DIPLOMSKO DELO

U

L

F

DIPLOMSKO DELO

Oskar Nemec

Ljubljana, 2021

U

L

F

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA

Funkcijska anotacija diferenčno izraženih krožnih RNA v raku jeter

DIPLOMSKO DELO

Oskar Nemec

M

: doc. dr. Tadeja Režen

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisani Oskar Nemec sem avtor diplomskega dela z naslovom: Funkcijska anotacija diferenčno izraženih krožnih RNA v raku jeter.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr.

Tadeje Režen;

• sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v

predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, Podpis avtorja:

Zahvaljujem se mentorici doc. dr. Tadeji Režen za vso strokovno pomoč in nasvete, za hitro odzivnost ter dosegljivost tudi na daljavo.

Prav tako bi se rad zahvalil delovnemu mentorju Roku Razpotniku, mag. biokem. za vso pomoč pri opravljanju laboratorijskega dela diplomske naloge.

Zahvaljujem se tudi doc. dr. Veri Župunski za strokovni pregled tega diplomskega dela.

Rad bi se zahvalil tudi prijateljem in vsem bližnjim za vzpodbudo v času študija.

Funkcijska anotacija diferenčno izraženih krožnih RNA v raku jeter

Povzetek: Krožne RNA uravnavajo številne procese v celicah in mnoge med njimi imajo vlogo v patofizioloških procesih, kot je razvoj raka. Imajo zelo raznolike funkcije od vezave miRNA in proteinov ter uravnavanja njihove vloge do prepisa v proteine. Pri raku imajo krožne RNA spremenjeno izražanje in delujejo kot onkogeni ali tumorski supresorji. Diplomsko delo se osredotoča na vlogo krožnih RNA v primarnem raku jeter, čigar najpogostejša vrsta je hepatocelularni karcinom (HCC). Zaradi omejenih simptomov in pomanjkanja učinkovitih bioloških označevalcev za zgodnjo diagnozo gre za enega od vodilnih vzrokov smrti zaradi raka na svetu. Namen diplomske naloge je bil uporaba različnih bioinformatskih orodij in podatkovnih zbirk za napoved funkcije krožnih RNA, ki imajo spremenjeno izražanje v tumorjih raka jeter, in eksperimentalna validacija njihovega izražanja v modelnih celičnih linijah raka jeter. Po funkcijski anotaciji smo kot kandidate izbrali eksosomske krožne RNA in s pomočjo metode RT- qPCR uspešno potrdili njihovo izražanje v modelnih celičnih linijah raka jeter (HepG2, Huh-7, SNU-449) in liniji jetrnih pericitov (LX-2). Izražanje smo izrazili relativno na kontrolno linijo THLE-5b in ugotovili, da se določene krožne RNA v uporabljenih celičnih linijah čezmerno izražajo, druge pa znižano. Ugotovili smo, da se podatki v večini uporabljenih podatkovnih zbirk ne prekrivajo, saj gre večinoma za eksperimentalno nepotrjene de novo napovedih z različnimi algoritmi in ne za eksperimentalno pridobljene podatke, ter da je nivo izražanja krožnih RNA v različnih linijah raka jeter različen.

Ključne besede: krožne RNA, hepatocelularni karcinom, RT-qPCR, funkcijska anotacija

Functional annotation of differentially expressed circular RNAs in liver cancer Abstract: Circular RNAs regulate many processes in cells and many of them play a role in pathophysiological processes such as cancer development. They have very diverse functions from binding miRNA and proteins and regulating their role to transcription into proteins. In cancer, circular RNAs have altered expression and act as oncogenes or tumor suppressors. The thesis focuses on the role of circular RNAs in primary liver cancer, the most common type of which is hepatocellular carcinoma (HCC). Due to its limited symptoms and lack of effective biomarkers for early diagnosis, it is one of the leading causes of cancer death in the world. The purpose of the thesis was to use various bioinformatics tools and databases to predict the functions of circular RNAs that have altered expression in liver cancer tumors and the experimental validation of their expression in model cell lines for liver cancer. Following functional annotation, exosomal circular RNAs were selected as candidates and their expression in model liver cancer cell lines (HepG2, Huh-7, SNU-449) and a liver pericyte line (LX-2) was successfully confirmed using the RT-qPCR method. Expression was expressed relative to the THLE- 5b control line, and it was found that certain circular RNAs in the cell lines used were upregulated and others downregulated. We found that the data in most of the databases used did not overlap, as they are mostly experimentally unconfirmed de novo predictions with different algorithms rather than experimentally obtained data, and that the levels of circular RNA expression in different liver cancer lines is variable.

Keywords: circular RNA, hepatocellular carcinoma, RT-qPCR, functional annotation

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Rak ... 1

1.2 Primarni rak jeter in hepatocelularni karcinom ... 1

1.2.1 Molekularna patogeneza ... 2

1.2.2 Biološki označevalci ... 2

1.2.3 Molekularna klasifikacija ... 2

1.3 Krožne RNA (circRNA) ... 3

1.3.1 Značilnosti circRNA ... 4

1.3.2 Biogeneza circRNA ... 5

1.3.3 Kategorije circRNA ... 6

1.3.4 Funkcije circRNA ... 7

1.4 Vloga krožnih RNA pri raku jeter ... 10

1.4.1 Identifikacija dereguliranih circRNA pri HCC ... 10

1.4.2 CircRNA kot diagnostični in prognostični markerji... 10

1.4.3 Funkcije in mehanizmi circRNA pri napredovanju HCC ... 11

2 Namen dela ... 13

3 Materiali in metode ... 15

3.1 Materiali ... 15

3.1.1 Laboratorijska oprema ... 15

3.1.2 Kemikalije in encimi ... 16

3.1.3 Začetni oligonukleotidi ... 17

3.1.4 Celične linije ... 17

3.2 Bioinformatski del ... 18

3.2.1 Funkcijska anotacija krožnih RNA... 18

3.2.2 Izbor krožnih RNA za potrditev izražanja v celičnih linijah ... 23

3.3 Laboratorijski del – Eksperimentalna validacija izražanja izbranih circRNA v

modelnih celičnih linijah ... 24

3.3.1 Izolacija celokupne RNA ter precipitacija in čiščenje ... 24

3.3.2 Reverzna transkripcija ... 25

3.3.3 Načrtovanje začetnih oligonukleotidov za kvantifikacijo izražanja s qPCR ... 27

3.3.4 qPCR ... 28

3.3.5 Analiza in statistična obdelava rezultatov qPCR ... 29

3.3.6 AGE ... 30

4 Rezultati in razprava ... 32

4.1 Funkcijska anotacija krožnih RNA... 32

4.1.1 ID-ji krožnih RNA ... 32

4.1.2 Simboli in imena krožnih RNA ... 35

4.1.3 Genomske pozicije, veriga in dolžina krožnih RNA ... 36

4.1.4 Tip krožnih RNA ... 37

4.1.5 Napovedi vezavnih mest za miRNA ... 39

4.1.6 Napovedi vezavnih mest za RBP ... 42

4.1.7 Napovedi sposobnosti kodiranja proteinov ... 45

4.1.8 Izražanje krožnih RNA v krvnih eksosomih in HepG2 ... 47

4.2 Validacija diferenčnega izražanja ... 49

4.2.1 RT-qPCR ... 49

4.2.2 AGE ... 58

5 Zaključek ... 61

6 Literatura ... 63

7 Priloge ... 72

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

5'/3'-UTR 5'/3'-neprevedena regija ACTB aktin beta (angl. beta-actin)

ADAR1 adenozin deaminaza specifična za dvoverižno RNA 1 (angl. double- stranded RNA-specific adenosine deaminase 1)

AFP alfa-fetoprotein (angl. alpha-fetoprotein) AGE agarozna gelska elektroforeza

AGO2 argonavt 2 (angl. argonaute 2) ALU kratke ponovitve DNA

Amotl1 angiomotinu podoben protein 1 (angl. angiomotin-like protein 1)

ARD1A interaktivno domeno vsebujoč protein bogat z AT 1A (angl. AT-rich interactive domain-containing protein 1A)

ARID2 interaktivno domeno vsebujoč protein bogat z AT 2 (angl. AT-rich interactive domain-containing protein 2)

BLAST osnovno orodje za iskanje lokalne poravnave (angl. basic local alignment search tool)

blat orodje za poravnave podobno BLAST (angl. BLAST-like alignment tool)

bp bazni pari

cDNA komplementarna DNA (angl. complementary DNA)

CDR1 z degeneracijo malih možgan povezan antigen 1 (angl. cerebellar degeneration-related antigen 1)

CDS kodirajoče zaporedje DNA (angl. coding DNA sequence) circRNA krožna RNA (angl. circular RNA)

ciRNA intronska circRNA (angl. intronic circRNA)

CLIP imunoprecipitacija s prečnim povezovanjem (angl. crosslinking immunoprecipitation)

CSCD podatkovna zbirka circRNA, ki so specifične za rak (angl. Cancer Specific CircRNA Database)

