UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
Karin SCHARA
MIKROVEZIKULACIJA KRVNIH CELIC PRI SLADKORNIH BOLNIKIH S CHARCOTOVO
NEVROARTROPATIJO
DOKTORSKA DISERTACIJA
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
Karin SCHARA
MIKROVEZIKULACIJA KRVNIH CELIC PRI SLADKORNIH BOLNIKIH S CHARCOTOVO NEVROARTROPATIJO
DOKTORSKA DISERTACIJA
MICROVESICULATION OF BLOOD CELLS IN PATIENTS WITH CHARCOT NEUROARTHROPATHY SECONDARY TO DIABETES
MELLITUS
DOCTORAL DISSERTATION
Ljubljana, 2021
Nikoli ni prepozno, da naredite kar je prav.
Nelson Mandela
Doktorska disertacija je zaključek Interdisciplinarnega doktorskega študija Bioznanosti, znanstveno področje Nanoznanosti na Biotehniški fakulteti in Fakulteti za elektrotehniko Univerze v Ljubljani.
Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa Komisije za doktorski študij Univerze v Ljubljani z dnem 29.2.2016 je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na Interdisciplinarnem doktorskem študijskem programu Bioznanosti, znanstveno področje Nanoznanosti. Za mentorico je bila imenovana prof. dr. Veronika Kralj-Iglič in za somentorja doc. dr. Rado Janša, dr. med.
Mentorica: prof. dr. Veronika Kralj-Iglič, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena fakulteta Somentor: doc. dr. Rado Janša dr.med., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: prof. dr. Damjana Drobne, univ. dipl. biol.
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta
Članica: prof. dr. Alenka Maček Lebar, univ. dipl. inž. el.
Univerza v Ljubljani, Fakuteta za elektrotehniko
Članica: izr. prof. Saba Battelino, dr.med.
Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta
Datum zagovora: 21.6.2021
Karin Schara
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI)
ŠD Dd
DK UDK 616.379-008.64:616.7(043.3)
KG Charcotova nevroartropatija, sladkorna bolezen, diabetična nevropatija, stopalo, krvne celice, zunajcelični mikrovezikli
AV SCHARA, Karin
SA KRALJ-IGLIČ, Veronika (mentorica) /JANŠA, Rado (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študij Bioznanosti, znanstveno področje Nanoznanosti
LI 2021
IN MIKROVEZIKULACIJA KRVNIH CELIC PRI SLADKORNIH BOLNIKIH S CHARCOTOVO NEVROARTROPATIJO
TD Doktorska disertacija
OP VIII, 45 str., 1 pregl., 13 sl., 3 pril., 97 vir IJ sl
JI sl/en
AI Namen naše raziskave je bil ugotoviti, ali je koncentracija plazme zunajceličnih veziklov pri aktivni diabetični Charcotovi nevroartropatiji (CNA) povezana z vnetnimi označevalci, zvišano temperaturo v prizadetem stopalu in koncentracijo topnega receptorja za napredne končne produkte glikacije (RAGE). Zunajcelične vezikle smo izolirali iz periferne krvi 36 bolnikov z aktivno CNA in 25 zdravih kontrolnih oseb, nato so bili na podlagi pretočne citometrije prešteti po večkratnem centrifugiranju in izpiranju vzorcev. Temperatura stopala je bila izmerjena z infrardečim termometrom. Koncentracija topnega receptorja za napredne končne produkte glikacije (RAGE) je bila ugotovljena z encimsko imunoadsorpcijsko preiskavo (ELISA). Ugotovljene so bile statistično pomembne korelacije koncentracij zunajceličnih veziklov (ne pa tudi koncentracije topnega RAGE) s C- reaktivnim proteinom (CRP) in s temperaturnimi razlikami med prizadetim in kontralateralnim stopalom (r = 0,40, p = 0,032 oziroma r = 0,84, p < 10-8). Potrjeno je bilo, da je koncentracija zunajceličnih veziklov povezana s povišano vrednostjo vnetnih označevalcev (tj. CRP in razlike v temperaturi obeh stopal) pri preiskovancih z aktivno diabetično CNA. Zunajcelične vezikle bi bilo v prihodnje smiseln obravnavati kot potencialne označevalce za postavitev diagnoze aktivne CNA, kar bi zagotovo pripomoglo k zgodnji postavitvi diagnoze in zdravljenju bolezni.
KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD)
DN Dd
DC UDC 616.379-008.64:616.7(043.3)
CX Charcot neuroartropathy/ diabetes mellitus/diabetic neuropathy/foot/ blood cells/
extracellular microvesicles AU SCHARA, Karin
AA KRALJ-IGLIČ, Veronika (supevisor)/ JANŠA, Rado (co-supervisor) PP 1000 Ljubljana, SLO, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Interdisciplinary Doctoral Study Programme in Biosciences, Scientific Field Nanoscience
PY 2021
TI MICROVESICULATION OF BLOOD CELLS IN PATIENTS WITH CHARCOT NEUROARTHROPATHY SECONDARY TO DIABETES
MELLITUS
DT Doctoral Dissertation
NO VIII, 45 p., 1 tab., 13 fig., 3 ann., 97 ref.
LA sl AL sl/en
AB This study focuses on membrane microvesiculation and its possible connection to inflammation processes in diabetic Charcot Neuroarthropathy (CNA). It was our aim to determine whether the concentration of extracellular vesicles (EVs) in isolates from blood of patients with CNA is increased, and whether it is connected to the concentration of soluble receptor for advanced glycation end products (RAGE) and standard markers of inflammation. EVs were isolated from peripheral blood of 36 patients with active CNA and of 25 non-Diabetic control subjects. EVs were counted after by repetitive centrifugation and washing of samples, by flow cytometry.
Concentration of soluble RAGE was determined by ELISA. Mean concentration of EVs was significntly higher in CN patients than in controls (73% higher; p<0.003).
Mean concentration of sRAGE was considerably (24%; p=0.046) lower in CNA patients than in controls. In CNA patients, CRP concentration was elevated and the correlation between the concentration of EVs and CRP was statistically significant (r=0.40, p=0.032). There was no correlation between concentration of EVs and concentration of soluble RAGE. We provide the first evidence that EVs are elevated in the acute phase of CNA and are related to elevation of the standard marker of inflammation, CRP. EVs should be considered in as a potential marker of acute CNA that may aid in the early diagnosis of this devastating condition.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) III KEY WORD DOCUMANTATION (KWD) IV KAZALO VSEBINE V KAZALO PREGLEDNIC VI KAZALO SLIK VII
KAZALO PRILOG VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI IX
1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE IN CILJEV 1
1.1 KLINIČNA SLIKA CHARCOTOVE NEVROARTROPATIJE 2
1.2 MEHANIZMI NASTANKA CHARCOTOVE NEVROARTROPATIJE 7
1.3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE 8
2 PREGLED OBJAV 10
2.1 CHARCOTOVA NEVROARTROPATIJA IN OSTEOKLASTOGENEZA 10
2.2 ZUNAJCELIČNI VEZIKLI 11
3 MATERIAL IN METODE 14
3.1 IZBOR PREISKOVANCEV 14
3.1.1 Preiskovanci v raziskavi mikrovezikulacija krvnih celic pri sladkornih bolnikih s CNA 14
3.1.2 Preiskovanci v in vitro raziskavi 15
3.2 ODVZEM KRVI 16
3.3 OCENA KONCENTRACIJE ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV 16
3.3.1 Teoretična ocena koncentracije zunajceličnih veziklov v izolatih 16
3.3.2 Opis pridobivanja zunajceličnih veziklov s centifugiranjem 16
3.4 ANALIZA S PRETOČNO CITOMETRIJO 18
3.5 DOLOČANJE KONCENTRACIJE TOPNEGA RECEPTORJA ZA NAPREDNE KONČNE PRODUKTE GLIKACIJE (RAGE) 19
3.6 ANALIZA STANDARDNIH KRVNIH PARAMETROV 19
3.7 MERITVE TEMPERATURE 20
3.8 STATISTIČNA ANALIZA 20
3.9 TEORETIČNI OPIS VPLIVA STRIŽNIH SIL MED PROCESIRANJEM VZORCEV NA KONCENTRACIJO ZV V IZOLATIH IZ KRVI 20
4 REZULTATI 21
4.1 ZUNAJCELIČNI VEZIKLI KOT OZNAČEVALCI CNA 21
4.2 VPLIV STRIŽNIH SIL NA KONCETRACIJO ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV V IZOLATIH KRVI 23
5 RAZPRAVA 27
5.1 POTENCIALNI MEHANIZEM CHARCOTOVE NEVROARTROPATIJE 30
6 SKLEPI 33
7 POVZETEK (SUMMARY) 34
7.1 POVZETEK 34
7.2 SUMMARY 34
8 VIRI 36
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Razlike v standardnih laboratorijskih preiskavah krvi, koncentraciji
ZV v krvnih izolatih in koncentraciji topnega RAGE v plazmi 21
KAZALO SLIK
Slika 1: Klinična slika aktivne oblike CNA 2 Slika 2: RTG slika stopala aktivne CNA 3
Slika 3: Kronična oblika CNA: deformacije in spremenjena oblika stopala 4
Slika 4: Kronična CNA: RTG slika stopala 5
Slika 5: Kronična CNA: zaradi porušene anatomije stopala je
na mestu največje deformacije nastala obsežna rana 6 Slika 6: Primerjava med eksperimentalnimi in teoretičnimi oblikami celic
(Kralj-Iglić in sod., 2020) 12 Slika 7: Bolnik s SB in aktivno CNA levega stopala: za
razbremenitev ima nameščen začasni čevelj in bergle.
