UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
JURIJ OBLAK
MAGISTRSKA NALOGA
MAGISTRSKI ŠTUDIJ INDUSTRIJSKE FARMACIJE
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
JURIJ OBLAK
IN SILICO NAPOVED FIZIKALNO-KEMIJSKIH LASTNOSTI IN EKSPERIMENTALNO
VREDNOTENJE CIS/TRANS IZOMERIZACIJE SELEKTIVNIH ZAVIRALCEV BUTIRILHOLIN
ESTERAZE
IN SILICO PREDICTION OF PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES AND EXPERIMENTAL
EVALUATION OF CIS/TRANS ISOMERIZATION OF SELECTIVE BUTYRYLCHOLINESTERASE
INHIBITORS
Ljubljana, 2021
I
Univerze v Ljubljani, pod mentorstvom doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm. in somentorstvom doc. dr. Damjana Kneza, mag. farm. Sinteze in analize smo izvajali na Katedri za farmacevtsko kemijo.
ZAHVALA
Iskreno se zahvaljujem mentorju doc. dr. Stanetu Pajku, mag. farm. in somentorju doc. dr.
Damjanu Knezu, mag. farm. za strokovno pomoč, vso predano znanje in koristne nasvete med delom v laboratoriju ter pri pisanju magistrske naloge. Najlepša hvala tudi za hitro odzivnost in prijaznost.
Ob zaključku študija se bi rad zahvalil svoji ženi Nini in pokojni hčerki Piki, mami in pokojnemu očetu, starim staršem, bratoma, kolegom na faksu in prijateljem za vso podporo, potrpljenje in vse spodbude tekom mojega študija.
IZJAVA
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelal pod vodstvom mentorja doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm. in somentorja doc. dr. Damjana Kneza, mag. farm.
Jurij Oblak
II
1 UVOD ... 1
1.1 Demenca ... 1
1.2 Alzheimerjeva bolezen ... 1
1.2.1 Prepoznavanje in diagnostika AB ... 3
1.3 Acetilholin esteraza in butirilholin esteraza ... 3
1.3.1 Strukturne razlike med AChE in BChE ... 4
1.3.2 Funkcije BChE ... 5
1.4 Razvoj selektivnih zaviralcev BChE ... 7
1.5 Kemijska stabilnost selektivnih zaviralcev BChE ... 9
1.5.1 Cis/trans izomerija ... 9
1.6 Fizikalno-kemijske lastnosti in farmakokinetični parametri zaviralcev BChE ... 10
1.6.1 Fizikalno-kemijske lastnosti ... 10
1.6.2 Lipofilnost ... 11
1.6.3 Topnost v vodi ... 12
1.6.4 Farmakokinetični parametri ... 13
2 NAMEN DELA ... 15
3 MATERIALI IN METODE ... 17
4 EKSPERIMENTALNI DEL ... 19
4.1 Sinteza 2-fluorofenilnih analogov selektivnih zaviralcev hBChE ... 19
4.1.1 Sinteza 1-(terc-butoksikarbonil)piperidin-3-karboksilne kisline (1) ... 19
4.1.2 Sinteza terc-butil 3-(metoksi(metill)karbamoil)piperidin-1-karboksilata (2) .. 19
4.1.3 Sinteza terc-butil 3-formilpiperidin-1-karboksilata (3) ... 20
4.1.4 Sinteza trifenilfosfonijeve soli (4) ... 20
4.1.5 Wittigova reakcija: sinteza (E/Z)-terc-butil 3-(2-fluorostiril)piperidin-1- karboksilata (5) ... 21
4.1.6 Odstranitev Boc zaščitne skupine ... 21
4.1.7 Sinteza (E)-1-(2-(3-(2-fluorostiril)piperidin-1-il)etil)pirolidin-2-ona (7) in (Z)- 1-(2-(3-(2-fluorostiril)piperidin-1-il)etil)pirolidin-2-ona (8) ... 22
III
4.2.1 Priprava vzorcev in kromatografski pogoji ... 23
4.3 Računalniško napovedovanje fizikalno-kemijskih in učinkovinam podobnim lastnosti 29 4.4 Vrednotenje izomerizacije cis/trans derivatov ... 34
5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 35
5.1 Sinteza ... 35
5.2 Razvoj kromatografske metode za ločevanje cis/trans izomerov selektivnih BChE zaviralcev ... 36
5.3 In silico analiza lastnosti zaviralcev hBChE ... 38
5.4 Vrednotenje izomerizacije cis/trans izomerov ... 39
5.4.1 Izomerizacija pod vplivom sončne svetlobe v CD3OD ... 39
5.4.2 Izomerizacija pod vplivom sončne svetlobe v 20 mM Na2PO4 (pH = 7,4)/DMSO-d6 ... 41
5.4.3 Vrednotenje izomerizacije cis izomera 8 pod vplivom Hg-žarnice ... 44
6 ZAKLJUČEK ... 46
7 LITERATURA ... 47
8 PRILOGE ... 51
IV
Tabela I: Izhodiščna kromatografska metoda. ... 23
Tabela II: Kromatografska metoda, pri kateri smo MeCN zamenjali z MeOH. ... 24
Tabela III: Kromatografska metoda pri kateri smo spremenili tip stacionarne faze in volumen inficiranja. ... 25
Tabela IV: Kromatografska metoda pri kateri smo povečali dolžino kolone. ... 26
Tabela V: Izokratske metoda s 30 % MeCN... 27
Tabela VI: Optimizirana kromatografska metode. ... 28
Tabela VII: Izračunani parametri za spojini A in B ter donepezil (SwissADME). ... 30
Tabela VIII: Izračunani parametri za spojini 7 in 8 (SwissADME)... 32
V
Slika 1: Shematski prikaz propada nevronskih celic, kar vodi do razvoja AB. ... 2
Slika 2: Shematski prikaz aktivnega mesta hBChE: acil-vezavni žep (zeleno), katalitična triada (oranžno), holin-vezavno mesto (rdeče) in periferno anionsko mesto (modro) ... 5
Slika 3: Strukture zaviralcev ChE ... 8
Slika 4: Struktura spojine A ... 8
Slika 5: Strukture formule 2-fluorofenilnih zaviralcev hBChE B–D. ... 15
Slika 6: Reakcijski mehanizem aktivacije karboksilne kisline s CDI ... 35
Slika 7: Mehanizem Wittigove reakcije ... 36
Slika 8: 1H-NMR spektri spojine B v CD3OD pri časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 0 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni, 21 dni. ... 39
Slika 9: 1H-NMR spektri spojine 8 v CD3OD pri časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 0 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni, 21 dni. ... 40
Slika 10: 1H-NMR spektri spojine 7 v CD3OD pri časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 0 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni, 21 dni. ... 41
Slika 11: 1H-NMR spektri spojine B v kombinaciji 20 mM Na2PO4 (pH = 7,4)/ DMSO-d6 v časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 0 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni, 21 dni. ... 42
Slika 12: 1H-NMR spektri spojine 8 v kombinaciji 20 mM Na2PO4 (pH = 7,4)/ DMSO-d6 v časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 0 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni, 21 dni. ... 43
Slika 13: 1H-NMR spektri spojine 7 v kombinaciji 20 mM Na2PO4 (pH = 7,4)/ DMSO-d6 v časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 0 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni, 21 dni. ... 44
Slika 14: 1H-NMR spektri spojine 8 v CD3OD v časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 1 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni. ... 45
Slika 15: 1H-NMR spektri spojine 8 v kombinaciji 20 mM Na2PO4 (pH = 7,4)/ DMSO-d6 v časovnih točkah (od zgoraj navzdol) 1 h, 1 dan, 5 dni, 7 dni, 14 dni. ... 45
VI
Raziskave na področju Alzheimerjeve bolezni (AB) in odkrivanju novih zdravilnih učinkovin v zadnjih letih močno napredujejo. Ob napredovanju AB se zviša koncentracija in aktivnost encima butirilholin esteraza (BChE), ki je v zadnjem desetletju postal zanimiva farmakološka tarča za blaženje kognitivnega upada v poznih stadijih bolezni.
Namen magistrske naloge je bil, da po že razviti sintezni poti ponovimo sintezo najbolj perspektivnega zaviralca humane (h)BChE, njegovih cis in trans analogov, in silico vrednotimo fizikalno-kemijske in učinkovini podobne lastnost celotne serije zaviralcev ter da z NMR spektroskopijo preverimo izomerizacijo cis/trans dvojne vezi 2-fluorofenilnih analogov pod vplivom svetlobe.
Po opisanih sinteznih postopkih z manjšimi modifikacijami smo uspešno opravili sintezo 2- fluorofenetilnega ter cis in trans 2-fluorofenilnih zaviralcev hBChE na gramski skali.
Pripravljene spojine smo nato uporabili za vrednotenje izomerizacije cis/trans dvojne vezi s protonsko NMR spektroskopijo pod vplivom naravne sončne svetlobe ter pri obsevanju z živosrebrovo žarnico. Izomerizacijo cis/trans dvojne vezi bi lahko alternativno spremljali tudi z UHPLC metodo, ki smo jo razvili in je pod optimiziranimi kromatografskimi pogoji ločila cis (8) in trans (7) izomera 2-fluorofenilnih zaviralcev hBChE. Na podlagi NMR spektroskopije smo ugotovili, da je termodinamsko manj stabilen cis derivat 8 pod vplivom sončne svetlobe izomeriziral do trans derivata po 21 dneh v manj kot 5 % deležu, medtem ko je pri obsevanju z živosrebrovo žarnico v 14 dneh nastalo približno 10 % trans izomera. Pri in silico vrednotenju fizikalno-kemijskih in učinkovinam podobnim lastnosti lahko izpostavimo, da vse spojine ustrezajo kriterijem po Lipinskem in imajo ustrezne lastnosti za dobro prehajanje krvno-možganske pregrade, kar je pomembno za doseganje mesta delovanja ter zaviralcev.
