UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Anja PIRIH
UPORABA ELEKTROPORACIJE PRI UNIČEVANJU RAKASTIH CELIC
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Anja PIRIH
UPORABA ELEKTROPORACIJE PRI UNIČEVANJU RAKASTIH CELIC
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
USE OF ELECTROPORATION IN THE DESTRUCTION OF CANCER CELLS
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Mojco Narat.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum predstavitve: 26. avgust 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 606:616-006.6:615.28:602.621(043.2)
KG elektroporacija, rakaste celice, elektrokemoterapija, ablacija tumorjev AV PIRIH, Anja
SA NARAT, Mojca (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN UPORABA ELEKTROPORACIJE PRI UNIČEVANJU RAKASTIH CELIC TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja)
OP VI, 22 str., 3 sl, 65 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Elektroporacija je fizikalna metoda, ki omogoča prehajanje številnih molekul skozi celično membrano, ki jih celica v normalnih pogojih ne prepušča. Z uporabo kratkih, visokonapetostnih električnih pulzov v plazemski membrani povzročimo nastanek hidrofilnih por. Ločimo reverzibilno elektroporacijo, po kateri se celična membrana zaceli in ireverzibilno elektroporacijo, po kateri se celična membrana ne more regenerirati ter posledično pride do celične smrti. Elektroporacija ima veliko možnih aplikacij na več področjih. Uporablja se jo za zlivanje celic, transfekcijo ali transformacijo celic, sterilizacijo vode, pasterizacijo hrane, ekstrakcijo snovi.
Elektroporacija je dobila tudi mesto v medicini, na področju zdravljenja raka. Za ta namen lahko uporabimo reverzibilno elektroporacijo, s katero omogočimo, da v rakaste celice prodrejo citostatiki in tako povečamo njihov učinek. Pri uporabi citostatika cisplatin z elektroporacijo povečamo njegovo učinkovitost za 70-krat, pri bleomicinu pa kar do 700-krat. Možna je tudi uporaba ireverzibilne elektroporacije, kjer rakaste celice ubijemo in jo uporabljamo za netermično ablacijo tkiv in tumorjev.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 606:616-006.6:615.28:602.621(043.2)
CX electroporation, cancer cells, electrochemotherapy, tumor ablation, AU PIRIH, Anja
AA NARAT, Mojca (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI USE OF ELECTROPORATION IN THE DESTRUCTION OF CANCER CELLS DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VI, 22 p., 3 fig., 65 ref.
LA sl AL sl/en
AB Electroporation is a physical method that allows the passage of many molecules through the cell membrane that is impermeable to this very molecules. Using short, high-voltage electrical pulses in the plasma membrane causes the formation of hydrophilic pores. Membrane electroporation can either be reversible (cell membrane reseal) or irreversible (cell membrane cannot return to its primary state and cell death occurs). Electroporation has many possible applications in several areas. It is used for cell fusion, water sterilization, food pasteurization, substance extraction, transfection, transformation, etc. Electroporation has also gained a place in medicine, especially in the field of cancer treatment. For this purpose, reversible electroporation is used to introduce cytostatic into cancer cells. When electroporation is used, the efficiency of cisplatin increases 70 times and the efficiency of bleomycin up to 700 times. We can also use irreversible electroporation, where we kill cancer cells, for non-thermal ablation of tissues and tumors.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V KAZALO SLIK VI
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI VI
1 UVOD 1
2 ELEKTROPORACIJA 1
2.1 PLAZEMSKA MEMBRANA 1
2.1.1 Mirovalna in vsiljena napetost na plazemski membrani 2
2.2 KONCEPT ELEKTROPORACIJE 3
2.2.1 Nastanek por 3
2.2.2 Regeneracija membrane 4
2.2.3 Povečana prepustnost membrane – transport 4
2.2.4 Nanoelektroporacija 5
2.3 REVERZIBILNA IN IREVERZIBILNA ELEKTROPORACIJA 6
2.4 DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA ELEKTROPORACIJO 7
2.4.1 Parametri električnega polja 7
2.4.2 Temperatura 8
2.4.3 Prevodnost in sestava medija 8
2.4.4 Osmolarnost 8
2.4.5 Popolnost celičnega citoskeleta 8
2.5 UPORABA ELEKTROPORACIJE 9
3 BIOLOŠKO TKIVO 10
3.1 ELEKTRIČNE LASTNOSTI 11
4 UNIČEVANJE RAKASTIH CELIC 12
4.1 KARCINOGENEZA IN LASTNOSTI RAKASTIH CELIC 12
4.1.1 Biološke značilnosti rakastih celic 13
4.1.2 Tumor kot kompleksno tkivo 13
4.2 ELEKTROKEMOTERAPIJA 13
4.2.1 Citostatiki 14
VI
4.2.1.1 Bleomicin 15
4.2.1.2 Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2 15
4.2.3 Protokol zdravljenja 16
4.2.4 Dejavniki povezani z odzivnostjo tumorja na elektrokemoterapijo 16 4.3 ABLACIJA TKIVA – TUMORJEV Z UPORABO IREVERZIBILNE
ELEKTROPORACIJE
17
4.4 STRANSKI UČINKI ELEKTROPORACIJE 17
5 ZAKLJUČEK 18
6 VIRI 18
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Sferična celica v električnem polju. 2
Slika 2: Energija hidrofobnih (predpor) in hidrofilnih por v odvisnosti od polmera por (levo) in nastanek por na molekularnem nivoju (desno).
4 Slika 3: Glede na uporabljene parametre električnega polja (jakost električnega polja,
dolžina pulzov) ločimo 4 območja elektroporacije: območje brez elektroporacije, reverzibilno območje, ireverzibilno območje in termično območje.
6
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
AIDS sindrom pridobljene imunske pomanjkljivosti (eng. acquired immunodeficiency syndrome)
ATP adenozin trifosfat
DNK deoksiribonukleinska kislina GTP gvanozin trifosfat
HPV humani virus papiloma RNK ribonukleinska kislina
1 1 UVOD
O elektroporaciji celic so poročali že leta 1958 (Kotnik in sod., 2015). Vseeno pa je bilo potrebno veliko časa in razumevanja, da se je elektroporacija vpeljala v aplikativno rabo.
Zaradi načina delovanja jo lahko uporabimo povsod, kjer želimo povečati prepustnost plazemske membrane ali uničiti tarčne celice (Marjanović in Miklavčič, 2011). Rakava obolenja postajajo v modernem svetu vse pogostejša in zaradi vse daljše življenjske dobe ter hitrega načina življenja naj bi v prihodnosti za rakom zbolel vsak drugi moški in vsaka tretja ženska (Kovač, 2018). Zato stremimo k novim metodam zdravljenja rakastih obolenj, ki bodo čim manj invazivna ter bolj znostna za bolnika. Kot perspektivni metodi, ki temeljita na uporabi elektroporacije, se na tem področju vse bolj uveljavljata elektrokemoterapija in ablacija tkiva z ireverzibilno elektroporacijo, na kateri se bom osredotočila v svojem diplomskem delu.
Z razumevanju elektroporacije in razvijanju novih aplikacij se v Sloveniji ukvarjajo raziskovalci na Onkološkem inštitutu in Fakulteti za elektrotehniko, Univerze v Ljubljani (Oddelek za biokibernetiko). Prva klinična raziskava elektrokemoterapije iz leta 1991 je spodbudila slovenske raziskovalce, da pričnejo z lastnimi študijami elektroporacije. Tako sta se Onkološki inštitut in Fakulteta za elektrotehniko osredotočili na elektrokemoterapijo z uporabo cisplatina. S partnerskimi inštitucijami iz Francije, Danske in Irske so v okviru dveh evropskih projektov Cliniporator in ESOPE razvili generator električnih pulzov CliniporatorTM in pripravili standardne operativne postopke za zdravljenje z elektrokemoterapijo (Mir in sod., 2006).
2 ELEKTROPORACIJA
Elektroporacija je pojav, pri katerem celice začasno izpostavimo električnemu polju, kar povzroči začasno povečano permeabilnost plazemske membrane in spremenjeno električno prevodnost (Kotnik in sod., 2005; Kotnik in sod. 2015). Proces elektroporacije je lahko reverzibilen ali ireverzibilen in ga najbolje opisuje teorija o nastanku hidrofilnih por v membrani (Mir in sod., 1998a).
2.1 PLAZEMSKA MEMBRANA
Vse celice imajo plazemsko membrano, ki je v splošnem sestavljena iz tankega lipidnega dvosloja (5 nm), v katerega so vgrajeni proteini, ki omogočajo transport molekul in ionov.
Glavna funkcija plazemske membrane je ločevanje in zaščita notranjosti celice pred okoljem.
