MAGISTRSKA NALOGA

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ANJA PAVLOVIČ

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

ANJA PAVLOVIČ

SINTEZA IN VREDNOTENJE NOVIH DERIVATOV 4,6- SUBSTITUIRANIH-1,3,5-TRIAZIN-2(1H)-ONOV KOT

KATALITIČNIH ZAVIRALCEV ČLOVEŠKE DNA TOPOIZOMERAZE IIα

SYNTHESIS AND EVALUATION OF NOVEL

DERIVATIVES OF 4,6-SUBSTITUED-1,3,5-TRIAZIN-2(1H)- ONES AS CATALYTIC INHIBITORS OF HUMAN DNA

TOPOISOMERASE IIα

Ljubljana, 2021

(3)

Magistrsko nalogo sem opravljala na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani pod mentorstvom doc. dr. Izidorja Sosiča, mag. farm. in somentorstvom doc. dr. Andreja Perdiha, mag. farm.

Spektroskopske meritve so bile opravljene na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani, načrtovanje spojin in testiranje encimske aktivnosti pa na Kemijskem inštitutu v Ljubljani.

Zahvala

Iskreno se zahvaljujem mentorjema doc. dr. Izidorju Sosiču, mag. farm. in doc. dr. Andreju Perdihu, mag. farm. za vse nasvete, spodbude, predano znanje in razpoloţljivost pri izdelavi magistrske naloge. Prav tako se zahvaljujem Aleši Bricelj in Andreju Štermanu za pomoč v laboratoriju ter Barbari Herlah in Kaji Bergant za vse podatke, izračune in slike.

Ob koncu bi se rada zahvalila svojim najbliţjim za podporo in spodbudne besede tekom študijskih let.

Izjava

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr.

Izidorja Sosiča, mag. farm. in somentorstvom doc. dr. Andreja Perdiha, mag. farm.

Anja Pavlovič

Predsednik komisije: prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm.

Članica komisije: asist. dr. Tijana Markovič, mag. farm.

(4)

I

VSEBINA

POVZETEK ... VII ABSTRACT ... IX SEZNAM OKRAJŠAV ... XI

1. UVOD ... 1

1.1. Rakava obolenja ... 1

1.1.1. Splošno o raku ... 1

1.1.2. Skupne značilnosti rakavih celic in njihova primerjava z normalnimi celicami .. 1

1.1.3. Statistika rakavih obolenj v Sloveniji... 3

1.1.4. Zdravljenje rakavih obolenj ... 3

1.2. Molekula DNA in njene topološke lastnosti ... 5

1.2.1. Različne oblike DNA vijačnice ... 5

1.2.2. Pakiranje DNA molekule v celično jedro ... 7

1.2.3. Topološki izzivi pri podvajanju in prepisovanju DNA ... 8

1.3. DNA topoizomeraze: molekulski motorji, ki uravnavajo in spreminjajo topologijo molekule DNA ... 9

1.3.1. Človeška DNA topo IIα ... 10

1.3.2. Katalitični cikel topoizomeraze tipa II ... 11

1.4. Zaviralci človeške DNA topoizomeraze II ... 12

1.5. Razvoj triazinonskih katalitičnih zaviralcev človeške DNA topo IIα ... 14

2. NAMEN DELA ... 16

3. MATERIALI IN METODE ... 18

3.1. Topila in reagenti ... 18

3.2. Aparature in laboratorijska oprema ... 18

3.3. Programska oprema ... 18

3.4. Analizne metode ... 18

3.4.1. Tankoplastna kromatografija (TLC) ... 18

(5)

II

3.4.2. Kolonska »flash« kromatografija ... 19

3.4.3. Jedrska magnetnoresonančna spektroskopija (NMR) ... 20

3.4.4. Masna spektrometrija (MS) ... 20

3.4.5. Ovrednotenje zaviralne aktivnosti z in vitro testom razpletanja kinetoplastne DNA, ki ga katalizira topo IIα... 20

3.4.6. Molekulsko sidranje aktivnih spojin v vezavno mesto za ATP na N-terminalni domeni človeške DNA topo IIα ... 22

4. EKSPERIMENTALNI DEL ... 23

4.1. Sintezna pot s 5-metilbenzo[b]tiofenom (I) kot izhodno spojino ... 23

4.1.1. Sinteza 6-(bromometil)benzo[b]tiofena (1) ... 23

4.1.2. Sinteza 2-(benzo[b]tiofen-5-ilmetil)izotiuronijevega bromida (2) ... 24

4.1.3. Sinteza 6-((benzo[b]tiofen-5-ilmetil)tio)-4-merkapto-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (3) ... 25

4.1.4. Sinteza 6-((benzo[b]tiofen-5-ilmetil)tio)-4-((3-fluoro-5- (trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (4), 6-((benzo[b]tiofen-5- ilmetil)tio)-4-((4-izopropilbenzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (5) in 6- ((benzo[b]tiofen-5-ilmetil)tio)-4-((4-(trifluorometil)benzil)tio))-1,3,5-triazin-2(1H)- ona (6) ... 26

4.2. Sintezna pot s 3-(bromometil)-5-klorobenzo[b]tiofenom (VIII) kot izhodno spojino ... 29

4.2.1. Sinteza 2-((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)izotiouronijevega bromida (7a) in 2-(3-(bromometil)-5-klorobenzo[b]tiofen-2-il)izotiouronijevega bromida (7b) ... 29

4.2.2. Sinteza 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)tio)-4-merkapto-1,3,5-triazin- 2(1H)-ona (8a) in 6-((3-bromometil)-5- klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-merkapto- 1,3,5-triazin-2(1H)-ona (8b) ... 31 4.2.3. Sinteza 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)tio)-4-((3-fluoro-5-

(trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (9a), 6-((3-(bromometil)-5- klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-((3-fluoro-5-(trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin- 2(1H)-ona (9b), 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)tio)-4-((4-izopropilbenzil)tio)- 1,3,5-triazin-2(1H)-ona (10a), 6-((3-(bromometil)-5-klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-

(6)

III

((4-izopropilbenzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (10b), 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3- il)metil)tio)-4-((4-(trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (11a) in 6-((3- (bromomethyl)-5-klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-((4-(trifluoromethil)benzil)tio)-1,3,5-

triazin-2(1H)-ona (11b) ... 33

4.3. Sintezna pot z 2-metilkinolinom (IX) kot izhodno spojino ... 37

4.3.1. Sinteza 2-(bromometil)kinolina (12) ... 37

4.3.2. Sinteza 2-(kinolin-2-ilmetil)izotiouronijevega bromida (13) ... 38

4.3.3. Sinteza 4-merkapto-6-((kinolin-2-ilmetil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (14) ... 39

4.3.4. Sinteza 4-((3-fluoro-5-(trifluorometil)benzil)tio)-6-((kinolin-2-ilmetil)tio)-1,3,5- triazin-2(1H)-ona (15) ... 40

5. REZULTATI IN RAZPRAVA ... 42

5.1. Komentar sinteznih postopkov ... 42

5.1.1. Izzivi na prvi stopnji sinteze – bromiranje aromatskih obročev ... 42

5.1.2. Izzivi na drugi stopnji sinteze - dodatek tiosečnine ... 43

5.1.3. Izzivi na tretji stopnji sinteze - dodatek etoksikarbonil izotiocianata ... 44

5.1.4. Izzivi na četrti stopnji sinteze - pripenjanje substituiranih benzilnih obročev ... 45

5.2. Preiskovanje zaviranja delovanja človeške DNA topo IIα ... 46

5.2.1. Validacija testa razpletanja kDNA z referenčno spojino etopozid ... 46

5.2.2. Rezultati in vrednotenje topo IIα zaviranja s sintetiziranimi spojinami ... 47

5.3. Predpostavljen model vezave spojin 4 ter 9a in 9b v vezavno mesto za ATP človeške DNA topo IIα ... 51

6. SKLEP ... 54

7. LITERATURA ... 56

(7)

IV

KAZALO SLIK

Slika 1: Razlike v strukturi med rakavimi in normalnimi celicami. Prirejeno po viru (4). ... 2

Slika 2: Različne oblike DNA vijačnice. Prirejeno po viru (15). ... 6

Slika 3: Pakiranje DNA v kromosome. Prirejeno po viru (19). ... 7

Slika 4: Topološke spremembe, ki jih katalizirajo encimi druţine topoizomeraz. Prirejeno po viru (21). ... 8

Slika 5: Razlika v delovanju med DNA topoizomerazo tipa I in topoizomerazo tipa II. Prirejeno po viru (21). ... 9

Slika 6: Kristalna struktura topoizomeraze tipa II iz glive Saccharomyces cerevisiae, kot dober pribliţek izgleda človeške različice encima (PDB: 4GFH). ... 10

Slika 7: Shema katalitičnega cikla topoizomeraze tipa II. ... 11

Slika 8: Topoizomerazni strupi registrirani v Sloveniji... 12

Slika 9: Izbrani predstavniki katalitičnih zaviralcev človeške DNA topo IIα. ... 13

Slika 10: Shema razvoja in optimizacije katalitičnih zaviralcev človeške topo IIα. ... 14

Slika 11: Izhodiščna spojina z nosilnim 1,3,5-triazin-2(1H)-onskim skeletom SAK-31. ... 16

Slika 12: Proces strukturno podprtega načrtovanja 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)- onov, ki jih bomo sintetizirali in ovrednotili v okviru magistrske naloge ter strukture tarčnih spojin. ... 17