Serija spojin je tako zaradi svojih dobrih zaviralnih aktivnosti na encimu BChE in ustreznih fizikalno-kemijskih lastnosti dobra odskočna deska za nadaljnji razvoj in optimizacijo selektivnih zaviralcev hBChE.
Ključne besede: Alzheimerjeva bolezen, butirilholin esteraza, zaviralci butirilholin esteraze, izomerizacija dvojne vezi
VII
Research in the field of Alzheimer's disease (AD) and the discovery of drugs has advanced significantly in recent years. As AD progresses, the concentration and activity of the enzyme butyrylcholinesterase (BChE) increases. Therefore, BChE has become an interesting pharmacological target to alleviate cognitive decline in the late stages of the disease.
The primary aim of the Master's thesis was to resynthesize the most promising inhibitors of human (h)BChE, its cis and trans analogues, and to evaluate the physicochemical and drug- like properties of the series of selective BChE inhibitors, and to study the isomerization of cis/trans double bonds of 2-fluorophenyl analogs under the influence of light.
Following the procedures described, the synthesis of 2-fluorophenethyl and cis and trans 2- fluorophenyl BChE inhibitors on a gram scale was successfully performed. The compounds synthesized were used to evaluate the isomerization of the cis/trans double bond by proton NMR spectroscopy under the influence of natural sunlight and under irradiation using a mercury lamp. Alternatively, the isomerization of the cis/trans double bond could also be monitored by the UHPLC method developed, which separated the cis (8) and trans (7) isomers of 2-fluorophenyl hBChE inhibitors under optimized chromatographic conditions. Based on NMR spectroscopy, we established that the thermodynamically less stable cis derivative 8 under the influence of sunlight isomerized to the trans derivative after 21 days in less than 5 % portion. On the other hand, the irradiation with a mercury lamp for 14 days yielded about 10
% of the trans isomer. The in silico evaluation of physicochemical and drug-like properties pointed out that all the compounds meet the Lipinski criteria and have appropriate properties for good crossing of the blood-brain barrier, which is important for achieving the site of action of the inhibitors. Given the potent BChE inhibition and the suitable physicochemical properties, the series of compounds is a good springboard for further development and optimization of selective hBChE inhibitors.
Keywords: Alzheimer’s disease, butyrylcholinesterase, butyrylcholinesterase inhibitors, double bond isomerization
VIII
SEZNAM OKRAJŠAV
AB Alzheimerjeva bolezen ACh acetilholin
AChE acetilholin esteraza
ADME absorbcija, distribucija, metabolizem, eliminacija BChE butirilholin esteraza
CDI karbonildiimidazol CD3OD devteriran metanol Cyp Citokrom
DAD detector z nizom diod (angl. Diode Array Detector) DMSO dimetilsulfoksid
HEB hemato-encefalna bariera, krvno-možganska pregrada IC50 srednja inhibitorna koncentracija
LogD desetiški logaritem porazdelitvenega koeficienta pri določenem pH LogP desetiški logaritem porazdelitvenega koeficienta
LogS desetiški logaritem topnosti v vodi NMR jedrska magnetna resonanca TFA trifluoroocetna kislina THF tetrahidrofuran
TLC tankoplastna tekočinska kromatografija TPSA topografska polarna površina
U(H)PLC (ultra) visokotlačna tekočinska kromatografija
WHO svetovna zdravstvena organizacija (angl. World Health Organization)
1
1 UVOD
1.1 Demenca
Alzheimerjeva bolezen (AB) spada med kronične, počasi napredujoče nevrodegenerativne bolezni možganov in je najpogostejši vzrok demence [1]. Demenca je motnja, pri kateri pride do poslabšanja kognitivnih funkcij možganov, ki se s časom in z napredovanjem bolezni še slabšajo [2]. Značilni simptomi demence so težave s spominom, logičnim reševanjem problemov, razumevanjem jezika, govorjenjem in težave pri drugih kognitivnih spretnostih, ki vplivajo na normalno izvajanje vsakodnevnih aktivnosti posameznika [1]. Oslabelost kognitivnih funkcij običajno vpliva tudi na poslabšanje čustvenega nadzora in pojava nevropsihiatričnih simptomov kot so nespečnost, halucinacije, depresija, blodnje in anksioznost [1, 2]. Demenca je tudi eden glavnih razlogov invalidnosti in nesamostojnosti starejših ljudi po vsem svetu. Pogosto je pomanjkanje zavedanja in razumevanja bolnikov tudi problem z vidika diagnoze, zdravljenja in oskrbe. Bolezen pa ni problematična le za ljudi, ki jo imajo, ampak tudi za njihove družine, negovalce in družbo, na katere bolezen vpliva tako na fizičen, psihološki, socialni kot tudi ekonomski način [2]. Obstaja več različnih oblik demence. Poleg že omenjene AB, ki predstavlja 60–70 % vseh primerov demence, poznamo tudi vaskularno demenco, demenco z Lewyjevimi telesci, demenco pri Parkinsonovi bolezni, frontotemporalno demenco in mešano demenco. Po ocenah WHO po vsem svetu za demenco trpi 50 milijonov ljudi, od tega jih kar 60 % živi v državah z nizkim in srednjim dohodkom. Znano je, da je vsako leto potrjenih skoraj 10 milijonov novih primerov. Po ocenah naj bi število bolnikov z demenco do leta 2030 naraslo do 82 milijonov oziroma na 152 milijonov do leta 2050 [2].
1.2 Alzheimerjeva bolezen
Alzheimerjevo bolezen (AB) je leta 1906 prvič opisal nemški psihiater in nevropatolog Alois Alzheimer [1]. Vse od takrat do danes so kot ključna nevropatološka znamenja AB izpostavljene senilne lehe in nevrofibrilarne pentlje (Slika 1) [3]. Prisotnost le-teh še vedno predstavlja kriterij za postavitev diagnoze bolezni, ki jih je moč opaziti pri magnetni resonanci možganov [4]. Poleg teh se v možganih obolelih z AB pojavijo tudi
2
druge strukturne in funkcionalne spremembe povezane tako z vnetnim odzivom kot tudi z oksidativnim stresom. Posledica patoloških dejavnikov je močno prizadeto delovanje in odmiranje nevronov ter sinaps. Propadanje nevronov zniža aktivnost holin-acetil transferaze ter posledično koncentracije acetilholina (ACh) v hipokampusu in možganski skorji. Ob vsem tem se zaradi odmiranja specifičnih nevronov začne spreminjati anatomija možganske skorje [3].
Slika 1: Shematski prikaz propada nevronskih celic, kar vodi do razvoja AB (prirejeno po [5]).
Zdravi nevroni imajo v svoji notranjosti strukture imenovane mikrotubuli, ki prenašajo hranila in molekule od telesa živčne celice od konca aksona in nazaj – ta proces imenujemo aksonski transport. Na mikrotubule se vežejo molekule proteina tau, ki jih na ta način stabilizirajo. Pri AB pa se tau kemično spremeni – hiperfosforilira, zaradi česar se začne povezovat z drugimi molekulami proteina tau, kar posledično poruši arhitekturo mikrotubulov in pripelje do motenj aksonskega transporta ter apoptoze [4]. Navkljub vsem prizadevanjem raziskovalcev na področju razumevanja patogeneze v zadnjih desetletjih, vzrok in potek AB še nista povsem znana, zaradi česar ostaja AB neozdravljiva [3].
3
1.2.1 Prepoznavanje in diagnostika AB
Trenutno je nedvoumna in najbolj točna postavitev diagnoze AB možna z obdukcijo možganov ali biopsijo, v praksi pa se diagnoza postavi na podlagi klinične anamneze in pregleda mentalnega stanja bolnika [4]. Vzroki za nastanek AB do sedaj še niso znani, zato pri zdravljenju bolezni ne odpravljamo vzrokov, temveč samo blažimo njene simptome. Trendi zdravljenja temeljijo na biokemičnih ter morfoloških lastnostih AB, zato je raziskovanje usmerjeno v iskanje novih učinkovin za uravnovešanje znižanega delovanja holinergičnega sistema, vpletanje v metabolizem amiloidnega proteina β (APβ) in zaščito živčnih celic. Alternativo predstavlja tudi posredno ali neposredno spodbujanje aktivnosti drugih nevrotransmiterskih sistemov, ki pomagajo v primeru oslabljenega holinergičnega prenosa, vplivajo na nastanek nevrofibrilarnih pentelj in protivnetnih učinkovin, ki bi posledično zmanjšale delež apoptotičnih živčnih celic. Za zdravljenje AB se uporabljajo zaviralci acetilholin esteraze (AChE), ki zmanjšajo razgradnjo ACh – ta ima v telesu funkcijo prenosa signala med živčnimi celicami in mišičnimi vlakni na motorični ploščici, hkrati pa je pomemben nevrotransmiter v centralnem živčnem sistemu (CŽS). Ta zdravila sicer upočasnijo potek bolezni, vendar so učinkovita le v začetnih stadijih [6].