Sodeluje pa tudi pri vzdrževanju homeostaze, urejanje komunikacije med celicami in celični signalizaciji, ionski prevodnosti ter pri pritrjevanju celic (Kotnik in sod., 2012). Osnovni gradniki membrane so fosfolipidi, ki imajo hidrofilno glavo in hidrofoben rep. V nepoškodovani membrani se fosfolipidne molekule razporedijo v dve plasti, tako da so hidrofobni repi obrnjeni drug proti drugemu, hidrofilne glave pa se orientirajo navzven, proti polarnemu, pretežno vodnemu okolju, tako da so na eni stani v stiku z zunanjim celičnim okoljem, na drugi strani pa z notranjostjo celice. Takšna struktura je selektivno prepustna za lipofilne snovi in neprepustna za vodotopne snovi, kot so ioni in glukoza. Celici daje tudi sposobnost, da uravnava transport teh snovi skozi membrano preko iz proteinov grajenih kanalčkov, ki ustvarjajo polarno okolje (Salimi, 2011).
2
2.1.1 Mirovalna in vsiljena napetost na plazemski membrani
Z električnega vidika deluje plazemska membrana kot tanek izolacijski sloj, ki je na obeh straneh obdan z vodnima raztopinama elektrolitov (Kotnik in sod., 2012).
Na celični membrani je konstantno prisotna električna napetost, ki je posledica primanjkljaja pozitivnih ionov v citoplazmi. Najpomembnejši so K+ ioni, ki membrano prehajajo preko Na+/K+ črpalk in trajno prepustnih K+ kanalčkov. Ko se pretok K+ stabilizira, se vzpostavi ravnotežno stanje. Takrat imamo na membrani mirovalno napetost, ki ima negativen predznak z razponom od 40 do 90 mV. Mirovalna napetost je odvisna od vrste celic in faze celičnega cikla (Kotnik in sod., 2005).
V električnem polju pride do prerazporeditve ionov v zunajceličnem mediju in citoplazmi, ki se gibljejo v smeri električne sile. Ker jim plazemska membrana predstavlja neprehodno oviro se na straneh membrane ustvari presežek ionov, ki povzroči polarizacijo membrane. Na membrani se tako vzpostavi vsiljena transmembranska napetost. Tekom izpostavljenosti električnim pulzom je celotna napetost na membrani enaka vsoti vsiljene in mirovalne napetosti. Po koncu izpostavitve električnemu polju se stanje normalizira in na membrani ostane le mirovalna napetost (Kotnik in sod., 2005).
Nastalo vsiljeno napetost opisuje Schwanova enačba (1), v kateri E predstavlja jakost električnega polja, R polmer celice in θ kot med smerjo električnega polja in izbrano točko na membrani, kot je prikazano na sliki 1. V primerjavi z mirovalno napetostjo, ki je po celotni membrani enaka, se vsiljena napetost razlikuje in je odvisna od kota θ. Schwanova enačba velja le za sferične (okrogle) celice, za ostale oblike pa so potrebne dodatne matematične izpeljave (Kotnik in sod., 2005). Bolj kot tokovnice električnega polja pravokotno prihajajo na površino celice, večja je sprememba transmembranskega potenciala oz. vsiljene napetosti (Maček Lebar in sod., 1998).
… (1)
Slika 1: Sferična celica v električnem polju. E – vektor jakosti električnega polja. r – polmer celice. θ – kot med smerjo električnega polja, središčem celice in izbrano točko na membrani (Shill in sod., 2007).
Kratkotrajna vsiljena transmembranska napetost do okoli 100 mV na membrani ne pusti posledic (Marjanovič in Miklavčič, 2011). Ko pa vsiljena napetost preseže določeno vrednost
3
(0,2 – 1 V), ki je odvisna od parametrov električnega pulza, je tisti del membrane polariziran in pride do oblikovanja prepustnih por (Serša in sod., 2015). V večini primerov si želimo, da s previsokim električnim poljem ne poškodujemo celice, zato je jakost električnega polja optimizirana med reverzibilnim in ireverzibilnim pragom elektroporacije (Davalos in sod., 2004).
2.2 KONCEPT ELEKTROPORACIJE
Proces elektroporacije je sestavljen iz treh faz. Prva faza je tvorba hidrofilnih por, ki je odziv celične membrane na inducirani prag membranskega potenciala, in traja nekaj mikrosekund.
Druga faza je časovno odvisna širitev velikosti por, ki poteka v časovnem razponu od 100 mikrosekund do milisekund in traja ves čas trajanja impulzov. Zadnja faza je regeneracija membrane, ki poteka po končanem tretiranju z električnimi pulzi. V tej fazi celica zapira pore v membrani in to traja nekaj minut (Kandušar in Miklavčič, 2008).
2.2.1 Nastanek por
Ko je celica izpostavljena močnemu električnemu polju, pride do polarizacije membrane, ker je njena prevodnost veliko manjša od zunanjega medija in citoplazme. Prisotni inducirani električni potencial skozi membrano se poveča, kar zagotavlja prosto energijo, ki je potrebna za strukturne spremembe v membrani (Kandušar in Miklavčič, 2008). Molekule vode na hidrofilnih regijah takrat pričnejo usmerjati svoje dipole vzdolž lokalno izpostavljenega električnega polja. Zaradi nastanka medmolekularnih vodikovih vezi, nastaja skupek molekul vode, ki se vse bolj širi v hidrofobni del membrane, dokler ne pride do združitve molekul vode iz obeh strani lipidne membrane (Kotnik in sod., 2019). V membrani se tako ustvarijo prehodne, vendar nestabilne pore imenovane "predpore", ki so hidrofobne, saj steno tvorijo hidrofobni repi fosfolipidov. Predpore se pričnejo širiti in ko njihov polmer preseže kritično vrednost (Salimi, 2011), se lipidi, ki mejijo na sloj vodnih molekul, znotraj pore pričnejo preusmerjati s svojimi polarnimi glavami proti vodnemu sloju (Kotnik in sod., 2019).
Prerazporeditev fosfolipidnih molekul privede do nastanka stabilnih hidrofilnih por, ki omogoča transport večjih in polarnih molekul (ioni, proteini, DNK) (Salimi, 2011). Proces tvorbe por v membrani prikazuje slika 2.
Z vedno višjo vsiljeno napetostjo se niža energija, ki je potrebna za tvorbo por. Zato tudi največ por nastane na delih membrane z najvišjo vsiljeno napetostjo (Kotnik in sod., 2012). Z višjo napetostjo se povečuje tudi verjetnost njihovega nastanka (Kotnik in sod., 2005).
Energija hidrofilne pore je odvisna od debeline celične membrane in premera pore. Ko premer pore narašča, hitro narašča tudi njena energija, ki narašča vse do kritične točke preloma/premera (R* na sliki 2) (Fuertes in sod., 2011). V tej točki imata hidrofobna in hidrofilna pora enako energijo, hkrati pa se pričnejo fosfolipidne molekule reorganizirati v hidrofilno poro, ki predstavlja za celico energetsko ugodnejše stanje (Fuertes in sod., 2011;
Salimi, 2011). Hidrofilna pora svoj minimum energije doseže pri Rm, ki je hkrati tudi točka, kjer je pora strukturno dokončno oblikovana. Če polmer pore preseže Rd, se pore neomejeno širijo in povratna formacija membrane ni več mogoča (Salimi, 2011). Energija hidrofilne pore je predvsem odvisna od premera in površinske napetosti (Fuertes in sod., 2011).
4
Slika 2: Energija hidrofobnih (predpor) in hidrofilnih por v odvisnosti od polmera por (levo) in nastanek por na molekularnem nivoju (desno). Prvi minimum energije se nahaja pri polmeru 0, ko pore ni oz. ko je membrana v naravnem stanju (A). Maksimum energije R* predstavlja točko v kateri prihaja do prerazporeditve lipidnega dvosloja iz hidrofobne pore (B) v hidrofilno poro (C). Če napetost ni previsoka, sledi še en minimum energije Rm, v katerem se pora ustali/stabilizira. Pri previsoki napetosti pa ta minimum energije ni prisoten in pora ob raztezanju nad kritičnim polmerom Rd ne doseže stabilnega stanja, kar povzroči nepovratno formacijo (D) (Kotnik in sod., 2005, 2012).
2.2.2 Regeneracija membrane
Ko se zunanje električno polje prekine, se lahko nastale kratkotrajne pore strukturno preuredijo v osnovno stanje ali pa zavzamejo stabilno konformacijo (Maček Lebar in sod., 1998). Da celica po izpostavitvi električnemu polju ostane živa, mora hitro obnoviti svojo membrano. Na mikroskopskem nivoju to pomeni, da mora zapreti nastale pore (Kotnik in sod., 2012). Zapiranje por je obraten proces njihovemu nastanku, z razliko, da zapiranje por ni odvisno od električnega polja pod katerim je bila pora ustvarjena (Kotnik in sod., 2019).
Sestava lipidnega dvosloja daje membrani fluidnost in elastičnost, zaradi česar se lahko membrana s številnimi hidrofilnimi porami povrne oz. regenerira v prvotno stanje (Kotnik in sod., 2012). Zapiranje por je postopno in počasno, saj mora vsaka pora za svoje zaprtje preseči določen energijski prag. Proces je zaključen, ko se ponovno vzpostavi selektivna prepustnost membrane (Kotnik in sod., 2005).
Ta faza je močno odvisna od temperature in ohranjenosti citoskeleta (Kandušar in Miklavčič, 2008).