Ct pražni cikel (angl. threshold cycle) CTNNB1 beta katenin 1 (angl. beta-catenin 1)

DCC protein DCC (angl. deleted in colorectal cancer)

DCP des-gama-karboksi protrombin (angl. des-gamma-carboxy prothrombin) DNA deoksiribonukleinska kislina

DNaza deoksiribonukleaza dNTP deoksinukleotid trifosfat

ecircRNA eksonska circRNA (angl. exonic circRNA)

EDTA etilendiamintetraocetna kislina (angl. ethylenediaminetetraacetic acid) EIciRNA ekson-intronska circRNA (angl. exon-intron circRNA)

EIF4A3 evkariontski iniciacijski faktor prevajanja 4A-III (angl. eukaryotic translation initiation factor 4A-III)

EMT epitelijsko-mezenhimski prehod (angl. epithelial–mesenchymal transition)

EtBr etidijev bromid

FAK kinaza fokalne adhezije (angl. focal adhesion kinase)

FBXW7 F-škatlo in WD-ponovitve vsebujoč protein 7 (angl. F-box/WD repeat- containing protein 7)

FISH fluorescenčna hibridizacija in situ (angl. fluorescence in situ hybridization)

FOXO3 protein FOXO3 (angl. forkhead box O-3)

FUS RNA-vezavni protein FUS (angl. RNA-binding protein FUS)

GEO podatkovna zbirka genske ekspresije (angl. Gene Expression Omnibus) GSK3β glikogen sintaza kinaza 3 beta (angl. glycogen synthase kinase 3-beta) HCC hepatocelularni karcinom (angl. hepatocellular carcinoma)

HIF-1α s hipoksijo inducirani faktor 1 alfa (angl. hypoxia-inducible factor 1- alpha)

HIPK3 s homeodomeno interagirjoča proteinska kinaza 3 (angl. homeodomain interacting protein kinase 3)

IRES notranje vstopno mesto za ribosom (angl. internal ribosome entry site)

kb kilobaze

lncRNA dolga nekodirajoča RNA (angl. long non-coding RNA) m⁶A N6-metiladenozin

m⁷G 7-metilgvanozin

MBL manan vezavni lektin (angl. mannan-binding lectin) miRNA mikro RNA (angl. micro RNA)

MRE odzivni elementi na miRNA (angl. miRNA response elements) mRNA informacijska RNA (angl. messenger RNA)

ncRNA nekodirajoča RNA (angl. non-coding RNA)

NF90/NF110 jedrni faktor 90 in 110 (angl. nuclear factor 90 in 110)

nt nukleotid

NTC kontrolni vzorec brez matrične DNA (angl. no template control) ORF odprti bralni okvir (angl. open reading frame)

piRNA piwi-interagirajoča RNA (angl. piwi-interacting RNA) pre-mRNA predhodna mRNA (angl. precursor mRNA)

QKI protein QKI (angl. quaking)

RBP RNA-vezavni protein (angl. RNA-binding protein) Ribo-Seq sekvenciranje ribosomov (angl. ribosome sequencing) RNA ribonukleinska kislina

RNA-seq sekvenciranje RNA (angl. RNA sequencing) RNaza ribonukleaza

RPLP0 stranska stebelna podenota P0 ribosomskega proteina (angl. ribosomal protein lateral stalk subunit P0)

rRNA ribosomska RNA (angl. ribosomal RNA)

RT-qPCR kvantitativni PCR z reverzno transkripcijo (angl. quantitative reverse transcription PCR)

siRNA mala interferenčna RNA (angl. small interfering RNA)

Sry protein spol določujoče regije Y (angl. sex-determining region Y protein) STAT3 protein STAT3 (angl. signal transducer and activator of transcription 3) TERT telomerazna reverzna transkriptiza (angl. telomerase reverse

transcriptase)

TP53 tumorski protein 53 (angl. tumor protein 53) tRNA prenašalna RNA (angl. transfer RNA)

snRNP majhni jedrni ribonukleoprotein (angl. small nuclear ribonucleoprotein) v/min vrtljaji na minuto

1

1 Uvod

1.1 Rak

Rak je bolezen, pri kateri se urejeni procesi rasti in množenja celic ter staranja in smrti okvarijo, kar vodi do nenadzorovane rasti in množenja celic. Te celice lahko tvorijo maligne (rakave) ali benigne (nerakave) tumorje. Kancerogene tumorske celice se lahko odcepijo od prvotnega tumorja (primarni tumor) in potujejo skozi krvni ali limfni sistem na oddaljene lokacije v telesu in tvorijo dodatne metastatske tumorje [1].

Večina rakavih celic se razvije iz ene same abnormalne celice, v katerih pride do somatskih mutacij genetske in/ali epigenetske narave. Genetske spremembe nastanejo zaradi raznih kancerogenih dejavnikov, ki so lahko kemikalije, ionizirajoča sevanja, biološki dejavniki [2]. Potrebno je sosledje neodvisnih, večinoma redkih genetskih dogodkov, ki se kopičijo. Običajno pride do spremenjenega delovanja treh vrst genov:

proto-onkogeni, tumor supresorski geni in geni za popravljanje DNA [1]. Epigenetske spremembe vključujejo pojav heterokromatina, modifikacije histonov in metilacije določenih zaporedij DNA, kar vodi do spremenjenega izražanja genov. Vse te spremembe morajo predstavljati selekcijsko prednost [2].

Rak je mozaično tkivo, saj imajo v istem tumorju različne celice po navadi različne genetske spremembe. Celični cikel v celicah ima vse faze, a poteka precej hitreje, kot je značilno za normalne celice [2]. Prihaja do preklopa na anaerobni metabolizem (glikoliza), kar vodi do posebnega gradienta pH (Warburgov efekt) [3]. Rakave celice lahko vplivajo na obdajajoče imunske celice, fibroblaste in krvne žile. V tumorskem mikrookolju tako pride do zmanjšanega parcialnega tlaka kisika in spremembe dotoka hranil. Prihaja tudi do angiogeneze, rasti krvnih žil proti tumorjem [1, 2].

1.2 Primarni rak jeter in hepatocelularni karcinom

Primarni rak jeter je maligni tumor, ki se začne v hepatocitih. Glavna vrsta primarnega raka jeter je hepatocelularni karcinom (HCC), znan tudi kot jetrocelični rak [4].

Predstavlja 75–85 % vseh primarnih rakov jeter in je tretji vodilni vzrok smrti zaradi raka na svetu, kajti ima visoko sposobnost metastaziranja in stopnjo ponovne pojavitve [5, 6].

Druge manj pogoste vrste primarnega raka jeter so intrahepatični holangiokarcinom, angiosarkom, hemangiosarkom in hepatoblastom [4]. Večina hepatocelularnih karcinomov se pojavi pri bolnikih z osnovno boleznijo jeter zaradi okužbe z virusom hepatitisa B ali C, zlorabe alkohola ali zaužitja aflatoksina B1 [7, 8]. Pri diagnosticiranju in zdravljenju tega raka je bil narejen velik napredek. Terapevtske strategije vključujejo

2

kemoterapijo, presaditev jeter, kirurško resekcijo, terapijo z zdravili proti tumorjem in sevanje [9, 6]. Na žalost pa je zaradi omejenih simptomov bolnikov in pomanjkanja učinkovitih bioloških označevalcev za zgodnjo diagnozo večina bolnikov diagnosticirana šele v naprednih fazah HCC (prisotnost metastaz), kadar kurativna terapija ni primerna.

Zato je nujno potrebno raziskati molekularne mehanizme tumorogeneze ter identificirati diagnostične biološke označevalce in terapevtske tarče [5].

1.2.1 Molekularna patogeneza

Razvoj hepatoceličnega karcinoma je kompleksen večstopenjski proces, ki vključuje trajne vnetne poškodbe, nekrozo hepatocitov in fibrozo. Tveganje za nastanek tega raka se pojavi ob nastanku ciroze in se povečuje z večanjem okvare jeter. Hepatocelularni karcinom je posledica kopičenja veliko somatskih mutacij, kar pojasnjuje njegovo veliko molekularno heterogenost [9]. Genetski in epigenetski dogodki se končajo z nastankom preneoplazemskih tvorb, v katerih celice dobijo proliferativne in invazivne lastnosti, povečano preživetje ter se dokončno razvijejo v poln karcinom [7].

Mutacije v promotorju TERT so najpogostejše genetske spremembe, ki predstavljajo približno 60 % primerov. Pogoste so tudi mutacije v genih, ki vplivajo na celični cikel (TP53), signalizacijo Wnt (CTNNB1) ali preoblikovanje kromatina (ARID1A in ARID2) [7].

1.2.2 Biološki označevalci

Najprimernejši test za kontrolo razvoja raka je ultrazvok, a ima žal nezadovoljivo diagnostično natančnost. Serumski tumorski označevalci so privlačna alternativa za nadzor in zgodnjo diagnozo, saj omogočajo neinvazivno, objektivno in ponovljivo oceno [9].