Na bolnikovi desni gre za stanje po amputaciji 15 Slika 8: Izolati iz periferne krvi, opazovani z vrstičnim elektronskim mikroskopom
(Šuštar V., 2009) 18 Slika 9: Koncentracija ZV-jev in koncentracija topnega RAGE v odvisnosti
od temperature v izolatih krvi bolnikov z aktivno CNA 22
Slika 10: Spreminjanje relativnega števila delcev v zgornji plasti plazme
kot posledica centrifugalne sile 23 Slika 11: Koncentracija ZV-jev v izolatih v odvisnosti od razdalje med zgornjo
ravnjo vzorca in osjo centrifugalnega rotorja x0 25
Slika 12: Relativna koncentracija ZV v odvisnosti od dela strižnih sil med pretakanjem krvi skozi iglo. Vsaka točka označuje dva odvzema, drugega za drugim, pri istem preiskovancu, z različnima vrstama igel.
δA = A1/A2 and δZV = cZV,1/cZV,2 26 Slika 13: Medcelična komunikacija preko nanocevk in ZV med osteoblastno in
osteoklastno linijo 31
KAZALO PRILOG
PRILOGA A: Matematični model pridobivanja zunajceličnih veziklov PRILOGA B: Opis pretoka krvi skozi iglo
PRILOGA C: Izvirni prispevki k svetovni znanosti
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
AGE napredni končni produkti glikacije BK bele krvničke
CNA Charcotova nevroartropatija CRP C-reaktivni protein
ELISA encimska imunoadsorpcijska preiskava GST glutation-S-transferaze
HbA1c glikohemoglobin HE holinesteraza IL interlevkin
M-CSF makrofagne kolonije stimulirajoči faktor
RAGE receptor za napredne končne produkte glikacije RANK-L ligand receptorja za aktivator jedrnega dejavnika kapa RANK receptor za aktivacijo jedrnega dejavnika kapa B RTG rentgen
SB sladkorna bolezen SD standardna deviacija
TNF- tumor nekrotizirajoči faktor alfa ZV zunajcelični vezikli
1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE IN CILJEV
Charcotova nevroartropatija (CNA) je kronična napredujoča okvara kosti in sklepov, za katero je značilen vnetni proces, ki povzroča razgradnjo kosti, zlome, izpahe in deformacije na stopalu z okvarjeno zaščitno občutljivostjo (Rogers in sod., 2011). Izguba zaščitne občutljivosti je v današnjem času najpogosteje povezana s sladkorno boleznijo (SB). Za SB je namreč značilna okvara perifernega živčevja, ki prizadene senzorično, motorično in avtonomno živčno nitje in se kaže kot distalna simetrična polinevropatija (Rajbhandari in sod., 2002), zato so najbolj prizadeti kosti in sklepi na distalnih delih spodnjih okončin, tj.
na stopalu in gležnju (Armstrong in Lavery, 1997). CNA je redka bolezen, vendar ne pri bolnikih s SB (Rogers in sod., 2011). Raziskave kažejo, da prizadene od 0,1 do 7,5 odstotka sladkornih bolnikov ter do 35 odstotkov sladkornih bolnikov z okvaro perifernega živčevja.
Povečano tveganje za nastanek CNA ni odvisno od tipa SB (tip I ali II) (Rosskopf in sod., 2019). SB tipa I je avtoimunska bolezen in se pojavi pri mladih. Pri tem tipu gre za genetsko pogojeno pomanjkanje hormona inzulina, ki uravnava raven krvnega sladkorja. SB tipa II pa nastane kot posledica zmanjšanega izločanja inzulina in inzulinske odpornosti celic tkiv.
Zaradi inzulinske odpornosti se celice na inzulin ne odzovejo in krvni sladkor vanje ne more prehajati, posledica česar je hiperglikemija. CNA prizadene sladkorne bolnike po praviloma več kot desetih letih obolelosti za SB, najpogostejša je pojavnost pri bolnikih, starih med petdeset in šestdeset let, ni pa razlik v pojavnosti med spoloma (Ergen in sod., 2013).
Vzajemno delovanje SB, okvare perifernega živčevja, metaboličnih dejavnikov in vnetja tkiv vodi v deformacije stopala, nastanek nezaraščajočih ran, okužbe in nekroze tkiv, ki privedejo do amputacij na spodnjem udu in posledično trajne invalidnosti sladkornih bolnikov (Rogers in sod., 2011).
Zaradi odsotnosti značilnih kliničnih znakov in laboratorijskih označevalcev je potrditev diagnoze CNA izziv v vsakodnevni klinični praksi. Predlagani so bili številni mehanizmi za ugotavljanje bolezni, povezani z nastankom CNA, vendar vzroki CNA še niso povsem razumljeni. Trenutna dognanja kažejo, da gre najverjetneje za preplet mehanizmov, ki vključujejo obvladovanje posredovalcev vnetja, glikozilacijo tkiv ter motnje v sintezi in razgradnji kosti (Johnson-Lynn in sod., 2018). CNA nastopi kot posledica neravnovesja aktivnosti celic dveh vrst – osteoblastov in osteoklastov (Jeffcoate, 2015), kar vodi do povečane osteolize in destrukcije kosti in sklepov (Jeffcoate in sod., 2005). Zmanjšana občutljivost, ki je posledica okvar perifernega živčevja, in vnetni odziv, ki se kaže s povišano temperaturo prizadetega stopala, še dodatno poslabšujeta stanje in začarani krog se nadaljuje.
Procesi osteolize so uravnavani s številnimi molekulami, ki omogočajo interakcijo med osteoblasti in osteoklasti (Sims in sod., 2015), iz česar je razvidno, da je medcelična komunikacija ključna v procesih presnove kosti. Ugotovljeno je bilo, da so zunajcelični vezikli (ZV) in nanocevke pomembni deležniki v celičnih procesih (Schara in sod., 2009).
Te membranske nanostrukture so premične in se povezujejo z membranami drugih celic, kar jih uvršča med nosilke medcelične komunikacije. Povečane vrednosti ZV so bile ugotovljene pri bolnikih z vnetji in okužbami (Boulanger in sod., 2006), pri sladkornih bolnikih (Leroyer in sod., 2007) in pri bolnikih z okvarami perifernega oživčenja (Omoto in sod., 2002).
1.1 KLINIČNA SLIKA CHARCOTOVE NEVROARTROPATIJE
V kliničnem poteku ločimo akutno (aktivno) in kronično (neaktivno) CNA. Aktivna CNA se začne nenadno, na stopalu so izraženi znaki vnetja: z rdečino, oteklino in povišano temperaturo nad prizadetimi sklepi.
Slika 1: Klinična slika aktivne oblike CNA: levo stopalo je rdeče in toplo in oteklo Figure 1: Active CNA presents with a red, hot and swollen foot (left foot)
povišano temperaturo nad prizadetimi sklepi. Navedene spremembe, prikazane na sliki 1, so praviloma vidne samo na enem od obeh bolnikovih stopal. Razliko v temperaturi med stopaloma, ki v aktivni fazi bolezni znaša najmanj dve stopinji Celzija (°C), ob kliničnem pregledu lahko ugotovimo z dotikom in izmerimo s kožnim termometrom (Guaveri in Papanas, 2011). McGill in sod. (2000) so ugotovili, da je zvišana temperatura kože v aktivni fazi bolezni povezana s procesi razgradnje kosti, in poročali, da povprečne vrednosti razlike temperature v aktivni fazi bolezni dosežejo 3,3 °C.
Slika 2: RTG slika stopala aktivne CNA
a: Zgodnja aktivna faza CNA. Na RTG sliki je anatomija stopala ohranjena, na nartu so vidne kostne naplastitve in zabrisane sklepne površine prizadetih sklepov (v krogu), b: napredovala aktivna faza CNA. V krogu so označene obsežne kostne naplastitve, porušena je anatomija stopala, zato je stopalni lok spuščen
Figure 2: Foot X-ray in the active CNA
a: Early active CNA. On the X-ray Foot anatomy is still preserved, joint structure is diminished, minor osiffications seen on the dorsum of the foot (in the circle), b: progression of active CNA. Bone and joint destructions are marked in the circle, longitudinal arch is disrupted (red line)
Na rentgenski sliki v začetni aktivni fazi bolezni sprva odstopanj od normalne zgradbe in strukture slikanega skeleta ni videti, v nadaljevanju procesa, ko potekata resorpcija in pozneje koalescenca kosti, na rentgenski sliki postanejo vidni demineralizacija kosti, izpahi, zlomi, fragmentacija in periostalna reakcija prizadetih kosti in sklepov (Eichenholtz, 1966) (slika 2). Za resorpcijo kosti je značilen hiter potek, zato se lahko stanje stopala, kot je vidno na rentgenski sliki, iz normalnega v patološkega spremeni v vsega nekaj tednih (Marmolejo in sod., 2018).