2.2.3 Povečana prepustnost membrane – transport
S povečanjem prepustnosti membrane se prične povečan transport snovi preko membrane, ki se povečuje z višanjem električne poljske jakosti in kmalu doseže največjo vrednost – plato (Batista Napotnik in sod., 2008).
Plazemska membrana je v naravnem stanju selektivno prepustna in omogoča prehajanje le majhnih in nenabitih molekul. Preko nastanka hidrofilnih por se prepustnost membrane močno poveča, kjer povečan tok molekul poteka v obe smeri. Tako lahko v celico potujejo različne molekule – zdravila (bleomicin, cisplatin), DNK, ioni, itd., hkrati pa iz celice nenadzorovano molekule tudi izhajajo izgubljamo – med njimi tudi ATP in GTP. Padec
Energija [10-21 J]
R* Rm Rd RPolmer [nm] d
5
koncentracije ATP v citoplazmi je za celico signal neravnovesja in nevarnosti, kar lahko privede do celične smrti (Serša in sod., 2015).
Tekom povečane prepustnosti membrane transport snovi v glavnem poteka po enem izmed 3 načinov:
- manjše molekule (< 4kDa), ki sicer niso prisotne v celici, potujejo s pomočjo difuzije, ki jo poganja koncentracijski gradient (Serša in sod., 2015);
- hidrofilne snovi, ki prosto ne prehajajo membrane, potujejo v celico preko nastalih hidrofilnih por;
- večje makromolekule (zdravila, proteini, DNK, RNK) oz. električno nabite molekule pa v času delovanja električnega polja prehajajo membrano s pomočjo elektroforetske vlečne sile (Kotnik in sod., 2005; Serša in sod., 2015). Makromolekule za najbolj optimalen transport potrebujejo časovno daljše trajajoče impulze ali pa večje število le-teh ter kombinacijo visoko in nizko napetostnih pulzov (Kandušar in Miklavčič, 2008).
2.2.4 Nanoelektroporacija
Ob povečanju jakosti električnega polja na 10-100 kV/cm in skrajšanju dolžine pulzov iz mikrosekund na nanosekunde pridemo v območje nanoelektroporacije. Z razliko od klasične elektroporacije se pri nanoporaciji vsiljena transmembranska napetost in tako tudi pore pojavijo na membranah znotrajceličnih organelov, kar nam omogoča znotrajcelično manipulacijo (Marjanović in Miklavčič, 2011).
Prav tako kot na plazemski membrani, se na membranah organelov vzpostavi vsiljena napetost. Sprva napetost narašča podobno kot na plazemski membrani, nato pa zaradi polarizacije v notranjosti celice, ki lokalno izničuje zunanjo električno polje, že v nekaj nanosekundah prične padati. Pri tem vsiljena napetost na plazemski membrani še vedno narašča. V fazi naraščanja napetosti na membranah organelov, lahko z dovolj visokim impulzom povzročimo tudi napetost, ki preseže kritično vrednost, s tem pa se prično ustvarjati pore v membranah organelov (Batista Napotnik in sod., 2008). Trajanje impulza je krajše od časa, ki je potreben za polarizacijo membrane. Pore, ki nastanejo, imajo polmer minimalne energije in se ne širijo naprej, ker pri uporabi kratkih visokonapetostnih pulzov tvorba por prevladuje nad njihovim širjenjem (Salimi, 2011).
Da dosežemo poracijo membrane organelov, pri čemer plazemska membrana ni porirana, moramo imeti ali organel, katerega notranjost je bolj prevodna kot citosol ali pa organel, katerega membrana ima manjšo dielektričnost kot plazemska membrana (Batista Napotnik in sod., 2008).
Aplikacije nanoporacije so še v fazi razvoja in raziskav, vseeno pa visokonapetostni nanosekundni pulzi postajajo učinkovito orodje za znotrajcelično manipulacijo, študije celičnih funkcij, proučevanje procesov apoptoze, zdravljenja raka, gensko transfekcijo, celjenje ran in razkuževanje (Batista Napotnik in sod., 2008).
6
2.3 REVERZIBILNA IN IREVERZIBILNA ELEKTROPORACIJA
Sprememba prepustnosti membrane je lahko reverzibilen ali ireverzibilen proces (Maček Lebar in sod., 1998). Glede na razpon jakosti električnega polja in dolžine električnih pulzov lahko definiramo 4 območja elektroporacije, ki so prikazana na sliki 3: območje brez elektroporacije, reverzibilno območje, ireverzibilno območje in termično območje. Območja se delno prekrivajo, ker je nastanek por naključen in ker se celice v splošnem razlikujejo med seboj po velikosti in/ali usmerjenosti glede na električno polje. Na meje med območji vplivajo tudi lastnosti medija v katerem celice so – električna prevodnost, osmolarnost, prisotnost topljencev (Kotnik in sod., 2015).
Slika 3: Glede na uporabljene parametre električnega polja (jakost električnega polja, dolžina pulzov) ločimo 4 območja elektroporacije: območje brez elektroporacije, reverzibilno območje, ireverzibilno območje in termično območje (Marjanović in Mikalvčič, 2011).
Prvo je območje, kjer elektroporacije ne zaznamo. Čeprav se lahko nekaj por oblikuje so te zelo majhne in kratkotrajne in nimajo vpliva na transmembranski transport. V območju reverzibilne elektroporacije pore predstavljajo začasno pot za transport, vendar se po koncu električnega pulza postopoma zaprejo, transport se ustavi in večina celic ohrani svojo sposobnost preživetja (Kotnik in sod., 2015). Premer por narašča z daljšo izpostavljenostjo oz.
z višjo jakostjo električnega polja, njihova stabilnost pa hitro upada z naraščanjem membranske napetosti (Kotnik in sod., 2005). Ko presežemo optimalne parametre elektroporacije, vstopimo v območje netermične ireverzibilne elektroporacije, ki v celici povzroči poškodbe DNK, mehansko porušitev membrane in izgubo celične integritete, ker privede do celične lize (Kandušar in Miklavčič, 2008). Ko pride do porušenja homeostaze v celici to privede do njene smrti (Marjanović in Miklavčič, 2011). Nastale pore v membrani se ne zaprejo ali pa se zapirajo prepočasi, da se ohrani sposobnost preživetja celic. Celice tako postopoma razpadajo in sproščajo svojo vsebino, ki pa ni termično poškodovana (Kotnik in sod., 2015). Prav tako v ireverzibilnem območju ne moremo pulzov povečevati v nedogled.
7
Če je pulzov preveč ali pa so le ti predolgi in/ali premočni, preidemo že v območje termičnega segrevanja. Pri tem lahko poškodujemo tkivo oz. celice zaradi prevelikega povišanja temperature, na račun toplotnih izgub. Te izgube so posledica električnega toka, ki teče skozi tkivo, ko je celica izpostavljena električnemu polju (Al-Sakere in sod., 2007).
Povišana temperatura v celici povzroči denaturacijo proteinov in taljenje DNK. Proces se zaključi s celično smrtjo (Kotnik in sod., 2015).
2.4 DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA ELEKTROPORACIJO
Da z elektroporacijo dosežemo željeni učinek moramo ustrezno izbrati parametre električnih pulzov, ustrezno temperaturo, sestavo medija, ki je povezana s njegovo prevodnostjo in osmolarnostjo. Kot dejavnik na uspešnost elektroporacije vpliva tudi popolnost celičnega citoskeleta. Edini parametri, na katere lahko vplivamo, so parametri električnih pulzov ter oblika in postavitev elektrod (Mir in sod., 1998a).
2.4.1 Parametri električnega polja
Prametri električnega polja so eni izmed najpomembnejših dejavnikov, s katerimi vplivamo na potek elektroporacije. Med te parametre vključujemo obliko, dolžino, amplitudo, število in frekvenco ponavljanja. Z izbiro parametrov vplivamo ali je elektroporacija v reverzibilnem ali ireverzibilnem območju (Maček Lebar in sod., 1998).
Prvi parameter je oblika električnih pulzov, ki jih lahko dovajamo v eni smeri in jim pravimo pravokotni pulzi, lahko pa se njihova orientacija tekom dovajanja spreminja. Razlika med oblikama se kaže predvsem v procesu polarizacije membrane, ki poteka na drugačen način (Neumann, 1992).
V splošnem velja, da intenziteta elektroporacije narašča z višanjem jakosti in trajanja električnih pulzov, vendar pa se pri daljših dolžinah pulzov prične sproščati toplota, s čimer tvegamo termične poškodbe celic (Kotnik in sod. 2005; Pliquett in sod., 1996). S tem pa narašča tudi delež celic, ki elektroporacije ne preživijo (Pliquett in sod., 1996).
Pomembna pa je tudi frekvenca ponavljanja pulzov. Ko pulze impliciramo s frekvenco nad 1 kHz je premor med dvema zaporednima pulzoma prekratek, da bi se membrana vrnila v pred- pulzno stanje. Najbolj optimalno območje frekvence je med 0,5 in 10 Hz (Kandušar in Miklavčič, 2008).
Z višanjem amplitude, dobimo večje območje elektroporirane membrane, med tem ko z višanjem števila pulzov ali podaljšanjem njihovega trajanja vplivamo na povečan učinek elektroporacije (Kandušar in Miklavčič, 2008).