Osnovna bolezen jeter povzroči zvišanje različnih jetrnih encimov, kot sta aspartat aminotransferaza in alkalna fosfataza. Vendar ti laboratorijski parametri niso specifični za HCC. Znatno zvišana raven (>500 ng/ml) alfa-fetoproteina (AFP) močno nakazuje na HCC, ampak žal tudi ta marker ni popolnoma specifičen. Drug podoben marker je des- gama-karboksiprotrombin (DCP), ki je približno ekvivalenten markerju AFP [8].

1.2.3 Molekularna klasifikacija

Genomske analize tumorjev HCC so pokazale precejšnjo molekularno heterogenost, ki verjetno zmanjša terapevtski učinek molekularno usmerjenih učinkovin [10].

Kompleksno tumorsko mikrookolje vključuje predvsem netumorske celice, povezane z imunostjo. Pri solidnih tumorjih prihaja do imunske inhibicije, kar ima ključno vlogo pri

3

napredovanju raka. Razumevanje interakcije med rakavimi celicami in njihovim mikrookoljem je ključnega pomena za razvoj novih terapij in identifikacijo boljših bioloških označevalcev [7].

Bolniki s hepatocelularnim karcinomom v isti klinični fazi imajo lahko različne molekularne podtipe, ki so povezani s kliničnimi značilnostmi in jih lahko razdelimo v proliferativni in neproliferativni razred. Za proliferativni razred, ki ga pogosteje opazimo pri bolnikih z okužbo s hepatitisom B, so značilne molekularne in histološke značilnosti, ki povzročajo agresivno klinično vedenje, visoke serumskime koncentracije AFP, slabo celično diferenciacijo, kromosomsko nestabilnost, mutacije gena TP53 in aktivacijo onkogenih poti. Tumorji neproliferativnega razreda pa imajo več mutacij v genu za beta- katenin (CTNNB1) in profil izražanja genov, ki je podoben tistemu pri normalnih hepatocitih [7].

1.3 Krožne RNA (circRNA)

Nekodirajoče RNA (ncRNA) so raznolika skupina molekul RNA, ki se večinoma ne prepišejo v proteine [6]. Zaporedja, iz katerih se prepišejo, se pogosto imenujejo RNA- geni. Veliko ncRNA še nima potrjene funkcije oziroma predpostavljajo, da precejšen delež teh sploh nima posebne funkcije (angl. junk RNA). V skupino nekodirajočih RNA spadajo tudi bolj znane molekule tRNA in rRNA [11]. Glede na dolžino prepisov jih delimo na kratke ncRNA (<200 nt) in dolge ncRNA (>200 nt). Med bolj raziskane kratke ncRNA sodijo miRNA, piRNA in siRNA. Gre za molekule, ki imajo regulatorno vlogo v različnih bioloških in celičnih procesih. Najbolje okarakterizirana funkcija teh molekul je regulacija izražanja genov. Na primer se miRNA lahko specifično vežejo na tarčno mRNA, kar vodi do razgradnje mRNA oziroma inhibicije prevajanja proteinov. Medtem pa dolge ncRNA interagirajo z DNA, RNA in proteini ter tako uravnavajo izražanje genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju [12]. Molekule miRNA in dolge ncRNA so pogosto deregulirane pri HCC, zato bi bilo smiselno raziskati pomen tudi drugih nekodirajočih RNA pri tumorogenezi in razvoju tega raka. Ene od teh so krožne RNA (circRNA) [6].

CircRNA so novoodkrit razred nekodirajočih RNA, z zaprto, kovalentno povezano krožno strukturo, ki nastane s povratnim spajanjem (angl. back-splicing) predhodne mRNA (pre-mRNA), med katerim se donorsko 3′-zaporedje spoji z akceptorskim 5′- zaporedjem. Prvič so jih odkrili leta 1976 Sanger in sod., in sicer so v rastlinskem virusu z elektronsko mikroskopijo opazili enoverižno virusno RNA, ki je bila krožne oblike in je imela visoko temperaturno stabilnost. Nato pa so leta 1979 njihov obstoj potrdili še v več evkariontskih celicah. Našli so jih pri virusu hepatitisa delta, kvasovkah, arhejah,

4

sadnih muhah in sesalcih. V naslednjih desetletjih je bilo veliko odkritij o circRNA. Leta 1991 so Nigro in sod. prvič dokazali prisotnost circRNA pri ljudeh in identificirali štiri circRNA, izražene iz gena DCC (angl. Deleted in Colon Cancer). Kasneje so bili identificirani še drugi geni, ki so sposobni generirati krožne prepise, vključno z genom za človeški citokrom P450 in človeški distrofin [13, 14].

Pred letom 2013 so molekule circRNA veljale le za produkt nepravilnega spajanja pre- mRNA z omejeno biološko funkcijo. Po pojavu visoko zmogljivostnega sekvenciranja RNA (RNA-seq) in razvoju bioinformatike pa so ugotovili, da so circRNA v številnih evkariontskih celicah izražene v velikih količinah in dinamično [13, 14], da so visoko ohranjene v različnih organizmih ter izkazujejo tkivno specifično in od razvojne stopnje odvisno izražanje [6]. Obstoj krožnega spajanja RNA je sedaj splošno sprejeta značilnost izražanja genov, vendar funkcija večine teh molekul še vedno ni znana [14].

Dosedanje raziskave so pokazale, da so circRNA deregulirane v patofizioloških procesih raznih bolezni, kot je npr. Alzheimerjeva bolezen. Molekule circRNA, ki so izražene v abnormalni nivojih lahko regulirajo prepisovanje genov prek posrednih interakcij z drugimi transkripcijskimi faktorji kot so npr. miRNA in RNA vezavni proteini (RBP).

Študije so tudi pokazale, da so se določene circRNA, ki vsebujejo elemente za iniciacijo translacije, sposobne prepisati v funkcionalne proteine in peptide. Poleg tega pa nastanek circRNA na nek način tekmuje s prepisovanjem v linearne mRNA in tako vpliva na ekspresijo starševskih genov. Poleg reguliranja ekspresije genov so circRNA zaradi svoje stabilne zaprte strukture ter tkivno specifičnega izražanja tudi obetavni biološki označevalci za diagnozo bolezni in prognozo, vendar pa je razumevanje circRNA še vedno v povojih in potrebuje znanje o biološkem pomenu teh molekul veliko dopolnitev [6, 13].

Določene circRNA so diferencialno izražene v rakavih tkivih. V okoli 1000 celičnih linijah raka, med katerimi so tudi vzorci HCC, je bilo identificiranih 92.589 circRNA [14]. S svojimi funkcijami naj bi uravnavale tumorogenezo in napredovanje raka. Krožne RNA tako predstavljajo obetavne diagnostične markerje in terapevtske tarče pri HCC in ostalih rakih [5, 6].

1.3.1 Značilnosti circRNA

Glavna značilnost krožnih RNA je njihova kovalentno povezana krožna struktura in odsotnost poli(A)-repov na 3′-koncu ter kape na 5’-koncu. Ta zaprta struktura jih ščiti pred razgradnjo z RNazo R ali RNA eksonukleazami, zaradi česar so bolj stabilne od

5

linearnih oblik RNA. Pri večini organizmov je njihov povprečni razpolovni čas približno 5-krat daljši od razpolovnega časa mRNA [14].

Velikost circRNA se giblje od manj kot sto do nekaj tisoč nukleotidov, povprečna velikost v človeških celicah pa je nekaj sto nukleotidov, kar obsega nekje 2–3 eksone [13]. Vsak od teh eksonov je lahko do trikrat daljši od povprečnega eksona, kar nakazuje na to, da je dolžina eksonov lahko kriterij pri cirkularizaciji [15].

Izražanje večine krožnih RNA je na splošno nižje od izražanja njihovih linearnih ustreznikov (starševskih genov), vendar pa obstajajo tudi taki primeri, kjer imajo krožni prepisi nekoliko ali veliko višjo raven izražanja, na primer produkti genov CDR1 (angl.

cerebellar degeneration related protein 1) in Sry (angl. sex-determining region Y protein) [13].

CircRNA do neke mere kažejo evolucijsko ohranjenost med organizmi. Pri sesalcih naj bi bila ohranjenost teh molekul večja kot pri drugih vrstah RNA [14]. Poročali so na primer, da ima 4522 od 15.849 circRNA pri miših homologna zaporedja pri ljudeh [16].

V celoti gledano visoka ohranjenost, stabilnost in specifičnost circRNA nakazuje na to, da imajo circRNA potencialno več bioloških funkcij in kliničnih aplikacij, kot je bilo prej mišljeno [13].