Slika 3: Kronična oblika CNA: deformacije in spremenjena oblika stopala Figure 3: Chronic CNA presents with a rocker bottom foot deformity
Opisani nespecifični znaki vnetnega procesa pri CNA neprekinjeno trajajo več mesecev skupaj. S kliničnim pregledom potrdimo okvaro perifernega živčevja, zlasti odsotnost občutka za dotik in posledično odsotnost zaščitne občutljivosti na stopalu. Pomembnih motenj prekrvitve pri aktivni CNA ni (Rogers in sod., 2011).
V kronični, neaktivni CNA znaki vnetja izzvenijo, oteklino, rdečino in povišano temperaturo zamenjajo spremenjena zgradba in oblika stopala ter deformacije kosti in sklepov. Ker stopalo tvorijo številni kosti in sklepi, so deformacije v kronični CNA zelo raznovrstne. V večini primerov se izrazijo s spremenjeno obliko narta in srednjega dela stopala in posledično s spuščenim vzdolžnim stopalnim lokom, kot prikazuje slika 3.
Slika 4: Kronična CNA na RTG sliki: prikazane so za bolezen značilne spremembe sklepov, strukture kosti in čolničasta oblika vzdolžnega stopalnega loka (rdeči polkrog)
Figure 4: Foot X ray in chronic CNA presents with mid foot changes in bone and joint structure resulting in rocker-bottom deformity (red line)
Slika 4 prikazuje rentgensko sliko stopala v stranski projekciji, na sliki so vidne popolnoma izražene spremembe stopala s kronično CNA. Opazni so izpahi in zrasti sklepov, kostne štrline in druge deformacije, ki jih je v aktivni CNA povzročila razgradnja kosti in sklepov
prizadetega stopala. Najpogosteje so prizadeti sklepi narta, zato je posledica kronične CNA spuščen vzdolžni stopalni lok, ki se boči v podplat in je čolničasto oblikovan. Zaradi čolničaste oblike stopala so ob obremenitvi stopalni pritiski na mestih največjih deformacij večji, s tem pa so pogosto razlog za nastanek odprte rane. Slika 5 prikazuje deformacijo na srednjem delu stopala zaradi okvar nartnih kosti in izpahov sklepov ter obsežno odprto rano.
Slika 5: Kronična CNA: zaradi porušene anatomije stopala je na mestu največje deformacije nastala obsežna rana
Figure 5: Chronic CNA: due to changes in anatomy a non-healing midfoot ulcer occurred
Posledica nastalih sprememb v zgradbi in obliki stopala ter nestabilnosti prizadetih sklepov so povečani stopalni pritiski ob vsakem stiku stopala s podlago, pri vsakem koraku.
Odsotnost bolečine in zmanjšana zaščitna občutljivost kože povečata možnost za nastanek rane na stopalu (Jeffcoate in Harding, 2003; Schara, 2015). Kronična rana poveča tveganje za nastanek bakterijskega, gnojnega vnetja in nepopravljive okvare kosti in sklepov, kar pogosto vodi v amputacijo nekrotičnih delov stopala ali goleni. Veliko amputacij in trajna invalidnost bolnikov sta pozna zapleta te bolezni in sta neločljivo povezana s SB in CNA (Margolis in sod., 2005).
Osnovna načela zdravljenja aktivne CNA zajemajo imobilizacijo prizadetega stopala z mavcem, razbremenitev z berglami in/ali invalidskim vozičkom ali kombinacijo naštetega.
Ključna dejavnika za uspešno zdravljenje sta pravočasno postavljena diagnoza in čimprejšnja razbremenitev stopala. Z razbremenitvijo dosežemo umiritev vnetnih procesov in preprečimo nadaljnjo okvaro kosti in sklepov, kar pri nezdravljenih primerih povzroča hude deformacije in nestabilnosti sklepov (Frykberg in Eneroth, 2010).
Ker klinična slika stopala z aktivno obliko bolezni ni značilna samo za CNA, temveč je opazna pri številnih boleznih, kot so na primer bakterijska vnetja kože in kosti (celulitis, osteomielitis), globoka venska tromboza, protin, limfedem, degenerativna sklepna bolezen (artritis) in druge bolezni, ki prizadenejo stopalo, je zgodnje prepoznavanje aktivne CNA v klinični praksi zahtevno in pomeni velik diagnostični izziv (Marmolejo in sod., 2018). To, da se ne izvedejo znane specifične preiskave ali se ne ugotovijo označevalci v telesnih tekočinah, s katerimi bi potrdili CNA oziroma številne bolezni z enakim kliničnim potekom, ki diferencialno diagnostično pridejo v poštev, pomeni, da traja dlje, da se le postavi diagnoza CNA in se začne zdravljenje te bolezni (Kaynak in sod., 2013).
1.2 MEHANIZMI NASTANKA CHARCOTOVE NEVROARTROPATIJE
Predlagani so bili številni mehanizmi, povezani z nastankom CNA, vendar vzroki te bolezni še niso povsem razumljeni. Iz trenutnih dognanj je razvidno, da gre najverjetneje za preplet mehanizmov, ki vključujejo obvladovanje posredovalcev vnetja, glikozilacijo tkiv ter motnje v sintezi in razgradnji kosti (Johnson-Lynn in sod., 2018). CNA nastopi kot posledica neravnovesja aktivnosti celic dveh vrst – osteoblastov in osteoklastov (Jeffcoate, 2015), kar vodi do povečane osteolize in destrukcije kosti in sklepov (Jeffcoate in sod., 2005).
Zmanjšana občutljivost, ki je posledica periferne nevropatije, in vnetni odziv še dodatno poslabšujeta stanje in začarani krog se nadaljuje. Procesi osteolize so uravnavani s številnimi molekulami, ki omogočajo interakcijo med osteoblasti in osteoklasti (Sims in sod., 2015), iz česar je razvidno, da je medcelična komunikacija ključna v procesih presnove kosti.
Ugotovljeno je bilo, da je CNA povezana s povišano ravnjo končnih produktov pospešene glikacije (AGE) v krvi, ki se pojavijo pri slabo urejeni sladkorni bolezni in/ali vnetju zaradi hiperglikemije in oksidativnega stresa. Izkazalo se je, da ti končni produkti spodbujajo apoptozo človeških mezenhimatskih matičnih celic (Kume in sod., 2005) in osteoblastov (Alikhtani in sod., 2007) tako, da se vežejo na receptorje za končne produkte glikacije (RAGE), ki so na membrani teh celic (Witzke in sod., 2011). Ugotovljeno je bilo tudi, da je koncentracija RAGE v krvni plazmi (sRAGE) pri bolnikih s CNA nižja kot pri zdravih osebah in sladkornih bolnikih (Witzke in sod., 2011), zaradi česar naj bi se povečala vezava AGE na membransko frakcijo RAGE (Witzke in sod, 2012). Poleg tega lahko receptorji za končne produkte glikacije povečajo aktivacijo RANKL, kar vodi v povečano osteoklastogenezo (Macaione in sod., 2007; Yaturu, 2009). Procese, ki vodijo v osteoklastogenezo, uravnavajo številne molekule, aktivne v interakciji med osteoblasti in osteoklasti (Sims in Martin, 2015), iz česar je razvidno, da ima medcelična komunikacija pomembno vlogo pri preoblikovanju kosti.
V zadnjem času se je povečalo zanimanje raziskovalcev za z membrano obdane celične fragmente – zunajcelične vezikle (ZV) kot deležnike v medcelični komunikaciji (Leroyer in sod., 2008; Schara in sod., 2009; Šuštar in sod., 2011). ZV odpuščajo v okoliško raztopino celice vseh vrst. Ker so mobilni s telesnimi tekočinami, lahko dosežejo oddaljene celice in se z njimi povezujejo. Pri tem prenašajo proteine, nukleinske kisline in membranske receptorje. Ker vsebino ZV obdaja membrana, je zaščitena pred encimsko razgradnjo.
Ugotovljena je bila vloga ZV pri metastaziranju rakave bolezni (Katsuda in sod., 2014;
Ogorevc in sod., 2013), nastanku krvnih strdkov v žilah (Zarà in sod., 2019), razširjanju vnetja (Buzas in sod., 2014) in regeneraciji (Azoidis in sod., 2018).
ZV je mogoče izolirati iz telesnih tekočin. Raziskave so potrdile, da zvišane koncentracije ZV spremljajo nekatere patofiziološke pojave in glede na vzorce zdravih kontrol so jih našli v izolatih krvi pri bolnikih z boleznimi srca in ožilja, avtoimunskimi boleznimi, vnetji in okužbami (Boulanger in sod., 2006), nekaterimi vrstami raka (Kim in sod., 2003; Janša in sod., 2008), pri sladkornih bolnikih (Leroyer in sod., 2007), v izolatih iz krvi sladkornih bolnikov z ledvično boleznijo, nefropatijo (Nakajima in sod., 1991), pri bolnikih z okvarami mrežnice, retinopatijo (Ogata in sod., 2006), pri bolnikih z žilnimi boleznimi (Jung in sod., 2011; Koga in sod., 2005) in pri sladkornih bolnikih s periferno nevropatijo in zapleti na stopalu (Omoto in sod., 2002).