Kot najbolj pogosta optimalna kombinacija parametrov za reverzibilno območje, se uporablja 1-8 pravokotnih pulzov, s ponavljajočo frekvenco 1 Hz, dolžino od nekaj mikrosekund do milisekund in z amplitudo, ki nam da jakost električnega polja do 100 V/cm (Rems in Miklavčič, 2014). Izbor parametrov električnih pulzov je torej predvsem odvisen od namena uporabe elektroporacije. Uporabljene vrednosti parametrov električnega polja pa so odvisne
8
od velikosti celic, njihove oblike, orientacije in gostote ter se zato lahko med celicami razlikujejo (Mir in sod., 1998a).
Za apliciranje električnega polja uporabljamo elektrode različnih oblik – ploščate elektrode, igle. Napetost na elektrodah je odvisna od tega kako daleč narazen sta elektrodi postavljeni.
Preko Schwannove enačbe, vidimo, da je vsiljena transmembranska napetost sorazmerna jakosti električnega polja. Jakost pa je sorazmerna napetosti med elektrodama in približno obratno sorazmerna razdalji med njima (Kotnik in sod., 2005).
2.4.2 Temperatura
Zaradi električnega polja, ki je prisotno le v kratkih časovnih intervalih, se temperatura visoko prevodnega medija poviša le za okoli 1 °C. Pri nizko prevodnih medijih je temperaturna sprememba še manjša (Maček Lebar in sod., 1998). Če celice pred apliciranjem električnega polja inkubiramo pri 4 °C, dosežemo boljši vnos snovi v celico (Zimmermann in sod., 1980).
Da povečamo učinkovitost poracije, celice po apliciranih električnih pulzih inkubriamo na 37
°C. Hkrati pri tej temperaturi dosežemo največji delež preživelih celic (Rols in sod., 1994).
2.4.3 Prevodnost in sestava medija
Pričakovano je, da z večjo prevodnostjo medija, dosežemo večji učinek elektroporacije, ker je s tem povečan pretok električnega toka (Kandušar in Miklavčič, 2008). Pri nizko prevodnih medijih tako pride do zmanjšanja vsiljene transmembranske napetosti (Rols in Teissie, 1989).
Bolj kot na samo elektroporacijo pa prevodnost in sestava medija vplivata na preživetje celic po elektroporaciji, saj komponente medija vplivajo na termično segrevanje tekom elektroporacije (Kandušar in Miklavčič, 2008).
Za prevodnost so ključni ioni v mediju (Kandušar in Miklavčič, 2008). Prisotnost monovalentnih ionov, kot so Na+, K+ in Li+, ne vpliva na elektroporirane celice, medtem ko prisotnost dvovalentnega Ca-iona povzroči lizo celic (Rols in Teissie, 1989). Razlog za njegovo toksičnost je vpletenost v različne fiziološke procese, ki potekajo v celici. Zaradi nenadnega povišanja kalcijevih ionov v celici, tekom trajanja izpostavitvi električnemu polju, pride do porušitve citoskeletnega ogrodja in do aktivacije od kalcija odvisnih katabolnih encimov (Orrenius in sod., 1989).
2.4.4 Osmolarnost
Na elektroporacijo lahko vplivamo tudi z osmolarnostjo medija. Ko se ta izvaja v hipertoničnem mediju, se celice elektroporirajo pri nižji napetosti, kot celice, ki se vzdržujejo v izotoničnem mediju in so izpostavljene enakim parametrom električnega impulza. Po drugi strani pa povečanje osmolarnosti v mediju za regeneracijo (hipertonično okolje) olajša regeneracijo membrane (Rols in Teissie, 1990).
2.4.5 Popolnost celičnega skeleta
Celični citoskelet je dinamična struktura, sestavljena iz aktinskih filamentov, mikrotubulov in intermediarnih filamentov, ki je odgovorna za vzdrževanje oblike in gibljivosti celic (Janmey,
9
1995). Ker je celični citoskelet povezan s plazemsko membrano, se pričakuje, da vpliva tudi na elektroporacijo. Ugotovljeno je bilo, da tubulin, ki je glavni gradnik mikrotubulov, igra pomembno vlogo pri elektroporaciji in elektrofuziji (Rols in Teissie 1992; Teissie in Rols, 1994).
S poskusi, kjer so porušili celični citoskelet s kemijskimi agensi, so dokazali, da integriteta citoskeleta ne vpliva na fazo nastanka in širjenja por. Igra pa ključno vlogo pri zapiranju por in regeneraciji membrane. Izkazalo se je, da je regeneracija membrane hitrejša ob porušeni strukturi citoskeleta (Rols in Teissie 1992; Teissie in Rols, 1994). Čeprav elektroporacija ovira organizacijo citoskeletnih filamentov, ne povzroči razgradnje njihovih proteinov (Kanthou in sod., 2006).
2.5 UPORABA ELEKTROPORACIJE
Elektroporacija je kot učinkovita tehnika vpeljana v različne aplikacije v biotehnologiji, medicini in živilstvu in zajema vse od ubijanja celic pri sterilizaciji vode in konzerviranju hrane do uničevanja rakastih celic preko vnosa citostatikov. Vse tehnologije in postopki, ki temeljijo na elektroporaciji, potrebujejo prirejeno izbiro osnovnih parametrov za doseganje željenega namena (Kandušar in Miklavčič, 2008). Poleg uporabe elektroporacije za uničevanje rakastih celic se jo uporablja še za:
- elektrotransformacijo in elektrotransfekcijo: transformacija na osnovi elektroporacije je le eden izmed načinov vnašanja genskih konstruktov v mikroorganizme, vendar je zaradi dokaj visoke učinkovitosti in uporabnosti na večini bakterij pogosto uporabljena metoda. Z nekaj omejitvami je elektro-transfekcija izvedljiva tudi na arhejah, mikroalgah in enoceličnih glivah (kvasovkah). Na potek in uspešnost vplivajo debelina celične stene, medij, razvojna faza, velikost celice in velikost genskega vključka (Kotnik in sod., 2015);
- ekstrakcijo snovi: pri uporabi elektroporacije za ekstrakcijo se mikroorganizme ali večcelična tkiva (predvsem rastlinska) elektroporira v obsegu, ki je potreben za sproščanje biomolekul, ki nas zanimajo. V nekaterih primerih je to mogoče doseči tudi z reverzibilno elektroporacijo. V večini primerov pa je pomembno, da elektroporacijo omejimo na ravni, ki preprečujejo hitro razgradnjo izpostavljenih celic in s tem nastanek ostankov, ki nam zmanjšajo čistost ekstrakta. Elektro-ekstrakcija je hitra metoda, ki poteka brez kemikalij, porabi malo energije ter ima enostaven prenos v večje merilo (up-scale). Hkrati nam omogoča večji izkoristek in višjo čistost snovi (Kotnik in sod., 2015);
- sterilizacijo vode: z uporabo elektroporacije želimo uničiti mikroorganizme v vodi.
Celice izpostavimo impulznemu električnemu toku in tako zmanjšamo njihovo število za 4 velikostne razrede. Tekom procesa temperatura ne preseže 70 °C, s čimer ohranimo encimsko aktivnost nukleaz, ki lahko razgradijo DNK po tem ko pride do sproščanja znotrajcelične vsebine. S tem se prepreči horizontalni prenos genov. Za razliko od razkuževanja z UV-svetlobo, do katere bakterije zlahka razvijejo toleranco, je bilo dokazano, da na inaktivacijo z elektroporacijo bakterije ne razvijejo tolerance ali odpornosti vsaj 30 generacij (Kotnik in sod., 2015);
- netermično pasterizacijo hrane: pri inaktivaciji na osnovi elektroporacije so mikroorganizmi izpostavljeni impulzom električnega polja, ki so dovolj močni in dovolj dolgi, da zavirajo njihovo aktivnost, vključno z njihovo delitvijo, rastjo in sintezo sekundarnih metabolitov. Ta metoda preprečuje kontaminacije in je obetavna pri
10
konzerviranju živil, kjer se je treba izogibati sevanju in kemikalijam, medtem ko toplotna obdelava zmanjša vrednost hranil v živilu (Kotnik in sod., 2015);
- zlivanje celic - elektrofuzijo: elektrofuzija je metoda, pri kateri z elektroporacijo dosežemo zlitje dveh membran. Zaradi nastanka por v membrani ta postane fuzogena, kar pomeni, da je sposobna zlivanja z drugo celično membrano. Zlivanje celic običajno uporabljamo za pridobivanje hibridnih celic, ki združujejo lastnosti obeh starševskih celic.