Poleg tega je izražanje circRNA na splošno tkivno specifično in odvisno od razvojne stopnje [13]. Številne študije so na primer pokazale, da je veliko circRNA prekomerno izraženih v živčevju, kar je najverjetneje povezano z njihovim posttranskripcijskim kopičenjem v nevronih, in pa tudi drugih tkivih kot so jetra, pljuča in maščevje [13, 17, 18]. Poleg tega nekatere nematodne circRNA niso izražene v 1- ali 2-celičnih zarodkih, ampak le v jajčnih celicah [19]. Znanstveniki domnevajo, da je znotrajcelična raven circRNA negativno povezana z indeksom celične proliferacije. Ta hipoteza lahko pojasni, zakaj je ekspresija circRNA v tumorskih celicah na splošno nižja od tiste v normalnih celicah [13].

1.3.2 Biogeneza circRNA

Pri procesu kanoničnega spajanja pride do aktivacije izrezovalno-povezovalnega kompleksa, ki izreže introne primarnega transkripta (pre-mRNA), kar vodi do spojitve eksonov v linearno mRNA [20]. V nasprotju s kanoničnim spajanjem mRNA pa krožne RNA nastanejo s spajalnim telescem posredovanim povratnim spajanjem pre-mRNA.

Sestavljene so lahko iz eksonov, intronov, medgenskih regij, protismiselnih in neprevedenih regij [13]. V procesu povratnega spajanja se donorsko 5′-mesto reverzibilno

6

spoji z akceptorskim 3'-mestom, da nastane kovalentno zaprta struktura. Kanonični signali in sistem za spajanje so nepogrešljivi za povratno spajanje [14].

Povratno spajanje lahko poteče prek dveh različnih mehanizmov. Prvi mehanizem je neposredno povratno spajanje. Pri tem procesu cirkularizacijo poganja parjenje reverzno komplementarnih intronskih zaporedij (t. i. robni introni), ki obdajajo eksone in delujejo kot cis elementi. Proces vodi do nastanka alternativno spojene RNA in stranskega produkta lariata. Pogoste reverzno komplementarne sekvence, ki so udeležene pri procesu, so zaporedja ALU [13, 14]. Pri tvorbi circHIPK3 na primer sodelujejo dolgi robni introni s komplementarnimi ponovitvami ALU [21]. Drugi mehanizem povratnega spajanja je preskakovanje eksonov. V tem primeru cirkularizacijo poganja lariat. V tem postopku nastane lariatni intermediat, ki vsebuje introne in eksone. V lariatu pride do notranje cepitve in spajanja. Spodnji ekson preskoči enega ali več eksonov, da se poveže z zgornjim eksonom in tako po odstranitvi intronov nastane circRNA [13, 14]

Pomemben dejavnik pri cirkularizaciji so RNA vezavni proteini (RBP). Ti delujejo kot trans faktorji. Vežejo se na ohranjena intronska zaporedja, ki obdajajo eksone iz obeh strani in z protein-proteinskimi interakcijami približajo donorje in akceptorje spajanja in tako pospešijo cirkularizacijo [6, 13]. Takšni proteini so QKI (angl. quaking), MBL (angl.

mannan-binding lectin), NF90 / NF110 (angl. nuclear factor 90 in 110) in FUS (angl.

RNA-binding protein FUS). Nasprotno pa lahko nekateri RBP-ji, kot je ADAR1 (angl.

double-stranded RNA-specific adenosine deaminase), zavirajo nastajanje circRNA [22].

ADAR1 je encim za urejanje RNA molekul in sodeluje pri deaminaciji adenozin nukleozidov v inozin ter tako destabilizira medsebojno povezovanje intronov, s čimer antagonizira biogenezo circRNA. Odvijanje dvoverižne RNA s pomočjo od ATP odvisne RNA helikaze A prav tako zavira biogenezo circRNA [23].

1.3.3 Kategorije circRNA

Strukturno gledano poznamo krožne RNA, ki so iz samih eksonov (ecircRNA), take ki imajo samo introne (ciRNA) ter krožne RNA, ki vsebujejo tako eksone kot introne (EIciRNA) [14].

a) EcircRNA (eksonske circRNA)

EcircRNA predstavljajo večino (približno 85 %) identificiranih circRNA. Interagirajo lahko z miRNA in RBP ali pa se prevedejo v proteine ter tako regulirajo ekspresijo genov.

Ta vrsta krožnih RNA vključuje samo eksone (po navadi manj kot 5) in se večinoma nahaja v citoplazmi. Biogeneza ecircRNA poteka prek dveh mehanizmov: neposrednega

7

povratnega spajanja in preskakovanja eksonov. Neposredno spajanje je glavni mehanizem za tvorbo ecircRNA [6, 14, 24].

b) CiRNA (intronska circRNA)

CiRNA se večinoma nahajajo v jedru in so regulatorji svoje starševske mRNA – povečujejo ekspresijo starševskih genov. So manj stabilne od drugih circRNA. Nastanek ciRNA je posebna situacija v lariatno posredovani cirkularizaciji. Nastajajo namreč iz intronskih lariatov, ki se izognejo procesom odstranjevanja in razgradnje intronov. To omogočajo ohranjeni motivi na obeh koncih intronov, kot je s sedmimi nukleotidi bogat motiv GU na 5'-mestu spajanja in 11 nukleotidov dolg motiv na mestu 3'-razvejitve.

Nastane krožna molekula s 3'-repom. Ta je kovalentno povezana preko 2', 5' ali 3', 5'- fosfodiesterske vezi na mestu stičišča (med donorjem spajanja in razvejitveno točko). 3'- rep, ki se razteza od 3’-konca introna do razvejitvene točke, se odstrani in nastane stabilna ciRNA [14, 24].

c) EIciRNA (ekson-intronska circRNA)

EIciRNA so sestavljene tako iz eksonov kot iz intronov in imajo določene značilnosti skupne tako z ecircRNA kot s ciRNA. Podobno kot ciRNA se tudi EIciRNA pretežno nahajajo v jedru in uravnavajo izražanje svojih starševskih genov, in sicer prek interakcije z RNA polimerazo II in snRNP (mali jedrni ribonukleoprotein). Nastanek EIciRNA je podoben nastanku ecircRNA – medtem ko ecircRNA nastanejo takrat, ko se introni v lariatu popolnoma odstranijo, EIciRNA nastanejo, kadar se določeni introni obdržijo med cirkulariziranimi eksoni [24].

1.3.4 Funkcije circRNA

Čeprav so krožne RNA odkrili že zdavnaj, so njihove funkcije še vedno slabo raziskane.

Tipične funkcije teh molekul so odvisne od njihove porazdelitve oziroma celične lokacije.

CircRNA, ki se nahajajo v citoplazmi, v glavnem delujejo kot miRNA-spužve in se potencialno lahko prevedejo, medtem ko bi lahko v jedru razpršene circRNA uravnavale transkripcijo starševskih genov in vplivajo na alternativno spajanje pre-mRNA. Čeprav imajo circRNA različne funkcije, v glavnem adsorbirajo miRNA in nato vplivajo na tarče, ki sodelujejo pri razvoju raka, ostale funkcije predstavljajo le majhen del (slika 1) [6, 14].

8

Slika 1: Tortni diagram razmerij funkcij circRNA pri raku [14].

a) miRNA-spužve

miRNA so velik razred majhnih (∼22 nt) nekodirajočih enoverižnih RNA. So pomembni regulatorji ekspresije genov, saj se lahko vežejo na mRNA prek komplementarnih sekvenc v 3′-UTR tarčnih mRNA, s čimer zavirajo translacijo ali spodbudijo razgradnjo mRNA [25]. Številne circRNA, zlasti ecircRNA, konkurirajo z miRNA, saj se porazdelijo v citoplazmi in vsebujejo odzivne elemente na miRNA (MRE), s katerimi lahko adsorbirajo miRNA in jim preprečijo, da bi se vezale na svoje tarčne mRNA. circRNA se lahko vežejo na več kot eno miRNA. Po navadi se na posamezno miRNA vežejo z samo enim vezavnim mestom, v določenih primerih tudi z večimi [13, 14]. Molekula CDR1as, na primer vsebuje več kot 70 vezavnih mest za miR-7, preko katerih uravnava izražanje tarčnih mRNA z adsorpcijo miR-7 [26].

Čeprav naj bi bila vezava miRNA med različnimi vrstami ohranjena in najbolj razširjena funkcija circRNA, je treba njen pomen še potrditi. Številčnost večine circRNA je na splošno majhna, kar omejuje tudi univerzalnost hipoteze o miRNA-spužvah [6, 13].

b) Vezava proteinov

Poleg interakcije z miRNA se lahko circRNA vežejo na razne proteine in tako uravnavajo ekspresijo genov ter vplivajo na razvoj nekaterih bolezni [14]. Vezava circRNA na nekatere ključne proteine lahko vpliva na več signalnih poti, ki vodijo do sprememb homeostaze [13]. Circ-FOXO3 (angl. forkhead box O-3) lahko na primer interagira s proteini FAK (angl. focal adhesion kinase) in HIF-1α (angl. hypoxia-inducible factor 1- alpha) v citoplazmi in prepreči vstop teh proteinov v jedro, kar na koncu spodbuja senescenco srca. Nasprotno pa lahko circ-Amotl1 (angl. angiomotin-like protein 1) interagira s STAT3 (angl. signal transducer and activator of transcription 3) in olajša translokacijo STAT3 [14]. Pomembna je tudi interakcija circRNA s prej omenjenimi proteini RBP. Ti naj bi bili pomembni regulatorji circRNA skozi celoten življenjski cikel, ne le pri biogenezi [27].