1.3 Acetilholin esteraza in butirilholin esteraza
AChE in butirilholin esteraza (BChE) sodita v skupino holin esteraz (ChE), ki hidrolizirata ACh v centralnem in perifernem živčevju ter s tem prekinejo živčni signal v sinapsah. Sodita med najhitreje delujoče encime, saj sta sposobna hidrolizirati ACh na acetat in holin s hitrostjo več kot 10000 molekul na sekundo [7]. Znano je, da ChE sodelujejo tudi izven klasičnih holinergičnih funkcij, kot je na primer v morfogenezi, med zgodnjim embrionalnim razvojem, pri modulaciji nevronske aktivnosti, izločanju različnih strupenih snovi, ki niso povezane z holinergičnim sistemom, povečano izraženje ChE pa je povezano tudi z nekaterimi tumorji [8]. Medtem ko je AChE zelo selektivna za hidrolizo ACh, je BChE neselektivna in poleg ACh presnavlja tudi druge molekule, med drugim tudi različne nevroaktivne peptide. Razlog za to raznolikost je aminokislinsko zaporedje in s tem povezana tridimenzionalna oblika aktivnega mesta encima. Znano je,
4
da se aktivnost encimov spreminja s koncentracijo substrata. Za AChE velja, da ima ta večjo aktivnost pri nizkih koncentracijah ACh, kar pomeni, da pride pri višjih koncentracijah substrata do substratne inhibicije AChE. Aktivnost BChE pa se v nasprotju z AChE pri višjih koncentracijah ACh ne zmanjša, saj encim hidrolizira ACh z enako katalitsko učinkovitostjo kot pri nižjih koncentracijah. Glede na razlike med encimoma in njunima distribucijama v možganih so prišli do ugotovitev, da je pri zdravih možganih za hidrolizo ACh ključna AChE, BChE pa ima le podporno vlogo [9]. AChE prevladuje v nevronih, BChE pa je lokaliziran predvsem v celicah glije pa tudi v endotelijskih celicah in nekaterih nevronih [10]. Čeprav BChE opravlja povsem enako funkcijo kot AChE, njegova vloga v možganih še vedno ni razjasnjena. Raziskave na miših so pokazale, da lahko v primeru miši, ki nimajo AChE, BChE prevzame vlogo glavne ChE in s tem omogoči normalno prekinitev holinergičnega prenosa [11]. V zdravih možganih AChE predstavlja 80 % aktivnosti ChE in BChE preostanek. Pri bolnikih z AB pa se lahko aktivnost AChE v določenih regijah možganov zmanjša na 55–
67 % normalne ravni, medtem ko aktivnost BChE močno poraste. Razmerje med aktivnostjo encimov BChE/AChE se drastično spremeni v kortikalnem delu možganov iz začetnega 0,5 pa vse do 11 v prid BChE. AChE kot tudi BChE se kopičita znotraj senilnih leh, najdemo ju tudi v nevrofibrilarnih pentljah [7].
1.3.1 Strukturne razlike med AChE in BChE
AChE in BChE imata kar 65 % homolognega zaporedja aminokislin, kodirata pa ju različna gena na ločenih kromosomih: gen za humano (h)AChE se nahaja na kromosomu 7 (7q22), gen za hBChE pa na kromosomu 3 (3q26). Oba encima imata hidrofobno 20 Å globoko aktivno mesto, v katerega se veže molekula substrata – ACh [9]. Aktivno mesto hBChE je večje od hAChE (500 Å3 v primerjavi s 300 Å3) in vsebuje približno 40 % manj aromatskih aminokislinskih ostankov. Aromatski aminokislinski ostanki so pri hBChE nadomeščeni z manjšimi alifatskimi ali celo polarnimi aminokislinami, kar je razlog za specifične katalitične lastnosti hBChE.
5
Slika 2: Shematski prikaz aktivnega mesta hBChE: acil-vezavni žep (zeleno), katalitična triada (oranžno), holin-vezavno mesto (rdeče) in periferno anionsko mesto (modro);
prirejeno po članku [12].
Aktivno mesto hBChE lahko razdelimo na 4 podenote (Slika 2). Prva podenota vsebuje aminokisline vključene v katalizo – t.i. katalitično triado Ser198, His438 in Glu325.
Prehodno stanje – aciliran encim – stabilizira t.i. oksianionska luknja, ki je sestavljena iz treh N-H dipolov na ostankih verige Gly116, Gly117 in Ala199. Druga podenota je holin- vezavni žep, kjer se veže holinski del ACh in orientira estersko vez, da lahko poteče nukleofilni napad serina. To mesto vsebuje ključen ostanek Trp82, ki tvori kationske interakcije z kvarternim centrom holina. Nekateri drugi ostanki v neposredni bližini pa imajo pomembno vlogo pri stabilizaciji funkcionalne konformacije Trp82: Met81 stabilizira Trp82 z interakcijami z žveplom, Tyr440 pa prek vodikovih vezi. Tretja podenota je acil-vezavni žep, ki je prilagojen acilnemu delu substrata in je sestavljen iz Leu286, Val288 in Trp231. Četrta podenota je periferno anionsko mesto sestavljeno iz treh ostankov (Asp70, Tyr72, Tyr332) locirano na vstopu v aktivno mesto. Periferno anionsko mesto kot prvo prihaja v stik s pozitivno nabitimi substrati in jih orientira, da učinkovito vstopijo v aktivno mesto [11].
1.3.2 Funkcije BChE
Pri zdravih posameznikih so raziskovalci našli “tiho” BChE – atipično varianto BChE, ki je katalitsko praktično neaktivna, kar postavlja pod vprašaj fiziološko funkcijo tega
6
encima. Raziskave na miškah, ki so jim izbili gen za AChE kažejo, da v določenih patoloških pogojih BChE prevzame funkcijo AChE v CŽS in živčno-mišičnem stiku [11, 13], kar podpira že zgoraj opisano podporno funkcijo pri prekinitvi holinergičnega signaliziranja. Opisane so tudi druge encimske in neencimske funkcije BChE, kot je na primer peptidazna aktivnost, kadar se v telesu pojavijo toksini. BChE ima aril- acilamidazno aktivnost, ki je sicer prenizka, da bi sodelovala pri presnovi endogenih aril- acilamidov, kot je melatonin, ali interakcijah z metaboliti tega hormona, kot so na primer serotonin in druge sorodne substance (npr. tiramin). Neencimske aktivnosti BChE v nevrogenezi in nevronskih motnjah so bile pripisane njegovim glikanom. BChE zavira tvorbo topnih AChE-amiloidnih skupkov, vendar za razliko od AChE nima neposredne vloge pri tvorbi fibrilov APβ [11].
Najbolj znano dejstvo glede BChE je, da ima vlogo pri detoksifikaciji človeškega telesa.
Ker v človeški plazmi ni karboksiesteraz, BChE prevzema vlogo pri obdelavi, katabolizmu in detoksifikaciji številnih estrov [13]. Človeška BChE hidrolizira substance, ki imajo v svoji strukturi estre, na primer sukcinilholin, aspirin, irinotekan, heroin ter kokain [11]. Toksini naravnega izvora kot so v krompirju prisotni glikoalkaloidini solanini, čakonini in anatoksini, ki jih proizvajajo modro-zelene alge Anabaena flos- aquae, so reverzibilni zaviralci BChE. Te spojine zavirajo hidrolizo zdravil z esterskimi vezmi in s tem sprožijo iatrogene neželene stranske učinke zdravil (kožne okužbe, prebavne težave, bolečine, hipoglikemija, odpoved ledvic, hipokaliemija) in alergijske reakcije (koprivnica, astma ali anafilaktični šok) [11, 13]. BChE reagira s strupenimi karbamati in organofosforjevimi spojinami, zato je BChE naravni stehiometrični lovilec teh spojin. Plazemska BChE v subletalnih odmerkih ščiti pred toksičnostjo živčnih bojnih strupov in nekaterih organofosfatnih pesticidov. Aplikacija velikih količin eksogene hBChE bi se torej lahko uporabljala kot profilaksa ali terapija zastrupitev z bojnimi strupi [11]. Injiciranje prečiščene človeške plazme z BChE se trenutno uporaba za povratno podaljšanje apneje, ki jo povzročajo mišični relaksanti (sukcinildiholin, mivakurij) pri bolnikih, ki imajo atipično BChE ter pri zdravljenju predoziranja s kokainom in heroinom [11, 13]. Človeška BChE hidrolizira tudi oktanoil grelin, ki spodbuja hranjenje in pospešuje povečanje telesne mase z zmanjšanjem porabe energije in katabolizma maščob.
Mišim z izbitim genom za BChE se na dieti z veliko maščobami telesna teža občutno poveča v primerjavi z mišmi, ki imajo normalno prisotno BChE. To dognanje je v skladu
7
s hipotezo, da je pomanjkanje aktivnosti BChE povezano z zmanjšanim katabolizmom maščob [13].
1.4 Razvoj selektivnih zaviralcev BChE
Pri terapiji AB danes lajšamo le njene kognitivne znake in simptome za kar se uporabljata selektivna reverzibilna zaviralca AChE donepezil in galantamin ter psevdoireverzibilen dualni zaviralec AChE in BChE rivastigmin (Slika 3). Zaviralci ChE blažijo simptome ali upočasnijo nadaljnji razvoj bolezni z obnovo holinergične aktivnosti v možganih, hkrati pa povzročajo neželene stranske učinke, kot so bruhanje, slabost, driska ali tresenje, ki so posledica zaviranja AChE v perifernem in parasimpatičnem avtonomnem živčevju.
Ta razred zaviralcev je omejen na zdravljenje blage do zmerne faze AB. Razvoj novih učinkovin na tem področju se je zato preusmeril predvsem v selektivne zaviralce BChE.