Slika 13: TLC ploščice s frakcijami pod valovno dolţino 254nm. ... 19

Slika 14: Kolonska »flash« kromatografija. ... 19

Slika 15: Princip testa razpletanja kataliziran s topo IIα in tipičen razvoj elektroforeznega gela. Prirejeno po viru (47). ... 21

Slika 16: Reakcijska shema sinteze spojine 1. ... 23

Slika 19: Reakcijska shema sinteze spojin 4, 5 in 6. ... 26

Slika 20: Reakcijska shema sinteze spojin 7a in 7b. ... 29

(8)

V

Slika 21: Reakcijska shema sinteze spojin 8a in 8b. ... 31

Slika 22: Reakcijska shema sintez spojin 9a, 9b, 10a, 10b, 11a in 11b... 33

Slika 27: Primeri poskusov bromiranja različnih derivatov kinolina z nizkimi izkoristki. . 43

Slika 28: Sintezni postopek z dodatkom CuBr, terc-butil hidroperoksida (TBHP) in acetonitrila. ... 43

Slika 29: Nastanek zmesi dveh spojin, pri čemer en produkt nastane po reakciji z metilensko skupino, drug pa po reakciji na mestu 2 benzotiofenskega skeleta. ... 44

Slika 30: Poskus ločbe dveh spojin iz zmesi. ... 45

Slika 31: Nukleofilna substitucija z 1-(bromometil)-3-fluoro-5-(trifluorometil)benzenom. ... 45

Slika 32: Validacija testa razpletanja kDNA in določitev zaviralne aktivnosti referenčne spojine etopozida. ... 46

Slika 33: Dobljeni geli po izvedbi testa spodbujanja cepitve DNA za novo sintetizirane triazinone. ... 47

Slika 34: Izračunani vezavni modeli aktivnih triazinonov 4 (zgoraj), 9a (spodaj levo) ter 9b (spodaj desno) v vezavnem mestu za ATP na N-terminalni domeni človeške topo IIα (PDB:1ZXM). ... 52

(9)

VI

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Rak v Sloveniji. Prirejeno po viru (5). ... 3 Preglednica II: Posamezne spojine, ki smo jim ovrednotili sposobnost zaviranja topo IIα. 48 Preglednica III: Zmesi spojin, ki smo jim ovrednotili sposobnost zaviranja topo IIα s testom razpletanja. ... 50

(10)

VII

POVZETEK

Rak je bolezen, za katero je značilna nekontrolirana rast celic v različnih organih. Encim človeška DNA topoizomeraza IIα (topo IIα) ima ključno vlogo pri uspešnem podvajanju celic, saj omogoča topološke spremembe molekule DNA in je uveljavljena protirakava tarča. Z zaviranjem encima doseţemo ustavitev procesa celične delitve, ki ima za posledico celično smrt. Zaradi poznanih neţelenih stranskih učinkov klinično ţe uveljavljenih topoizomeraznih strupov, kot so kardiotoksičnost in nastanek sekundarnih oblik raka, poteka intenziven razvoj katalitičnih zaviralcev, ki bi encim zavrli preko alternativnih mehanizmov ter tako zmanjšali pojavnost stranskih učinkov.

V magistrski nalogi smo sintetizirali in ovrednotili nove predstavnike kemijskega razreda 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onov, ki delujejo kot katalitični zaviralci človeške DNA topo IIα in ciljajo na vezavno mesto za ATP ter tako razširili poznavanje odnosa med strukturo in delovanjem (SAR). Pri razvoju smo izhajali iz predhodno sintetiziranih spojin in na substitucijsko mesto 6 triazinonskega obroča uvedli nove biciklične substituente, ki smo jih izbrali z analizo dostopne serije sorodnih spojin farmacevtske druţbe Novartis.

S kondenzacijo strukturno novih bicikličnih derivatov amidin izotiouree in etoksikarbonil izotiocianata smo najprej pripravili monosubstituirane 1,3,5-triazin-2(1H)-onske obroče.

Na mesto 4 smo nato pripeli predhodno identificirane najugodnejše benzilne substituente.

V nekaterih primerih smo na koncu reakcije izolirali zmes dveh spojin, ki je še nismo uspeli ločiti, smo pa z različnimi spektroskopskimi in analitičnimi metodami kot so TLC, NMR in HRMS uspeli potrditi identiteto obeh nastalih triazinonov.

Zaviralno delovanje končnih spojin in dobljenih zmesi smo ovrednotili z in vitro testom razpletanja kinetoplastne DNA, ki ga katalizira topo IIα. Vse sintetizirane spojine in zmesi spojin so izkazovale boljšo zaviralno aktivnost kot referenca etopozid. Predvsem so visoko topo IIα zaviralno aktivnost izkazovale spojine z benzotiofenskim obročem na mestu 6, med katerimi so izstopale spojine z alkil bromidno skupino na mestu 2 benzotiofenskega obroča. Molekulsko sidranje v tarčno vezavno mesto za ATP na N-terminalni domeni topo IIα je pokazalo, da triazinonski obroč sintetiziranih spojin tvori vodikovo vez s karbonilnim kisikom aminokisline Asn120, ki je ključna za uspešno medmolekulsko prepoznavanje.

(11)

VIII

Naši rezultati so potrdili, da uvedba bicikličnih derivatov na mesto 6 v kemijski seriji 4,6- substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)onov vodi do spojin z dobro topo IIα zaviralno aktivnostjo. Derivati, ki vsebujejo benzotiofenski biciklični substituent na tem mestu, so še posebej dobro izhodišče za nadaljnji razvoj in optimizacijo tega kemijskega razreda katalitičnih zaviralcev kot potencialnih novih protirakavih učinkovin.

Ključne besede: rak, človeška DNA topoizomeraza IIα, katalitični zaviralci, 4,6- substituirani-1,3,5-triazin-2(1H)-oni

(12)

IX

ABSTRACT

Cancer is a common disease characterized by the uncontrolled growth of cells in various organs. The enzyme human DNA topoisomerase IIα (topo IIα) plays a key role in the successful cell replication, as it allows topological changes of the DNA molecule, and is an established anti-cancer target. By inhibiting this enzyme the process of cell division is halted, which results in cell death. Due to known negative side effects of clinically established topoisomerase poisons, such as cardiotoxicity and induction of secondary malignancies, there is an intense on-going development of catalytic inhibitors that would inhibit the enzyme via alternative mechanisms thus reducing the incidence of side effects.

In this master's thesis we successfully synthesized and evaluated new representatives of the chemical class of 4,6-substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones, which act as catalytic inhibitors of the human DNA topo IIα targeting its ATP binding site. This expanded the structure- activity relationships (SARs) of this chemical class. In the development, we started from previously synthesized compounds and introduced new bicyclic substituents at the substitution site 6 of the triazinone ring, which were selected by analyzing an accessible series of related compounds developed by pharmaceutical company Novartis.

Initially, the 1,3,5-triazin-2(1H)-one ring was prepared by a condensation of the corresponding structurally new bicyclic derivatives of the amidine isothiourea and ethoxycarbonyl isothiocyanate. Subsequently, we attached the preidentified most advantageous benzyl substituents to the scaffold position 4 to yield the final compounds. In some cases, at the end of the reaction, a mixture of two compounds was isolated. These mixtures have not yet been separated, but the identity of the two resulting triazinones was confirmed by various spectroscopic and analytical methods such as TLC, NMR and HRMS.

The inhibitory activity of the obtained compounds and mixtures was evaluated by the in vitro kinetoplast DNA decantentation assay catalyzed by topo IIα. All synthesized compounds and their mixtures exhibited improved inhibitory activity compared to the reference etoposide. Particularly favorable topo IIα inhibitory activity was demonstrated by compounds with incorporated benzothiophene ring present at the triazinone position 6, of which compounds with the alkyl bromide group at position 2 of the benzothiophene ring additionally stood out. Molecular docking into the targeted ATP binding site located on the

(13)

X

N-terminal domain of human topo IIα displayed that the triazinone ring of the newly obtained compounds forms a hydrogen bond with the carbonyl oxygen of the amino acid Asn120, which can be considered a crucial interaction for successful intermolecular recognition.

Our results confirmed that the introduction of new bicyclic substituents at the position 6 of the 1,3,5-triazin-2(1H)-one scaffold yields compounds with promising topo IIα inhibitory activity. Furthermore, derivatives with incorporated benzothiophene substituent at this position comprise a particularly good starting point for further development and optimization of this chemical class of catalytic inhibitors as potential anticancer drugs.