82,94%

3,41%1,37%1,71%

11,60%

miRNA spužve vezava proteinov prevajanje v proteine regulacija transkripcije ostale funkcije

9

c) Prevajanje v proteine

Čeprav sodijo circRNA v razred nekodirajočih RNA, je vse več dokazov, da se nekatere circRNA potencialno lahko prevedejo v proteine. Za razliko od zrelih mRNA, ki običajno potrebujejo 7-metilgvanozinsko (m⁷G) kapo na 5'-koncu in poli(A)-rep na 3'-koncu, da se lahko prepišejo, imajo circRNA zaradi odsotnosti teh struktur drugačne procese prevajanja. Nekatere circRNA sprožijo prevajanje prek notranjih vstopnih mest za ribosom (IRES). Prevajanje olajšuje tudi prisotnost N6-metiladenozinskih modifikacij (m⁶A), ki so najpogostejše modifikacije RNA [14]. Primer proteina, ki se prevede iz circRNA je 21 kDa protein FBXW7-185aa (angl. F-box/WD repeat-containing protein 7), ki ga kodira krožna RNA circ-FBXW7 [28].

Do danes poročajo, da se prevede le nekaj circRNA. Čeprav so bila razvita nekatera bioinformatska orodja za napovedovanje translacijskega potenciala circRNA, je treba njihovo natančnost izboljšati in eksperimentalno potrditi. Poleg tega je treba raziskati, če imajo ti proteini sploh pomembne funkcije, morda imajo ključno vlogo pri razvoju boleznih [13].

d) Regulacija transkripcije in translacije

EIciRNA in ciRNA se pretežno nahajajo v jedru in vsebujejo relativno majhno število tarčnih mest za miRNA. Vlogo naj bi imele pri cis regulaciji transkripcije oziroma pri regulaciji izražanja svojih starševskih genov. Intronski del molekul EIciRNA naj bi imel vezavno mesto za U1 snRNP, kar bi omogočilo nastanek kompleksov EIciRNA-U1 snRNP, ki bi se dalje povezali z RNA polimerazo II na promotorjih gostiteljskih genov, kar pa bi povečalo ekspresijo genov. Interakcije med circRNA in transkripcijskim sistemom bi lahko torej spodbujale transkripcijo starševskih genov z uravnavanjem elongacijske aktivnosti Pol II [6, 14].

Poleg tega so ugotovili, da circRNA regulirajo tudi translacijo mRNA [6]. Gen za mišji formin tvori normalni in krožni transkript, ki naj bi imel sposobnost prekriti mesto začetka prevajanja na okrnjenem linearnem transkriptu mRNA in preprečiti nastanek proteina. To dokazuje med drugim dejstvo, da odstranitev določenih eksonov iz gena prepreči nastanek krožne RNA ter vodi v visoke ravni izražanja linearnega transkripta [29].

CircRNA bi lahko torej z blokiranjem mesta začetka prevajanja, modulacijo prevajanja mRNA in izražanja proteinov delovale kot pasti za mRNA. CircRNA imajo tako na več nivojih pomembno vlogo pri uravnavanju izražanja genov [6].

e) Regulacija alternativnega spajanja

Cirkularizacija in kanonično spajanje tekmujeta med seboj. Kadar tvorba krožne RNA in linearne mRNA vključuje isti ekson, pride do konkurence. Več kot je cirkulariziranih eksonov, manj enakih eksonov se bo pojavilo v procesirani mRNA. Zato tvorba circRNA vpliva na alternativno spajanje pre-mRNA, kar sčasoma povzroči spremenjeno izražanje genov [14]. To najbolje ponazarja krožna RNA circMbl, ki nastane s cirkularizacijo

10

drugega eksona gena za spajanje mišic (MBL), pri čemer modulacija ravni MBL močno vpliva na biosintezo circMbl [30].

f) Druge funkcije

Zanimiva značilnost circRNA je njihova stabilnost in kopičenje skozi čas. Tako bi lahko populacija circRNA v določenem trenutku v celici (ali samo nam, opazovalcu) dala posnetek zgodovine transkripcije celice ali celo celičnega porekla. S tega vidika bi lahko circRNA služile kot spominske molekule [31].

circRNA so prisotne v raznih veziklih in imajo funkcijo signalnih molekul. Celice lahko circRNA in druge molekule izločijo v zunajcelični prostor prek sproščanja veziklov, kot so eksosomi in mikrovezikli. Ta tovor lahko nato prevzamejo druge celice, kar prispeva k komunikaciji med celicami [32].

1.4 Vloga krožnih RNA pri raku jeter

Krožne RNA imajo lahko pomembno vlogo pri napredovanju raka, saj s prej spoznanimi funkcijami kot je vezava miRNA, vplivajo na številne signalne poti, ki so povezane z rakom. Njihovo delovanje lahko vodi do pojava trajnih signalov za proliferacijo, izogibanja zaviralcem rasti, zaviranja diferenciacijskih signalov, prispevanja k metastazam in invazivnosti tumorja, preoblikovanja zunajceličnega matriksa ter indukcije angiogeneze. Krožne RNA lahko s svojim delovanjem tudi spodbujajo ali zavirajo imunski sistem oziroma vplivajo na tumorsko mikrookolje [14].

1.4.1 Identifikacija dereguliranih circRNA pri HCC

Vse več dokazov kaže, da je veliko število krožnih RNA diferencialno izraženih tudi pri HCC in da te molekule sodelujejo pri tumorogenezi in razvoju tega raka [6]. Vzorci, ki se uporabljajo pri identifikaciji diferenčno izraženih circRNA so tkiva HCC, plazemskih ali serumskih eksosomi, mononuklearne celice periferne krvi pa tudi celične linije HCC.

Deregulirane circRNA se najprej identificirajo z visokozmogljivim RNA sekvenciranjem (RNA-seq) ali mikromrežami nato pa še potrdijo s kvantitativnim PCR z reverzno transkripcijo (RT-qPCR) ob uporabi divergentnih začetnih oligonukleotidov ali pa z hibridizacijo in situ. Zaradi edinstvenih značilnosti krožnih RNA jih je mogoče potrditi s Sangerjevim sekvenciranjem regije okoli spojitvenega mesta v produktu RT-qPCR, prek odpornosti na razgradnjo z RNazo R pa tudi prek dolge razpolovne dobe v primerjavi z linearnim prepisi z intervencijo zaviralca transkripcije, kot je aktinomicin D [5].

1.4.2 CircRNA kot diagnostični in prognostični markerji

Glavni razlog za nizko preživetje bolnikov s HCC je pomanjkanje učinkovitih bioloških označevalcev za zgodnjo in natančno diagnozo. Klasični bioloških označevalci, kot sta

11

AFP in DCP, žal niso dovolj specifični [5]. Zaradi večje stabilnosti (odpornost na eksonukleaze) in tkivne specifičnosti (številčnost v tkivih HCC in telesnih tekočinah) so circRNA odličen vir za razvoj novih bioloških označevalcev za zgodnjo diagnozo HCC [5, 13]. Iz tega stališča bi bile še posebej koristne krožne RNA iz eksosomov. Gre za endocitotske nanovezikle, ki se izločijo iz celic v telesne tekočine. Vsebujejo obilo tovora različnih vrst RNA, ki lahko modulirajo obnašanje prejemnih celic. Našli so jih v krvi zdravih posameznikov in bolnikov z malignimi obolenji. Zaradi svojega selektivnega prevzema tovora in podobnosti s starševskimi celicami pa so dragocen vir bioloških označevalcev [13, 33].

Natančna prognoza bolezni lahko pomaga pri odločitvah o zdravljenju in v veliki meri izboljša preživetje bolnikov. Čeprav pri HCC še ni potrjenih prognostičnih bioloških označevalcev, obstajajo potencialni kandidati. CircRNA imajo zaradi visoke stabilnosti in robustnih vzorcev izražanja v kliničnih vzorcih velik potencial tudi kot prognostični biološki označevalci v HCC [5].

1.4.3 Funkcije in mehanizmi circRNA pri napredovanju HCC

Študije so pokazale, da lahko deregulacija nekaterih circRNA vpliva na različne biološke procese, ki prispevajo k napredovanju HCC, vključno s proliferacijo celic, invazivnostjo, nastanek metastaz in apoptozo. Funkcijo krožnih RNA pri napredovanju HCC je mogoče oceniti in vitro in in vivo. V študijah in vitro lahko s spremembo izražanja circRNA povzročimo spremembo napredovanja HCC. Izražanje lahko npr. povečamo z ekspresijskimi vektorji ali lentivirusi in znižamo z RNA-interferenco. Za potrditev rezultatov se pogosto izvajajo dodatni poskusi in vivo. V teh poskusih se celice HCC injicirajo subkutano, da se vzpostavi model mišjega ksenografta, ali pa jih injiciramo v vene repa golih miši, da vzpostavimo metastatski model miši. Ko se miši žrtvujejo, se zabeležijo in analizirajo tumorski volumni, velikosti, teže in lokacije teh miši. Patologija in izražanje specifičnih genov se lahko ovrednoti z različnimi tehnologijami, kot je obarvanje s hematoksilin-eozinom, RT-qPCR, prenos Western, imunohistokemija, imunofluorescenca itd. [5, 34, 10].