Raziskovalci so odkrili že številne selektivne reverzibilne in psevdo-ireverzibilne zaviralce BChE, pri čemer imajo analogi cimserina dokazano in vivo aktivnost zaviranja BChE, bisnorcimserin (Slika 3) pa je edini uspešno napredoval v I. fazo kliničnih preizkušanj. Analogi cimserina so psevdo-ireverzibilni zaviralci karbamatnega tipa, kjer poteče hitra reakcija tvorbe kovalentne vezi med karbonilno skupino karbamata ter katalitičnim serinom v aktivnem mestu BChE, čemur sledi počasna regeneracija – hidroliza karbamoiliranega Ser198 [14].
8
Slika 3: Strukture zaviralcev ChE (Povzeto po [15]).
Zaradi pomembne vloge BChE pri bolnikih z AB so se raziskovalci s Katedre za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo UL osredotočili na raziskovanje novih učinkovin, ki bi učinkovito in selektivno zavirale hBChE in omogočile učinkovito zdravljenje v kasnejših stadijih AB [15–18]. Z virtualnih rešetanj na osnovi liganda so nadalje odkrili pet spojin zadetkov (zaviralcev BChE), ki so imeli vrednosti IC50 v nanomolarnem območju in so se strukturno razlikovale od osnovnih zaviralcev opisanih v publikacijah [19]. Spojina (1-(2-(3-(4-fluorofenetil)piperidin-1-il)etilpirolidin-2-on) – spojina A (Slika 5) je bila najmočnejši zaviralec hBChE iz te serije spojin z IC50
vrednostjo 80,3 nM [19]. Na podlagi strukture te spojine so raziskovalci sintetizirali serijo 80 zaviralcev hBChE (rezultati še niso objavljeni).
Slika 4: Struktura spojine A (Povzeto po [20]).
9
1.5 Kemijska stabilnost selektivnih zaviralcev BChE
Kemijska stabilnost učinkovin v raziskovanju novih zaviralcev BChE ni prvenstvena [21], saj imajo noviteta, jakost zaviranja in selektivnost večjo težo [22], kljub temu pa je kemijska stabilnost ključna za nadaljnji razvoj zdravil in rokovanje z njimi [21].
Raziskovalci v zadnjem desetletju vse bolj poudarjeno proučujejo lastnosti spojin, kot so fizikalno-kemijske lastnosti, presnova in farmakokinetične lastnosti, ki so se izkazale kot ključne determinante za uspeh pri odkrivanju in razvoju novih zdravilnih učinkovin z delovanjem v CŽS [22]. Dobro je, da znamo že v fazi razvoja serije spojin prepoznati in optimizirati več fizikalno-kemijskih lastnosti, da bo celoten razvoj uspešnejši. Zmanjšana količina učinkovine v zdravilu lahko zmanjša želen farmakološki odziv, hkrati pa lahko razgradnji produkti povzročijo neželene stranske učinke in/ali toksičnost. Učinkovine so med razvojem, skladiščenjem in proizvodnjo izpostavljene različnim dejavnikom, kot so zračna vlaga, svetloba, povišana temperatura ali različni pH-ji, ki lahko povzročijo različne reakcije razgradnje [22].
1.5.1 Cis/trans izomerija
V seriji sintetiziranih zaviralcev hBChE ima več kot polovica spojin prisotno dvojno vez, ki je lahko v cis ali trans poziciji (Priloge, Tabela S1). O cis-(Z)/trans-(E) geometrijski izomeriji govorimo, ko vezi med atomi niso vrtljive, zato so atomi oz. skupine atomov ob tej vezi trajno v različni prostorski razporeditvi. Cis/trans izomeri se zaradi tega razlikujejo po številnih fizikalno-kemijskih lastnostih. Cis izomeri imajo običajno višje vrelišče, so manj termodinamsko stabilni in so zaradi nabojev, ki jih nabirajo na eni strani, v primerjavi s trans izomeri tudi bolj polarni [23]. Ločevanje med cis/trans izomeri je možno z NMR spektrometrijo, kjer lahko s pomočjo sklopitvenih konstant opazujemo okolico vodikovih atomov, saj sta vodika ob dvojni vezi glede na geometrijo v različni okolici. Ločevanje med cis/trans izomeri je možno tudi s pomočjo kromatografije, saj se izomera razlikujeta v fizikalno-kemijskih lastnostih in s tem v njunem porazdeljevanju med stacionarno in mobilno fazo.
10
Raziskovanje pretvorbe cis izomera v trans izomer je potekalo že v 19. stoletju, kjer so dokazali, da je pretvorbo možno doseči ob prisotnosti močnih kislin ali halogenov kot sta I2 ali Br2. Mehanistične hipoteze vključujejo protonacijo elektronsko bogatega alkena, pri čemer nastane kationski intermediat, ki omogoči vrtljivost okoli dvojne vezi.
Izomerizacija maleinske kisline tako poteka preko nastanka C(sp3)-C(sp3) hibridiziranega klorosukcinata s sočasnim izstopom HCl. Raziskave, ki jih je leta 1890 opravil Liermann, so dokazale tudi kvantitativno pretvorbo Z izomera cimetne kisline v E izomer po dodajanju joda in segrevanju pri refluksu. Reakcija temelji na disociaciji joda (termični ali fotokemični) in adiciji jodovega radikala na alken. Podoben reakcijski mehanizem je dokazan tudi ob uporabi elementarnega selena ter pri fotokemični tvorbi radikalskega intermediata. Alken v Z konfiguraciji se lahko v termodinamsko ugodnejši E izomer pretvorijo tudi z organokovinskimi reagenti. Kovinski katalizator se ob tem reverzibilno veže na dvojno vez v obliki kovino-hidridnega intermediata [24].
Izomerizacijo enostavnih alkenov iz E v pogosto manj termodinamsko ugodno Z konfiguracijo je mogoče doseči s fotokemično aktivacijo, ki vključuje bodisi neposredno obsevanje s svetlobo ustreznih valovnih dolžin ali pa uporabo fotosenzibilizatorja s prenosom energije [24].
1.6 Fizikalno-kemijske lastnosti in farmakokinetični parametri zaviralcev BChE
1.6.1 Fizikalno-kemijske lastnosti
Farmakološki učinek zdravilnih učinkovin je povezan z različnimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi kot so topnost, porazdelitveni koeficient (LogP), disociacijska konstanta (pKa), število donorjev in akceptorjev vodikovih vezi, redoks potencial, sposobnost kompleksacije, površinska aktivnost, vezava na serumske proteine in izomerija [25].
Spletni vmesnik SwissADME (http://www.swissadme.ch/) omogoča enostaven izračun fizikalno-kemijskih lastnosti kot so molska masa, število težkih atomov in težkih aromatskih atomov, rotirajočih se vezi, število akceptorjev oziroma donorjev vodikove
11
vezi, molarno refraktivnost, hkrati pa izračuna topološko polarno površino, ki koristi za ocenjevanje nekaterih ADME lastnosti kot sta npr. absorpcija in prehajanje HEB [26].
1.6.2 Lipofilnost
Lipofilnost spojine vpliva na številne fizikalno-kemijske in fiziološke lastnosti spojine in je povezana predvsem s sposobnostjo prehajanja bioloških membran – permeabilnostjo [27]. Lipofilnost je definirana glede na porazdelitev spojine med dvema fazama – hidrofilno in hidrofobno [28]. Hansch je bil eden prvih, ki je preučil pomembnost porazdelitvenega koeficienta za razlago strukturne aktivnosti spojin. Porazdelitveni koeficient (P) je fizikalna konstanta in je definiran kot razmerje med ravnotežno koncentracijo raztopljene snovi v nevtralni obliki v dvofaznem sistemu, sestavljenem iz dveh medsebojno ne mešajočih se topil, klasično sta to n-oktanol in voda [28].
Porazdelitveni koeficient (P) je torej količnik dveh koncentracij in je običajno podan v obliki desetiškega logaritma (logP). LogP se spreminja glede na pogoje, pod katerimi se meri in izbiro sistema topil [27], nanj pa vpliva več strukturnih lastnosti: molekularni volumen, dipolarnost ter kislost oziroma bazičnost vodikovih vezi [28].
LogD je definiran kot koeficient porazdelitve pri določenem pH, ki upošteva ravnovesje med ionizirano in neionizirano obliko v posameznem topilu. Najpogosteje je LogD podan pri pH = 7,4 saj s tem poda lipofilnost učinkovine pri pH krvne plazme. V podatkovnih bazah je na voljo več kot 100.000 eksperimentalno določenih vrednosti logP in logD, ki predstavljajo dragoceno orodje za primerjavo in za študije obnašanja učinkovin v različnih sistemih [27]. Za kisline se kvocient med neionizirano in ionizirano obliko v vodni raztopini zmanjšuje s povečevanjem pH vrednosti, za baze pa velja ravno obratno [28].
Lipofilnost je povezana z biološko aktivnostjo zdravilne učinkovine in predvsem z ADMET lastnostmi (absorpcija, porazdelitev, presnova, izločanje in toksičnost). Zaradi tega so podatki o lipofilnosti zelo pomembni pri zgodnjem odkrivanju novih učinkovin [28]. V primeru zaviralcev hBChE je lipofilnost pomembna z vidika absorpcije zdravilnih učinkovin po peroralni aplikaciji in predvsem prehajanja HEB.
