, 7 – topna frakcija proteina ORF8, izražena pri 25 °C, na Ni-kroglicah, 8 – topna frakcija proteina ORF8, izražena pri 25 °C.
28
Slika 6: Analiza poskusnega izražanja proteinov v E. coli BL21[DE3] z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: 1 – topna frakcija proteina ORF8, izražena pri 37 °C, na Ni-kroglicah, 2 – topna frakcija proteina ORF8, izražena pri 37 °C, 3 – netopna frakcija proteina ORF8, izražena pri 18 °C, na Ni- kroglicah, 4 – netopna frakcija proteina ORF8, izražena pri 18 °C, st. – proteinski standard, 5 – netopna frakcija proteina ORF8, izražena pri 25 °C, na Ni-kroglicah, 6 – netopna frakcija proteina ORF8, izražena pri 25 °C, 7 – netopna frakcija proteina ORF8, izražena pri 37 °C, na Ni-kroglicah, 8 – netopna frakcija proteina ORF8, izražena pri 25 °C.
4.3 Izolacija proteina N iz topne frakcije
Protein N smo izrazili v večjem merilu. Lizat bakterijskih celic smo centrifugirali in topno frakcijo pripravili za čiščenje z nikljevo afinitetno kromatografijo. Po nanosu na kolono smo očiščeni protein zbrali v desetih alikvotih po 1 mL in jim izmerili A280.
Absorbanca je bila največja pri tretji frakciji in je nato postopno upadala. Glede na vrednosti absorbance smo se odločili, v katerih frakcijah je dovolj proteina in jih je smiselno nadalje očistiti z dializo. To so bile 3., 4. in 5. eluirana frakcija. Po dializi smo s centrifugiranjem odstranili nastalo oborino in vzorcu izmerili A280, ki je znašala 0,524.
Z NaDS-PAGE smo analizirali tiste frakcije, s katerimi smo nadaljevali delo. Rezultati so vidni na sliki 7. Vidimo, da je poleg našega proteina, katerega lisa se nahaja nekoliko nad standardno liso 45 kDa, prisotnih še veliko nečistoč. Največ proteinov se v skladu z meritvami absorbance nahaja v tretji in četrti eluirani frakciji. V peti eluirani frakciji je protein prav tako prisoten, a v nižji koncentraciji, manj pa je tudi nečistoč. Zaradi velike kontaminiranosti vzorca z drugimi proteini smo se odločili še za drugo stopnjo čiščenja, pri kateri smo uporabili proteazo TEV.
29
Slika 7: Analiza vzorcev proteina N po IMAC z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: 1 – netopna frakcija, 2 – topna frakcija, 3 – nevezana frakcija, 4 – sprana frakcija, , 5 – prva eluirana frakcija, 6 – druga eluirana frakcija, 7 – tretja eluirana frakcja, 8 – četrta eluirana frakcija, 9 – peta eluirana frakcija, st. – proteinski standard.
4.4 Cepitev proteina N s proteazo TEV
Protein N smo čez noč dializirali v pufru, ki je vseboval proteazo TEV. Proteaza TEV je endopeptidaza, ki prepozna zaporedje ENLYFQG in cepi pred zadnjim aminokislinskim ostankom zaporedja. Na genskem konstruktu z zapisom za naš protein se prepoznavno mesto nahaja za histidinsko oznako, ki jo tako lahko odcepimo. Po odcepitvi oznake lahko protein dodatno očistimo z IMAC, le da se tokrat izbrani protein ne veže na kolono in se nahaja že v nevezani frakciji, na koloni pa ostanejo vezani preostali proteini.
Po cepitvi s proteazo TEV smo vzorec nanesli na kolono, ko smo nanesli ves vzorec, smo na kolono začeli nanašati še vezavni pufer, dokler nismo zbrali 15 frakcij po 1 mL.
Vezavni pufer smo začeli nanašati pri peti sprani frakciji Po nanosu vzorca smo na kolono nanesli elucijski pufer in zbrali 8 frakcij po 1 mL. Spranim in eluiranim frakcijam smo izmerili vrednosti A280, ki jih prikazuje graf 1.
30 0,01
0,248
0,299
0,176
0,368
0,147
0,042 0,031 0,027
0,347
0,073
0,046 0
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A280
Frakcija
Sprane frakcije Eluirane frakcije
Graf 1: Rezultati določanja koncentracije proteinov z merjenjem A280.
Vrednosti A280 ostalih vzorcev so bile blizu 0.
Koncentracija proteinov narašča do tretje sprane frakcije, nato pade in ponovno naraste v peti sprani frakciji, ko smo na kolono začeli nanašati vezavni pufer. Le-ta vsebuje 20 mM koncentracijo imidazola, ki bi lahko povzročil, da so se s kolone eluirali nespecifično vezani proteini. Vzorce S2 do S4 smo zato analizirali in koncentrirali ločeno kot vzorca S5 in S6. Analizirali smo tudi eluirano frakcijo E2. Rezultati NaDS- PAGE so prikazani na sliki 8.
Slika 8: Analiza vzorcev proteina N po cepitvi s proteazo TEV z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: 1 – sprane frakcije S2 do S4, 2 – sprani frakciji S5 in S6, 3 – eluirana frakcija E2, st. – proteinski standard.
31
Rezultati NaDS-PAGE so pokazali, da eluirana frakcija vsebuje predvsem nečistoče, protein N pa se glede na liso nekoliko nad 45 kDa verjetno nahaja v spranih frakcijah S5
in S6. Na gelu lahko vidimo, da je koncentracija proteinov zelo nizka, zato smo se odločili vzorca spranih frakcij skoncentrirati. Koncentrirali smo s centrifugirnim filtrom Amicon Ultra-4 in po koncentriranju tudi zamenjali pufer. Dotlej se je protein nahajal v vezavnem pufru z visoko koncentracijo soli (500 mM NaCl, 50 mM Tris) in 20 mM koncentracijo imidazola, kar bi lahko negativno vplivalo na strukturo proteina in povzročilo njegovo izsoljevanje. Namesto tega smo uporabili dializni pufer (150 mM NaCl, 20 mM Tris) z nižjo koncentracijo soli in brez imidazola. Skoncentriranima vzorcema smo izmerili A280:
A280 (S2 do S4) = 0,111 A280 (S5 in S6) = 0,047
Koncentracija proteinov je bila nižja kot pred koncentriranjem, kar je bilo morda posledica tega, da so se proteini zalepili na membrano centrifugirnega filtra. Filter smo zato čez noč v hladilniku dializirali z dializnim pufrom in nato vzorca ponovno koncentrirali. Vrednosti A280 sta po drugem koncentriranju znašali:
A280 (S2 do S4) = 0,102 A280 (S5 in S6) = 0,075
Po koncentriranju smo dobili približno 500 µL vsakega vzorca, ki smo ju odpipetirali v mikrocentrifugirki in jo shranili na –80 °C. Posebej smo na –20 °C shranili 10 µL alikvota, ki smo ju nato analizirali z NaDS-PAGE, rezultate vidimo na sliki 9.
Slika 9: Analiza koncentriranih vzorcev proteina N z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: 1 – sprani frakciji S5 in S6, 2 – sprane frakcije S2 do S4, st. – proteinski standard.
