HISTOKEMIJSKO DOLOČANJE β-GLUKANOV V ZRNIH JEČMENA

(1)

URŠKA KEBER

HISTOKEMIJSKO DOLOČANJE β-GLUKANOV V ZRNIH JEČMENA

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2019

(2)

URŠKA KEBER

Mentor: PROF. DR. KATARINA VOGEL MIKUŠ

HISTOKEMIJSKO DOLOČANJE β-GLUKANOV V ZRNIH JEČMENA

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2019

(3)

II Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija kemije in biologije. Opravljeno je bilo na Katedri za fiziologijo rastlin Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: izr. prof. dr. Mateja GERM

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentorica: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ

Recenzent: dr. Aleš KLADNIK

Datum zagovora: ________________________________________________

Podpisana izjavljam, da je diplomska naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Izjavljam, da je elektronska verzija identična tiskani. Na Univerzo v Ljubljani prenašam pravico objave svoje diplomske naloge v polnem tekstu na svetovnem spletu preko Digitalne knjiţnice Pedagoške fakultete.

Urška Keber

(4)

III POVZETEK

Ječmen je eno od najstarejših ţit na svetu in spada v botanično druţino trav (Poaceae).

Glavna gradbena komponenta notranjega dela celičnih sten škrobnega endosperma so (1→3),(1→4)-β-D-β-glukani. To so linearni polisaharidi, ki spadajo v skupino prehranskih vlaknin in so pomemben del človekove prehrane. Glavni nalogi β-glukanov sta stabilizacija rastlinske celične stene ter mobilizacija nastale energije pri njihovi hidrolizi. Namena našega raziskovalnega dela sta bila histokemijska lokalizacija β-glukanov v zrnu ječmena ter ovrednotenje intenzitete fluorescence pri štirih vrstah ječmena kot osnova za semi- kvantitativno določanje vsebnosti beta glukanov. Kot izhodni material smo vzeli po nekaj zrn treh različnih kultivarjev ječmena z ţe znanimi vsebnostmi β-glukanov ter nekaj zrn kultivarja ječmena z neznano vsebnostjo β-glukanov. Vzorce smo s tehniko zamrzovanja in odmrzovanja (angl. freeze-thaw) pripravili za rezanje in barvanje. Pri barvanju smo uporabili dve fluorescentni barvili, kalkofluor beli (Sigma-Aldrich) in fluorestentni osvetljevalec 28 (Sigma-Aldrich), ki se veţeta na β-1,3 in β-1,4 polisaharide. Ugotovili smo, da se β-glukani nahajajo znotraj zrna ječmena, natančneje v škrobnem endospermu in alevronski plasti. Na slikah pobarvanih rezin vzorcev smo izmerili intenziteto fluorescence s programom ImageJ. S pomočjo povprečnih vrednosti intenzitete fluorescence smo izdelali umeritveno krivuljo, s pomočjo katere smo določili vsebnost β-glukanov v zrnu ječmena z neznano vsebnostjo β-glukanov. Zaključimo lahko, da je histokemijska metoda primerna za semi-kvantitativno določanje količine β-glukanov v zrnih ječmena, pri čemer jih lahko razdelimo v razrede z manjšo, srednjo in veliko vsebnostjo β-glukanov.

KLJUČNE BESEDE: ječmen, β-glukan, fluorescenca, kalkofluor beli, fluorescentni osvetljevalec 28, endosperm, alevronska plast

(5)