12
SwissADME omogoča dostop do petih modelov za napoved logP:
1. XLOGP3 je empirična atomistična metoda, ki vsebuje korelacijske faktorje in znanje iz podatkovnih baz eksperimentalno določenih logP vrednosti;
2. WLOGP je atomistična metoda, ki temelji na aditivnosti prispevkov posameznih atomov;
3. MLOGP je arhetip topološke metode, ki se opira na linearno razmerje s 13 molekularnimi deskriptorji;
4. SILICOS-IT je hibridna metoda, ki temelji na 27 fragmentnih in 7 topoloških deskriptorjih;
5. iLOGP je fizikalna metoda, ki so jo razvili avtorji orodja SwissADME in temelji na prostih energijah solvatacije v n-oktanolu in vodi izračunanih z modelom
»Generalized Born, BG«, model je približek eksaktne linearizirane Poisson- Boltzmanove enačbe in bazira na razlikah topilu dostopnih površin [26].
1.6.3 Topnost v vodi
Pri razvoju učinkovin za peroralno uporabo je zelo pomembna tudi topnost spojin, saj je le-ta lahko omejujoči faktor za absorpcijo. Tudi zdravila namenjena parenteralni uporabi morajo biti dobro topna v vodi, da lahko zagotovimo ustrezen odmerek.
Programska oprema SwissADME vključuje več metod za napovedovanje topnosti in sicer ESOL, Ali ter SILICOS-IT. Prvi dve se razlikujeta od splošne enačbe za topnost in ne upoštevata tališča, ki ga je težko napovedovati, hkrati pa dajeta linearno korelacijo med napovedanimi in eksperimentalnimi vrednostmi. Tretja metoda SILICOS-IT pa za razliko od prej omenjenih upošteva še molsko maso. Vse vrednosti topnosti so podane kot desetiški logaritmi molarne topnosti v vodi (logS) [26]. Topnost v vodi je merilo količine snovi – spojine, ki se lahko raztopi v vodi pri določeni temperaturi in je običajno podana v mg/L ali ppm [29].
13
1.6.4 Farmakokinetični parametri
Farmakokinetika opisuje procese absorpcije, porazdelitve, presnove in izločanja spojine.
Predklinične študije zahtevajo določitev sprejemljive in vitro aktivnosti in farmakokinetike vsaj na dveh živalskih vrstah, pri človeku pa je treba opraviti dodatne farmakokinetične študije, ki koncentracije v krvi povežejo z biološkimi učinki [30].
Absorpcija je opredeljena kot prehod z mesta aplikacije v sistemski krvni obtok.
Porazdelitev se običajno zgodi s pasivno difuzijo po transcelularni ali paracelularni poti.
Pri transcelularni absorpciji, porazdelitvi ter izločanju imajo pomembno vlogo številni transportni proteini, npr. membranski transportni proteini iz skupine SLC (angl. solute carrier) in od ATP odvisni transporterji (angl. ATP-binding casette transporter, ABC).
Na farmakokinetične karakteristike vplivajo številni dejavniki kot so genetika, bolezen, starost, življenjski slog in prehrana. Plazemski profili učinkovine po intravenski aplikaciji spojine pogosto kažejo eksponenten padec koncentracije v krvi z definirano razpolovno dobo [30].
V programu SwissADME lahko s pomočjo specializiranih modelov ocenjujemo posamezne ADME korake molekul v predkliničnem razvoju. Prvi model je multipla linearna regresija za napovedovanje koeficienta permeabilnosti (Kp, v cm/s), ki je linerano povezan z velikostjo molekule in lipofilnostjo. Bolj kot je Log(Kp) negativen, manj je molekula permeabilna [26]. Napovemo lahko tudi pasivno absorpcijo iz človeških prebavil (HIA) in prehajanje HEB, ki je v spletnem orodju predstavljena v obliki grafičnega modela klasifikacije BOILED-Egg [26].
Po nekaterih ocenah je med 50 % in 90 % učinkovin substratov za citokrome petih glavnih izooblik (CYP1A2, CYP2C19, CYP2C9, CYP2D6, CYP3A4). Inhibicija le-teh je eden glavnih razlogov za farmakokinetične interakcije med zdravili, kar lahko vodi do toksičnih ali drugih neželenih učinkov zaradi manjšega očistka in kopičenja zdravilne učinkovine ali njenih presnovkov. Prav zaradi močnega vpliva na citokrome je pri odkrivanju zdravilnih učinkovin zelo pomembno napovedati nagnjenost molekul k interakcijam z zdravili in zaviranjem CYP. Program SwissADME vključuje binarne modele klasifikacije, ki omogočajo napovedovanje tendence majhnih molekul za
14
metabolizem s citokromi oziroma verjetnost, da so te spojine substrati za P-glikoprotein (P-gp) [26].
15
2 NAMEN DELA
V okviru magistrske naloge bomo ponovili sintezo cis in trans derivata najbolj perspektivnega selektivnega zaviralca hBChE – spojine B (Slika 5), in silico ovrednotili fizikalno-kemijske lastnosti serije zaviralcev hBChE ter preverili izomerizacijo dvojne vezi, ki je prisotna v strukturi nekaterih zaviralcev. Resintezo 2-fluorfenilnih zaviralcev BChE bomo opravili po že uveljavljenih sinteznih poteh z manjšimi modifikacijami, pripravljene spojine pa bomo nato uporabili za vrednotenje izomerizacije cis/trans dvojne vezi derivatov C in D. Izomerizacijo bomo vrednotili z NMR spektroskopijo in sicer na podlagi protonskih 1H-NMR spektrov, ki jih bomo snemali v različnih časovnih točkah ob obsevanju vzorca spojine z naravno sončno svetlobo ter živosrebrovo (Hg) žarnico.
Kot alternativo za vrednotenje izomerizacije bomo razvili kromatografsko metodo, ki bo ločevala cis in trans izomera. Za serijo več kot 80 analogov zaviralcev hBChE sintetiziranih na Katedri za farmacevtsko kemijo UL FFA bomo s pomočjo spletne platforme SwissADME izračunali fizikalno-kemijske in učinkovini podobne lastnosti (angl. drug-like properties).
Slika 5: Strukture formule 2-fluorofenilnih zaviralcev hBChE B–D.
17
3 MATERIALI IN METODE
Pri sintezi 2-fluorofenilnih analogov selektivnih hBChE zaviralcev smo uporabili topila in reagente različnih proizvajalcev (Sigma, Merck, Fluka, Acros, Apollo Scientific, Fluorochem).
Spektroskopske metode
Jedrska magnetna resonanca (NMR): za snemanje spektrov smo uporabljali spektrometer Bruker Avance III 400 MHz. Vzorce za snemanje smo pripravljali tako, da smo jih raztopili v izbranem devteriranem topilu (DMSO-d6 ali CD3OD). Za analizo rezultatov smo uporabili programsko opremo MestReNova; kemijske premike (δ) smo podali v enotah ppm glede na uporabljeno devterirano topilo.
Kromatografske metode
Tankoplastna kromatografija (TLC): kot stacionarno fazo smo uporabljali ploščice Silica gel 60 F254 z 0,20 mm nanosom silikagela na aluminijastem nosilcu (Merck). Kot mobilno fazo smo uporabljali razmerja različnih topil, ki so navedena pri posameznih sinteznih stopnjah. Za detekcijo spojin smo uporabljali UV lučko (λ = 254 nm) ter ninhidrin kot orositveni reagent.
Kolonska »flash« kromatografija: kot stacionarno fazo smo uporabljali silikagel 60 (0,04–0,063 mm) proizvajalca Merck, mobilne faze pa so navedene pri opisih postopkov sinteze in čiščenja.
Analitska HPLC: Za razvoj kromatografske metode smo uporabljali sistem Thermo Fisher UltiMate 3000 UHPLC sistem z DAD detektorjem. Uporabljali smo tri različne kolone: Acquity UPLC HSS C18, 1,8 µm (2,1 × 50 mm), Acquity UPLC BEH Phenyl, 1,7 µm (2,1 × 100 mm) in Acquity UPLC BEH Phenyl, 1,7 µm (2,1 × 150 mm). Pretok smo uravnavali glede na tlak na koloni, volumen injiciranja pa se je prilagajal glede na intenziteto odzivov pri posameznih injiciranjih. Na kanalih na sistemu smo imeli štiri mobilne faze: A, 0,1 % TFA(aq), B, MeOH; C, voda; D, MeCN.
19
4 EKSPERIMENTALNI DEL
4.1 Sinteza 2-fluorofenilnih analogov selektivnih zaviralcev hBChE
4.1.1 Sinteza 1-(terc-butoksikarbonil)piperidin-3-karboksilne kisline (1)
Piperidin-3-karboksilno kislino (20,0 g, 155 mmol, 1 ekv.) smo raztopili v 170 mL 1 M NaOH(aq) ter 100 mL 1,4-dioksana. Raztopino smo mešali na magnetnem mešalu, jo ohladili na ledeni kopeli (0 °C) in ji postopoma dodali Boc2O (37,91 g, 170 mmol, 1,1 ekv.) ter mešali 24 h pri sobni temperaturi. Nato smo pri znižanem tlaku uparili polovico topila in preostanku z 1 M HCl(aq) pH uravnali na 2. Izpadlo oborino smo filtrirali s presesavanjem, sprali z vodo in jo sušili 24 h pri 50–60 °C.
4.1.2 Sinteza terc-butil 3-(metoksi(metill)karbamoil)piperidin-1-karboksilata (2)
1-(Terc-butoksikarbonil)piperidin-3-karboksilno kislino (1) (29,725 g, 129,6 mmol, 1,0 ekv.) smo med mešanjem pod Ar atmosfero raztopili v 150 mL THF, dodali karbonildiimidazol (23,116 g, 142,6 mmol, 1,1 ekv) in trietilamin (26,363 g, 260,5 mmol, 2 ekv) ter mešali 1 h pri sobni temperaturi. Nato smo dodali N,O- dimetilhidroksilamonijev klorid (13,976 g, 142,6 mmol, 1,1 ekv.) ter mešali čez noč.