V HCC imajo določene prekomerno izražene krožne RNA učinek na napredovanje tega raka – delujejo kot onkogeni. Povečajo lahko proliferacijo, migracijo in invazijo, metastaziranje in EMT ter zmanjšajo apoptozo. Določene krožne RNA pa imajo znižano izražanje v tkivih HCC in celičnih linijah. Te imajo običajno zaviralno vlogo pri napredovanju HCC – so tumorski supresorji [5, 6].

Za preučevanje mehanizmov circRNA je bistvena njihova lokalizacija v celici. Študije so pokazale, da je večina circRNA v glavnem porazdeljenih v citoplazmi, kjer naj bi uravnavale izražanje genov na post-transkripcijski ravni. Najverjetneje spodbujajo izražanje genov, in sicer tako, da se kot miRNA-spužve vežejo na miRNA in preprečijo

12

interakcijo med miRNA in njihovimi tarčnimi mRNA. Določene circRNA pa so v veliki količini prisotne v jedru in najverjetneje modulirajo izražanje genov na transkripcijski in post-transkripcijski ravni. Celično lokalizacijo specifične circRNA je mogoče zaznati s fluorescenčno hibridizacijo in situ (FISH) ali RT-qPCR jedrskih in citoplazemskih RNA [5]. Pri HCC je trenutno najbolj raziskan vpliv krožnih RNA na proliferacijo, migracijo, invazivnost in apoptozo. Potencialni mehanizmi delovanja so študirani le za določene circRNA [6].

Raziskave kažejo, da je večina funkcionalnih circRNA v HCC pretežno porazdeljenih v citoplazmi in torej delujejo kot miRNA-spužve. V HCC ima večina povišano izraženih krožnih RNA vlogo onkogenov, z njimi interagirajoče miRNA pa pogosto delujejo kot zaviralci tumorjev z moduliranjem izražanja tarčnih onkogenih genov. Znižano izražene circRNA imajo običajno zaviralne učinke na napredovanje HCC, z njimi interagirajoče miRNA pa delujejo kot onkogeni – zmanjšajo izražanje tumor supresorskih genov.

Izražanje circRNA je torej pogosto obratno sorazmerno z izražanjem tarčnih miRNA in pozitivno korelirano z izražanjem genov, ki so tarče miRNA [5]. Na primer je v tkivih HCC izražanje circHIPK3 in gena AQP3 (akvaporin 3) regulirano navzgor, izražanje miRNA, miR-124, pa je znižano [35]. Na žalost so pri večini circRNA trend in korelacija ekspresije circRNA-miRNA-mRNA potrjene le v študijah in vitro [5].

Za razliko od večine circRNA, ki delujejo kot miRNA-spužve pri HCC, so ugotovili, da krožna RNA circβ-katenin, ki nastane iz eksonov 2 do 7 β-katenina, spodbuja napredovanje HCC s proizvodnjo nove proteinske izooblike β-katenina, β-katenin-370aa.

Izooblika spodbuja rast in migracijo raka jeter in vitro ter atenuira tumorogenezo in metastaze in vivo z aktiviranjem signalne poti Wnt. β-katenin-370aa najverjetneje deluje kot vaba za protein GSK3β (glikogen sintaza kinaza 3 beta), ki lahko vodi do ubikvitinske razgradnje β-katenina. Ker β-katenin tako ubeži razgradnji, se z rakom pogosto povezana Wnt/β-kateninska signalna pot lahko aktivira [36].

13

2 Namen dela

Po odkritju krožnih RNA in številnih raziskavah na tem področju se je za namene shranjevanja rezultatov analiz in olajšanja nadaljnjih raziskav pojavilo kar nekaj podatkovnih zbirk in orodij, ki se osredotočajo na krožne RNA. Namen diplomske naloge je uporabiti nekaj od teh orodij oziroma zbirk za napoved funkcije krožnih RNA, ki imajo spremenjeno izražanje v tumorjih raka jeter. Temu sledi izbor kandidatov, ki bi lahko bili zanimivi za nadaljnje raziskave, ter validacija njihovega diferenčnega izražanja v modelnih celičnih linijah HepG2, Huh-7, SNU-449, LX-2 v primerjavi s celično linijo THLE-5b, in sicer s pomočjo metode RT-qPCR. S tem naredimo prve korake analize, ki bi lahko sprožila nadaljnje raziskave.

Hipoteze:

1. Za podatkovni zbirki, ki uporabljata javno dostopne nabore podatkov (circBase in CircInteractome), pričakujemo visoko stopnjo prekrivanja.

2. Za podatkovne zbirke, ki uporabljajo nabore podatkov iz raznih eksperimentov RNA-seq (circAtlas, CIRCpedia, CSCD, exoRBase, riboCirc) in na podlagi teh naredijo de novo napovedi, pričakujemo malo prekrivanja.

3. Nivo izražanja izbranih krožnih RNA se bo razlikoval med celičnimi linijami.

14

15

3 Materiali in metode

3.1 Materiali

3.1.1 Laboratorijska oprema

V tabeli 1 so navedene naprave in pripomočki s pripadajočimi proizvajalci.

Tabela 1: Uporabljena laboratorijska oprema.

laboratorijska oprema proizvajalec

0,2 ml PCR mikrocentrifugirke v traku po 8 Eppendorf

plošča s 384 vdolbinami Eppendorf

plošča s 96 vdolbinami Eppendorf

avtomatske pipete ErgoOne

banjice, stekelca, glavnički, napajalnik za AGE BioRad

centrifuga Tehtnica

ciklični termostat za PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific

mikrocentrifugirke Eppendorf

mikrovalovka Clatronic

mini centrifuga za mikrocentrifugirke v traku po 8 Carl Roth

multikanalna pipeta Biohit

namizna centrifuga FastGene Mini Centrifuge Nippon Genetics Europe naprava za qPCR LightCycler 480 Roche

naprava za slikanje agaroznega gela Uvitec nastavki za multikanalno pipeto Biohit

nastavki za pipete Eppendorf

nastavki za serološko pipeto LLG-Labware

optična folija Brooks Life Sciences

parafilm Heathrow Scientific

serološka pipeta BrandTech Scientific

spektrofotometer Nanodrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific

tehtnica Kern & Sohn

termo stresalnik Eppendorf

vibracijski mešalnik MS 3 digital IKA

16

3.1.2 Kemikalije in encimi

V tabeli 2 je prikazan seznam uporabljenih kemikalij in encimov.

Tabela 2: Uporabljene kemikalije in encimi.

kemikalije in encimi proizvajalec

1x pufer TBE Invitrogen

5x RT pufer Thermo Fisher

Scientific

agaroza Sigma-Aldrich

DNaza I (10 U/µl) Roche

EDTA Sigma-Aldrich

etanol (100-odstotni) KEFO

etidijev bromid (5 mg/ml) Sigma-Aldrich

glikogen (20 mg/ml) Ambion

izopropanol Sigma-Aldrich

kloroform Carlo Erba Reagents

lestvica SM1103 FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific

mešanica dNTP (10mM vsakega) Thermo Fisher

Scientific naključni začetni oligonukleotidi Random Hexameres (100

µM)

Thermo Fisher Scientific

nanašalni pufer RO261 Thermo Scientific

natrijev acetat (3M) Ambion

pufer DNaze I Roche

reverzna transkriptaza Maxima (200 U/µl) Thermo Fisher Scientific

RNaseZAP Thermo Fisher

Scientific smerni in protismerni začetni oligonukleotidi

SYBR Green I Master Roche

TRI-reagent (raztopina fenola in gvanidinijevega izotiocianata)

Sigma-Aldrich

voda za injekcije B. Braun

17

3.1.3 Začetni oligonukleotidi

V tabeli 3 so navedeni smerni in protismerni oligonukleotidi za pomnoževanje z metodo RT-qPCR ter dolžina amplikonov.

Tabela 3: Uporabljeni smerni in protismerni začetni oligonukleotidi ter dolžina pomnožkov v nukleotidih.

RNA smerni začetni oligonukleotid protismerni začetni oligonukleotid

dolž.

pom.