Elektrofuzija se uporablja za pridobivanje hibridnih rastlin, pripravo celičnih cepiv za stimulacijo imunskega odziva pri zdravljenju raka. Najbolj uporabljena aplikacija elektrofuzije je pridobivanje hibridomov iz mielomskih celic in limfocitov B, za produkcijo monoklonskih protiteles (Rems in Miklavčič, 2014);
- sušenje biomase: elektroporacijo lahko uporabimo tudi za lažje izločanje vode iz biološkega materiala. Samo sušenje biomase po navadi poteka s stiskanjem in končnim sušenjem. Če korak stiskanja biomase združimo z elektroporacijo, se biomasa v pečici posuši 2-3x hitreje (Kotnik in sod., 2015);
- frakcioniranje in/ali slektivno inaktivacijo: metoda je uporabna v mikrofluidiki in izkorišča lastnost elektroporacije, da jakost električnega polja ne deluje na vse celice enako (zaradi razlik). To nam omogoča frakcioniranje heterogenih vzorcev celic in selektivno elektroporiranje željene vrste celic. Premer je ločevanje levkemičnih celic od eritrocitov. Pri uporabljenih pogojih so bili eritrociti ireverzibilno elektroporirani, levkemične celice pa so lahko regenerirale svojo membrano in so bile na voljo za nadaljnjo analizo. S pomočjo dielektroforeze lahko potem reverzibilno in ireverzibilno porirane celice ločimo do več kot 90 % čistosti (Kotnik in sod., 2015).
Poleg vseh opisanih primerov uporabe elektroporacije, raziskujejo tudi številna nova področja možnosti uporabe. Ena izmed takih idej je tudi vnašanje antibiotikov preko elektroporacije v krvne celice. Tako bi dobili celice, ki bi delovale kot nosilke zdravil po telesu. Ali pa vstavljanje proteinov v plazemsko membrano (s tem so želeli ozdraviti AIDS) (Zeira in sod., 1991). Prav tako lahko proučujemo nekatera dogajanja, kot sta aktivnost encimov in vivo in celično signalizacijo preko nadzora koncentracije ionov v citosolu (Ozil in Swann, 1995).
3 BIOLOŠKO TKIVO
Do sedaj smo govorili o elektroporaciji posamezne celice in povečani prepustnosti njene membrane. Isti učinek pa lahko dosežemo tudi v celični suspenziji, adherentnih celičnih kulturah, ex vivo na tkivih in celicah ter in vivo na tkivih (Maček Lebar in sod., 1998).
V suspenziji celic, kjer je razdalja med posameznimi celicami dovolj velika, ne prihaja do vpliva na električno polje, ki obdaja vsako celico. V tkivni ureditvi pa so celice redko izolirane oziroma je njihova medsebojna razdalja dovolj majhna, da že vplivajo na električno polje sosednje celice. Pogosto so celice tudi v neposrednem stiku in tvorijo dvodimenzionalne (monosloj, pritrjen na dnu posode) ali tridimenzionalne strukture, kot so biološka tkiva (Kotnik in sod., 2010). Poleg tega so celice v teh strukturah pogosto tudi medsebojno povezane s tesnimi stiki, adherentnimi stiki, dezmosomi, presledkovnimi stiki (Resnik in Veranič, 2008). Medcelične povezave zagotavljajo pot za izmenjavo ionov med sosednjimi celicami. Odprto ali zaprto stanje teh povezav pa lahko celice med seboj električno poveže ali pa tudi izolira. S tem posledično vpliva na porazdelitev transmembranske napetosti in učinek elektroporacije (Kotnik in sod., 2010).
11
Tadej Kotnik in njegovi sodelavci so opravili raziskavo vpliva inducirane transmembranske napetosti na molekularni transport, posredovan z elektroporacijo. Rezultati so pokazali, da se skupek celic ob aplikaciji električnega polja v rangu 100 V/cm, obnaša kot ena sama velika celica, kar odraža tudi prisotnost medceličnih poti, ki naredijo celice električno povezane. Ob aplikaciji električnega polja v rangu 1000 V/cm, kar je močno nad vrednostjo praga pa se medcelične povezave blokirajo. Ker celice niso bile med seboj električno povezane, je bil učinek, kot da bi elektroporirali vsako posamezno celico v skupku (Kotnik in sod., 2010).
Pri poskusih in vitro celice zavzemajo 1-2 % volumna, preostalih 98-99 % pa predstavlja gojišče. Ko prehajamo na in vivo poskuse zasedajo celice 10-80 % prostornine. V pogojih in vitro zaradi velike medsebojne razdalje celice nimajo vpliva druga na drugo. V in vivo pogojih pa elektroporiranje ene same celice spremeni prevodnost tkiva v okolici in s tem tudi lokalno porazdelitev električnega polja (Miklavčič in sod., 2006).
Frakcija elektroporiranih celic se zmanjšuje s povečanjem gostote celic in ponovno zapiranje por je v gostih celičnih suspenzijah počasnejše. Prav tako pride do počasnejšega transporta molekul, zaradi počasnejše difuzije teh molekul v skupkih celic. Goste celične suspenzije nam lahko služijo kot model za tkiva s homogeno strukturo, sestavljeno iz podobnih celic v tesnem stiku; kljub temu večina tkiv ni homogenih. Tkiva so sestavljena iz različnih vrst celic, ki so nepravilne oblike, so vaskularizirane in imajo različne električne lastnosti. Vsi omenjeni dejavniki vplivajo na porazdelitev električnega polja v tkivu in posledično na njegovo učinkovitost elektroporacije (Miklavčič in sod., 1998).
3.1 ELEKTRIČNE LASTNOSTI
Biološko tkivo je nehomogena struktura, ki ga sestavljajo celice različnih oblik, velikosti in diferenciacij. Med tkivi lahko opazimo velike razlike med vrednostmi električne prevodnosti.
Med slabše prevodnike tako spadajo pljuča (zaradi visoke vsebnosti plinov), maščobno tkivo (zaradi nizke vsebnosti elektrolitov), koža (zaradi neprevodne zunanje plasti) in kosti (ker so zgrajene v večini iz nizko-prevodnega kalcijevega fosfata) (Miklavčič in sod., 2006). Prav tako imajo mišična vlakna izrazite anizotropne lastnosti, kar pomeni, da ima v različnih smereh različne fizikalne lastnosti. Pri mišičnih vlaknih so električne lastnosti odvisne torej od smeri krčenja, zato je prevodnost tkiva večja vzdolž celic kot prečna prevodnost (Epstein in Foster, 1983). Na električne lastnosti tkiva pa lahko vplivajo tudi dejavniki okolja, starost in bolezenska stanja (Geddes in Baker, 1967).
Za učinkovito elektroporacijo tkiva in vivo je ključnega pomena porazdelitev električnega polja, ki je odvisna od geometrije elektrode, položaja in električnih lastnosti vzorca (Kandušar in Miklavčič, 2008). Električne lastnosti biološkega tkiva, kot sta prevodnost in permitivnost, se spremenijo, ko se tkivo elektroporira in spremeni porazdelitev električnega polja. Največji del teh sprememb pripišemo povečani prevodnosti membrane zaradi elektroporacije (Pavšelj in sod., 2005).
Ker so celice različnih oblik, razporejene v različnih nivojih v tkivni organizaciji in ker ima medcelični prostor različne električne lastnosti je dogajanje v tkivu na mikroskopskem nivoju precej kompleksno (Miklavčič in sod., 2006). Za uspešno elektroporacijo tkiva so anatomsko utemeljeni matematični modeli pomembna orodja za napovedovanje izida zdravljenja.
12
Matematični modeli so tako dragoceno orodje za napovedovanje vedenja elektroporacije tkiva (Miklavčič in sod., 1998).
4 UNIČEVANJE RAKASTIH CELIC
4.1 KARCINOGENEZA IN LASTNOSTI RAKASTIH CELIC
Maligna transformacija celic oz. karcinogeneza je proces nastanka rakastih celic, kot posledica nabiranja mutacij v DNK. Te mutacije povzročajo različni karcinogeni dejavniki, ki lahko izzovejo nastanek rakastih celic (Novaković, 2006; Serša, 2015). Tekom maligne transformacije so pomembne predvsem mutacije, ki nastajajo v genih, ki so odgovorni za rast, diferenciacijo celic in celično smrt. Na račun teh mutacij celice pridobijo lastnosti, ki jih ločujejo od zdravih celic (Serša, 2015). Iz ene same rakaste celice, ki se nenormalno razmnožuje dobimo skupek celic, imenovan tumor. V splošnem lahko karcinogenezo razdelimo na 3 osnovne stopnje: iniciacija, promocija in progresija (Novaković, 2006).
V začetni fazi iniciacije pride do nabiranja mutacij v DNK, ki jih lahko povzročijo tako endogeni (žolčne kisline, reaktivni kisikovi radikali), kot eksogeni dejavniki (sevanje, prehrana, smog, cigarete, itd.) (Novaković, 2018). Karcinogene dejavnike ločimo na biološke (virusi), kemijske (kemijske spojine – npr. katran, akrilamid) in fizikalne (UV-sevanje, ionizirajoče sevanje). Skupno vsem dejavnikom je, da spremenijo genetski material, tako da izzovejo mutacije (zato jih imenujemo mutageni dejavniki) ali da posredno spremenijo izražanje genov (zato jih imenujemo epigenetski dejavniki). Pri predpostavki, da tumor nastane iz ene same mutirane celice, mora ta celica biti sposobna nove lastnosti izražati in prenašati na naslednjo generacijo. Pri tem karcinogeni dejavnik deluje kot mutageni pulz s katerim spremeni genetski zapis in tako se sprememba lahko prenese med podvojevanjem.