20
Reakcijski zmesi smo uparili topilo, zaostanku dodali 200 mL etil acetata in 200 mL vode in ločili faze. Organsko fazo smo sprali z 1 M HCl(aq) in nato še z 1 M NaOH(aq), jo sušili nad Na2SO4, uparili topilo ter tako izolirali surovi produkt (2).
4.1.3 Sinteza terc-butil 3-formilpiperidin-1-karboksilata (3)
Amid (2) (34,440 g, 126,5 mmol, 1 ekv.) smo raztopili v THF (100 mL) na ledeni kopeli (0 °C) pod Ar(g) atmosfero in med mešanjem v manjših porcijah dodali raztopino LiAlH4
(2,4 M raztopina v THF, 40 mL, 0,75 ekv.). Po dodatku celotne količine reducenta smo suspenzijo 1 h mešali pri 0 °C. Reakcijsko ustavili z dodatkom citronske kisline (10
%(aq), w/w), oborino filtrirali s presesavanjem, matičnico pa nato uparili in izolirali oljnat produkt (3).
4.1.4 Sinteza trifenilfosfonijeve soli (4)
V bučko smo zatehtali trifenilfosfin (21,747 g, 82,9 mmol, 1 ekv.), ga raztopili v MeCN (70–80 mL), dodali 1-(bromometil)-2-fluorobenzen (10 mL, 82,9 mmol, 1 ekv.) ter mešali na oljni kopeli (90 °C) čez noč. Izpadli produkt (4) smo filtrirali s presesavanjem, sprali s petroletrom ter čez noč sušili pri 50–60 °C.
21
4.1.5 Wittigova reakcija: sinteza (E/Z)-terc-butil 3-(2-fluorostiril)piperidin-1- karboksilata (5)
Trifenilfosfonijevo sol (4) (11,655 g, 25,8 mmol, 1,1 ekv.) smo natehtali v 100 mL bučko, jo raztopili v 100 mL brezvodnega THF in zagotovili Ar(g) atmosfero. Med mešanjem smo dodali bazo kalijev terc-butoksid (3,152 g, 28,1 mmol, 1,2 ekv.), po 30 min pa še terc-butil 3-formilpiperidin-1-karboksilat (3) (5,0 g, 23,4 mmol, 1 ekv.) in mešali 24 h pri sobni temperaturi. Nato smo uparili topilo in izvedli ekstrakcijo s 100 mL vode in 100 mL etil acetata. Produkt smo očistili s kolonsko kromatografijo, kot mobilno fazo smo uporabili etil acetat in heksan v razmerju 1:10 (V/V).
4.1.6 Odstranitev Boc zaščitne skupine
Izhodni (E/Z)-terc-butil 3-(3-fluorostiril)piperidin-1-karboksilat (5) (2,224 g, 7,28 mmol, 1 ekv.) smo raztopili v 100 mL EtOH, dodali 12 mL 37 % HCl (145,6 mmol, 20 ekv.), mešali pri sobni temperaturi 24 h ter uparili topilo.
22
4.1.7 Sinteza (E)-1-(2-(3-(2-fluorostiril)piperidin-1-il)etil)pirolidin-2-ona (7) in (Z)-1-(2-(3-(2-fluorostiril)piperidin-1-il)etil)pirolidin-2-ona (8)
Izhodni sekundarni amin (6) (1,745 g, 7,282 mmol, 1 ekv.) smo raztopili v 50 mL MeCN, dodali 1-(2-bromoetill)pirolidin-2-on (2,097 g, 10,923 mmol, 1,5 ekv.), K2CO3 (3,019 g, 21,846 mmol, 3 ekv.) in katalizator NaI (katalitična količina, cca 50 mg), mešali 24 h pri temperaturi 80 °Cter nato uparili topilo. Preostanku smo dodali 50 mL diklorometana in 50 mL vode, pretresli ter ločili faze. Organsko fazo smo nato uparili, produkt pa očistili s kolonsko kromatografijo, kjer smo kot mobilno fazo uporabili diklorometan : metanol
= 20:1 (V/V) ter izolirali čista cis (8) in trans (7) derivata.
4.2 Razvoj kromatografske metode za ločevanje cis/trans izomerov
Pri razvoju kromatografske metode smo pripravili slepi vzorec (topilo), vzorec s trans (7) izomerom, vzorec z cis (8) izomerom, vzorec z reduciranim derivatom A in vzorec, kjer smo zmešali cis in trans izomera v enakem razmerju. Elucijo spojin smo v prvem poskusu spremljali pri štirih valovnih dolžinah, in sicer 200, 220, 234 ter 254 nm, saj imata cis in trans derivata različne absorpcijske maksimume. Za doseganje največje občutljivosti smo resolucijo nato spremljali pri 200 in 220 nm.
23
4.2.1 Priprava vzorcev in kromatografski pogoji
V plastično epico smo natehtali med 1–1,5 mg spojine in jo raztopili v ustrezni količini MeCN, da smo dosegli koncentracijo 1 mg/mL. Dobljeno raztopino smo redčili do končne koncentracije 0,2 mg/mL z MeCN. Kot slepi vzorec smo uporabili 100 % MeCN.
Parametri ločbe za izhodiščno metodo so podani v Tabeli I.
Tabela I: Izhodiščna kromatografska metoda.
Kolona Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm; 2,1 × 50 mm
Pretok 0,3 mL/min
Temperatura kolone 40 °C Volumen injiciranja 5 µL
Mobilna faza 0,1 % TFA(aq) / MeCN
Gradient (za MeCN) 0–7 min, 10 % 90 % MeCN, 7–10 min, 90% MeCN
λ 200 nm
Retencijski čas tR (cis, 8) = 3,223 min tR (trans, 7) = 3,337 min Retencijski faktor k (cis, 8) = 7,59
k (trans, 7) = 7,89
24
Z namenom izboljšanja resolucije smo preskusili tudi več izokratskih metod, pri čemer smo delež MeCN variirali od 10–40 % v korakih po 5 %, preostanek je predstavljala 0,1
% TFA(aq). Zaradi neuspešnosti ločbe pod izokratskimi pogoji smo nadalje preizkusili, kako na resolucijo pri gradientni metodi vpliva sprememba organske komponente mobilne faze in sicer smo MeCN zamenjali z MeOH (Tabela II).
Tabela II: Kromatografska metoda, pri kateri smo MeCN zamenjali z MeOH.
Kolona Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm; 2,1 × 50 mm
Pretok 0,3 mL/min
Temperatura kolone 40 °C
Volumen iniciranja 5 µL
Mobilna faza 0,1 % TFA(aq) / MeOH
Gradient (za MeOH) 0–7 min, 10 % 90 % MeOH, 7–10 min, 90 % MeOH
Valovna dolžina 220 nm
Retencijski čas tR (cis, 8) = 4,560 min tR (trans, 7) = 4,670 min Retencijski faktor k (cis, 8) = 11,16
k (trans, 7) = 11,45
25
Glede na dobljene kromatograme smo se odločili, da zamenjamo C18 stacionarno fazo s fenilno stacionarno fazo in da bomo v nadaljevanju pri metodah uporabljali MeCN. Na fenil funkcionalizirani koloni smo podaljšali čas metode in zmanjšali volumen injiciranja (Tabela III).
Tabela III: Kromatografska metoda, pri kateri smo spremenili tip stacionarne faze in volumen inficiranja.
Kolona Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm; 2,1 × 100 mm
Pretok 0,3 mL/min
Temperatura kolone 40 °C Volumen iniiciranja 2 µL
Mobilna faza 0,1 % TFA(aq) / MeCN
Gradient (za MeCN) 0–14 min, 10 % MeCN 90 % MeCN 14–15 min, 90 % MeCN
Valovna dolžina 200 nm
Retencijski čas tR (cis, 8) = 6,123 min tR (trans, 7) = 6,370 min Retencijski faktor k (cis, 8) = 4,10
k (trans, 7) = 4,31
26
Kot je razvidno iz kromatograma, je sprememba stacionarne faze iz C18 na fenilno izboljšala resolucijo. Ker pa vrhova nista povsem ločena na bazni liniji smo se odločili, da kolono še podaljšamo (iz 10 cm na 15 cm), kar bo podaljšalo zadrževanje spojin na stacionarni fazi in izboljšalo resolucijo (Tabela IV).
Tabela IV: Kromatografska metoda, pri kateri smo povečali dolžino kolone.
Kolona Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm; 2,1 × 150 mm
Pretok 0,3 mL/min
Temperatura kolone 45 oC Volumen injiciranja 2 µL
Mobilna faza 0,1 % TFA(aq) / MeCN
Gradient (za MeCN) 0–14 min, 10 % MeCN 90 % MeCN 14–15 min, 90 % MeCN
Valovna dolžina 200 nm
Retencijski čas tR (cis, 8) = 7,023 min tR (trans, 7) = 7,250 min Retencijski faktor k (cis, 8) = 3,68
k (trans, 7) = 3,84
27
Poskusili smo tudi različne izokratske metode: 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 % ali 40 % MeCN v kombinaciji z 0,1 % TFA(aq), kjer se je najbolje izkazala izokratska metoda s 30 % MeCN (Tabela V). Po koncu izokratskega segmenta smo vključili še hiter gradient s povečanjem deleža organskega topila, s čimer smo s kolone sprali vse morebitne nečistote oziroma tudi analit, če se le-ta v času izokratskega segmenta ne bi eluiral.
Kromatogrami preostalih izokratskih metod zaradi preglednosti niso prikazani.