1.3 NAMEN DELA IN HIPOTEZE
V okviru tega dela želimo bolje razumeti vlogo membranskih nanostruktur pri CNA, njihov pomen pri pojasnjevanju vzrokov za nastanek CNA ter njihovo potencialno uporabnost v vlogi označevalcev pri odkrivanju in spremljanju zdravljenja aktivne CNA.
Opredelili smo naslednje hipoteze:
• Pri bolnikih s CNA je koncentracija ZV v izolatih iz periferne krvi povišana glede na izolate krvi zdravih kontrolnih oseb.
• Koncentracija v plazmi prisotnega RAGE pri bolnikih s CNA je nižja kot pri zdravih kontrolnih osebah.
• Med v plazmi raztopljenim RAGE in koncentracijo ZV v izolatih iz krvi je korelacija.
• Povišana koncentracija ZV v izolatih iz krvi bolnikov s CNA je povezana z vnetnimi označevalci.
• Povišana koncentracija ZV v izolatih iz krvi bolnikov s CNA je povezana s temperaturo prizadetega stopala in temperaturo kontralateralnega stopala v aktivni CNA.
V ta namen smo prispevali tudi k izboljšanju metode za določanje koncentracije ZV iz izolatov krvi. Na podlagi dobljenih rezultatov smo predlagali mehanizem omogočanja interakcije z ZV med osteoblasti in osteoklasti.
2 PREGLED OBJAV
CNA je kronična napredujoča bolezen, ki ob periferni nevropatiji povzroča okvare kosti in sklepov ter v svoji aktivni fazi tudi povišano temperaturo prizadetega stopala (Dg in La, 1997, Najafi in sod., 2012; Rogers in sod., 2011). Čeprav naj bi k pojavu CNA pripomoglo kar nekaj biološko-kemijskih mehanizmov, njen vzrok ostaja nepojasnjen (Petrova in sod., 2014).
Osteoartropatijo ali CNA je leta 1868 prvič opisal francoski nevrolog Jean-Martin Charcot, ki je proučeval nastanek okvar oživčenja, ki so nastale v poznih stadijih po poškodbah hrbtenjače in v primerih nekaterih sistemskih vnetnih bolezni. Ugotovil in opisal je, da obstaja povezava med motnjami oživčenja in deformacijami kosti in sklepov na stopalu in gležnju (Sanders, 2004). Vzrok za nastanek CNA sta Mitchell in Charcot poskusila pojasniti z nevrovaskularno teorijo, ker naj bi okvare perifernega oživčenja povečale pretok krvi in lokalno prekrvitev kostnine. Avtorja nevrotravmatske teorije Virchov in Volkman sta vzrok za nastanek CNA povezovala z mehanično poškodbo skeleta pri osebah z okvaro perifernega živčevja. Kot so pokazale nadaljnje raziskave, nevrovaskularna in nevrotravmatska teorija ne pojasnjujeta patofizioloških procesov in mehanizmov za nastanek CNA (Edmonds in sod., 1982, Shapiro in sod., 1998).
Do danes kot vzrok CNA izpostavljajo preplet mehanizmov, ki obvladovanje posredovalcev vnetja, glikozilacijo tkiv ter motnje v sintezi in razgradnji kosti (Johnson-Lynn in sod., 2018).
2.1 CHARCOTOVA NEVROARTROPATIJA IN OSTEOKLASTOGENEZA
Jeffcoate in sod. (2005) so objavili hipotezo, po kateri so med ključnimi dejavniki za nastanek CNA vnetni procesi, ki vodijo v razgradnjo kostnega tkiva. CNA nastopi kot posledica neravnovesja aktivnosti celic dveh vrst – osteoblastov in osteoklastov (Jeffcoate, 2015). Neravnovesje, ki ga spodbujajo vnetja, povzroči povečano lomljivost kosti in več zlomov (Petrova in Shanahan, 2014). V aktivni CNA je bila v raziskavah ugotovljena povečana aktivnost osteoklastov (Gough in sod, 2012), ob osteoklastih so bili najdeni vnetni citokini TNF-, interlevkin-1 in interlevkin-6 (Baumhauer in sod., 2006). Povečane količine omenjenih vnetnih citokinov, zmanjšane količine protivnetnih citokinov interlevkin-4 in interlevkin-10 ter povečane količine površinskih molekul CD40, CD80 in CD86 so bile najdene v monocitih bolnikov, ki trpijo za CNA (Uccioli in sod., 2010). Zvišani koncentraciji citokinov TNF- in interlevkin-6 sta bili ugotovljeni tudi v serumih bolnikov, ki trpijo za CNA (Petrova in sod., 2015).
Prisotnost vnetnih citokinov v celoti ne pojasnjuje povečane aktivnosti osteoklastov in bolj izražene osteoklastogeneze pri CNA zato so se nekateri raziskovalci usmerili v proučevanje receptorjev na membranah osteoklastov in osteoblastov ter njihovih posredovalcev.
Osteoblasti se razvijejo iz osteoprogenitorske linije mezenhimatskih matičnih celic (Tye in sod, 2015), osteoklasti pa se razvijejo iz osteoklastne linije krvotvornih matičnih celic (Xiao in sod., 2015). Celice osteoklastne linije vsebujejo v svojih membranah molekule, imenovane receptor aktivator NF-κB (RANK), celice osteoblastne linije pa ligande, ki se lahko vežejo na te receptorje (RANKL) (Miller, 2014). Številne celice, tudi T-limfociti, dendritične celice, endotelijske celice, fibroblasti in osteoblasti, izločajo RANKL, vendar le osteoblasti izločajo faktor, ki spodbuja rast kolonij makrofagov oziroma razvoj osteoklastov iz matičnih krvotvornih celic, ki imajo RANK na površini membrane (Mabilleau in sod., 2008). RANK in RANKL omogočata medcelično interakcijo (Katagiri in Takahashi, 2002).
Vezava RANKL na RANK kaže na razvoj predniških celic osteoklastov v večjedrne osteoklaste (Mabilleau in sod., 2008; Jeffcoate in sod., 2005) in s tem vpliva na resorpcijo kosti. Razvoja osteoklastov in osteoblastov sta med seboj povezana, poleg tega je koncentracija RANKL v osteoblastih uravnavana z interakcijo z osteociti (Nakashima in sod., 2011).
Pojav CNA je povezan tudi s povečanjem količine AGE v krvi, kar je običajno rezultat slabše urejene SB in/ali vnetja zaradi hiperglikemije in oksidativnega stresa (Jeffcoate, 2015).
Ugotovljeno je bilo, da AGE spodbujajo apoptozo mezenhimskih matičnih celic (Kume in sod., 2005) in osteoblastov (Alikhani in sod., 2007) tako, da se vežejo na RAGE na njihovih membranah (Witzke in sod., 2011). Poleg tega je koncentracija RAGE v krvni plazmi (topen RAGE) pri bolnikih s CNA nižja kot pri zdravih ljudeh in sladkornih bolnikih. Pomanjkanje topnega RAGE verjetno vpliva na zmanjšanje možnosti vezave AGE na topni RAGE s škodljivo posledico vezave AGE na membransko frakcijo RAGE (Witzke in sod., 2011).
Ugotovljeno je bilo tudi, da lahko RAGE poveča aktivacijo RANKL, kar vodi v povečano osteoklastogenezo (Macaione in sod., 2007; Yaturu, 2009). Ker vse omenjene procese uravnavajo številne poti, ki zadevajo linije osteoblastov in osteoklastov (Nomura in sod., 2000; Petrova in Shanahan, 2014; Schmidt in sod., 2001), je očitno, da je za obnovo kosti pomembna medcelična komunikacija.
2.2 ZUNAJCELIČNI VEZIKLI
Dokler se niso izboljšali tehnike opazovanja in teoretična predvidevanja, so bili ZV zaradi svoje majhnosti in krhkosti prezrti. Wolf je leta 1967 v krvi našel delce, manjše kot mikrometer (Wolf in sod., 1967), in jih poimenoval celični prah. Pozneje so ugotovili, da so ti delci pomembni nosilci fizioloških in patofizioloških pojavov (Yanez-Mo in sod., 2015).
Slika 6: Primerjava med eksperimentalnimi in teoretičnimi oblikami celic (Kralj-Iglič in sod., 2020)
a-d: transformacija diskocita v stomatocit kot prikazano v izolatu krvi in pripadajoče oblike izračunane na podlagi pomanjšanja proste energije membran, e: diskocitna oblika eritrocita primerjalno z diskocitno obliko nanovezikla in izračunano obliko, f-i: transformacija orjaškega fosfolipidnega mehurčka v obliko, ki s tankim vratom povezuje materinsko membrano in kroglast brst, j: brstenje membrane eritrocitov.
Fig 6. Comparison between experimental and theoretical cell shapes (Kralj-Iglič in sod.., 2020)
a-d: The transformation of a discocyte into a stomatocyte as represented by the shapes observed in cellular nanovesicles, and the corresponding contours of the calculated shapes obtained by minimization of the membrane free energy. e: Discocyte shape of an erythrocyte complying with discocyte shape of cellular nanovesicle and with the calculated shape. f-i: The transformation of the outward bud in giant phospholipid vesicles and the corresponding result of the theoretical description obtained by minimization of the membrane free energy, j:shows the budding erythrocytes.