Druge skupine karcinogenih snovi imajo epigenetsko delovanje, kar pomeni, da vplivajo na vzorce izražanja genov. (Novaković, 2006).
Da spremenjena celica postane rakasta celica, je potrebna faza promocije, kjer se mutirana celica prične razmnoževati in izražati vse mutacije (Novaković, 2006). Promocijo sprožijo promotorski dejavniki, kot so mikotoksini in hormoni, ki sami niso karcinogeni, vendar spodbujajo delitev celic brez predhodne metabolne aktivacije ter pospešijo maligno transformacijo. Z nabiranjem novih mutacij postaja genom vse bolj nestabilen, kar ga naredi še bolj dovzetnega za nastanek novih mutacij. V tej fazi so ključne mutacije v genih, ki so odgovorni za programirano celično smrt – apoptozo (Novaković, 2018).
V fazi progresije prično rakaste celice z izražanjem vseh novo pridobljenih značilnih lastnosti, kot so nenadzorovano podvojevane celic, izogib celični smrti, dediferenciacija, itd. Rakaste celice se v obliki majhnega skupka prehranjujejo in izmenjujejo pline preko difuzije iz okoliškega tkiva, hkrati pa že prično izločati rastne faktorje, ki spodbudijo nastanek krvožilja v tumorju. Razvoj ožilja označuje prehod v vaskularno fazo rasti tumorja in omogoča boljšo preskrbo tkiva s hranili in kisikom. Krvni sistem omogoča tudi prodor rakastih celic v krvni in limfni obtok ter metastaziranje po telesu. Konstantno poteka tudi klonalna selekcija celic z agresivnejšimi lastnostmi (Novaković, 2018).
13 4.1.1 Biološke značilnosti rakastih celic
Tekom karcinogeneze morajo celice pridobiti nekaj značilnih lastnosti, ki jih naredijo sorazmerno neodvisne od ustaljenih mehanizmov v zdravih celicah. Te lastnosti so:
- neobčutljivost na zaviralce rasti;
- spremenjen celični metabolizem;
- samozadostnost za lastno proliferacijo: večina rastnih signalov, ki so potrebni za podvojevane, so regulirani znotraj same celice in so neodvisni od okolja ter zunanjih signalov;
- izogibanje celični smrti: v normalnih okoliščinah se po hujših poškodbah DNK aktivirajo popravljalni mehanizmi, ki napako odpravijo ali pa celico usmerijo v apoptozo. Rakasta celica tekom karcinogeneze postane neodzivna na popravljalne mehanizme (Novaković, 2006);
- neomejena proliferacija: vsaka celica ima že v naprej določeno število podvojitev, ki jih bo tekom svojega življenjskega cikla izvršila. Tekom diferenciacije tkiv se aktivnost večine telomeraz zmanjšuje in je po koncu embriogeneze popolnoma zavrta (Cong in sod., 2002). Rakaste celice, morajo za namen neomejenega razmnoževanja ponovno aktivirati telomerazo (Serša, 2015);
- genetska nestabilnost: genom rakastih celic je bolj nagnjen k novim mutacijam, ki celicam omogočajo hitrejše in učinkovitejše prilagajanje na vplive iz okolja;
- sposobnost tkivne invazije ter metastaziranja: po vzpostavitvi žilnega sistema v tumorjih, lahko rakaste celice potujejo po krvnem in limfnem obtoku ter na novih mestih prodirajo v tkiva, kjer tvorijo nove tumorske tvorbe (Novaković, 2006);
Pri nastanku različnih vrst tumorjev je pridobivanje teh lastnosti lahko različno (Serša, 2015).
4.1.2 Tumor kot kompleksno tkivo
Tumorja ne sestavljajo samo rakaste celice temveč tudi mezenhimske matične celice – fibroblasti, imunske celice in novo nastale žile z endotelijem. Vse te celice so v tumorju spremenjene tako, da sodelujejo z rakastimi celicami in jim omogočajo rast in razvoj. Skupaj tako tvorijo kompleksno tumorsko tkivo (Serša, 2015).
Tumorsko tkivo se s časoma tudi spreminja, saj v populaciji rakastih celic nastajajo vedno nove mutacije zaradi nestabilnosti genoma. V začetku razvoja tumorja deluje imunski sistem še dokaj učinkovito, vendar se tumorske celice vse hitreje prilagajajo in izognejo imunskemu sistemu. Tako se s časom selekcionirajo in postajajo vedno bolj agresivne celice (Serša, 2015).
4.2 ELEKTROKEMOTERAPIJA
Za zdravljenje raka oz. uničevanje rakastih celic se najpogosteje uporablja obsevanje, kirurgijo in kemoterapijo (Marjanovič in Miklavčič, 2011). Kemoterapija je metoda zdravljenja, ki uporablja naravne ali kemijsko pridobljene spojine, ki delujejo protitumorsko.
Skupna lastnost vseh kemoterapevtikov je, da delujejo na celoten organizem, zato je kemoterapija sistemski način zdravljenja. Slabost kemoterapevtikov je, da niso specifični za
14
rakaste celice ampak delujejo le na hitro se deleče celice – tako rakave in zdrave celice. To je tudi razlog zakaj ima kemoterapija toliko stranskih učinkov (Serša, 2009).
Pri standardni uporabi kemoterapevtikov za uničevanje rakastih celic je problem, ker njihova nespecifična citotoksičnost negativno vpliva tudi na zdrave celice in razvoj rezistence rakastih celic zaradi genetskih sprememb. Problematični so predvsem kemoterapevtiki, za katere je plazemska membrana neprepustna ali premalo prepustna, saj je zato potrebno uporabiti višje koncentracije, ki še v večji meri vplivajo na normalne celice in povzročajo negativne učinke (Serša in sod., 1993). Zato lahko z uporabo elektroporacije povečamo vnos kemoterapevtika v celico in s tem povečamo njihovo učinkovitost. To pomeni, da lahko za zdravljenje uporabimo nižje koncentracije kemoterapevtika, ter s tem tudi zmanjšamo neželene stranske učinke zdravljenja (Orlowski in sod., 1988). Metodo, kjer kombiniramo vnos zdravil v celico z elektroporacijo imenujemo elektrokemoterapija (Marjanovič in Miklavčič, 2011).
Z elektroporacijo poškodujemo tudi endotelne celice tumorskega ožilja, ki imajo v primerjavi z zdravimi endotelnimi celicami hitrejšo celično delitev ter spremenjene molekularne označevalce (Serša in sod., 2005; Siemann in sod., 2005). Serša in sodelavci so ugotovili, da se lokalna tumorska cirkulacija popolnoma zaustavi že tekom dovajanja električnih pulzov. S tem trajno ustavimo pretok krvi v tumor, kar privede do ishemičnega propada tumorskih celic (Serša in sod., 2008a). Takojšni učinek je posledica močnega krčenja gladkih mišic v stenah žil, ki ga sproži porušitev citoskeletnega ogrodja (Serša in sod., 2008b). Mikrocirkulacija se po koncu apliciranja delno obnovi, vseeno pa traja več kot 48h za vzpostavitev primarnega stanja (Serša in sod., 1999). Tekom časa, ko imamo zmanjšan pretok krvi v tumorjih, je povečano zadrževanje kemoterapevtikov v tumorskih celicah, kar pozitivno deluje na njihovo učinkovitost (Serša in sod., 2003). Med tem pa tumorske celice izločajo antigene, ki sprožijo imunski odziv ter tako še dodatno prispevajo k protitumorski učinkovitosti elektrokemoterapije (Serša in sod., 2007).
Rezultati metaanalize, ki so jo objavili leta 2013, opravljene na 150 bolnikih in 922 tumorjih, so pokazali, da je objektivni odziv kožnih zasevkov po enkratni terapiji elektrokemoterapije 80,6 %. Od tega jih 56,8 % predstavlja popolnih odziv, brez ponovnega zasevanja (Mali in sod., 2013). V analizo so bili vključeni zasevki velikosti do 3 cm, kjer naj bi zadoščalo enkratno zdravljenje. Postopek je možno uspešno opraviti tudi na zasevkih večjih od 3 cm, kjer enkratno tretirane ni dovolj. Velik napredek pri uporabi elektrokemoterapije v klinični praksi je predstavljala uvrstitev te metode v evropske smernice zdravljenja melanoma in drugih kožnih zasevkov (Campana in sod., 2009).
4.2.1 Citostatiki
Kemoterapija temelji na vnosu kemoterapevtikov v celice, kjer se ti vežejo na svoje tarče in prično s svojim delovanjem. Da kemoterapevtiki dosežejo rakaste celice morajo potovati po krvi do tumorskega tkiva ter preiti plazemsko membrano, ki je za številne spojine prepustna.
Za posamezna zdravila iz skupine citostatikov, pa je membrana neprepustna oz. premalo propustna. Primer takih citostatikov sta bleomicin in cisplatin (Mir in Orlowski, 1999).