Key words: cancer, human DNA topoisomerase IIα, catalytic inhibitors, 4,6-substituted- 1,3,5-triazin-2(1H)-one

(14)

XI

SEZNAM OKRAJŠAV

AIBN azobisizobutironitril

AMP-PNP adenozin 5'-(β,γ-imido)trifosfat ATP adenozin trifosfat

BSA goveji serumski albumin CDCl3 devteriran kloroform DMSO-d6 devteriran dimetilsulfoksid DNA deoksiribonukleinska kislina

DTT ditiotreitol

EDTA etilendiamid tetraocetna kislina

HPLC tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti HRMS masna spektroskopija visoke ločljivosti HTS rešetanje visokih zmogljivosti

IC50 koncentracija zaviralca, ki zmanjša odziv za 50 %

J sklopitvena konstanta

kDNA kinetoplastna deoksiribonukleinska kislina

MF mobilna faza

NBS N-bromosukcinimid

NMR jedrska magnetna spektroskopija

PDB baza proteinskih struktur (Protein Data Bank) Rf retencijski faktor

SAR odnos med strukturo in delovanjem TBHP terc-butil hidroperoksid

TLC tankoplastna kromatografija topo IIα topoizomeraza IIα

UV ultravijolično

(15)

1

1. UVOD

1.1. Rakava obolenja

1.1.1. Splošno o raku

Rak je bolezen oziroma skupina bolezni, za katere je značilna nekontrolirana rast celic v različnih organih, brez fiziološke funkcije za ta organ (1). V zahodni civilizaciji je rak trenutno drugi najbolj pogost vzrok smrti, predvsem pri starejši populaciji. Njegov izvor najdemo v spremenjenem genomu. Na celični ravni to pomeni nebrzdano razmnoţevanje celic zaradi okvarjenega nadzora celične delitve in okvare odmiranja celic. Klinično se kaţe kot več različnih bolezni s številnimi lokalnimi in sistemskimi znamenji. Vsem pa sta skupna začetek – sprememba v genih somatskih celic in konec – smrt, v primeru, da bolezen ni zdravljena oz. da je zdravljenje neuspešno (2).

Proces nastanka rakavih celic je večstopenjski. Maligno transformirane celice lahko nastanejo pod vplivom karcinogenih dejavnikov, ki povzročajo mutacije v genih. Te mutacije omogočajo nadaljnjo celično delitev nastalih mutiranih celic, za normalne celice pa niso smrtne. Poznamo več vrst karcinogenih dejavnikov: fizikalne (UV sevanje, ionizirajoče sevanje), kemične (tobačni dim) in biološke (virusi). Na nastanek raka lahko vplivajo tudi drugi dejavniki, ki ne delujejo direktno na DNA molekulo, ampak spodbujajo celično delitev (npr. hormoni) (1).

1.1.2. Skupne značilnosti rakavih celic in njihova primerjava z normalnimi celicami Čeprav se rakava obolenja med seboj razlikujejo, sta raziskovalca Hanahah in Weinberg ugotovila, da je vsem rakavim celicam skupnih vsaj šest značilnosti (ang. Hallmarks of Cancer) pridobljenih med večstopenjskim razvojem raka (3).

Te značilnosti so:

- genetska nestabilnost: kopičijo se mutacije, ki vplivajo na podvajanje dednega materiala in popravljanje napak, prihaja do sprememb na kromosomih;

- nekontrolirana proliferacija: zaradi mutacij se zmanjša odvisnost proliferacije od rastnih dejavnikov, v nekaterih primerih pa celice rastne faktorje proizvajajo same in s tem pospešujejo lastne delitve;

(16)

2

- induciranje angiogeneze: celice spodbujajo rast krvnih ţil, ki dovajajo kisik in hranila za nemoteno rast, hkrati pa odvajajo ogljikov dioksid in metabolite;

- invazivnost celic in metastaziranje: celice izločajo proteolitične encime, ki povzročijo prekinitev celičnih stikov, neodvisne so tudi od kontaktne inhibicije, zato nasploh laţje migrirajo;

- celična nesmrtnost: doseţejo jo z mehanizmom reaktivacije telomeraz – aktivna telomeraza omogoči stabilizacijo koncev kromosomov, povzroči neomejeno proliferacijo in posledično razvoj celične nesmrtnosti;

- upiranje apoptozi: proces programirane celične smrti zaradi mutacij v ključnih delih celičnega cikla ne poteče (3).

Skupna imenovalca vseh značilnosti sta nestabilnost genoma, ki ustvarja genetsko raznolikost, ter vnetje, ki spodbuja nastanek tumorja. Z napredkom raziskav raka v zadnjem desetletju se je seznam neoplastičnih značilnosti razširil še za prilagojeno pridobivanje celične energije in izogibanje imunskemu sistemu (3).

Poleg razlik v bioloških sposobnostih lahko rakave celice in normalne celice tkiva, iz katerega izvirajo, ločimo tudi na podlagi značilnih sprememb celične strukture. Na spodnji Sliki 1 prikazujemo nekaj najbolj opaznih lastnosti v strukturi celic, ki jih lahko določimo pod mikroskopom (4).

Slika 1: Razlike v strukturi med rakavimi in normalnimi celicami. Prirejeno po viru (4).

(17)

3 1.1.3. Statistika rakavih obolenj v Sloveniji

Po podatkih Registra raka Republike Slovenije (RRRS) je leta 2016 za rakom v Sloveniji na novo zbolelo 15.072 ljudi, umrlo pa jih je 6.247. Vseh še ţivečih bolnikov, ki jim je bila v ţivljenju postavljena diagnoza rak, je bilo 107.093. V zadnjem desetletju se število na novo obolelih vsako leto poveča za pribliţno 2 %. Med moškimi je najpogostejši rak prostate (20,8 %), pri ţenskah pa je najpogostejši rak koţe (21 %). Pogosto zbolevamo še za rakom pljuč, dojk ter debelega črevesa in danke, ki predstavljajo več kot 60 % vseh na novo ugotovljenih rakov. V zadnjem času spodbudne novice predstavlja dejstvo, da več kot polovica obolelih ţivi dlje kot pet let po diagnozi (5).

Leta 2016 je v Sloveniji za rakom na novo zbolelo 8.117 moških in 6.955 ţensk. Zaradi raka je tega leta umrlo 3.522 moških in 2.725 ţensk. Med vsemi še ţivečimi ljudmi je značilno več ţensk (58.452) v primerjavi z moškimi (48.641). Na podlagi vsakoletnih rezultatov lahko sklepamo, da za rakom pogosteje zbolevajo moški ter za posledicami bolezni tudi pogosteje umirajo, saj so njihovi raki bolj usodni (5).

Preglednica I: Rak v Sloveniji. Prirejeno po viru (5).

MOŠKI ŢENSKE SKUPAJ

INCIDENCA 8117 6955 15072

UMRLI 3522 2725 6247

PREVALENCA 48641 58452 107093

1.1.4. Zdravljenje rakavih obolenj

Štirje najpogostejši načini zdravljenja raka so kirurška odstranitev, obsevanje (radioterapija), zdravljenje z zdravili in imunsko zdravljenje. Pogosto kombiniramo po več pristopov skupaj, da povečamo verjetnost ozdravitve. Za katero zdravljenje se bomo odločili, je odvisno predvsem od vrste tumorja, njegove velikosti in razširjenosti ter tudi od tega, kakšno je trenutno splošno zdravstveno stanje bolnika (6).

Najpogosteje uporabljana metoda je kirurgija, saj operiramo kar 60 % vseh bolnikov z rakom. Pri tem s kirurškim posegom odstranimo nastalo tumorsko tkivo. Uporaba te

(18)

4

metode zdravljenja je smiselna le, če se tumor še ni razširil na preostale organe in pričel metastazirati (6).

Sledi zdravljenje z zdravili, kjer so v ospredju predvsem citostatiki (kemoterapija), hormonska zdravila in v novejšem času tako imenovano tarčno zdravljenje. Citostatiki imajo več načinov delovanja. Delujejo na rast, razvoj in razmnoţevanje celice. Celični cikel, ki ima več faz, lahko ustavljajo na več ravneh. Vpletajo se bodisi v podvajanje DNA bodisi v podvajanje celice, ko je genski material v njej ţe razdeljen. V skupino kemoterapevtikov uvrščamo tudi molekule, s katerimi se bomo ukvarjali v okviru magistrske naloge. Pri hormonskem zdravljenju terapija temelji na zniţanju nivoja moških ali ţenskih spolnih hormonov v telesu oziroma na zaviranju hormonskih receptorjev z zdravilnimi učinkovinami. Pri nekaterih oblikah rakov je hormonska terapija izjemnega pomena in je nepogrešljiva. Taki rakavi obolenji sta npr. rak dojk in rak prostate. Kot eno od moţnih oblik zdravljenja lahko to terapijo učinkovito uporabimo še pri raku materničnega vratu in raku jajčnikov. Tarčna zdravila, ki so osredotočena na selektivno delovanje na rakavo celico, so pogosto učinkovitejša ter izkazujejo manj neţelenih učinkov. V praksi so se na tem področju najbolj uveljavila monoklonska protitelesa in zaviralci tirozin kinaz (6,7,8).

Z biološkim zdravljenjem oz. imunoterapijo spodbujamo telesu lastne mehanizme, ki preprečujejo razrast rakavih celic. Pri radioterapiji zdravimo z ionizirajočimi ţarki. Bistvo aplikacije teh ţarkov je okvara genetskega zapisa celice, s čimer se ji onemogoči delitev.

Pri tem izkoriščamo dejstvo, da so rakave celice bolj občutljive od zdravih, z natančnim načrtovanjem obsevanja skušamo ţarke nadalje umeriti zgolj na tumorsko obolenje (6,7).