V literaturi so poročali o povišanih vrednostih koncentracije ZV v izolatih iz krvi pri fizioloških pojavih, kot na primer po fizičnem naporu ali postprandialno (Chaar in sod., 2011; Šuštar in sod., 2011). Med spontane in stabilne mikrostrukture oziroma nanostrukture bioloških membran uvrščamo brste, nanocevke (Kralj-Iglič in Iglič, 2002), nanovezikle (Ratajczak in sod., 2006) in ozke vratove (Kralj- Iglič in sod., 2006). Pri brstenju membrane se oblikuje tanek vrat, s katerim je brst povezan z materinsko membrano. Brstenje je posledica prerazporejanja membranskih gradnikov, lahko pa tudi mehanskega in toplotnega stresa na membrane. Če se vrat pretrga, nastane vezikel, ki je prosto gibljiv v raztopini (Ratayczak in sod., 2006). Slika 6 prikazuje primerjavo med eksperimentalnimi in teoretičnimi oblikami celic v izolatu iz krvi, povezave s tankimi vratovi in brstenje membrane eritrocitov. Fotografije, ki so del rezultatov raziskovalne skupine prof. Kralj- Igličeve, so uporabljene z dovoljenjem avtorjev (Kralj-Iglič in sod., 2020).
Mehanizmi nastanka in delovanja ZV še niso povsem pojasnjeni, vendar postaja jasno, da je treba procese brstenja membrane in njene vezikulacije upoštevati pri opisovanju in proučevanju patoloških procesov. Tudi pri SB obeh tipov (tipa I in tipa II) so raziskovalci v izolatih periferne krvi potrdili zvišane koncentracije ZV (Leroyer in sod., 2007).
Mikrovezikulacija celičnih membran je v zadnjem času postala predmet raziskav tudi na področju poznih zapletov pri sladkornih bolnikih (Wang in sod., 2013). Povišane ravni ZV so bile ugotovljene pri sladkornih bolnikih in bolnikih z okvarami perifernega živčevja, ki je pomemben dejavnik tveganja za nastanek CNA. Mesto izvora ZV so bile predvsem membrane celic levkocitne in monocitne vrste (Omoto in sod., 2002). Pasquier in sod. so proučevali mikrovezikulacijo pri bolnikih s CNA in ugotovili povišane vrednosti ZV v primerjavi s skupino bolnikov s periferno nevropatijo in skupino zdravih preiskovancev. ZV so bili monocitnega izvora. V in vitro poizkusu so izolirani ZV monocitnega izvora, inkubirani z monociti zdravih preiskovancev, sprožili diferenciacijo osteoklastov, ki so nosilci procesa razgradnje kosti (Pasquier in sod., 2017).
A
3 MATERIALI IN METODE
3.1 IZBOR PREISKOVANCEV
3.1.1 Preiskovanci v raziskavi mikrovezikulacija krvnih celic pri sladkornih bolnikih s CNA
Raziskava je bila opravljena z etičnim dovoljenjem Komisije RS za medicinsko etiko (št.
82/07/14). Pred vključitvijo v raziskavo so bili bolniki seznanjeni z namenom in ciljem raziskave, razložili smo jim tudi možne dejavnike tveganja ob postopku. Pridobili smo pisno soglasje bolnikov za sodelovanje v raziskavi.
K sodelovanju v raziskavi je bilo povabljenih 36 bolnikov s potrjeno sladkorno boleznijo (26 moških s povprečno starostjo 52,8 leta, starih od 34 do 65 let), v povprečju so se za sladkorno boleznijo zdravili 11,7 leta. Merilo za vključitev v raziskavo je bila s kliničnim pregledom ugotovljena aktivna CNA na stopalu ali gležnju pri bolnikih, ki so bili obravnavani v specialističnih ortopedskih ambulantah Poliklinike (Ortopedska klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana). Vsi bolniki so izpolnjevali naslednja merila vključitve v raziskavo: enostransko, rdeče, toplo (s temperaturo stopala za vsaj 2 °C višjo od temperature kontralateralnega stopala) in oteklo stopalo, z zmanjšano zaščitno občutljivostjo in z normalno periferno prekrvitvijo stopala (Young in sod., 1993). Poleg obojestranske izgube zaščitne občutljivosti je bila okvara perifernega oživčenja dodatno potrjena s testiranjem in percepcijo pritiska 10 g monofilamenta in pragom percepcije vibracije na palcu v vrednosti > 25 sekund, določenim na podlagi bioteziometra (Biomedical Instruments Inc, Newbury, Ohio, ZDA). Merila za izključitev bolnikov iz raziskave so zajemala motnje periferne prekrvitve spodnjih udov, prebolela venska tromboza, vnetne bolezni, maligne bolezni, nedavno prebolele ishemične bolezni srca in možganov, odpoved jeter ali ledvic in pljučna embolija.
Slika 7 prikazuje 56-letnega sladkornega bolnika s CNA, ki je sodeloval v raziskavi. Bolnik se je 11 let zdravil zaradi SB, zadnjih pet let tudi zaradi povišanega krvnega tlaka in okvare vida, ki je posledica retinopatije zaradi SB. Zaradi zmanjšane zaščitne občutljivosti se štiri leta po naši raziskavi ni pravočasno odzval na rano, ki je nastala v pretesni obutvi, razvilo se je bakterijsko vnetje, kar je vodilo v razširjeno okužbo in sepso, ki se je odrazila z mrzlico in visoko telesno temperaturo, ognojek se je razširil na celotno stopalo in golen, zato je bila napravljena podkolenska amputacija na desni nogi. Od tedaj ima nameščeno protezo. Ko je opazil oteklino in rdečino na levem stopalu, je nemudoma poiskal pomoč. V diagnostični obravnavi je bil sprva postavljen sum ponovnega bakterijskega vnetja, zato je bila uvedena antibiotična terapija. Ker bakterijsko vnetje ni bilo potrjeno, se je diagnostična obravnava nadaljevala.
Slika 7: Sladkorni bolnik z aktivno CNA, izraženo na levem stopalu. Za razbremenitev ima nameščen začasni čevelj in uporablja bergle. Na bolnikovi desni nogi je vidno za stanje po amputaciji
Figure 7: Diabetic patient is an amputee (right leg) with active CNA of the left foot. During off-loading treatment, he is using healing shoe and crutches.
Ugotovili smo, da gre za aktivno CNA. Zdravljenje smo nadaljevali z imobilizacijo stopala z mavčnim škornjem in razbremenitvijo z uporabo bergel, v nadaljevanju, ko je bolezen
prešla v subakutno fazo, pa z začasnim čevljem. Bolniku je bila hoja na daljše razdalje odsvetovana, v začetni fazi zdravljenja je bila odsvetovana tudi polna obremenitev prizadete noge. Bolnik pri hoji potrebuje pomoč in spremstvo, zato ga je na odvzem krvi in redno ambulantno obravnavo spremljala žena. Oba sta sodelovala v raziskavi in darovala kri.
3.1.2 Preiskovanci v in vitro raziskavi
V in vitro raziskavo smo vključili 25 zdravih oseb (9 moških s povprečno starostjo 48,7 leta, starih od 27 do 64 let), pri katerih smo opravili venski odvzem krvi. Pri proučevanju zunanjih parametrov izolacije smo v analizo vključili vzorce 9 zdravih prostovoljcev, ki so bili pred odvzemom krvi vsaj 12 ur tešči.
3.2 ODVZEM KRVI
Odvzem krvi je bil narejen v skladu s Helsinško deklaracijo o biomedicinskih raziskavah na človeku, določil Konvencije Sveta Evrope o varovanju človekovih pravic in dostojanstva (Ovidska konvencija) in načel Slovenskega kodeksa medicinske deontologije. Zaradi odvzema krvi nismo opazili nobenih neželenih učinkov na zdravje darovalcev.
Odvzem krvi je potekal na Ortopedski kliniki (Univerzitetni klinični center Ljubljana). Vse odvzeme krvi je opravila ista oddelčna diplomirana medicinska sestra. Kri vseh bolnikov, ki smo jih vključili v eno sejo, je bila odvzeta v največ 20 minutah. V raziskavi smo kri odvzeli 36 bolnikom. Vsi bolniki so bili pred odvzemom tešči vsaj 8 ur.
Za odvzem krvi smo izbrali medialno kubitalno veno in ga izvedli z 21-gauge iglami (MULTI Sample Needle, NIPRO Corporation, Tokio, Japonska) in 2,7-ml vakuumskimi epruvetami (shranjene pri 37 °C), ki so vsebovale 270 µl natrijevega citrata v koncentraciji 0,109 mol/l (Becton Dickinson, New Jersey, ZDA). V postopku procesiranja so bili epruvete in vzorci krvi shranjeni v termo blokih pri 37 °C.