15 4.2.1.1 Bleomicin
Bleomicin je dober primer citostatika za katerega je plazemska membrana neprepustna. Kot zdravilo se pogosto uporablja iz 2 razlogov. Prvi razlog je njegova visoka citotoksičnost v celici, vendar mora zato najprej priti v celico. Drugi razlog je, da se molekule bleomicina povežejo s proteini membrane v prenosne komplekse, ki sodelujejo pri transportu bleomicina v notranjost celice. Sam transport v celico sledi principu endocitoze (Mir in Orlowski, 1999).
Bleomicin po vstopu v celico potuje v jedro do svoje končne tarče – DNK. Ker je DNK skupna vsem celicam, bleomicin deluje nespecifično na vse celice – tumorske in zdrave. V celici se molekule bleomicina obnašajo kot restrikcijske endonukleaze in povzročajo enojne ter dvojne prelome DNK (Mir in Orlowski, 1999). Če je prelom manjši, do smrti celice pride šele tekom celične delitve, ko pa je prelomov preveč, da bi jih celica uspela popraviti pa pride do aktivacije apoptoze (Miklavčič in sod., 2000). Tako lahko torej bleomicin v pogojih in vitro ubije celice na dva načina – v majhnih koncentracijah preko mitotične celične smrti ali v večjih koncentracijah preko pseudoapoptoze. V in vivo pogojih pa so opazili, da terapevtski odmerki bleomicina ubijejo celico samo preko počasne mitotične celične smrti. V in vivo pogojih tako bleomicin ne more povzročiti apoptoze ali krčenja ter posledično odmiranje tumorja, če ni prisotnega vnetnega odziva (Mir in Orlowski, 1999).
Pomembno je poudariti, da bleomicin ne zavira delovanja imunskega sistema temveč lahko pozitivno deluje na imunski sistem. Pod določenimi pogoji namreč lahko bleomicin spodbuja oz. stimulira različne komponente in procese imunskega odzivagovora, kot so izločanje tumor-specifičnih T-supresorjev, povečanje tumoricidne aktivnosti makrofagov, induciranje izločanja interlevkina-2 (IL-2) (Mir in Orlowski, 1999).
V in vitro pogojih je bilo dokazano, da elektroporacija poveča vnos bleomicina v celico ter tako poveča citotoksični učinek za približno 700-krat (Mir in Orlowski, 1999). Pri klasični kemoterapiji se uporablja odmerke bleomicina v razponu od 120 mg/m2, do več kot 500 mg/m2. Odmerek je predvsem odvisen od lokacije, velikosti in vrste tumorja (Aronson, 2016).
Pri elektrokemoterapiji se pri enkratnem odmerku vnaša 15.000 IU/m2 (= 15 mg/m2) bleomicina intravensko ali 250-1.000 IU/m2 (= 0,25-1 mg/m2) intratumorsko (Serša in sod., 2007).
4.2.1.2 Cisplatin (cis-PtCl2(NH3)2
Tako kot za bleomicin je tudi za cisplatin plazemska membrana dokaj neprepustna, vseeno pa do 50% cisplatina vstopi v celico preko difuzije, ostali del pa s pomočjo aktivnega transporta (Serša in sod., 2009).
V celici se cisplatin hidrolizira - en atom klora v molekuli cisplatina se zamenja s hidroksilno skupino in nastane visoko reaktiven platinov kompleks. Kompleks potem lahko potuje v jedro, kjer se hidroksilni ion odcepi, da se platinov atom lahko veže z organskimi dušikovimi bazami (predvsem z gvaninom) (Trzaska, 2005). Sledi ponovna hidroliza, pri kateri se odcepi še preostali kloridni ligand in platina se lahko poveže z novo organsko dušikovo bazo. Te povezave med bazami so lahko na isti verigi ali na različnih verigah in tvorijo notranje in medsekovne povezave DNK – pravimo da pride do zamreženja DNK. Posledica tega je spreminjanje strukture DNK, ki ovira podvajanje in prepisovanje ter posledično tudi sintezo
16
proteinov. Če celica ni sposobna popraviti oz. odpraviti platinovega kompleksa, sproži apoptozo (Johnstone in sod., 2016).
V in vitro pogojih je citotoksičnost cisplatina zaradi vnosa s pomočjo elektroporacije povečana za približno 70-krat (Serša in sod., 1998). Pri klasični kemoterapiji se uporablja odmerek cisplatina 50 mg/m2. Pri elektrokemoterapiji vnašamo 0,5-2 mg/cm3 cisplatina intratumorsko v enkratnem odmerku (Serša in sod., 2007).
4.2.3 Protokol zdravljenja
Z elektrokemoterapijo so najprej zdravili kožne in podkožne tumorske tvorbe. V zadnjih 10 letih pa se elektrokemoterapija prenaša tudi na notranje organe, kot so jetra, trebušna slinavka, prostata, itd. (Serša in sod., 2008a). Da dosežemo učinkovito zdravljenje moramo zagotoviti, da je v okolici tumorja zadostna količina kemoterapevtika ter da tumorske celice izpostavimo dovolj veliki jakosti električnega polja, vseeno pa moramo ostati v območju reverzibilne elektroporacije.
Glede na število in velikost tumorskih tvorb se izvede lokalno ali sistemsko anestezijo. Nato se na podlagi velikosti tumorja izbere ustrezen citostatik, ki ni odvisen od histološkega tipa tumorja. Sledi injiciranje citostatika v količini, ki sam nima protitumorskega učinka in stranskih učinkov. V obdobju 5 min pri intratumorskem oz. 8-28 min pri intravenskem načinu vnosa citostatika, ko je njegova koncentracija v tumorju največja, dovedemo električne pulze.
Tako dosežemo maksimalen odziv rakastih celic na zdravljenje. Kot najbolj standardne parametre elektroporacije se uporablja 8 pravokotnih električnih pulzov napetosti 1100-1300 V/cm, dolžine 100 mikrosekund in frekvence ponavljanja 5 kHz. Tretma se izvede le enkrat izjemoma pa zdravljenje ponovimo večkrat v primeru večjih ali ponovno izraslih tumorjih (Serša in sod., 2007).
4.2.4 Dejavniki, povezani z odzivnostjo tumorja na elektrokemoterapijo
Glede na klinične izkušnje med dejavnike, ki vplivajo na uspešnost zdravljenja z elektrokemoterapijo uvrščamo histološki tip in velikost tumorja ter izpostavljenost predhodnim onkološkim zdravljenjem. Različni tumorji imajo različno občutljivost na elektrokemoterapijo. Glede na tip tumorja se na zdravljenje najbolje odzovejo površinski sarkomi (odzivnost 99,3 %), najslabše pa melanomi (odzivnost 80,6 %). Zasevki, ki so v premeru manjši od 3 cm dajejo bistveno višje odzivnosti na elektrokemoterapijo, kot večji tumorji. Poleg tega je pokritost večjih tumorjev z električnim poljem zahtevna. Tako obstaja večja verjetnost, da se del celic ne elektroporira. V številnih študijah se je tudi raziskovalo vpliv predhodnih metod zdravljenja tumorja na zdravljenje z elektrokemoterapijo. Rezultati so pokazali, da se tumorji, ki so bili predhodno zdravljeni z obsevanjem in kemoterapijo, na elektrokemoterapijo odzovejo z nižjo občutljivostjo. Klinični dejavniki, povezani z odzivom tumorja na elektrokemoterapijo, temeljijo na bioloških dejavnikih zdravljenja tumorjev (Serša in sod., 2021).
Pri bioloških dejavnikih ločimo 2 večji skupini: karakteristike rakastih celic ter njihovo mikrookolje. Na karakteristike rakastih celic lahko vpliva morebitna virusna okužba, ki je prisotna v telesu in lahko spremeni njihovo celično biologijo. V primeru zdravljenja tumorjev
17
vratu in glave, ki so bili okuženi z HPV virusom, se je pokazalo da zaradi sprememb v rakastih celicah te postanejo bolj odzivne na elektrokemoterapijo. Vpliv mikrookolja pa se kaže predvsem s prisotnostjo krvožilnega sistema ter ekstracelularnega matriksa. Zaradi opisanega učinka elektroporacije na krvožilje v poglavju 4.2, prisotnost ožilja poveča odzivnost in učinkovitost zdravljenje z elektrokemoterapijo. Ekstracelularni matriks vpliva predvsem s svojo gostoto. Gostejši kot je matriks, bolj počasna in otežene je difuzija kemoterapevtikov do rakastih celic (Serša in sod., 2021).
4.3 ABLACIJA TKIVA – TUMORJEV Z IREVERZIBILNO ELEKTROPORACIJO
Na področju uničevanja rakastih celic je uporabna tudi ireverzibilna elektroporacija. S tem, ko presežemo kritično mejo parametrov elektroporacije, pridemo v območje ireverzibilne elektroporacije, kjer pride do smrti celic na račun porušene homeostaze.
Ireverzibilna elektroporacija je novo razvita tehnika netermične ablacije tkiva (tudi tumorskega tkiva) (Al-Sakere in sod., 2007). Z električnim poljem pokrijemo območje tumorja in v membranah celic povzročamo trajno permeabilnost ter posledično njihovo smrt.