Tabela V: Izokratske metoda s 30 % MeCN.
Kolona Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm; 2,1 × 150 mm
Pretok 0,3 mL/min
Temperatura kolone 45 °C Volumen injiciranja 2 µL
Mobilna faza 0,1 % TFA(aq) / MeCN
Gradient (za MeCN) 0–12 min, 30 % MeCN
12–14 min, 30 % 90 % MeCN 14–15 min 90 % MeCN
Valovna dolžina 200 nm
Retencijski čas tR (cis, 8) = 4,257 min tR (trans, 7) = 4,817 min Retencijski faktor k (cis, 8) = 2,27
k (trans, 7) = 2,71
28
Obe spojini sta se po metodi opisani v Tabeli V eluirale že v manj kot 5 minutah, zato smo metodo skrajšali (Tabela VI), saj tako omogočimo izvedbo večih analiz na isto časovno obdobje.
Tabela VI: Optimizirana kromatografska metoda.
Kolona Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm; 2,1 × 150 mm
Pretok 0,3 mL/min
Temperatura kolone 45 oC Volumen iniciranja 1 µL
Mobilna faza 0,1 % TFA(aq) / MeCN
Gradient (za MeCN)
0–6 min, 30 % MeCN
6–8 min, 30 % 90 % MeCN 8–10 min, 90 % MeCN
Valovna dolžina 200 nm
Retencijski čas tR (cis, 8) = 4,257 min tR (trans, 7) = 4,807 min Retencijski faktor k (cis, 8) = 2,21
k (trans, 7) = 2,64
29
4.3 Računalniško napovedovanje fizikalno-kemijskih in učinkovinam podobnim lastnosti
Za računalniško napovedovanje fizikalno-kemijskih lastnosti spojin smo najprej uporabili programsko opremo ChemDraw Professional (PerkinElmer Informatics, Inc.), kjer smo narisali strukture serije 80 selektivnih BChE zaviralcev in iz programa izvozili SMILES kodo, ki smo jo v programski opremi SwissADME uporabili za prepoznavo strukture in napovedovanje fizikalno-kemijskih ter učinkovinam podobnih lastnosti spojin (Priloga, Tabeli S1 in S2). Programska oprema nam poda večji nabor fizikalno-kemijskih lastnosti spojin, podrobneje pa smo vrednotili naslednje parametre: LogP, prehajanje GIT in HEB, TPSA, topnost, vezava na proteine in ali spojine ustrezajo pravilom Lipinskega ter pravilom po Vebru.
Analizirali smo 80 zaviralcev BChE, osredotočili pa smo se na pet spojin (Tabeli VII in VIII). Prva je spojina zadetek A, sledijo spojina B, cis in trans analoga 7 in 8 ter za primerjavo donepezil, ki je uveljavljena učinkovina za zdravljenje AB.
30
Tabela VII: Izračunani parametri za spojini A in B ter donepezil (SwissADME).
Struktura
Fizikalno-kemijske lastnosti
Formula C19H27FN2O C19H27FN2O C24H29NO3
Molekulska masa 318,43 g/mol 318,43 g/mol 379,49 g/mol Število težkih
atomov 23 23 28
Število težkih aromatskih
atomov 6 6 12
Frakcija Csp3 0,63 0,63 0,46
Število rotirajočih
se vezi 6 6 6
Število
akceptorjev H- vezi
3 3 4
Število donorjev
H-vezi 0 0 0
Molekulska
refraktivnost 98,64 98,64 115,31
TPSA
(topological polar surface area)
23,55 Ų 23,55 Ų 38,77 Ų
Lipofilnost Log Po/w
(iLOGP) 3,67 3,61 3,92
Log Po/w
(XLOGP3) 2,98 2,98 4,28
Log Po/w
(WLOGP) 2,75 2,75 3,83
Log Po/w
(MLOGP) 3,32 3,32 3,06
31
Log Po/w
(SILICOS-IT) 4,00 4,00 4,91
Povprečje vseh
Log Po/w 3,34 3,33 4,00
Topnost v vodi
Log S (ESOL) 1,03e–01 mg/mL 1,03e–01 mg/mL 5,87e–03 mg/mL Log S (Ali) 2,32e–01 mg/mL 2,32e–01 mg/mL 5,92e–03 mg/mL Log S (SILICOS-
IT) 2,51e–03 mg/mL 2,51e–03 mg/mL 4,78e–05 mg/mL Farmakokinetični parametri
Gastrointestinalna
absorpcija Visoka Visoka Visoka
Prehajanje HEB Da Da Da
P-gp substrat Ne Ne Da
CYP1A2
inhibitor Ne Ne Ne
CYP2C19
inhibitor Ne Ne Ne
CYP2C9 inhibitor Ne Ne Ne
CYP2D6
inhibitor Da Da Da
CYP3A4
inhibitor Ne Ne Da
Log Kp (skin
permeation) –6,13 cm/s –6,13 cm/s –5,58 cm/s Druglikeness
Lipinski Da Da Da
Ghose Da Da Da
Veber Da Da Da
Egan Da Da Da
Muegge Da Da Da
Ocena biološke
uporabnosti 0,55 0,55 0,55
Farmacevtsko-kemijske lastnosti
PAINS 0 0 0
32
Brenk 0 0 0
Leadlikeness Da Da Ne, MM > 350, XLOGP3
> 3,5 Sintezna
dostopnost 2,78 2,87 3,62
Tabela VIII: Izračunani parametri za spojini 7 in 8 (SwissADME).
Struktura
Fizikalno-kemijske lastnosti
Formula C19H25FN2O C19H25FN2O
Molekulska masa 316,41 g/mol 316,41 g/mol
Število težkih atomov 23 23
Število težkih aromatskih
atomov 6 6
Frakcija Csp3 0,53 0,53
Število rotirajočih se vezi 5 5
Število akceptorjev H-vezi 3 3
Število donorjev H-vezi 0 0
Molekulska refraktivnost 98,96 98,96
TPSA (topological polar
surface area) 23,55 Ų 23,55 Ų
Lipofilnost
Log Po/w (iLOGP) 3,39 3,39
Log Po/w (XLOGP3) 2,81 2,81
Log Po/w (WLOGP) 2,72 2,72
Log Po/w (MLOGP) 3,23 3,23
Log Po/w (SILICOS-IT) 3,83 3,83
Povprečje vseh Log Po/w 3,20 3,20
Topnost v vodi
Log S (ESOL) 1.16e–01 mg/mL 1.16e–01 mg/mL
33
Log S (Ali) 3.46e–01 mg/mL 3.46e–01 mg/mL
Log S (SILICOS-IT) 1,30e–02 mg/mL 1,30e–02 mg/mL Farmakokinetični parametri
Gastrointestinalna
absorpcija Visoka Visoka
Prehajanje HEB Da Da
P-gp substrat Ne Ne
CYP1A2 inhibitor Ne Ne
CYP2C19 inhibitor Da Da
CYP2C9 inhibitor Ne Ne
CYP2D6 inhibitor Da Da
CYP3A4 inhibitor Ne Ne
Log Kp (skin permeation) –6,24 cm/s –6,24 cm/s
Druglikeness
Lipinski Da Da
Ghose Da Da
Veber Da Da
Egan Da Da
Muegge Da Da
Ocena biološke uporabnosti 0,55 0,55
Farmacevtsko-kemijske lastnosti
PAINS 0 0
Brenk 0 0
Leadlikeness Da Da
Sintezna dostopnost 3,29 3,29
34
4.4 Vrednotenje izomerizacije cis/trans derivatov
Vrednotenje izomerizacije cis/trans derivatov je potekalo pod dvema različnima pogojema – pod vplivom naravne (sončne) svetlobe ter pod vplivom Hg-žarnice ob različnih časovnih točkah z merjenjem protonskih NMR spektrov.
Vzorce spojin B, 7 in 8 za vrednotenje vpliva naravne svetlobe smo pripravili na dva načina. Prve smo pripravili v devteriranem MeOH (CD3OD) tako, da smo natehtali 3,5–
4 mg spojine in jo raztopili v CD3OD pri koncentraciji spojine 5 mg/mL. Za drugo paralelo smo natehtali 3,5–4 mg spojine in jo raztopili v kombinaciji topil DMSO-d6 in 20 mM Na2PO4, pH 7,4 (volumsko razmerje 1:1) pri koncentraciji 5 mg/mL. Za vrednotenje vpliva svetlobe Hg-žarnice smo izbrali le cis derivat 8 in ga pripravili po postopku opisanem zgoraj.
Raztopine spojin smo prenesli v NMR cevke (Norell® Standard Series™ 5 mm) in jih pustili stati na okenski polici izpostavljene naravni sončni svetlobi; izomerizacijo vzorcev pod vplivom umetne UV-svetlobe pa smo spremljali z obsevanjem z Hg-žarnico (Osram Germicidal, UV-C žarnica, 4W), vzorci so bili zaščiteni pred naravno dnevno svetlobo.
Ob različnih časovnih točkah smo posneli 1H-NMR spektre (število scanov: 32, nastavitve snemanje so bile standardne kot je določeno v pulznem programu zg30 na Bruker 400 MHz spektrometeru; DS: 2, SWH: 8012.82 Hz, AQ: 4.089 s).