3.3 OCENA KONCENTRACIJE ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV 3.3.1 Teoretična ocena koncentracije zunajceličnih veziklov v izolatih
Koncentracijo ZV smo ugotovili tudi teoretično z matematičnim modelom gibanja celic in fragmentov med centifugiranjem. ZV v izolatih krvi so delci (celice in celični fragmenti), ki po končanem počasnem centrifugiranju (pri manj kot ≃ 1.000 g) ostanejo v zgornjem predelu epruvete. Ti preostanki se nato dodatno fragmentirajo pri naslednjem hitrem centrifugiranju (pri več kot ≃ 20.000 g). Predpostavljamo, da so pred prvim centrifugiranjem
celice in delci v epruveti razporejeni enakomerno. V prilogi A je pojasnjeno, kako se število teh preostankov v zgornjem predelu vzorca spreminja med počasnim centrifugiranjem.
3.3.2 Opis obdelave vzorcev krvi s centrifugiranjem
Obdelava vzorcev krvi za izolacijo ZV se je začela v manj kot 20 minutah po odvzemu prvega vzorca. ZV smo izolirali s ponavljajočim se centrifugiranjem in izpiranjem vzorcev (Diamant in sod., 2002) ter jih modificirali, kot je podrobneje opisano v Šuštar in sod.
(2011a). Prikaz elementov, izoliranih s tem protokolom s SEM in AFM (Junkar in sod., 2009), vključuje oblike, ki so značilne za delce brez notranje strukture (npr. diskociti, stomatocitne oblike in oblike »starfish«) (Seifert, 1997), ki ustrezajo minimumu membranske proste energije pri različnih razmerjih med z membrano obdano prostornino in površino membrane. Heterogenost oblik v izolatih je tako mogoče pojasniti z različnimi površinami membrane in z membrano obdanimi prostorninami, ki nastanejo z različnimi procesi, preden se brsti odcepijo od membrane materinske celice. Populacija ZV, pridobljena po tem protokolu, je v povprečju velika okoli 300 nm (Šuštar in sod., 2011a). Označevanje izolatov s protitelesi anti-CD31-FITC in anti-CD42b-PE je pokazalo približno 30 % (15–
45 %) dogodkov, ki so ustrezali neoznačenim delcem. Izmed teh jih je bilo 15 % pripisanih delcem, označenim z anti-CD235-FITC, 9 % ozadju in približno 6 % delcem, pri katerih ni bilo mogoče opaziti sledi uporabljenih označevalcev (Šuštar in sod., 2011b).
Svežo kri smo 20 minut centrifugirali pri 1.550 x g in pri 37 °C v centrifugi Centric 200/R (Domel d.o.o., Železniki, Slovenija). Vrhnji del 250 µl plazme smo počasi odstranili in shranili v 1,8-ml mikroepruveto Eppendorf. Preostalih 500 µl plazme smo s pipeto počasi prenesli v drugo mikroepruveto Eppendorf in shranili pri −80 °C za poznejšo analizo topnega RAGE. Vrhnji del 250 µl plazme smo pet minut centrifugirali pri 17.570 x g v centrifugi Centric 200/R (Domel d.o.o., Železniki, Slovenija) z nihajočim rotorjem Lilliput (Domel d.o.o.), namenjenim posebej za izolacijo ZV, tako da so bili ZV zbrani na dnu mikroepruvete.
Vrhnji del 210 µl plazme smo zavrgli, preostalih 40 µl usedline pa smo z vrtinčenjem premešali pri 1.200 x g in resuspendirali v 210 µl citrirane fosfatno puferirane raztopine (pH
= 7,4). Vzorce smo znova pet minut centrifugirali pri 17.570 x g. 210 µl supernatanta smo zavrgli, 40 µl usedline pa resuspendirali v 60 µl citrirane fosfatno puferirane raztopine (pH
= 7,4).
Slika 8 prikazuje fotografije izolatov periferne krvi in sinovialne tekočine, ki opazovani z vrstičnim mikroskopom, prikazujejo številne ZV in brsteče levkocite. Slike so del neobjavljenih rezultatov raziskovalne skupine prof. Kralj-Igličeve iz leta 2009 in so uporabljene z dovoljenjem avtorjev Šuštarja in sodelavcev.
Slika 8: Izolati iz periferne krvi, opazovani z vrstičnim elektronskim mikroskopom (foto: Šuštar V., 2009) A: V izolatu vidimo številne ZV-je (bela puščica), a tudi residualne eritrocite (črna puščica). B: Večja povečava prikaže, da imajo ZV-ji različne oblike in velikosti
Figure 8: Isolates from peripheral blood as observed with scanning electron microscope (photo:Šuštar V.,2009) A: In the isolate we observe numerous EVs (white arrow) but also residual erythrocytes (bleck arrow). B:
higher magnification reveals that EVs have different shapes and size
3.4 ANALIZA S PRETOČNO CITOMETRIJO
Koncentracijo ZV v izolatih smo ugotovili s pretočnim citometrom MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Nemčija; https://miltenybiotec.com/en/
products-and-services/macs-flow-cytometry/instruments/macsquant-analyzers/macsquant- analyzers.aspx) z zračno hlajenimi laserji valovnih dolžin 405 nm, 488 nm in 640 nm. Za pridobivanje podatkov in analizo rezultatov smo uporabili programsko opremo MACSQuantifyTM 2.4 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach, Nemčija). Meritve smo opravili na 25 µl vzorca. Prisotnost rezidualnih celic in ZV smo ugotovili na podlagi parametrov sipanja svetlobe v smeri laserskega žarka (angl. forward scatter) in sipanja svetlobe pravokotno na smer vpadlega laserskega žarka (angl. side scatter). Območje dogodkov, ki ustrezajo parametrom za določanje ZV, je zajemalo več kot 90 % dogodkov v vseh razsevnih diagramih.
3.5 UGOTAVLJANJE KONCENTRACIJE TOPNEGA RECEPTORJA ZA NAPREDNE PRODUKTE GLIKACIJE (RAGE)
Za odtajane vzorce plazme, pripravljene v skladu z zgoraj opisanim postopkom, smo vrednost topnega RAGE ugotovili z encimskoimunskim testom Quantikine RAGE (R&D Systems), pri čemer smo upoštevali navodila proizvajalca. 50 µl vzorca/standarda smo vnesli v vdolbinice s 100 µl pufra za redčenje vzorca in inkubirali dve uri. Po štirih izpiranjih smo v alikvote dodali 200 µl konjugata in inkubirali dve uri. Po štirih izpiranjih smo v vdolbinice dodali 200 µl substrata, inkubirali 30 minut in zmešali s 50 µl raztopine za zaustavljanje na posamezni alikvot. Absorbanco smo izmerili pri valovni dolžini 450 nm, s korekcijo pri 570 nm, in sicer s čitalcem mikrotitrskih plošč Infinite (Tecan, Groening, Avstrija). Po odštetju prispevka povprečnega ničelnega standarda optične gostote smo rezultate za vzorce določili na podlagi sedmih standardnih vzorcev v razponu 78–5.000 pg/ml na podlagi štiriparametrske krivulje. Povprečni koeficient variacije replikatov je bil 2,7 %.
3.6 ANALIZA STANDARDNIH KRVNIH PARAMETROV
Analiza krvnih vzorcev je bila izvedena za naslednje hematološke parametre: koncentracija belih krvnih celic, C-reaktivni protein (CRP) in glikozilirani hemoglobin (HbA1c). Meja za oceno povišane vrednosti pri testu CRP je znašala 5 mg/l, zato smo vse vrednosti, nižje od 5 mg/l, obravnavali kot 5 mg/l. Populacije krvnih celic smo testirali s hematološkim sistemom ADVIA® 2120 Hematology System (Siemens, Erlangen, Nemčija) z reagentom ADVIA 2120/2120i BASO in na podlagi citokemijskih reakcij peroksidaze.
3.7 MERITVE TEMPERATURE STOPALA
Temperaturo kože nad prizadetimi sklepi Charcotovega stopala in nad enakimi območji kontralateralnega stopala smo izmerili z infrardečim ročnim termometrom (Thermoval duo scan, Hartmann, Heidenheim, Nemčija).
3.8 STATISTIČNA ANALIZA
Za izračun srednje vrednosti in standardnih odklonov smo uporabili metode opisne statistike.
Korelacije med ustreznimi parametri smo ugotovili s Pearsonovim koeficientom korelacije, sovpadajočo verjetnost p pa s kalkulatorjem za p-vrednosti p-Value Calculator for Correlation Coefficients, dostopnim na spletni strani http://www.danielsoper.com/statcalc.
Za izračun statistične moči smo uporabili kalkulator, dostopen na spletu (http://www.statisticalsolutions.net/pss_calc.php).
3.9 TEORETIČNI OPIS VPLIVA STRIŽNIH SIL MED PROCESIRANJEM VZORCEV NA KONCENTRACIJO ZV V IZOLATIH IZ KRVI
ZV nastajajo z vezikulacijo (predvsem krvnih) celic in vivo in ex vivo. Na te procese vplivata termični in mehanski stres, ki so jima celice v krvi podvržene med obdelavo vzorcev. Za tolmačenje rezultatov poskusov smo izdelali matematična modela, s katerima smo opisali nekatere glavne dejavnike procesiranja, in sicer model sedimentacije delcev v krvi (celic in ZV) in model pretakanja krvi skozi iglo pri odvzemu. Modelne enačbe so v prilogi B.
Gibanje celic med centrifugiranjem je kompleksen proces, ki je odvisen tudi od medsebojnih interakcij med celicami, predvsem eritrociti.