ACTB CCAACCGCGAGAAGATGA CCAGAGGCGTACAGGGATAG 97

RPLP0 TGCATCAGTACCCCATTCTATCA AAGGTGTAATCCGTCTCCACAGA 75 hsa_circ_0000045 AGTGGAGGAGGCGGCTATAA CATGCAACGCTCATTCCACC 97 hsa_circ_0008856 GGTTCCGGGAGTTCTTCGAG CACTTTGGTGAGGTCGGACA 113 hsa_circ_0028255 TATCCAGTCCCAGTGAGCCC GGGAGACCTGGGTCTATGAGT 132 hsa_circ_0007996 TGCATTGTAATTGGTGTGCTGT CCAAGAGCCAAATAAGACCGC 136 hsa_circ_0002696 CTTGGAGCCAACTAGAGGCA CAGCCTGGAGTGATTCGCA 114 hsa_circ_0045006 CGAAGGGGAGTTTCCACAGT TGTCGTAAGACCCATGTCGAG 88 hsa_circ_0052531 TTGCCTACCAGCTGAGGACT AGGTTGGTGGAAAGCCATGTA 73 hsa_circ_0005029 TCCTGCCATGGGGATATGAC CGCCAGCCAAGTAGGAAATAC 122 hsa_circ_0069559 TGGGCCGCGACAATGG CCGACTGTGTCTCGGATGTC 153 hsa_circ_0070039 GGGAGGAAACCAGACCCTTAC TGTCCCAAATCCTCCAAACCC 83 hsa_circ_0001434 ATGCGAATGATCCTGAAGCCT TCTTCATAGGAATGCCATTTTCCTC 120 hsa_circ_0082333 GTGGACACAACTGAAACCAAACA CGATGTCCACTTCGTGCTGG 85 hsa_circ_0083766 AGGGGGTCCTTCATTTTGCT CCAAAGGGGACATGTTGGGA 167 hsa_circ_0001861 CTCGCAGTCTCCCTGCTACT CTCATCCGAGTCCCACTGCT 96

3.1.4 Celične linije

Pri validaciji izražanja circRNA smo uporabili 3 modelne celične linije raka jeter HepG2, Huh-7 in SNU-449, linijo jetrnih pericitov LX-2 in kontrolno linijo THLE-5b. HepG2 je v farmakotoksikoloških raziskavah široko uporabljena celična linija človeškega hepatoma. Izhaja iz biopsije jeter 15-letnega belca z diferenciranim HCC. Celice HepG2 so dobro diferencirane, netumorogene ter imajo epitelno morfologijo [37]. Celična linija Huh-7 je prav tako bila vzpostavljena iz dobro diferencirane celične linije HCC, vzete iz jetrnega tumorja 57-letnega Japonca. Gre za zelo heterogeno netumorogeno linijo z epitelijsko morfologijo [38]. Celična linija SNU-449 je bila pridobljena iz primarnega HCC, odvzetega 52-letnemu korejskemu bolniku pred citotoksično terapijo [39]. V nasprotju s celičnima linijama Huh-7 in HepG2, ki imata epitelijske lastnosti in predstavljata zgodnjo (dobro diferencirano) stopnjo HCC, so celice SNU-449 slabo diferencirane oziroma so v pozni fazi in imajo lastnosti mezenhimskih celic [40]. THLE- 5b je netumorogena epitelijska celična linija jeter odraslih ljudi. Te celice se obnašajo kot progenitorske jetrne celice. Uporabljajo se kot modelna celična linija normalnih jetrnih progenitorjev ali matičnih celic [41]. LX-2 je celična linija specializiranih jetrnih pericitov (celice Ito). Lahko se aktivirajo v fibrogene celice, podobne miofibroblastom in so primerne za študije jetrne fibroze pri ljudeh [42].

18

3.2 Bioinformatski del

3.2.1 Funkcijska anotacija krožnih RNA

Analiza in funkcijska anotacija je bila opravljena na 36 krožnih RNA, za katere se je v eksperimentih z mikromrežami izkazalo, da se diferencialno izražajo v tkivih HCC. Ti kandidati so bili pridobljeni s pomočjo zbirke Gene Expression Omnibus (GEO), v kateri so med drugim arhivirani podatki iz raziskav z mikromrežami in sekvenciranja naslednje generacije [43]. Izbrane so bile krožne RNA, ki so bile v treh eksperimentih profiliranja izražanja diferencialno izražene v tkivih HCC v primerjavi s tkivi normalnih jeter (kriterij adjPvalue < 0,05). V vseh treh eksperimentih je bila uporabljena mikromreža Agilent- 069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1, ki temelji na in situ hibridizaciji tarčnih zaporedij z oligonukleotidnimi sondami. Kode za dostop do eksperimentov v zbirki GEO: GSE94508, [44]; GSE97332, [45]; GSE164803, [46]. Tabela z zaporedji sond, ki hibridizirajo s temi krožnimi RNA (tabela 4), je bila prejeta od doc. dr. Tadeje Režen, CFGBC.

19

Tabela 4: Diferenčno izražene circRNA v HCC v primerjavi z netumorskim tkivom. Mikromreža: Agilent-069978 Arraystar Human CircRNA microarray V1.

GSE94508 [44] GSE97332 [45] GSE164803 [46]

array ID (hg19) zaporedje oligonukleotidne sonde adj.P.Val logFC adj.P.Val logFC adj.P.Val logFC ASCRP000008 AAATGAGTAGTATGTTGGTGAGAGTGAACGTGCTGTGCGACAAGTT 0.001 0.53 0.000 -1.84 0.036 -1.80 ASCRP000189 ATTCTGGGTAAAAGGACAGGGGGATGGCGTCTCCCACAGACGGTAA 0.000 1.36 0.016 2.42 0.047 0.85 ASCRP000526 TAACATTCATGCAGAACATCAGGTGTTGGTGGAATGAGCGTTGCAT 0.000 0.80 0.001 -1.27 0.035 -1.95 ASCRP000536 TTGAGGCCAGTCTGGAGAGGTGTTGGTGAATGTTAAGGAGCACTCC 0.000 0.96 0.000 -1.60 0.035 -1.65 ASCRP000578 TTCAGCACAGGATTCGAGGCACAAACCCAGCAGCCTCAACCTAGTT 0.001 -1.10 0.034 0.17 0.034 1.03 ASCRP000596 TGCTGGCCTGGATGTAGTAACTGGAGTTAGTCCCCTGCTCTTCAGG 0.010 0.52 0.006 -0.52 0.007 -1.31 ASCRP000892 AGCCATACAGCTCACCATCTGCTACCTGGATATGCTGATGACCAGT 0.018 -0.62 0.011 -0.19 0.018 1.00 ASCRP001009 TTCAGAAAGCTGGTGTGCTGTCCGACCTCACCAAAGTGACCCGGAT 0.047 0.74 0.000 -1.64 0.005 -1.18 ASCRP001250 CTCCTACAATGGTCGAGCACGCACGCATGCATGCCAAGCACCGTGG 0.000 -2.15 0.003 0.49 0.007 2.30 ASCRP001365 TAGTTCAAAGGTCTAGGCTGAGGTTCTCATCCAGTAAAATTTCTCC 0.007 0.42 0.029 0.51 0.007 0.97 ASCRP001513 TATAGAGCAGTTCCAAGATTATCCCCTAAAACTCATAGACCCAGGT 0.026 -0.24 0.002 0.32 0.048 0.69 ASCRP001664 CTCGGGGTGACAAAGAAGCTGAAAATGTGTGTCTGACATGCAAGCT 0.000 0.71 0.000 -1.68 0.047 -1.70 ASCRP001665 CGCCAGTGCATCTTCTAGCTGAAAATGTGTGTCTGACATGCAAGCT 0.000 0.80 0.000 -1.18 0.046 -1.15 ASCRP001747 AGTATTGCAGGGTCATAATCGTATCATTGCCTACAGTAGACCAGTT 0.000 -1.68 0.000 -0.47 0.044 -0.68 ASCRP001821 ACCTGCTGGAAGAGTTCTCAGGCGCTGTGGTCTCACCTTCCACTGG 0.000 0.75 0.003 1.90 0.024 0.93 ASCRP002099 GTGGAAAACGTGGTATGTGTGCAACAGAGAGAAATTATGCGAATCA 0.007 0.96 0.000 -1.84 0.024 -2.86 ASCRP002412 GAAAGCATTTGCTATTTCAAGAAGCCCCTGAATATCTACTTTGGAT 0.000 -0.69 0.050 0.20 0.013 0.95 ASCRP002480 TTCCACAGTGATTGATGCTGCCTCAGTGGTTCCCCCTGGAAGTCCT 0.000 1.02 0.000 1.97 0.015 0.89 ASCRP002486 CCAATCCCTTACCGGGACCACTTAATAGTGAGTCTTCCAACCAGAG 0.032 0.34 0.000 0.88 0.025 1.23 ASCRP002716 TGGTCATCTTCGCTTCCTGCGGAATGTGGTGTCGGGCGAGCACTAC 0.001 0.77 0.000 -1.07 0.019 -1.83 ASCRP002913 AACTGGCCCGGAAACAGGAGGACGTGTGGATGTGGAAGCAGCCAAG 0.003 0.92 0.000 -1.64 0.024 -2.06 ASCRP002929 GCAGCGACATATCCTACATGGCTTTCCACCAACCTGGGCATCCTGA 0.002 0.36 0.042 -0.28 0.008 1.10 ASCRP002944 AAGATCAGTGTGTGGAAATCAGCCTAGAGGCAACCAAAAACATGGT 0.010 0.91 0.003 -1.39 0.006 -2.36 ASCRP002962 TATGACATTAGCCAGGTGTACAGTGCTGTGGATACCAATCCACTTT 0.007 -0.69 0.001 -0.90 0.031 -1.23 ASCRP003094 ATAAGTTTGCTTTGGAATCTGAGTGCTTCCTCCTGTTGAAGAGGCT 0.000 0.97 0.001 0.73 0.031 1.14 ASCRP003401 TCAATCCCTCAAGGTTGGTGTTCGAGGAAGAGACATTGTTGTTCTT 0.033 -0.68 0.003 -0.87 0.002 -1.70 ASCRP003430 ACAATCACAGTACTTTACCTCGTGTGGGCCTTTATTCCTGAATCTT 0.022 -1.25 0.002 -1.18 0.043 0.81 ASCRP003922 ACAATGGCCGTGTTTTGCTGTGCGTTCTCTGGGATGGGTAGAGATG 0.024 1.04 0.000 -1.11 0.024 -1.40 ASCRP003961 AAACATTGCCAGATGATCAGTGGGTTTGGAGGATTTGGGACAACAT 0.003 -0.52 0.006 -0.79 0.031 -1.06 ASCRP004003 AAGTTTCATGAGAATGTAACTGGTCACTACATTTCCCCCTTTCATG 0.000 -1.54 0.001 0.58 0.027 0.77 ASCRP004739 TGTGATCTACCAGAAGAGAGGCCACAGACCTCCACCAGCACGAAGT 0.016 -0.45 0.001 0.31 0.036 0.90 ASCRP004828 AAGCGATGAGGGCGGTGGCCAGTTTGAATACTCCCTTCATACCAGC 0.000 1.12 0.000 2.92 0.036 1.97 ASCRP005030 AAGTGAAGAACTGTGAGGTGGAGCAGTGGGACTCGGATGAGCCCAT 0.010 -0.61 0.000 -1.01 0.041 -0.96 ASCRP005099 CAACTGACAGGCAAAATCCTCAATGATGATACTGCTCTCAAAGAAT 0.000 -0.72 0.000 0.60 0.036 1.13