35
5 REZULTATI IN RAZPRAVA
5.1 Sinteza
Sintezo cis/trans derivatov 7 in 8 smo izvedli po že razvitih sinteznih poteh. Najprej smo piperidin-3-karboksilno kislino na sekundarnem piperidinskem dušiku zaščitili s terc- butoksikarbonil (Boc) zaščitno skupino, ki je pogosta zaščitna skupina v farmacevtski kemiji. Boc zaščitna skupina je stabilna pri nevtralnih pogojih, katalitičnem hidrogeniranju in v prisotnosti nukleofilnih reagentov, občutljiva pa je na kisle pogoje [31], zato smo reakcijo izvajali ob prisotnosti baze. Sekundarni amin piperidin-3- karboksilne kisline kot nukleofil napade karbonilni ogljik Boc anhidrida, izstopita CO2 in terc-butanol [32]. V nadaljevanju smo N-Boc zaščiteno piperidin-3-karboksilno kislino pretvorili do Weinrebovega amida z N,O-dimetilhidroksilamonijevim kloridom in CDI kot sklopitvenim reagentom. Pri reakciji pride najprej do aktivacije karboksilne kisline s CDI, nato pa poteče nukleofilni napad sekundarnega amina na aktivirano karbonilno skupino, kot stranski produkt pa izstopi imidazol (Slika 6). Dobljeni terciarni amid smo nato z LiAlH4 selektivno reducirali do aldehida, ki smo ga v nadaljevanju uporabili v Wittigovi reakciji.
Slika 6: Reakcijski mehanizem aktivacije karboksilne kisline s CDI (Povzeto po [33]).
Trifenilfosfonijevo sol smo pripravili z reakcijo 1-(bromometil)-2-fluorobenzena s trifenilfosfinom, kjer poteče nukleofilna Sn2 substitucija. Trifenilfosfin deluje kot
36
nukleofil, ki s prostim elektronskim parom napade pozitivno polariziran ogljikov atom ob halogenu, v našem primeru bromu. Pri tem izstopi Br–, ki deluje kot protiion novo nastalemu fosfonijevem kationu. Pri Wittigovi reakciji smo tvorili C-C vez med Wittigovo soljo in aldehidom pod bazičnimi pogoji. Wittigovo sol smo raztopili v brezvodnem THF pod Ar atmosfero in dodali bazo kalijev terc-butoksid, ki odcepi kislel vodika, nastane fosforjev ilid (Wittigov reagent). Ob dodatku aldehida fosforjev ilid nukleofilno napade elektrofilni karbonilni atom, kot intermediat se tvori 4-členski obroč (oksafosfetan), ki se nato zaradi sterične napetosti odpre in nastane alken. Kot stranski produkt nastane trifenilfosfonijev oksid, ki smo ga odstranili s kolonsko kromatografijo [34].
Slika 7: Mehanizem Wittigove reakcije (Povzeto po [34]).
Po Wittigovi reakciji je sledila acidolitična odstranitev Boc zaščitne skupine, produkt – piperidinijeva sol s HCl pa je nato v reakciji nukleofilne substitucije reagirala z 1-(2- bromoetil)pirolidin-2-onom. Reakcija je potekla v prisotnosti K2CO3 kot baze, ki je nevtralizirala sproščeni HBrin NaI kot katalizatorja reakcije.
5.2 Razvoj kromatografske metode za ločevanje cis/trans izomerov selektivnih BChE zaviralcev
Eden izmed ciljev magistrske naloge je bil tudi razvoj kromatografske metode za ločevanje trans (7) in cis (8) izomereov 2-fluorofenilnih zaviralcev hBChE. Razvoj metode lahko predstavlja precejšen izziv, saj so si geometrijski izomeri po fizikalno- kemijskih lastnostih zelo podobni. Pri izbiri stacionarne faze smo izhajali iz v praksi pogosto uporabljanih reverznofaznih C18 in fenilnih kolon: Acquity UPLC HSS C18 1,8 µm (2,1 × 50 mm), Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm (2,1 × 100 mm) in Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm (2,1 × 150 mm). Pri razvoju in optimizaciji metode smo preizkušali
37
različne mobilne faze (MeCN/0,1% TFA(aq), MeOH/ 0,1% TFA); izokratske kot tudi gradiente metode, variirali pretoke mobilne faze (0,3–0,4 mL), temperature kolone (40–
45 °C), volumne injiciranja (1–5 µL) in čas analize z namenom da cis in trans izomera ločimo na bazni liniji.
Že pri osnovni gradientni metodi (Tabela I) sta se izomera ločevala, vendar ne na bazni liniji. Poskusili smo z menjavo organske komponente mobilne faze: MeCN smo nadomestili z MeOH, kar pa se ni izkazalo kot ugodno, saj sta se vrhova še zbližala – ločba je bila slabša. Ker smo podobne učinke pričakovali tudi z drugimi kolonami oziroma pod modificiranimi pogoji kromatografske ločbe z MeOH, smo kot organsko komponento mobilne faze v vseh nadaljnjih poskusih uporabili MeCN. Najprej smo preizkusili izokratske metode z različnimi deleži MeCN (15–40 % MeCN) v kombinaciji z 0,1 % TFA(aq). Izkazalo se je, da se vrhovi pri vseh teh metodah ne ločujejo dobro, zato smo kolono Acquity UPLC HSS C18 1,8µm (2,1 × 50 mm) zamenjali s kolono Acquity UPLC BEH Phenyl 1,7 µm (2,1 × 100 mm), ki ima fenilno stacionarno fazo. Pri tej spremembi smo opazili boljšo resolucijo izomerov, vendar še vedno ne na bazni liniji, zato smo se odločili, da kolono podaljšamo na 150 mm in s tem zagotovimo daljše zadrževanje vzorca na koloni. Pri optimizaciji smo bili pozorni tudi na vpliv volumna injiciranja na resolucijo. Pri volumnu injiciranja 5 µL smo opazili širše vrhove in posledično slabše ločevanje vrhov, kar je posledica lokalne prenasičenosti kolone z vzorcem (t.i. »overload«). Ta problem smo reševali z manjšanjem volumna injiciranja s 5 µL na 2 µL ter nato na 1 µL, pri čemer se je slednji izkazal za najustreznejšega. Ob spremembi stacionarne faze iz C18 na fenilno in manjšem volumnu injiciranja smo dobili ločene vrhove cis in trans izomerov. Za metodo z najboljšo resolucijo se je izkazala izokratska metoda s 30 % MeCN in 70 % 0,1 % TFA(aq). Pri večjih deležih MeCN se komponenti ne zadržujeta dovolj časa na koloni, zato se ne ločita in prideta skozi kolono pri zelo kratkih retencijskih časih in s retencijskimi faktorji manjšimi od 2. Pri manjših deležih MeCN sta se izomera iz kolone izločila šele na koncu metode, kjer smo imeli kratek gradient, da smo izprali spojine, če se te ne bi izločile v izokratski fazi. Sledila je še časovna optimizacija izokratske metodo s 30 % MeCN, saj sta se pri tej metodi analita izločila že v roku 6 minut, sama metoda pa je trajala 15 minut. Končna metoda je tako trajala 10 minut s 6 minutnim izokratskim delom in 4-minutnim gradientom, ki izpere
38
morebitne nečistote oziroma druge nepričakovane degradacijske produkte, ki bi lahko nastali pri preučevanju izomerizacije. Pri optimizaciji bi se lahko lotili tudi modifikacij vodne komponente mobilne faze (npr. uporaba drugih pufrov, fosfatni, acetatni, formiatni pufri), ki bi zaradi večje ionske moči in pufrne kapacitete v primerjavi z 0,1 % TFA lahko vodili v boljšo ločbo.
5.3 In silico analiza lastnosti zaviralcev hBChE
Za računalniško analizo z orodjem SwissADME smo izbrali pet zaviralcev hBChE:
spojina zadetek A, spojine B, 7 in 8 ter donepezil. Zaradi strukturne podobnosti se prve štiri spojine med sabo po fizikalno-kemijskih in ADMET lastnostih ne razlikujejo bistveno, ob primerjavi teh spojin z donepezilom pa lahko opazimo kar nekaj ključnih razlik. Prva razlika je molska masa, ki je pri donepezilu (379,49 g/mol) za približno 60 g/mol višja od spojin pripravljenih na UL FFA (spojini A in B 318,43 g/mol, 7 in 8 316,41 g/mol). Naslednjo razliko lahko opazimo pri površini polarnih atomov, ki je pri donepezilu (38,77 Å2) za 65 % večja od štirih preučevanih spojin (23,55 Å2). Donepezil je slabše topen v vodi (4,78e–05 mg/mL) in ima tudi višji LogP (4,00), kar nakazuje, da bi lahko topnost delovala kot omejujoč faktor pri dostavi učinkovine na mesto delovanja.
Preučevane spojine so boljše topne v vodi (spojini A in B 2,51e–03 mg/mL, 7 in 8 1,30e–
02 mg/mL) in imajo nižji LogP (spojina A 3,34; B 3,33; 7 in 8 3,20). Poleg tega se donepezil veže tudi z P-glikoprotein, spojine A, B, 7 in 8 po napovedi niso substrati za P- gp, kar bi lahko pomenilo, da imajo boljšo biološko razpoložljivost. Programska oprema za vse spojine napoveduje visoko absorpcijo v gastrointestinalnem traktu, prehajanje skozi HEB. Vse spojin ustrezajo pravilom po Lipinskem, Ghosetu, Vebru, Eganu in Mueggeju, ki opredeljujejo učinkovinam podobne lastnosti oziroma njihovo peroralno uporabnost. Vse te spojine pa so glede na napovedi zaviralci citokromov. Donepezil tako zavira CYP2D6 in CYP3A4, 7 in 8 zavirata izoobliko CYP2C19 in CYP2D6, A in B zavirata le izoobliko CYP2D6. Glede na podatke računalniške analize lahko sklepamo, da imajo naše spojine boljše izhodišče za in vivo učinkovitost v primerjavi z donepezilom.