4 REZULTATI
4.1 ZUNAJCELIČNI VEZIKLI KOT OZNAČEVALCI CNA
Pri sladkornih bolnikih z aktivno CNA so rezultati standardnih testov krvi pokazali naslednje vrednosti: bele krvničke = 9,2 3,3·109/l, CRP = 19 45 mg/l in HbA1c = 7,0 1,4 % (54 ± 15 mmol/mol), kar je prikazano v preglednici 1.
Preglednica 1: Razlike v standardnih laboratorijskih preiskavah krvi, koncentraciji ZV v krvnih izolatih in koncentraciji topnega RAGE v plazmi pri 36 bolnikih z aktivno CNA in pri 25 vzorcih krvi zdravih oseb Table 1: Differences between laboratory blood test results, concentrations of EVs in blood isolates and concentrations of soluble RAGE in plasma of 36 samples of patients with active CNA and 25 samples of healthy subjects
Vzorec Test Kontrola Razlika (%) p (t-test) P (N)
BK ± SD (109/l) 9,2 ± 3,3 5,6 ± 0,5 49 0,14
RK ± SD (1012/l) 4,6 ± 0,6 5 ± 0,1 -7 0,49
Hb ± SD (g/l) 138 ± 20 150 ± 6 -8 0,44
MPV ± SD (fl) 9 ± 1 8 ± 0 12 0,18
TROMB ± SD (109/l) 244 ± 60 240 ± 32 1 0,94
LDH ± SD (µkat/l) 2,76 ± 0,59 2,66 ± 0 4 0,77
KS ± SD (mmol/l) 8,5 ± 4,8 4,3 ± 0,4 65 0,15
S-Hol ± SD (mmol/l) 4,4 ±1,4 5,2 ± 1,1 -17 0,35
Trg ± SD (mmol/l) 1,9 ± 1,2 0,8 ± 0,1 84 0,14
HDL-hol± SD (mmol/l) 1,2 ± 0,4 2,0 ± 0,4 -49 0,003* 0,93 (3)
LDL-hol ± SD (mmol/l) 2,6 ± 1,1 2,8 ± 0,8 -9 0,71
Alb ± SD (g/l) 75 ± 4 75 ± 3 0 0,94
Alb ± SD (g/l) 44 ± 4 47 ± 1 -7 0,26
CRP ± SD (mg/l) 19 ± 45 5 ± 0 117 0,55
HbA1c ± SD (%) 7,0 ± 1,4 5,6 22 NA
ZV ± SD (µl) 2790 ± 2293 1303 ± 1083 73 0,002* 0,95 (24)
RAGE ± SD 968 ± 435 1228 ± 348 -24 0,045* 0,47 (10)
Opombe: BK: bele krvničke. RK: rdeče krvničke. MPV: srednji volumen trombocitov (mean platelet volume).
TROMB: trombociti. LDH: laktatna dehidrogenaza. KS: krvni sladkor. S-Hol: celokupni holesterol. Trg:
trigliceridi, HDL-hol: lipoproteini visoke gostote LDL-hol: lipoproteini nizke gostote Alb: albumini CRP: C reaktivni protein. HbA1c: glikozilirani hemoglobin. ZV: število zunajceličnih veziklov, RAGE: koncentracija receptorjev za končne produkte glikacije, SD: standardna deviacija, NA: ni aplikabilno, p: verjetnost, ki kaže statistično značilnost razlike, P: statistična moč pri α=0,05. Zvezdica (*) označuje statistično pomembno razliko.
Srednja vrednost razlike med temperaturo prizadetega stopala in temperaturo kontralateralnega stopala je bila 2,61 0,29 °C (razpon od 2,1 do 3,6 °C). Ugotovili smo statistično pomembne korelacije med koncentracijo ZV in vrednostjo CRP (r = 0,40, p
= 0,032 pri n = 22) ter med koncentracijo ZV in temperaturno razliko med obema stopaloma
T (r = 0,84, p < 10-8 pri n = 34) kar prikazuje slika 9.
Slika 9: Koncentracija ZV in koncentracije topnega RAGE v odvisnosti od razlike temperature med stopalom s CNA in kontralateralnim stopalom, v izolatih krvi bolnikov z aktivno obliko CNA
Figure 9: EVs concentration and concentration of soluble RAGE according to the difference between the temperatures of the affected and contralateral foot in patients with active CNA
Korelacij med koncentracijo ZV in koncentracijo topnega RAGE (r = 0,08 pri n = 33), med koncentracijo topnega RAGE in temperaturno razliko T (r = -0,02 pri n = 32) ali med vrednostjo CRP in temperaturno razliko T (r = 0,03 pri n = 33) nismo ugotovili (slika 9).
4.2 VPLIV STRIŽNIH SIL NA KONCENTRACIJO ZV V IZOLATIH KRVI
Slika 10: Spreminjanje relativnega števila delcev v zgornji (1 cm debeli) plasti plazme v epruveti kot posledica centrifugalne sile. A: časovna odvisnost in B: odvisnost od razdalje zgornje plasti vzorca od osi centrifugalnega rotorja x0, za trombocite. Različne vrste celic na Sliki 10A so simulirali različni efektivni polmeri r: eritrociti (r = 3 μm), krvne ploščice (r = 1 μm), ZV (r = 0,2 μm). Drugi parametri so bili Δρ = 50 kg/m3, ω = 3000/min, η = 0,002 kg/sm, xmin = 0, xmax = 1cm
Figure 10: Change of the relative number ob particles in the upper (1 cm thick) portion of plasma in the epruvette as a consequence of centrifugal force. A: time dependence and B: dependence on the distance of the sample level from the rotor axis x0, for platelets. Various blood cells with various effective diameters r were simulated: erythrocytes (r = 3 μm), platelets (r = 1 μm), EVs (r = 0,2 μm). Other parameters were Δρ = 50 kg/m3, ω = 3000/min, η = 0,002 kg/sm, xmin = 0, xmax = 1cm.
Vzorčenje krvi je osnovni del metode izolacije ZV in je zato ključno za klinično vrednost metode. Kri je dinamičen sistem, odvisen tako od zunanjih parametrov kot od lastnosti notranjih komponent. Vzorčenje spremeni biološko-fizikalne in funkcijske lastnosti krvi, zato je lahko tudi problematični dejavnik za ponavljajočo se in natančno metodo ocenjevanja ZV odvzetih iz krvi (Štukelj in sod., 2017).
Izračunana odvisnost števila delcev v zgornji plasti plazme po centrifugiranju krvi (Enačba (A11)) je prikazana na Sliki 10 A.Vidimo pojemanje števila delcev v zgornjem delu epruvete s časom, zaradi njihove sedimentacije pod vplivom centrifugalne sile. Vidimo, da se število večjih in težjih eritrocitov v zgornjem delu epruvete manjša hitreje kot število manjših in lažjih trombocitov oziroma še manjših ZV. Ob izbiri kotne hitrosti rotorja centrifuge v območju, ki je relevantno za poskuse, prikazane v tem delu, in časa, tj.20 minut, s slike 10 A razvidno, da večina eritrocitov sedimentira, večina trombocitov in skoraj vsi ZV pa ostanejo v zgornjem delu epruvete. Slika 10 B prikazuje odvisnost števila delcev v zgornjem delu epruvete od razdalje vzorca od osi rotorja centrifuge. Če je vzorca v epruveti več in je v povprečju bližje osi rotorja, je centrifugalna sila na delce manjša in jih več ostane v zgornjem delu. ZV večinoma nastanejo iz trombocitov v naslednjem koraku (pri centrifugiranju pri velikih hitrostih). Tako pričakujemo, da bo ZV v izolatih več, če bo izhodnega vzorca krvi več.
Slika 11 prikazuje izmerjeno odvisnost koncentracije ZV v izolatih od oddaljenosti gladine izhodnega vzorca krvi od osi rotorja. Vidimo, da v skladu s pričakovanji, koncentracija ZV v izolatih pada z x0(Štukelj in sod., 2017). Pri apliciranih centripetalnih pospeških centrifuge model, v katerem imajo delci fiksno identiteto, napove, da se pri prvem centrifugiranju koncentracija ZV v zgornji plasti nastale plazme v veliki meri ohrani (slika 10 A), skoraj vsi ZV pa se potem sedimentirajo v peletu pri drugem centrifugiranju, pri večjih centripetalnih pospeških. Tako bi v tem primeru pričakovali, da bi bilo število ZV v izolatih neodvisno od oddaljenosti gladine vzorca od osi rotorja. Vendar pa vidimo, da število ZV v izolatih sledi številu trombocitov v zgornji plasti plazme po prvem centrifugiranju (Slika 10B), kar kaže na to, da ZV nastajajo med procesom izolacije in to pretežno iz trombocitov. Iz elektronsko mikroskopskih slik izolatov je razvidno, da so nastali ZV ob stenah epruvet deformirani in usmerjeni (Šuštar in sod., 2011), vzorci odvzeti iz osrednjega dela pa kažejo več globularnih oblik. Oblika fragmentov, ki ostanejo ob stenah epruvete, tudi kaže, da se med deformacijo oblikujejo tanki vratovi, z njihovim trganjem pa nastajajo manjši fragmenti (Šuštar in sod., 2011). Tako smo sklepali, da do fragmentacije prihaja predvsem ob stenah epruvete, zaradi strižnih sil, ki delujejo na celice in njihove fragmente.