Na splošno je onkologija v zadnjih letih zabeleţila izjemen napredek pri zdravljenju ter pri učinkoviti diagnostiki rakavih obolenj. Pri tem velja poudariti, da je rakavo obolenje najbolje odkriti v čim zgodnejših stadijih, ko je bolezen praviloma omejena na posamezen organ in se še ni preselila v bezgavke ali oddaljene organe in tkiva (tj. metastaziranje). Ena najboljših metod za zgodnje odkrivanje predrakavih in rakavih sprememb so presejalni programi. Gre za preventivne zdravstvene programe, ki jih financirajo drţave v okviru svojih zdravstvenih sistemov. Njihov osnovni namen je v navidezno zdravi populaciji pravočasno odkriti tiste, ki ţe imajo začetno stopnjo rakavega obolenja, še preden se pojavijo simptomi in značilni znaki obolenja (9). V Sloveniji imamo trenutno tri presejalne programe, s katerimi odkrivamo raka debelega črevesa in danke (program SVIT), raka dojk

(19)

5

(program DORA) ter raka materničnega vratu (program ZORA). Vsem je skupno to, da so v program osebno povabljeni vsi posamezniki določene starostne skupine, ki imajo stalno prebivališče v Sloveniji. Z odkrivanjem raka v zgodnejših stadijih ţelimo zmanjšati umrljivost, zniţati število na novo obolelih ljudi in izboljšati kakovost bolnikovega ţivljenja (9).

Čeprav je rak v mnogih primerih ţe postal kronična bolezen in se je preţivetje pri številnih oblikah raka signifikantno podaljšalo, so odzivi bolnikov in njihovih sorodnikov ob prvi diagnozi zelo pretresljivi. Izkušnje o soočanju z boleznijo, minljivostjo in strahovi je v svojem avtobiografskem romanu Belo se pere na devetdeset doţiveto opisala Bronja Ţakelj. Za svoje delo je leta 2019 prejela tudi prestiţno literarno nagrado kresnik (10).

Za laţje razumevanje občutka strahu in nemoči, s katerim se bolniki soočajo ob postavitvi diagnoze raka, je zelo ilustrativen sledeči odlomek iz te knjige: »Ampak »pozdravila se boš« je zame laţ. Je slepilo, uteha, ki mi ne pomaga. In ne pomaga tudi »nič ne skrbi«, ker mene še vedno skrbi in strah je tudi še vedno tu. Otipljiv je in na trenutke je vame trdo zaţrt. Osamljena sem z njim, ker ga ne delijo z menoj, ker mi ga ne pustijo, ker mi ga ne priznajo. Ţelim si, da bi rekli: »Seveda, da te je strah. Tudi nas je strah.« Ţelim si, da bi mi dali pravico do strahu, da bi ga sprejeli, si ga vsi skupaj razdelili, ga ukrotili, obvladali in udomačili. Ker jaz vem, da le to pomaga.« (11).

1.2. Molekula DNA in njene topološke lastnosti

Deoksiribonukleinska kislina (DNA) je nosilka genetske informacije v vseh ţivih organizmih. DNA je nerazvejan polimer, katerega osnovna enota je nukleotid. Ima obliko dvojne vijačnice, pri čemer se dve molekuli DNA ovijeta ena okrog druge in tvorita stabilno tridimenzionalno obliko. Razpletanje teh dveh verig, ki je pomembno pri praktično vseh genskih procesih, je prav zaradi tega izjemno teţko (12,13).

1.2.1. Različne oblike DNA vijačnice

Poznamo tri najpomembnejše oblike DNA – A, B in Z (Slika 2). Omenimo še obliko H- DNA, kjer gre v osnovi za trojno vijačnico. Najpogosteje prisotna oblika je B-DNA, ki jo sestavljata dve desnosučni verigi, med seboj povezani z vodikovimi vezmi. Vodikove vezi, ki v pare povezujejo purinske in pirimidinske baze, so pravokotne na os molekule, kar vijačnici omogoča konstantno širino. A-DNA je širša desnosučna vijačnica s krajšo

(20)

6

razdaljo med osnovnimi pari (bolj sploščene oblike). Z-DNA oblika pa je prisotna kot levosučna dvojna vijačnica. Konformacije DNA molekule v organizmu se nekoliko razlikujejo od opisanih idealnih struktur. Ne moremo namreč z gotovostjo trditi, katero obliko bodo prevzela posamezna zaporedja nukleotidov (12,13,14).

V kateri konformaciji se bo DNA nahajala, je praviloma odvisno od sledečih treh pogojev.

Prvi pogoj je ionsko oz. hidracijsko okolje, ki olajša pretvorbo med različnimi vijačnimi oblikami. V primeru dehidracije je B-DNA podvrţena reverzibilni konformacijski spremembi v A-DNA, v okolju z veliko vsebnostjo soli pa se B-DNA pretvori v Z-DNA.

Drugi pogoj, ki pomembno vpliva na zvijanje, je DNK zaporedje. A-DNA se pogosteje izrazi pri purinskih in pirimidinskih ostankih v anti konformaciji, medtem ko se Z-DNA izrazi v primeru, ko purin in pirimidin izmenično zavzemata anti in syn konformacijo.

Tretji pogoj je prisotnost beljakovin, ki se lahko veţejo na DNA v eni vijačni konformaciji in jo silijo v drugo konformacijo, na primer iz B-DNA v A-ali Z-oblike. V ţivih celicah je večina DNA v mešanici konformacij A in B-DNA, nekaj manjših predelov je sposobno tvoriti tudi Z-DNA (12,14).

Slika 2: Različne oblike DNA vijačnice. Prirejeno po viru (15).

Linearna oblika DNA molekule se lahko prosto zvija in spreminja število navojev. Kroţna oblika DNA pa ima omejeno število navojev. Kroţne molekule dvojne vijačnice DNA so značilne predvsem za bakterije, mitohondrije, kloroplaste in številne viruse (16). Če so kroţne molekule še dodatno zvite, temu pravimo superzvitje (ang. supercoiling). To ima ključno vlogo pri shranjevanju DNA v celično jedro in pri razvijanju dvojne verige pri

(21)

7

prepisovanju in podvajanju DNA (13). Pojav opišemo z enačbo Lk = Tw + Wr. Lk oz.

linking number predstavlja število zavojev, ki jih prva veriga naredi okoli druge. Tw oz.

twist je število vseh obratov, ki jih ena od verig DNA naredi okoli osi dvojne vijačnice, Wr oz. writhing number pa opisuje število zavojev, ki jih dvojna vijačnica naredi okoli spiralne osi. Iz zgornje teorije sklepamo, da je Lk moţno spremeniti zgolj na dva načina: s spremembo zasuka dvojnega heliksa ali s kovalentno prekinitvijo polinukleotidne verige. S tem natančno definiramo vlogo topoizomeraze (13,16,17).

1.2.2. Pakiranje DNA molekule v celično jedro

Človeški dedni zapis vsebuje pribliţno tri milijarde baznih parov DNA, zapakiranih v 23 kromosomov. Večina celic v telesu (razen moških in ţenskih spolnih celic) je diploidnih, skupno to pomeni okoli šest milijard baznih parov DNA na celico. Ker je vsak osnovni par dolg pribliţno 0,34 nanometra, vsaka diploidna celica vsebuje okrog 2 metra DNA materiala. Do najbolj dramatične kondenzacije DNA pride med celično delitvijo v metafazi, ko se kromatin nadalje zapakira v visoko organizirane strukture kromosome (Slika 3) (18).

V evkariontskih celicah ima kromatin dve nalogi: spraviti dva metra dolgo DNA v nekaj mikrometrov veliko celično jedro in omogočiti dodatno kontrolo pri procesu izraţanja genov s tem, da različne dele DNA različno gosto pakira. Na ta način lahko celica natančno nadzoruje prepisovanje, podvajanje, popravljanje in rekombinacijo DNA (18).

Slika 3: Pakiranje DNA v kromosome. Prirejeno po viru (19).

(22)

8

Osnovna enota kromatina je nukleosom, ki vsebuje osem histonskih proteinov in pribliţno 146 baznih parov DNA. Nukleosom sestavlja proteinsko jedro iz osmih histonov: H2A, H2B, H3 in H4 (po dve kopiji vsakega), okrog katerega je 1,65 × ovita DNA. Dodatek enega H1 proteina zavije še dodatnih 20 baznih parov, kar ima za posledico dva polna obrata okoli oktamera, in tvori strukturo, imenovano kromatosom. DNA, ki poteka med številčnimi nukleosomi in jih med seboj povezuje, imenujemo povezovalna DNA. Vsak kromosom je torej dolga veriga nukleosomov, ki pri opazovanju z elektronskim mikroskopom daje videz nanizanih kroglic. Nukleosomi se nato zloţijo in tvorijo 30 nanometrov veliko kromatinsko vlakno, ki v nadaljnjem zvijanju tvori 300 nanometrov dolge zanke. 300 nm vlakna se stisnejo in zloţijo, da nastanejo 250 nm široka vlakna, ki so tesno navita v kromatido kromosoma (18,20).

1.2.3. Topološki izzivi pri podvajanju in prepisovanju DNA

Iz opisanega kompleksnega mehanizma pakiranja DNA v celici je razvidno, da se mora dvojno zvita veriga DNA znotraj kromosoma odviti in ponovno zviti, da lahko steče podvajanje in prepisovanje molekule DNA ter s tem prenos dedne informacije. Če se to ne zgodi, se v molekuli DNA pričenja nabirati sterična napetost, ki lahko vodi do ustavitve teh procesov (21,22).

Slika 4: Topološke spremembe, ki jih katalizirajo encimi druţine topoizomeraz. Prirejeno po viru (21).