IV ABSTRACT

Barley is one of the oldest cultivated cereals in the world and is classified as a botanical member of the grass family (Poaceae). The primary structural components in the cell wall interiors of the starchy endosperm are (1→3), (1→4)-β-D-β-glucans. They are linear polysaccharides that belong to the group of dietary fibres and are a crucial part of human nutrition. β-glucan’s primary functions are the stabilisation of a plant’s cell wall and the mobilisation of energy produced by its hydrolysis. Our research project’s goals were the histochemical localisation of β-glucans within the grain of barley and the evaluation of fluorescence intensity in four different barley types for the basis of quantitative determination of the content of β-glucans. For source material, we gathered a few grains from three different types of barley with known concentrations of β-glucans, and a few grains of a type of barley with an unknown concentration of β-glucans. The specimens were prepared for cutting and dyeing with the freeze-thaw technique. Dyeing was achieved with two fluorescent dyes; Calcofluor White (Sigma-Aldrich) and the Fluorescent Brightener 28 (Sigma-Aldrich), which bind to the β-1,3 and β-1,4 polysaccharides. We determined that the β-glucans are present within the grain of barley, specifically within the starchy endosperm and the aleurone layer. We measured the intensity of fluorescence on the images of dyed slice samples using imageJ programme. With the help of the average values of fluorescence intensity, we created a calibration curve, which we used to determine the content of β-glucans in the grain of barley with an unknown content of β- glucans. We can conclude that the histochemical method is appropriate for semi- quantitative assessment of the β-glucan levels in grains of barley, which can then be classified into grades of lower, medium, and higher β-glucan content.

KEYWORDS: barley, β-glucan, fluorescence, Fluorescent Brightener 28, Calcofluor White, endosperm, aleurone layer

(6)

V KAZALO

POVZETEK ... III ABSTRACT ... IV KAZALO ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VI KAZALO SLIK ... VII KAZALO PRILOG ... VIII OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... IIX

1 UVOD ... 1

2 PREGLED OBJAV ... 2

2.1 ZGRADBA ZRNA JEČMENA ... 3

2.2 KAJ SO β-GLUKANI ... 5

2.3 KEMIJKA STRUKTURA β-GLUKANOV V ŢITIH ... 6

2.4 FLUORESCENČNA BARVILA ... 7

3 MATERIALI IN METODE ... 8

3.1 KEMIKALIJE ... 8

3.2 LABORATORIJSKA OPREMA ... 8

3.2.1 Drobni inventar ... 8

4 METODE DELA ... 9

4.1 PRIPRAVA VZORCEV ... 9

4.2 PRIPRAVA VODNIH RAZTOPIN BARVIL ZA IZVEDBO POSKUSA ... 9

4.3 REZANJE VZORCEV... 10

4.4 BARVANJE REZIN ... 10

4.5 POSTOPEK ZAJEMA SLIK ... 10

4.6 OPIS VREDNOTENJA INTENZITETE FLUORESCENCE ... 12

4.7 STATISTIČNA ANALIZA ... 14

5 REZULTATI Z RAZPRAVO ... 15

5.1 STATISTIČNA OBDELAVA VREDNOSTI INTENZITETE FLUORESCENCE ... 18

5. 2 STATISTIČNA PRIMERJAVA BARVANJA Z BARVILOMA FB28 IN CFW ... 20

ZAKLJUČEK ... 21

VIRI ... 23

ZAHVALA ... 26

PRILOGE ... 27

(7)

VI KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Rezultati povprečnih vrednosti intenzitet fluorescence prečnih prerezov treh kultivarjev ječmena pobarvanih z barvilom FB28, standardni odklon in standardna napaka ... 18 Preglednica 2: Rezultati povprečnih vrednosti intenzitet fluorescence prečnih prerezov treh kultivarjev ječmena, pobarvanih z barvilom CFW, standardni odklon in standardna napaka ... 18 Preglednica 3: p vrednosti Studentovega T-testa ... 20

(8)

VII KAZALO SLIK

Slika 1: Zgradba ječmenovega zrna ... 5

Slika 2: Osnovna struktura (1→3),(1→4)-β-D-β-glukanov iz ţit ... 6

Slika 3: Fotografije prečnega prereza ječmena, pobarvanega z barvilom CFW. ... 12

Slika 4: Fotografije prečnega prereza ječmena, pobarvanega z barvilom FB28... 12

Slika 5: Fotografije postopka merjenja intenzitete fluorescence pri prečnem prerezu zrna ječmena, pobarvanega z barvilom FB28 pri 2,5-kratni povečavi ... 13

Slika 6: Prečni prerez zrna ječmena (Hordeum vulgare Lyseval), pobarvanega z 0,01% raztopino barvila FB28 pri 2,5 kratni povečavi in UV svetlobi. ... 15

Slika 7: Prečni prerez zrna ječmena (Hordeum vulgare Lyseval), pobarvanega z 0,1% raztopino barvila FB28 pri 2,5-kratni povečavi in UV svetlobi. ... 15