array ID – ID oligonukleotidne sonde ;

hg19 – referenčni genom hg19;

logFC – drugi logaritem razmerja spremembe (angl.

fold change) adj.P.Val –

normirana vrednost P

20

Krožne RNA so bile anotirane v zbirkah:

1.) circBase

S pomočjo podatkovne zbirke circBase lahko v genomskem kontekstu brskamo po naborih podatkov o krožnih RNA ter identificiramo znane in nove krožne RNA iz rezultatov sekvenciranj. Podatkovna zbirka trenutno vsebuje podatke o krožnih RNA iz različnih vzorcev Homo sapiens, Mus musculus, Caenorhabditis elegans in Latimeria [47].

Iskanje podatkov v zbirki je v potekalo prek orodja blat (angl. BLAST-like alignment tool). Kot vhodne podatke smo uporabili zaporedja sond iz tabele 4, da identificiramo, katere krožne RNA hibridizirajo s posamezno sondo. CircBase za iskanje z blat vsebuje referenčna zaporedja krožnih RNA pri ljudeh, miših in C. elegans. Ta so razrezana nasproti spojitve med glavo in repom, da ostane spojitveno mesto intaktno in je mogoče iskanje zadetkov, ki prekrivajo to mesto. Algoritem najde več rezultatov, upoštevali smo tisti rezultat, ki ima najvišjo točkovno vrednost (angl. score). V primerih, kjer sta dva rezultata z isto najvišjo točkovno vrednostjo, pa smo upoštevali oba. Informacije, ki smo jih tako pridobili, so ID posamezne krožne RNA, ime gena, kromosomska pozicija (hg19), veriga, na kateri se nahaja zapis (+ ali -), in pa dolžina krožne RNA po spajanju.

Prav tako pa so prisotne še anotacije o tem, če se zaporedje prepiše iz intergenske ali intragenske regije, če je eksonsko ali intronsko oziroma če je kodirajoče. S pomočjo tega orodja smo pridobili tudi zaporedja FASTA posameznih krožnih RNA, da jih lahko primerjamo z zaporedji v ostalih zbirkah in potrdimo, da so ista. Prav tako so na voljo podatki o tem, če je izražanje krožnih RNA potrjeno v celični liniji HepG2 [47].

2.) circAtlas

CircAtlas je integrirana podatkovna zbirka krožnih RNA vretenčarjev. Vsebuje podatke iz knjižnic RNA-seq. Glavne značilnosti zbirke so, da dodeljuje krožnim RNA ID-je in pretvarja ID-je med različnimi podatkovnimi zbirkami; omogoča iskanje ohranjenih krožnih RNA pri človeku, makakih, miših, podganah, prašiču in piščancu; napove prevedljivost krožnih RNA (napovedi ORF in IRES); s pomočjo algoritmov miRanda, Targetscan in PITA napove potencialna vezavna mesta za miRNA; prek podatkov iz zbirk POSTAR2 in starBase napove vezavna mesta za RBP-je v zgornjem in spodnjem robnem intronskem zaporedju ter znotraj same krožne RNA (okoli mesta spajanja) [48].

Za iskanje po tej zbirki smo uporabili circBase ID-je krožnih RNA. Informacije, ki smo jih tako pridobili so circAtlas ID, napovedi vezavnih mest za miRNA in RBP-je v vseh treh regijah ter napovedi ORF in IRES. Prav tako smo primerjali zaporedja FASTA med

21

zbirkama circAtlas in circBase. Spletna zbirka vsebuje tudi orodja za analizo FASTA- zaporedij za pridobitev napovedi ORF, IRES, RBP in MRE, kar nam je koristilo pri analizi krožnih RNA, ki še niso anotirane v zbirki [48].

3.) CSCD

CSCD (angl. Cancer Specific CircRNA Database) je integrirana podatkovna zbirka, katere namen je olajšati funkcionalne študije normalnih in z rakom povezanih krožnih RNA. V njej so zbrani nabori podatkov iz eksperimentov RNA-seq. Uporabniki lahko s pomočjo zbirke ugotovijo, če so circRNA njihovih vzorcev specifične za rak ali ne. Lahko si ogledajo tudi potencialno funkcionalno regulacijo in prevajanje teh circRNA ter napovedi MRE (algoritem TargetScan), RBP (podatki iz zbirke StarBase), in ORF (iz zbirke ORF Finder). Izvedejo se lahko tudi napovedi dogodkov spajanja [49].

Podatkovna zbirka je glede na tip podatkov (specifični za rak, normalni in običajni) razdeljena v tri podatkovne podzbirke. Krožne RNA smo iskali prek iskalnika, v katerega smo vnesli genomsko pozicijo v referenčnem genomu hg19 in pogledali, če je zadetek v kateri od podzbirk (naše krožne RNA smo prepoznali po circBase ID-ju). Zbirka nam vrne tabelo krožnih RNA, ki so zakodirane na danem genomskem odseku in osnovne anotacije. Ob kliku na zadetek je viden grafični prikaz linearnega starševskega gena z vidnimi eksoni in introni, možni alternativni dogodki spajanja ter tudi vsi možni prepisi.

Zbirko smo uporabili predvsem, da si lahko ogledamo grafični prikaz krožnih RNA, iz katerega lahko razberemo sestavne dele posamezne molekule (eksoni, introni) in število ter položaj morebitnih mest MRE, RBP in ORF. Najdene informacije smo primerjali z zbirkama circBase in circAtlas [49].

4.) exoRBase

Gre za spletno bazo podatkov, ki je repozitorij krožnih RNA, lncRNA in mRNA iz človeških krvnih eksosomov. Podatki so bili pridobljeni iz eksperimentov RNA-seq, a zbirka vsebuje tudi eksperimentalne validacije iz literature. exoRBase odlikuje integracija in vizualizacija profilov izražanja RNA pri normalnih posameznikih in tudi bolnikih z različnimi boleznimi. Namen exoRBase je olajšati odkritje novih eksosomskih bioloških označevalcev in funkcije teh molekul pri razvoju bolezni. V zbirki tako najdemo razne anotacije, raven izražanja in predvidena izvorna tkiva [50].

Z orodjem smo preverili izražanje vseh 36 krožnih RNA v krvnih eksosomih, ki izvirajo iz tkiv HCC. Vhodni podatki so bili circBase ID-ji krožnih RNA. Rezultat iskanja je tabela z osnovnimi podatki o poizvedovanih RNA. Ravni izražanja so v zbirki prikazane kot točkovni diagram ali toplotni grafi. Na voljo so tudi podrobne informacije o ustreznih