(23)

9

Da ti procesi potekajo nemoteno, je narava razvila obseţno skupino encimov, imenovanih topoizomeraze. Tako jih imenujemo, ker lahko spreminjajo topološko stanje molekule DNA oz. število njenih zavojev (L), ne pa tudi njene kovalentne strukture. Nekaj topoloških sprememb, ki jih DNA topoizomeraze lahko katalizirajo, prikazujemo na Sliki 4 (17,21,23).

1.3. DNA topoizomeraze: molekulski motorji, ki uravnavajo in spreminjajo topologijo molekule DNA

Vsem DNA topoizomerazam je skupno, da imajo v aktivnem mestu katalitične tirozinske (Tyr) aminokislinske preostanke, ki sproţijo cepitev DNA z nukleofilnim napadom hidroksilne skupine Tyr na fosfat nukleinske kisline. Reakcija transesterifikacije povzroči nastanek kovalentne vezi med fosforjem in hidroksilnim kisikom tirozina. Na drugem koncu se prekine fosfodiesterska vez v DNA, ostane pa hidroksilna skupina. Nato sledi obratna reakcija - religacija, ki ponovno poveţe razcepljeno verigo DNA, hkrati pa tudi regenerira aktivno mesto DNA topoizomeraze. S tem procesom se spremenijo le topološke lastnosti dvojne vijačnice, sama kemijska struktura molekule pa ostane nespremenjena (17).

Ločimo 2 tipa DNA topoizomeraz (Slika 5):

1. Topoizomeraze tipa I, ki delujejo tako, da začasno prekinejo eno verigo v DNA.

2. Topoizomeraze tipa II, ki delujejo tako, da začasno prekinejo obe verigi DNA.

Pri tem za svoje delovanje porabljajo energijo energijskih molekul ATP (17).

Slika 5: Razlika v delovanju med DNA topoizomerazo tipa I in topoizomerazo tipa II. Prirejeno po viru (21).

(24)

10 1.3.1. Človeška DNA topo IIα

V nalogi se bomo osredotočili na encim druţine topoizomeraz, natančneje na človeško DNA topoizomerazo tipa II. Le-to najdemo v dveh izooblikah: α in β, ki sta verjetna produkta podvajanja genov. Gen, ki kodira obliko alfa, je lokaliziran v kromosomu 17, beta gen pa v kromosomu 3. Poleg ločenega genskega zapisa se izoobliki razlikujeta tudi v aktivnosti. Človeška DNA topo IIα je potrebna za celično replikacijo, medtem ko je izooblika β vpletena v regulacijo transkripcije in diferenciacijo tkiva. Predvsem izooblika α, kateri se bomo posvetili, je pomembna tarča protirakavih učinkovin (24,25,26).

Slika 6: Kristalna struktura topoizomeraze tipa II iz glive Saccharomyces cerevisiae, kot dober pribliţek izgleda človeške različice encima (PDB: 4GFH).

Pri uspešnem racionalnem načrtovanju zaviralcev pomembno vlogo igrajo dosegljivi strukturni podatki o izbrani tarči. Kristalna struktura celotne topoizomeraze tipa II je trenutno poznana le za kvasovko Saccharomyces cerevisiae (PDB: 4GFH), ki je prikazana na Sliki 6 (27). Encim je homodimer, ki ga naprej delimo na tri dele, le-ti pa vsebujejo več funkcionalnih enot. Za nas bo zanimiv njegov N-končni del (ATPazna domena), kjer se nahaja vezavno mesto za ATP. Za to domeno je bila rešena tudi kristalna struktura človeške topo IIα v kompleksu z nehidrolizirajočim derivatov AMP-PNP (PDB: 1ZX), ki smo jo uporabili v tej nalogi (28). Omenimo še, da so med raziskavami te naloge poleti

(25)

11

2021 raziskovalci iz Francije s pomočjo krio-elektronske mikroskopije določili tudi prvi 3D strukturi celotne človeške DNA topo IIα (PDB: 6ZY7 in 6ZY8) (29).

1.3.2. Katalitični cikel topoizomeraze tipa II

Topoizomeraze tipa II delujejo preko kompleksnega katalitičnega cikla, ki ga shematsko predstavljamo na Sliki 7. Cikel se prične z reverzibilno vezavo encima topoizomeraza II na G segment/verigo molekule DNA. Segment G se veţe v DNA vrata, pri čemer morajo biti N vrata odprta. V naslednjem koraku se dve energijski molekuli ATP veţeta v vezavni mesti za ATP, ki se nahajata na N-terminalni domeni. Njuna vezava povzroči dimerizacijo encima ter s tem zaprtje N-vrat in ujetje drugega segmenta DNA - Verige T. Sledi cepitev verige G s pomočjo dveh tirozinskih ostankov, ki leţita štiri bazne pare narazen. Pri tem sodelujejo tudi dvovalentni Mg²⁺ ioni kot potrebni kofaktor pri reakciji (25,30,31).

Slika 7: Shema katalitičnega cikla topoizomeraze tipa II.

Rezultat cepitve sta dva 5-fosfotirozinska intermediata, ki predstavljata kratkotrajni intermediat, ko je G-segment DNA kovalentno vezan na encim. Skozi nastali prelom DNA se nato prenese segment T, pri čemer hidrolizira ena molekula ATP. Hidroliza sproţi religacijo verige G ter odprtje C-vrat, segment T lahko sedaj končno zapusti encimski kompleks. Hidroliza druge ATP molekule sistem vrne v začetni korak cikla, vrata N se ponovno odprejo, dve molekuli ADP pa se sprostita z encima (25,30,31).

(26)

12

1.4. Zaviralci človeške DNA topoizomeraze II

Zaviralce človeške DNA topoizomeraze II lahko glede na mehanizem njihovega delovanja razdelimo v dve skupini. Prvo skupino sestavljajo topoizomerazni strupi (32). Te spojine delujejo tako, da stabilizirajo kratkoţivi kovalentni kompleks med DNA (G-segment) in topoizomerazo II, kar ima za posledico zvišano raven poškodb DNA v celicah - dvojnih prelomov DNA. Povečane ravni kovalentnega kompleksa DNA – topoizomeraza II namreč delujejo kot celični toksin (oz. strup), saj z blokiranjem replikacije in transkripcije DNA sčasoma spodbujajo apoptozo celic (25,33).

V Sloveniji imamo registriranih pet topoizomeraznih strupov, ki se v kliniki uporabljajo kot protirakave učinkovine: etopozid, doksorubicin, epirubicin, idarubicin ter mitoksantron (Slika 8). Od teh je etopozid edini neinterkalirajoči strup, ki deluje tako, da se veţe na sam encim in s tem ovira njegovo delovanje. Ostali spadajo med interkalatorje, kar pomeni, da delujejo po mehanizmu vrivanja med bazne pare molekul DNA in na ta način oteţujejo religacijo (25).

Slika 8: Topoizomerazni strupi registrirani v Sloveniji.

(27)

13

Kljub kliničnemu uspehu topoizomeraznih strupov obstajajo nekatere omejitve, povezane z njihovo uporabo pri zdravljenju raka. Najpomembnejše med njimi so razvoj odpornosti na te zdravilne učinkovine (34) in pogosti resni neţeleni stranski učinki, kot sta razvoj sekundarnih malignih bolezni (35) in kardiotoksičnost (36). Prav manifestacija sekundarnih malignih bolezni je neposredna posledica mehanizma delovanja topoizomeraznih strupov. Povišana koncentracija prelomljenih DNA verig, ki v celicah povzroči apoptotične učinke strupov, hkrati vpliva tudi na specifične translokacije kromosomov, ki sproţijo razvoj sekundarnih levkemij (25).

Druga skupina zdravil, ki zavira delovanje topoizomeraze II, vključuje katalitične zaviralce (37). V tem primeru do citotoksičnih učinkov pride z zaviranjem katalitične funkcije topoizomeraze II, ne da bi pri tem nastala poškodba DNA molekule. Ta raznolika skupina topoizomeraznih zaviralcev, nekaj predstavnikov prikazuje Slika 9, lahko deluje prek različnih mehanizmov, kot so preprečevanje vezave na DNA, tekmovanje za vezavo na vezavno mesto za ATP, preprečevanje cepitve DNA molekule ter zaviranje hidrolize ATP.

Med njihove predstavnike štejemo: aklarubicin, merbaron, deksrazoksan ter gambojsko kislino (25,33). V okviru naših raziskav se bomo ukvarjali z razvojem katalitičnih zaviralcev, ki bi preprečili vezavo molekule ATP.

Slika 9: Izbrani predstavniki katalitičnih zaviralcev človeške DNA topo IIα.

(28)

14

1.5. Razvoj triazinonskih katalitičnih zaviralcev človeške DNA topo IIα

Zaradi opisanih neţelenih učinkov topoizomeraznih strupov se razvoj protirakavih učinkovin, ki delujejo na človeško DNA topo IIα, zadnja leta usmerja k odkrivanju novih katalitičnih zaviralcev (37). Tudi raziskovalci na Kemijskem Inštitutu v Ljubljani so se v sodelovanju s Fakulteto za farmacijo odločili razvijati nove katalitične zaviralce topo IIα, ki interagirajo z vezavnim mestom za ATP. Pri načrtovanju so izhajali iz 9H-purinskega razreda katalitičnih zaviralcev, ki so ga razvijali v farmacevtski druţbi Novartis (38,39).