Slika 11: Koncentracija ZV v izolatih v odvisnosti od razdalje med zgornjo ravnjo plazme in osjo centrifugalnega rotorja x0. Vzorce smo dobili od treh zdravih darovalcev (1 ženske, stare 54 let in 2 moških, starih 25 oziroma 23 let)
Figure 11: EVs concentration in relation to the distance of the upper level of the sample and centrifuge rotor axis x0. Blood was donated by three donors without a record of disease (a female, 54 years and two males, 25 and 23 years of age)
Strižne sile delujejo na celice tudi ob odvzemu krvi, saj se kri pretoči skozi relativno ozko iglo. Energijo strižnih sil med pretakanjem skozi iglo smo ocenili z delom, ki ga opravijo strižne sile pri pretakanju skozi iglo, z matematičnim modelom (Enačba (B 32)). Ker v izrazu za delo nastopata parametra viskoznost in gostota krvi, ki sta karakteristična za posamezen vzorec, a ju ne poznamo, vpeljemo kot relevantno količino razmerje dela strižnih sil pri pretakanju skozi dve igli z različnima dimenzijama A=A1/A2, in razmerje ustreznih izmerjenih koncentracij ZV v izolatih ZV = cZV,1/cZV,2. Slika 12 prikazuje odvisnost koncentracije ZV od dela strižnih sil. Med količinama je statistično pomembna korelacija (Pearsonov koeficient korelacije = 0.69, p = 1.2 ·10-5), kar podpira hipotezo, da večina ZV v izolatih nastane v procesu izolacije.
Slika 12: Energija, porazdeljena v igli, v odvisnosti od koncentracije ZV v izolatih. Vsaka točka označuje dva odvzema, drugega za drugim, pri istem preiskovancu, z različnima vrstama igel: δA = A1/A2 in δNV = cNV,1/cNV,2
Figure 12: Energy dissipated in the needle in dependence on the concentration of EVs in the isolates. Each point was obtained by two blood samplings performed on the same donor, immediately one after another, but with different types of needles: δA = A1/A2 and δNV = cNV,1/cNV,2.
5 RAZPRAVA
Za uspešno zdravljenje CNA sta ključna zgodnje prepoznavanje in pravočasna diagnoza bolezni (Petrova in sod., 2007; Yousaf in sod., 2018). Odsotnost značilnih znakov, označevalcev CNA ter nespecifičnost izvidov laboratorijskih in radioloških preiskav, da bi ugotovili bolezen in potrdili diagnozo, so izziv (Rogers in sod., 2013). Proučevanje pojava CNA je raziskovalcem izziv tudi zato, ker bolezen v aktivni fazi pogosto ostane neprepoznana, v kronični fazi pa klinični znaki in potencialni označevalci bolezni izzvenijo.
Študije pojava in mehanizmov nastanka CNA so praviloma dolgotrjane in izvedene na majhnih vzorcih preiskovancev. Tako so Petrova in sod. (2014) v študijo proučevanja aktivnosti osteoklastov, izoliranih iz krvi, vključili osem bolnikov z aktivno CNA. V študijo potencialnega mehanizma signaliziranja RANKL/RANK/OPG-poti in morebitnega vpliva tega na poapnenje žilne stene (Ndip in sod., 2011) je bilo vključenih 12 bolnikov z aktivno CNA. Pasquier in sod. (2017) so proučevali mikrovezikulacijo krvi v aktivni CNA. V raziskavo so vključili 11 bolnikov z aktivno CNA, o njihovih ugotovitvah smo poročali v pregledu virov s področja ZV (Pasquier in sod., 2017). V našo raziskavo smo vključili 36 bolnikov z aktivno CNA.
Kolikor nam je znano iz dostopnih virov literature, v svetu ni bila izvedena nobena študija, v katero bi vključili veliko bolnikov z aktivno CNA. Nabor preiskovancev je namreč dolgotrajen, kar potrjuje dejstvo, da je raziskava proučevanja kostne gostote petnice pri bolnikih z aktivno CNA pri 36 bolnikih z aktivno CNA potekala šest let, med letoma 2002 in 2008 (Petrova in Edmonds, 2010).
V začetni aktivni CNA rentgenske slike in standardni parametri vnetja (bele krvničke, sedimentacija in CRP) ne pokažejo odstopov od normalnih vrednosti in pogosto niso povišani (Pakarinen in sod., 2002). Nekatere študije so pokazale povezavo med CNA in vnetji (Petrova in sod., 2007; Uccioli in sod., 2010): visokoobčutljiv test CRP je pri analizi vzorcev krvi 36 bolnikov s CNA potrdil le malce zvišano srednjo vrednost CRP, 5,4 (1,8–
19,9) mg/l, ki je bila statistično pomembno višja kot pri sladkornih bolnikih brez CNA ter višja kot pri kontrolni skupini brez ugotovljene CNA, kjer je bila nižja od 5 mg/l – hkrati je 50 % bolnikov s CNA izkazovalo normalne vrednosti CRP. V naši raziskavi smo potrdili ugotovitve, da je srednja vrednost koncentracije belih krvničk v okvirih normalnih vrednosti belih krvničk, vrednosti CRP v aktivni CNA pa so povišane (19 mg/ml). V skladu z ugotovitvami Petrove in sod. (2015) je imelo 25 % naših bolnikov normalen CRP, 25 % bolnikov je imelo nekoliko povišan CRP (5–10 mg/l), 23 % bolnikov pa je imelo CRP višji od 10 mg/l.
Ker mehanizmi nastanka CNA še niso pojasnjeni, za potrditev aktivne CNA, znanih označevalcev bolezni še nimamo. RAGE, pridobljen iz plazme, je bil predlagan kot možen biološki označevalec za CNA, čeprav so podatki za kaj takega še nezadostni (Oliveira in sod., 2013) in povezani z ledvičnim delovanjem (Semba in sod., 2009). ZV so pred kratkim pritegnili zanimanje znanstvenikov z različnih področij medicine in biologije, tudi pri poznih zapletih SB, vendar, kolikor nam je znano, poročil o delovanju ZV pri bolnikih s CNA še ni.
ZV se lahko izkažejo kot diagnostični označevalec, zlasti v povezavi z drugimi kazalniki bolezni ali v primerih diagnostične negotovosti (npr. ob sočasnem vnetju kosti, osteomielitisu), in nam morebiti lahko pomagajo bolje razumeti patogenezo diabetične CNA.
Iz teh razlogov smo raziskavo osredotočili na vlogo ZV pri aktivni CNA. Prvi smo pokazali, da lahko ZV nastopajo kot uporabni biološki označevalci za CNA (Schara in sod., 2017).
Pokazali smo, da pri bolnikih s CNA koncentracija ZV v izolatih, dobljenih iz vzorcev periferne krvi, izkazuje povezavo s temperaturno razliko med prizadetim in kontralateralnim stopalom (r = 0,84, p < 10-8), kar je znani označevalec bolezenske aktivnosti (Rogers in sod., 2011). Ugotovili smo, da koncentracija ZV izkazuje povezavo s standardnim vnetnim označevalcem CRP (r = 0,40, p = 0,032), kar potrjuje izsledke predhodnih študij, ki kažejo na povišano koncentracijo ZV, izoliranih iz krvne plazme in sinovijske tekočine bolnikov z vnetimi sklepi (Buzas in sod., 2014). Če je z ZV povzročen povečani metabolizem osnovni mehanizem razvoja CNA in vnetja, vnetje ni predpogoj za CNA, vendar je lahko verjetnost njegovega pojava večja. Statistično pomembne korelacije med izmerjenimi standardnimi krvnimi parametri (vključno s CRP) in koncentracijo topnega RAGE ter statistično pomembne korelacije med koncentracijo topnega RAGE in temperaturno razliko med prizadetim in kontralateralnim stopalom nismo ugotovili.
Odsotnost korelacije med CRP in temperaturno razliko T kaže tudi na to, da vnetni proces ni vzrok za povišano lokalno temperaturo pri CNA. Možno je, da skupni osnovni mehanizmi (npr. mehanizmi, ki temeljijo na ZV) sodelujejo pri patogenezi CNA, vnetju in metabolizmu naprednih končnih produktov glikacije (AGE).
Zaradi okvar avtonomnega živčevja, ki lahko povzročijo izgubo arterijske kompliance, se v majhnih žilah tkiv ohranita turbulenten pretok krvi z večjo strižno napetostjo in višja lokalna temperatura. Povečana strižna napetost aktivira celice v krvi, zlasti trombocite, in ojača njihovo mikrovezikulacijo ex vivo in in vivo. ZV, ki so nastali in vivo, hitro zajamejo celice (Ogorevc in sod., 2014) v kosteh in v kostnem mozgu. Učinek lahko okrepi poškodba, ki povzroči spremembe prizadetih krvnih žil, kar lahko vodi v njihovo (delno) okluzijo.
Nadaljnji mehanizmi lahko izhajajo iz povišanega lokalnega tlaka kisika (O2) (Boulton in sod., 1982). Posledično se poveča verjetnost nastanka oksidiranih fosfolipidov v membrani