Z dovedenimi pulzi lahko tako ciljno uničujemo celice znotraj pokritega območja, hkrati pa zunajcelični matriks in okolica poriranega območja ostaneta nepoškodovani, kar izboljša integriteto poškodovanega tkiva, zmanjša brazgotinjenje in omogoča hitrejšo obnovo tkiva (Al-Sakere in sod., 2007; Cindrič in sod., 2021). Celice lahko zato po zdravljenju znova prerastejo porirano območje in mu vrnejo funkcionalnost. Če bi s prevelikimi pulzi prešli v termično območje elektroporacije, bi lahko močno poškodovali zunajcelični matriks in okolico poriranega območja (Al-Sakere in sod., 2007).
Pri uporabi optimalnih parametrov (jakost električnega polja 2500 V/cm, 80 pulzov dolžine 100 mikrosekund in frekvenco 0,3 Hz) je bila dosežena 92 % učinkovitost odstranitve tumorja, brez prisotnega toplotnega segrevanja tkiva, kar nakazuje na učinkovitost elektroporacije kot metoda ablacije tkiva (Al-Sakere in sod., 2007).
Metoda ireverzibilne elektroporacije tako lahko popolnoma nadomesti druge, bolj invazivne metode ablacije, kot so kirurška odstranitev, radiofrekvenčna ablacija, mikrovalovna ablacija in krioablacija. Prednost ireverzibilne elektroporacije je, da v primerjavi z ostalimi tehnikami trajno ne poškoduje okoliškega tkiva (Al-Sakere in sod., 2007).
Trenutno je reverzibilna elektroporacija v uporabi pri ablaciji globoko ležečih tumorjev na notranjih organih (jetra, prostata, ledvice). Ker gre za dokaj novo metodo, še ni bilo postavljenih standardnih protokolov in postopkov za načrtovanje zdravljenja (Cindrič in sod., 2021).
4.4 STRANSKI UČINKI ELEKTROPORACIJE
Pri metodah in tehnikah, ki uporabljajo elektroporacijo, se lahko pojavijo tudi redki neželeni stranski učinki, kot so lokalne opekline, ki nastanejo na stiku z elektrodo, zaradi visokih vrednosti električnih tokov med dovajanjem pulzov in običajno izginejo v roku nekaj ur do enega dneva; edem in rdečica, ki izgineta v zelo kratkem času ter nenamerno mišično krčenje tekom dovajanje električnih pulzov (Mir in sod., 1998b; Miklavčič in sod., 2005).
18
Pri uporabi ireverzibilne elektroporacije za ablacijo tkiva, so lahko prisotne močne mišične kontrakcije. Zato se bolnika prehodno lokalno paralizira ali anestezira (Cindrič in sod., 2021).
5 ZAKLJUČEK
Elektroporacija postaja vse bolj uporabljena tehnika v biotehnologiji, farmaciji ter v medicini, njena uporaba pa sega tudi na ostalo področja. Kot metoda vnosa ima nekaj prednosti pred ostalimi biokemijskimi metodami, lahko jo uporabimo na katerikoli celici, ne prizadene celičnega preživetja, je specifična za celično membrano ter povzroči le minimalne motnje membranskih funkcij. Kot aplikaciji v medicini sta se do sedaj najbolj uveljavili elektrokemoterapija in ablacija tkiva z ireverzibilno elektroporacijo. Prednost elektrokemoterapije je, da s tem, ko znižamo koncentracije toksičnih snovi, kot sta bleomicin in cisplatin, zmanjšamo neželene učinke terapije, ki so pri zdravljenju raka velikokrat velik problem. Elektrokemoterapija se je izkazala kot uspešna metoda zdravljenja, ko že vse ostale terapijo odpovejo. Hkrati pa je postopek neinvaziven, hiter in lokalno usmerjen. Za ablacijo tkiva so do sedaj prevladovale termične metode, z uporabo ireverzibilne elektroporacije pa se izognemo povišanim temperaturam in posledicam, ki jih le-te lahko pustijo. Tretiramo lahko tudi tkiva in organe, v okolici katerih termični učinek ni zaželen. Da vsa zdravljenja z uporabo elektroporacijo potekajo po najbolj optimalni poti, se vedno bolj uvajajo matematični modeli, s katerimi si pomagajo pri interpretaciji in napovedovanju dogajanja med samim potekom zdravljenja. V modele se vključuje vse več dejavnikov, ki v kakršnikoli meri vplivajo na potek in rezultat elektroporacije. Ti dejavniki so lahko vse od homogenosti tkiv pa do koncentracije glukoze v krvi.
Uvajanja novih postopkov zdravljenja v prakso je dolgotrajni postopek in vključuje veliko študij, kliničnih testiranj in teste varnosti. Do danes so že postavljeni standardni operativni postopki za zdravljenje kožnih tumorjev z elektrokemoterapijo. Nadaljnji razvoj na področju aplikativne rabe elektroporacije v medicini se zato usmerja na vzpostavitev standardnih zdravljenj tudi drugih vrst tumorjev, predvsem na notranjih organih in ablacije tkiva z ireverzibilno elektroporacijo. Del tega razvoja bosta vsekakor Onkološki inštitut in Fakulteta za elektrotehniko, ki sta Slovenijo že zapisali, kot pionirja na področju elektrokemoterapije.
Vsekakor elektroporacija predstavlja velik potencial na vseh področjih, vendar pa pušča še veliko prostora za izboljšave.
6 VIRI
Al-Sakere B., André F., Bernat C., Connault E., Opolon P., Davalos R. V., Rubinsky B. , Mir L. M. 2007. Tumor ablation with irreversible electroporation. PloS ONE, 2, 11: e1135, doi:
10.1371/journal.pone.0001135: 8 str.
Aronson J. K. 2016. Blomycin. V: Meyler's side effects of drugs. 16th ed. Aronson J. K. (ur.).
Elsevier: 10005-10006
Batista Napotnik T., Reberšek M., Kotnik T., Miklavčič D. 2008. Učinki visokonapetostnih nanosekundnih električnih pulzov na celice in tkiva. Medicinski razgledi, 47: 271-281 Campana L. G., Mocellin S., Basso M., Puccetti O., De Salvo G. L., Chiarion-Sileni V.,
Vecchiato A., Corti L., Rossi C. R., Nitti D. 2009. Bleomycin-based electrochemotherapy:
19
clinical outcome from a single institution's experience with 52 patients. Annals of Surgical Oncology, 16: 191-99
Cindrič H., Kos B., Miklavčič D. 2021. Irreversible electroporation as a novel method for soft tissue ablation: review and challenges in clinical practice. Zdravstveni vestnik, 90, 1-2: 38- 53
Cong Y. S., Wright W. E., Shay J. W. 2002. Human telomerase and its regulation.
Microbiology and Molecular Viology Reviews, 9: 407-425
Davalos R. V., Mir L. M., Rubinsky B. 2004. Tissue ablation with irreversible electroporation. IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 51: 761-767
Epstein B. R., Foster K. R. 1983. Anisotropy in the dielectric properties of skeletal muscle.
Medical & Biological Engineering & Computing, 21, 1: 51-55
Fuertes G., Gimenez D., Esteban-Martin S., Sanchez-Munoz O. L., Salgado J. 2011. A lipocentric view of peptide-induced pores. European Biophysics Journal, 40: 399-415 Geddes L. A., Baker L. E. 1967. The specific resistance of biological material – a
compendium of data for the biomedical engineer and physiologist. Medical and biological engineering, 5: 271-293
Janmey P. 1995. Cell membranes and the cytoskeleton. V: Structure and Dynamics of Membranes, Handbook of Biological Physics. Lipowsky R., Sackmann E. (ur.). Elsevier:
256-264
Johnstone T. C., Suntharalingam K., Lippard S. J. 2016. The next generation of platinum drugs: targeted Pt(II) agents, nanoparticle delivery, and Pt(IV) prodrugs. Chemical Reviews, 116, 5: 3436-3486
Kandušar M., Miklavčič D. 2008. Electroporation in biological cell and tissue: an overview.
V: Electrotechnologies for Extraction from Food Plants and Biomaterials. New York, Springer: 1-37
Kanthou C., Kranjc S., Serša G., Tozer G., Županič A., Čemažar M. 2006. The endothelial cytoskeleton as a target of electroporation-based therapies. Molecular Cancer Therapeutics, 5: 3145-3152
Kotnik T., Frey W., Sack M., Haberl Meglič S., Peterka M., Miklavčič D. 2015.
Electroporation-based applications in biotechnology. Trends in Biotechnology, 33, 8: 480- 488
Kotnik T., Kramar P., Pucihar G., Miklavčič D., Tarek M. 2012. Cell membrane electroporation - Part 1: The phenomenon. IEEE Electrical Insulation Magazine 28, 5:14- 23
Kotnik T., Maček Lebar A., Kandušar M., Pucihar G., Pavlin M., Valič B., Miklavčič D.
2005. Elektroporacija celične membrane: teorija ter poizkusi in vitro. Medicinski razgledi, 44: 81-90
Kotnik T., Pucihar G., Miklavčič D. 2010. Induced transmembrane voltage and its correlation with electroporation-mediated molecular transport. Journal of Membrane Biology, 236: 3- 13