Na podlagi teh spojin so s pomočjo rekonstrukcije njihovega modela vezave v vezavno mesto za ATP na N-terminalni domeni človeške topo IIα rešetali obseţno knjiţnico komercialno dostopnih spojin z uporabo farmakofornih modelov. Kot potencialne zaviralce so s pomočjo in vitro HTS testa relaksacijske encimske aktivnosti topo IIα identificirali razred 4,6-substituiranih-1,3,5-triazinov, ki niso izkazovali najboljših fizikalno-kemijskih lastnosti, so pa bili selektivno citotoksični za človeško jetrno rakavo celično linijo HepG2 v primerjavi z nerakavo celično linijo Huvec (40).

Slika 10: Shema razvoja in optimizacije katalitičnih zaviralcev človeške topo IIα.

(29)

15

Po optimizaciji začetnega 3D farmakofornega modela in ponovnemu rešetanju spojin z usmerjeno kemijsko knjiţnico so kot boljše potencialne zaviralce opredelili 4,6- substituirane-1,3,5-triazin-2(1H)-one. Najobetavnejše spojine so eksperimentalno ovrednotili ter nato raziskovali odnos med strukturo in delovanjem (SAR) substituentov na mestu 4 glede na 1,3,5-triazin-2(1H)-onski obroč. Kot najboljše so se izkazale spojine, ki so na tem mestu vsebovale fluoro- ali kloro- substituiran tiobenzilni fragment. Ker so sintetizirane spojine sicer izkazovale dobro zaviralno aktivnost ter tudi citotoksičnost na rakavi celični liniji HepG2, njihova topnost pa še ni bila optimalna, so raziskovalci z optimizacijo nadaljevali (41,42).

Tokrat so se osredotočili na spremembo obroča, pripetega na mesto 6 1,3,5-triazin-2(1H)- onskega obroča, kjer sta se v predhodni seriji nahajala p-klorobenzil oziroma m- klorobenzil. Z uvedbo heterocikličnega kinolinskega substituenta, ki je ţe v Novartisovih predkliničnih študijah izkazoval dobre lastnosti (38) in se je v izračunanih vezalnih modelih nahajal na istem mestu kot izhodni benzilni substituenti triazinona na mestu 6, so sintetizirali dva biciklično substituirana analoga. Eden izmed njih je spojina SAK-31, predstavljena na Sliki 10. Poleg ohranjene topo IIα zaviralne aktivnosti so takšne optimizirane spojine izkazovale tudi izboljšane fizikalno-kemijske lastnosti (predvsem topnost) v primerjavi s preostalimi doslej sintetiziranimi spojinami te kemijske serije. V nadaljevanju so s testom spodbujanja cepitve potrdili, da novi biciklično substituirani spojini ne delujeta kot topoizomerazna strupa, ampak kot katalitična zaviralca encima topo IIα. S testom aktivnosti razpletanja pa so tudi vizualno dokazali, da spojini uspešno zavirata encim tudi pri bistveno niţjih koncentracijah kot referenčni zaviralec topo IIα - zdravilna učinkovina etopozid (43).

(30)

16

2. NAMEN DELA

Namen magistrske naloge je sintetizirati in ovrednotiti nove predstavnike 4,6- substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onov kot katalitičnih zaviralcev človeške DNA topo IIα za razširitev SAR tega obetavnega kemijskega razreda. Kot izhodiščno spojino bomo vzeli ţe delno optimiziran derivat, spojino SAK-31, ki je v do sedaj opravljenih testiranjih izkazoval dobre zaviralne lastnosti ter izboljšane fizikalno-kemijske lastnosti (Slika 11) (43).

Slika 11: Izhodiščna spojina z nosilnim 1,3,5-triazin-2(1H)-onskim skeletom SAK-31.

Na podlagi raziskav, ki so bile ţe opravljene v okviru tega projekta, smo se odločili, da bomo pri sintezi novih 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onov na mestu 4 obdrţali tri R² benzilne substituente, ki so se glede na predhodne raziskave izkazali za najučinkovitejše (Slika 12) (42). Na obročno mesto 6 bomo z ustrezno vodeno sintezo uvedli nove R¹ biciklične substituente, ki naj bi na osnovi računalniško podprtega načrtovanja, izvedenega na Kemijskem Inštitutu, še dodatno izboljšali zaviralno aktivnost ter ohranili ugodne fizikalno-kemijske lastnosti molekul tega kemijskega razreda (Slika 12). Pri načrtovanju bomo uporabili biciklične fragmente, ki so se v Novartisovi patentni prijavi ţe izkazali za ugodne za zaviranje topo IIα (39).

V prvem delu sinteze novih spojin bomo 1,3,5-triazin-2(1H)-onski obroč pripravili s kondenzacijo strukturno novih derivatov amidin izotiouree in etoksikarbonil izotiocianata.

Na obročno mesto 4 bomo nato pripeli ustrezne benzilne substituente, na Sliki 12 označene z R².

Strukture načrtovanih sintetiziranih spojin bomo eksperimentalno potrdili s pomočjo spektroskopskih metod in jim določili zaviralno delovanje z uporabo in vitro testa razpletanja kinetoplastne DNA, ki ga katalizira človeška DNA topo IIα.

(31)

17

Slika 12: Proces strukturno podprtega načrtovanja 4,6-substituiranih-1,3,5-triazin-2(1H)-onov, ki jih bomo sintetizirali in ovrednotili v okviru magistrske naloge ter strukture tarčnih spojin.

Spojine, ki bodo v testiranju pokazale najboljše zaviralne lastnosti, bomo dodatno ovrednotili z metodo molekulskega sidranja ter izračunali njihove vezavne modele v tarčnem vezavnem mestu za ATP človeške topo IIα. Na ta način bomo pridobili strukturne podatke o njihovi moţni vezavi ter vplivu posameznih substituentov na zaviralno aktivnost. Na podlagi razširjenega odnosa med strukturo in delovanjem (SAR), ki ga bomo izluščili iz pridobljenih rezultatov, bomo lahko ocenili, katere interakcije so pomembne pri vezavi triazinonskega razreda v aktivno mesto človeške topo IIα. Vse pridobljene informacije raziskav bodo uporabne pri nadaljnjem razvoju triazinonskih zaviralcev.

(32)

18

3. MATERIALI IN METODE 3.1. Topila in reagenti

Za sintezo načrtovanih spojin smo uporabili kemikalije proizvajalcev Acros, Apollo Scientific, Carlo Erba, Fluka, Fluorochem, Maybridge, Merck, Sigma-Aldrich in TCI.

3.2. Aparature in laboratorijska oprema

- Analizna tehtnica: Mettler Toledo PM400, Švica - Precizna tehtnica: Mettler Toledo AG245, Švica - Pipete: Brand, Schott

- Magnetno mešalo: IKA RCT basic, Nemčija - Rotavapor: Büchi 461 Water Bath, Švica - UV svetilka: Camag, Švica

3.3. Programska oprema

Za risanje reakcijskih shem, kemijskih struktur, računanje molekulskih mas produktov in poimenovanje spojin (po IUPAC-u) smo uporabili ChemDraw Professional 18.0 proizvajalca PerkinElmer. Tridimenzionalne strukture spojin smo generirali s programom Chem 3D proizvajalca CambridgeSoft (44).

S programom GOLD proizvajalca Cambridge Crystalographic Data Centre (CCDC) (45) smo aktivne molekule sidrali v ATP-vezavno mesto ATPazne domene človeške topo IIα.

Sledila je primerjava sidranih konformacij in vizualizacija, ki smo jo izvedli s programom LigandScout proizvajalca Inte:Ligand (46).

3.4. Analizne metode

3.4.1. Tankoplastna kromatografija (TLC)

Z metodo tankoplastne kromatografije (ang.: Thin layer chromatography, TLC) smo spremljali potek reakcij, iskali primerne mobilne faze za gravitacijsko »flash« kolonsko kromatografijo in določevali frakcije, v katerih se je po kolonski kromatografiji nahajala spojina, ki smo jo ţeleli izolirati. Uporabljali smo TLC ploščice proizvajalca Merck (Silica gel 60 F254, 20 cm × 20 cm). Spojine smo detektirali bodisi s pomočjo UV svetlobe

(33)

19

valovnih dolţin 254 nm in 366 nm ali pa smo TLC ploščico orosili z ustreznim orositvenim reagentom (Slika 13).

Slika 13: TLC ploščice s frakcijami pod valovno dolţino 254nm.

Kot mobilno fazo smo uporabljali zmes različnih organskih topil (etilacetat (EtOAc), heksan (hex), diklorometan (CH2Cl2), metanol (MeOH)) v ustreznih razmerjih.

3.4.2. Kolonska »flash« kromatografija

Kolonsko kromatografijo smo uporabili za čiščenje vmesnih spojin in končnih produktov.

Izvajali smo jo v steklenih kolonah, katerih velikosti smo določili glede na maso vzorca.

Za stacionarno fazo smo uporabili Silica Gel 60 proizvajalca Merck z velikostjo delcev 0,04–0,063 mm. Za mobilne faze smo uporabili mešanico organskih topil v ustreznih razmerjih (podrobno so opisane pri posameznih sinteznih postopkih).

Slika 14: Kolonska »flash« kromatografija.