Slika 8: Prečni prerez zrna ječmena (Hordeum vulgare Lyseval), pobarvanega z 0,35% raztopino barvila FB28 pri 2,5-kratni UV svetlobi. ... 15

Slika 9: Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev, pobarvanih z barvilom CFW, posnete na modrem kanalu pri 2,5-kratni povečavi. ... 16

Slika 10: Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev, pobarvanih z barvilom FB28, posnete na modrem kanalu pri 2,5-kratni povečavi ... 16

Slika 11: Fotografije območja merjenja intenzitete fluorescence prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev na modrem kanalu, pobarvanih z barvilom CFW, pri 2,5 kratni povečavi. ... 16

Slika 12: Fotografije območja merjenja intenzitete fluorescence prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev na modrem kanalu, pobarvanih z barvilom FB28, pri 2,5 kratni povečavi. ... 17

Slika 13: Umeritvena krivulja za določitev neznane količine β-glukanov v vzorcu 42 .... 19

(9)

VIII KAZALO PRILOG

PRILOGA A ... 27 PRILOGA B ... 31 PRILOGA C ... 35

(10)

IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

CFW barvilo kalkofluor beli

FB28 barvilo fluorescentni osvetljevalec 28 UV ultravijolična svetloba

EFSA Evropska agencija za varnost hrane (angl. European Food Safety Authority)

(11)

1 1 UVOD

V zadnjih nekaj letih se veliko pozornosti v prehrani posveča ječmenu, saj je EFSA (angl.

European Food Safety Authority) odobrila prehranski trditvi, da zadostno uţivanje β- glukanov iz ječmena lahko zmanjša količino holesterola v krvi ter prispeva k niţji ravni glukoze v krvi po obroku (EFSA 2010, 2011a).

Ječmen je zelo staro ţito, saj naj bi ga začeli gojiti ţe pred pribliţno 10 000 leti na območju srednjega vzhoda, od koder se je razširil po vsem svetu. Uvrščamo ga v druţino trav (Poaceae) in rod Hordeum. Najbolj poznana in razširjena je vrsta Hordeum vulgare (Havrlentová in Kraic, 2006). Zrna ječmena so bogata s hranili in sekundarnimi metaboliti, ki imajo znanstveno dokazane koristi za zdravje. Vsebujejo veliko prehranskih vlaknin, oligosaharidov, antioksidantov, mikrohranil, fenolov in drugih spojin, ki so povezane s preprečevanjem bolezni kot so debelost, diabetes, in povišan krvni tlak (Sullivan in sod., 2013).

Glavne pozitivne učinke znanstveniki pripisujejo β-glukanom, ki jih vsebuje večina trav, odkriti so bili tudi pri bakterijah, kvasovkah, plesnih, algah in nekaterih uţitnih gobah.

Čeprav veliko vrst ţit naravno vsebuje β-glukane, so bile večje količine tega polisaharida izolirane le iz zrn ječmena, ovsa in prosa (Sikora in sod., 2013). β-glukan, imenovan tudi (1-3, 1-4)-β-D-glukan, je naravna, linearna molekula, v vodi delno topnega polisaharida, ki je sestavljen iz molekul β-D-glukopiranoznih enot povezanih z glikozidnimi vezmi β-(1-4) in β-(1-3) (Sullivan in sod., 2013).

Cilji diplomske naloge so bili: optimizirati protokola za histokemijsko barvanje β- glukanov v zrnu ječmena z dvema različnima barviloma ter izmeriti intenziteto fluorescence pri štirih vrstah ječmena kot osnovi za semi-kvantitativno določanje vsebnosti beta glukanov. Določili smo optimalne koncentracije raztopin dveh različnih barvil za barvanje rezin ječmenovih zrn (kalkofluor beli - CFW, fluorescentni osvetljevalec 28 – FB28). S kamero AxioCam MRc (Carl Zeiss) smo posneli slike pobarvanih rezin ječmenovih zrn ter po obdelavi slik pomerili intenzitete fluorescence. Na podlagi izmerjenih intenzitet fluorescence smo izdelali umeritveno krivuljo s pomočjo katere smo določili količino β-glukanov v zrnu ječmena z neznano količino β-glukanov.