(34)

20

3.4.3. Jedrska magnetnoresonančna spektroskopija (NMR)

Z NMR smo potrjevali identitete spojin in preverjali njihovo čistoto. ¹H spektre spojin smo snemali na napravi Bruker AVANCE III 400 pri 400 MHz. Kot topili za raztapljanje vzorcev smo uporabili devteriran kloroform (CDCl3) ali devteriran dimetilsulfoksid (DMSO-d6). Kemijske premike (δ) smo podali glede na signal topila v enotah parts per million (ppm). Sklopitvene konstante (J) so podane v hertzih (Hz), vrhove pa smo označili z naslednjimi oznakami: singlet (s), široki singlet (br s), multiplet (m), dublet (d), triplet (t), kvartet (q), septet (sept), dublet dubleta (dd), dublet dubleta dubleta (ddd). Spektre smo obdelali s programom MestReNova proizvajalca Mestrelab Research S.L.

3.4.4. Masna spektrometrija (MS)

Masne spektre smo posneli na masnem spektrometru Q Exactive Plus proizvajalca Thermo Scientific s tehniko ionizacije z razprševanjem v električnem polju (ang.: Electrospray ionisation, ESI).

3.4.5. Ovrednotenje zaviralne aktivnosti z in vitro testom razpletanja kinetoplastne DNA, ki ga katalizira topo IIα

Test aktivnosti razpletanja človeške DNA topo IIα (angl. human DNA topo IIα mediated decantenation assay) smo uporabili za določevanje zaviralne aktivnosti testiranih spojin.

Človeška DNA topoizomeraza II je namreč encim, ki je sposoben razplesti dvovijačno molekulo DNA in tako poenostaviti njeno topologijo. Z izvajanjem testa smo ugotavljali, ali testirane spojine zavrejo delovanje encima topo IIα in s tem preprečijo razpletanje zvite DNA (47).

Za substrat smo uporabili kinetoplasto DNA (kDNA), ki je sestavljena iz mreţe številnih malih kroţnih DNA in nekaj velikih kroţnih DNA. Če je encim prisoten, mreţo kDNA lahko razplete in iz nje sprosti male kroţne molekule DNA. Po dodatku etidijevega bromida sproščene kroţne DNA na elektroforeznem gelu lahko zaznamo kot liso, ki je potovala navzdol. Če pa je bila topo IIα zavrta zaradi zaviralne aktivnosti testiranih spojin, je velik kDNA substrat ostal na začetku elektroforeznega gela (Slika 15) (47,48).

(35)

21

Slika 15: Princip testa razpletanja kataliziran s topo IIα in tipičen razvoj elektroforeznega gela. Prirejeno po viru (47).

Test razpletanja kDNA za sintetizirane triazinone so po uveljavljenem protokolu pri štirih koncentracijah spojine (7,8 μM, 15,6 μM, 31,25 μM in 125 μM) in v dveh ponovitvah izvedli v visokotehnološkem podjetju Inspiralis (Velika Britanija):

1 U encima (človeška DNA topo IIα) so inkubirali za 30 min z 200 ng kDNA v 30 µL reakcijski zmesi pri 37 °C. Zmes je vsebovala: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 0.1 mg/mL govejega serumskega albumina (BSA), 1 mM ATP. Spojine so bile dodane v reakcijsko zmes pred dodatkom encima.

Nato so reakcijo ustavili z dodatkom 30 µL kloroform/izoamil alkohola (26:1) in 30 µL STOP barvila, sestavljenega iz 40 % sukroze (w/v), 100 mM Tris-HCl (Ph 7,5), 10 mM EDTA in 0,5 μg/mL bromofenol modro. Na koncu so zmes nanesli na 1 % agarozni gel ter gel razvijali 2 uri pri napetosti 90 V. Lise, ki so nastale na gelu, so vizualizirali z uporabo barvila etidijev bromid (48).

Vse spojine, ki smo jih testirali, so imele čistoto, določeno s HPLC, višjo od 95 %.

(36)

22

3.4.6. Molekulsko sidranje aktivnih spojin v vezavno mesto za ATP na N-terminalni domeni človeške DNA topo IIα

Molekulsko sidranje izbranih aktivnih triazinonov 4

ter

9a in 9b smo izvedli na Kemijskem Inštitutu skupaj z mlado raziskovalko Barbaro Herlah. Uporabili smo razvit in preizkušen in silico računski protokol, ki ga povzemamo v nadaljevanju (42).

Začetne 2D strukture izbranih spojin smo najprej narisali s programom ChemDraw Professional 20.1.1.125, njihove 3D konformacije pa generirali s programom Chem3D 20.1.1.125 (PerkinElmer) (44). Začetne konformacije 3D struktur smo z MMFF94 poljem sil geometrijsko optimizirali v istem programu do prevzetih pogojev konvergence.

Molekulsko sidranje smo izvedli s programom za sidranje GOLD (45) proizvajalca Cambridge Crystalographic Data Centre (CCDC) in z njim izračunali moţne vezane konformacije teh spojin v vezavnem mestu za ATP, ki se nahaja na N-terminalni domeni človeške DNA topo IIα. Uporabili smo en protomer te domene, ki je vseboval ţe vezan ligand - nehidrolizirajoči derivat ATP, AMP-PNP (PDB: 1ZXM). Ta kristalna struktura je javno dostopna v proteinski banki PDB (28).

Vezavno mesto človeške topo IIα za sidranje smo definirali kot sfero okoli referenčnega liganda AMP-PNP (koordinate središča krogle: x = 35,7113; y = 0,452; z = 40,0306), katere premer je bil 10 Å. V aktivnem mestu smo upoštevali dve molekuli vode, W924 ter W931, saj naj bi po dosedanjih modelih imeli pomembno vlogo pri vezavi molekule ATP v vezavno mesto tako, da vzpostavijo dodatne vodikove vezi med ligandom ter aminokislinami vezavnega mesta (42).

Kot iskalni algoritem smo uporabili genetski algoritem (GA) s prevzetimi nastavitvami ter cenilno funkcijo GoldScore za ocenitev energijske ugodnosti posamezne izračunane sidrane konformacije liganda. Vsako molekulo smo sidrali desetkrat v definirano aktivno mesto in rezultate sidranj vizualizirali in analizirali s programom LigandScout (46).

(37)

23

4. EKSPERIMENTALNI DEL

4.1. Sintezna pot s 5-metilbenzo[b]tiofenom (I) kot izhodno spojino

4.1.1. Sinteza 6-(bromometil)benzo[b]tiofena (1)

Slika 16: Reakcijska shema sinteze spojine 1.

V 50 mL bučko smo natehtali spojino I (148 mg, 1 mmol, 1 ekv.), dodali NBS (spojina II) (169 mg, 0,95 mmol, 0,95 ekv.) in obe spojini raztopili v CCl4 (7,5 mL) ter dodali konico spatule dibenzoil peroksida. Reakcijsko zmes smo 2 h segrevali na refluksu (80 ºC) in nato še 16 h pri sobni temperaturi. Trdni del smo odfiltrirali, filtrat pa odparili pri zniţanem tlaku. Identiteto produkta 1 smo potrdili z ¹H NMR.

Lastnosti spojine 1:

Masa produkta 983 mg

Molska masa 227,12 g/mol

Izkoristek 70 %

Izgled Oranţno-rjava amorfna snov

Rf (MF: EtOAc/Hex = 1/9) 0,44

1H NMR (400 MHz, CDCl3) 4,65 (s, 2H, CH2), 7,32 (dd, J1 = 4,4 Hz, J2

= 0,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,38 (dd, J1 = 8,4 Hz, J2 = 1,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,48 (d, J = 5,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,83-7,87 (m, 2H, Ar-H)

(38)

24

4.1.2. Sinteza 2-(benzo[b]tiofen-5-ilmetil)izotiuronijevega bromida (2)

Raztopini spojine 1 (983 mg, 4,33 mmol, 1 ekv.) v brezvodnem CH3CN (25 mL) smo dodali tiosečnino (428 mg, 5,63 mmol, 1,3 ekv.). Reakcijsko zmes smo mešali najprej pri 80 ºC, da se je spojina III raztopila, nato pa še 2 h pri sobni temperaturi. Dobljeno oborino smo filtrirali z odsesavanjem in spirali z brezvodnim CH3CN, ki je bil predhodno ohlajen na ledeni kopeli. Identiteto produkta 2 smo potrdili z ¹H NMR.

Izkoristek 60 %

Izgled Rumeno-bela amorfna snov

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1) 0

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 4,61 (s, 2H, CH2), 7,41 (dd, J1 = 8,4 Hz, J2

= 1,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,47 (dd, J1 = 5,3 Hz, J2 = 0,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,83 (d, J = 5,3, 1H, Ar-H), 7,92 (d, J = 1,2 Hz, 1H, Ar-H), 8,03 (d, J = 8,4, 1H, Ar-H) 8,97 (br s, 2H, NH⁺), 9,18 (br s, 2H, NH2)

(39)

25

4.1.3. Sinteza 6-((benzo[b]tiofen-5-ilmetil)tio)-4-merkapto-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (3)

V 100 mL bučki smo v H2O (15 mL) suspendirali spojino 2 (789 mg, 2,6 mmol, 1 ekv.).

Nastali suspenziji smo dodali toluen (15 mL) in na magnetnem mešalu močno mešali 5 min. Nato smo po kapljicah izmenično začeli dodajati 2 M NaOH (10 mL) in spojino IV (477 mg, 3,64 mmol, 1,4 ekv.), raztopljeno v toluenu (10 mL). Po 15 min smo dodali še 10 mL 2 M NaOH in mešali 24 h pri sobni temperaturi. Reakcijski zmesi smo nato dodali 2 M NaOH (60 mL) in toluen (60 mL) ter fazi ločili z lijem ločnikom. Zdruţene alkalne faze smo nakisali z 2 M H2SO4 do pH = 1. Nastalo oborino smo filtrirali z odsesavanjem in spirali s heksanom. Končni produkt smo dodatno očistili s kolonsko kromatografijo, pri čemer smo za mobilno fazo uporabili CH2Cl2/MeOH = 15/1. Identiteto produkta 3 smo potrdili z ¹H NMR.

Izkoristek 32 %

Izgled Rumena amorfna snov

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1) 0,26

= 1,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,43 (dd, J1 = 5,2 Hz, J2 = 0,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,78 (d, J = 5,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,92 (d, J = 1,1 Hz, 1H, Ar-H),

(40)

26

7,96 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 12,38 (br s, 1H), 13,60 (br s, 1H)

4.1.4. Sinteza 6-((benzo[b]tiofen-5-ilmetil)tio)-4-((3-fluoro-5- (trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (4), 6-((benzo[b]tiofen-5-ilmetil)tio)- 4-((4-izopropilbenzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (5) in 6-((benzo[b]tiofen-5- ilmetil)tio)-4-((4-(trifluorometil)benzil)tio))-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (6)

Slika 19: Reakcijska shema sinteze spojin 4, 5 in 6.

(41)

27 Splošni postopek za pripravo spojin 4-6:

V raztopino spojine 3 (264 mg, 0,86 mmol, 1 ekv.) v brezvodnem EtOH (5 mL) in 2 M NaOH (3 mL) smo dodali reagent V ali VI ali VII (1,1 ekv.). Reakcijsko zmes smo mešali 2 h pri sobni temperaturi in ji nato dodali H2O (6 mL). Nato smo zmes nakisali z 2 M H2SO4 do tvorbe oborine, ki smo jo filtrirali z odsesavanjem. Identiteto produktov 4, 5, in 6 smo potrdili z ¹H NMR.

Masa produkta 90 mg

Izkoristek 78 %

Izgled Bela amorfna snov

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1) 0,70

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 4,45 (s, 2H, CH2), 4,49 (s, 2H, CH2), 7.38 (dd, J1 = 8,3 Hz, J2 = 1,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,41 (dd, J1 = 5,5 Hz, J2 = 0,5 Hz, 1H, Ar- H), 7,54-7,63 (m, 2H, Ar-H), 7,68 (s, 1H, Ar-H), 7,77 (d, J = 5,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,89 (d, J = 1,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,95 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 13,05 (bs, 1H, NH)

(42)

28 Lastnosti spojine 5:

Masa produkta 70 mg

Izkoristek 55 %

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1) 0,62

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1,16 (d, J = 6.9 Hz, 6H, Ar-CH(CH3)2), 2,84 (sept, J = 6.9 Hz, 1H, Ar-CH(CH3)2), 4,33 (s, 2H, CH2), 4,51 (s, 2H, CH2), 7,14- 7,19 (m, 2H, Ar-H), 7,27-7,31 (m, 2H, Ar- H), 7.40 (dd, J1 = 8,3 Hz, J2 = 1,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,42 (dd, J1 = 5,5 Hz, J2 = 0,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,78 (d, J = 5,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,90 (d, J = 1,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,95 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar-H), 12,99 (br s, 1H, NH) Lastnosti spojine 6:

Izkoristek 76 %

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1) 0,68

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 4,43 (s, 2H, CH2), 4,47 (s, 2H, CH2), 7.38 (dd, J1 = 8,3 Hz, J2 = 1,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,41 (dd, J1 = 5,4 Hz, J2 = 0,5 Hz, 1H, Ar- H), 7,58-7,62 (m, 2H, Ar-H), 7,63-7,68 (m, 2H, Ar-H), 7,77 (d, J = 5,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,88 (d, J = 1,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 12,97 (br s, 1H, NH)

(43)

29

4.2. Sintezna pot s 3-(bromometil)-5-klorobenzo[b]tiofenom (VIII) kot izhodno spojino

4.2.1. Sinteza 2-((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)izotiouronijevega bromida (7a) in 2- (3-(bromometil)-5-klorobenzo[b]tiofen-2-il)izotiouronijevega bromida (7b)

Slika 20: Reakcijska shema sinteze spojin 7a in 7b.

V 100 mL bučko smo natehtali spojino VIII (2,39 g, 9,12 mmol, 1 ekv.) in tiosečnino (903 mg, 11,86 mmol, 1,3 ekv.) ter vse skupaj raztopili v brezvodnem CH3CN (50 mL).

Reakcijsko zmes smo 1 h mešali pri 80 °C in nato še 2 h pri sobni temperaturi. Dobljeno oborino smo filtrirali z odsesavanjem ter spirali z ledeno hladnim CH3CN. Identiteto produktov 7a in 7b smo potrdili z ¹H NMR ter HRMS. Skupna masa obeh produktov (bela amorfna zmes) je bila 1387 mg, pri čemer sta bili spojini v molarnem razmerju 7a/7b = 0,27/1.

(44)

30 Lastnosti spojine 7a:

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH, 9/1) 0

= 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,92 (s, 1H, Ar-H), 8,08 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 8,16 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 9,20 (br s, 4H, NH in NH3+)

HRMS (ESI) za C10H10CIN2S2+ (M)⁺ za 7a Izračunana: 256,9968 Dobljena: 256,9962

Lastnosti spojine 7b:

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH, 9/1) 0

= 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 8,07 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 8,19 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 9,20 (br s, 4H, NH in NH3+)

HRMS (ESI) za C10H9BrCIN2S2+ (M)⁺ za

7b Izračunana: 334,9074

Dobljena: 334,9078

(45)

31

4.2.2. Sinteza 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)tio)-4-merkapto-1,3,5-triazin- 2(1H)-ona (8a) in 6-((3-bromometil)-5- klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-merkapto-1,3,5- triazin-2(1H)-ona (8b)

Slika 21: Reakcijska shema sinteze spojin 8a in 8b.

V 250 mL bučki smo v H2O (20 mL) suspendirali spojino 7, dodali toluen (20 mL) in močno mešali 5 min. Nato smo po kapljicah izmenično začeli dodajati 2 M NaOH (15 mL) in spojino IV (755 mg, 5,75 mmol, 1,4 ekv.), raztopljeno v toluenu (15 mL). Po 15 min smo dodali še 15 mL 2 M NaOH in mešali 24 h pri sobni temperaturi.

Naslednji dan smo reakcijski zmesi dodali 2 M NaOH (60 mL) in toluen (60 mL) ter fazi ločili z lijem ločnikom. Zdruţene alkalne faze smo nakisali z 2 M H2SO4 do nastanka oborine. Oborino smo filtrirali z odsesavanjem in spirali s heksanom. Produkta 8a in 8b smo poskušali ločiti s kolonsko kromatografijo, pri čemer smo za mobilno fazo uporabili CH2Cl2/MeOH = 15/1 in EtOAc/MeOH = 200/1. Kljub poskusom z različnima mobilnima fazama smo uspeli iz zmesi dobiti le zelo majhno količino 8b (nekaj miligramov).

Identiteto produktov 8a in 8b smo potrdili z ¹H NMR in HRMS. Skupna masa obeh produktov (rumena amorfna zmes) je bila 329 mg, pri čemer sta bili spojini v molarnem razmerju 8a/8b = 0,35/1.

(46)

32 Lastnosti spojine 8a:

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1 in EtOAc/MeOH = 200/1)

0,16 in 0,36

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) za 8a 4,60 (s, 2H, CH2), 7,43 (dd, J1 = 8,6 Hz, J2

= 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,87 (s, 1H, Ar-H), 8,05 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 8,06 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 11,93 (br s, 1H), 13,61 (br s, 1H)

HRMS (ESI) za C12H7CIN3OS3 (M–H)^– za

8a Izračunana: 339,9445

Dobljena: 339,9446

Lastnosti spojine 8b:

Rf (MF: CH2Cl2/MeOH = 9/1 in EtOAc/MeOH = 200/1)

0,16 in 0,36

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) za 8b 4,61 (s, 2H, CH2), 7,46 (dd, J1 = 8,6 Hz, J2

= 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 8,03 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 12,04 (br s, 1H), 13,60 (br s, 1H)

HRMS (ESI) za C12H6CIN3OBrS3 (M–H)^–

za 8b Izračunana: 417,8550

Dobljena: 417,8554

(47)

33

4.2.3. Sinteza 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)tio)-4-((3-fluoro-5- (trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (9a), 6-((3-(bromometil)-5- klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-((3-fluoro-5-(trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin- 2(1H)-ona (9b), 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3-il)metil)tio)-4-((4-izopropilbenzil)tio)- 1,3,5-triazin-2(1H)-ona (10a), 6-((3-(bromometil)-5-klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-((4- izopropilbenzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (10b), 6-(((5-klorobenzo[b]tiofen-3- il)metil)tio)-4-((4-(trifluorometil)benzil)tio)-1,3,5-triazin-2(1H)-ona (11a) in 6-((3- (bromomethyl)-5-klorobenzo[b]tiofen-2-il)tio)-4-((4-(trifluoromethil)benzil)tio)-1,3,5- triazin-2(1H)-ona (11b)

Slika 22: Reakcijska shema sintez spojin 9a, 9b, 10a, 10b, 11a in 11b.