(12)

2 HIPOTEZE:

 β-glukani so lokalizirani v celični steni endosperma in v alevronskih celicah, zato bodo ti deli po barvanju z barvilom CFW in FB28 vidni ob vzbujanju z UV svetlobo.

 Intenzitete fluorescence prečnega prereza zrna ječmena bodo ob uporabi različnih barvil a isti koncentraciji barvila, različne.

 Izmerjene vrednosti intenzitete fluorescence bodo višje pri tistih vrstah ječmena, ki imajo večjo količino β-glukanov.

(13)

3 2 PREGLED OBJAV

Gojenje in pridelava ţit za potrebe človeške prehrane se je pričelo z razvojem kmetijstva, to je pred pribliţno 10 000 leti. V zadnjih 4000 letih predstavljajo ţitni prehranski proizvodi glavni deleţ celotne svetovne prehrane. Pozitivni učinki uporabe celotnih zrn v ţitnih proizvodih na človeško zdravje so znani ţe dolgo časa, saj so zrna ţit bogata s hranili, prehranskimi vlakninami, oligosaharidi, antioksidanti, mikrohranili, fenoli in drugimi spojinami, ki so povezane s preprečevanjem kardiovaskularnih bolezni (Havrlentová in Kraic, 2006).

Številne študije in vitro, tako v humani medicini kot tudi v veterini, so pokazale predvsem koristne učinke uţivanja ovsa in ječmena, saj imata visoko vsebnost nenasičenih maščobnih kislin, esencialno pomembnih prehranskih mineralov ter proteinov, ki naj bi zmanjševali raven holesterola v krvi. Dokazano je bilo tudi, da je v vodi topen β-glukan ena iz med glavnih bioaktivnih komponent, ki je odgovorna za številne domnevne pozitivne učinke na zdravje (Sullivan in sod., 2013). Evropska agencija za varno hrano – EFSA je leta 2010 potrdila, da se z zauţitjem 3 gramov prehranskih vlaknin na dan, kamor spadajo tudi β-glukani iz ječmena in ovsa, zmanjšujejo moţnost razvoja srčno-ţilnih bolezni (EFSA 2010). Pred tem so opravili različne analize, ki so dokazale, da se z zauţitjem 3 gramov prehranskih vlaknin iz ovsa ali ječmena raven holesterola v krvi zniţa od 0,13 do 0,16 mmol/L. Večjo zmanjšanje holesterola pa so imele tiste osebe, ki so imele na začetku analize višjo vrednost holesterola v krvi. (Johansson, 2006)

2.1 ZGRADBA ZRNA JEČMENA

Ječmen je eno od najstarejših ţit na svetu, ki je imelo veliko vlogo v človeški zgodovini, pri prehodu iz lova in nabiranja k agrarnemu načinu ţivljenja. Arheološke študije razkrivajo, da naj bi ječmen začeli gojiti pred 10 000 leti na območju »Rodovitnega polmesca« oziroma na današnjem bliţnjem Vzhodu. Skozi stoletja so ječmen gojili predvsem za krmo ţivine, v zadnjem času pa ga uporabljajo predvsem pri proizvodni hrane ter alkoholnih pijač, predvsem pri varjenju piva in viskija (Wigley in sod., 2017).

Ječmen je enoletnica, ki spada med ţita, te pa spadajo v botanično druţino trav (Poaceae).

Najbolj poznana in razširjena vrsta ječmena je Hordeum vulgare (Havrlentová in Kraic, 2006). Ječmen zori v kratki rastni sezoni, zato se ga lahko goji na različnih geografskih

(14)

4 lokacijah in pri različnih vremenskih razmerah. Zaradi nezahtevnosti pri gojenju, ječmen uspeva tako na subarktičnem delu Skandinavije kot tudi v sušnih in vročih predelih Evrope, Severne Amerike, Avstralije in Afrike (Wigley in sod., 2017). Vsebnost β- glukanov v ječmenu in ovsu je sortno specifična, odvisna pa je tudi od različnih okolijskih dejavnikov Najpomembnejši dejavnik, ki vpliva na vsebnost β-glukanov je razpoloţljivost vode med zorenjem ţita. Tako naj bi bila vsebnost β-glukanov najvišja pri tistih vrstah ječmena, ki so bile pred ţetvijo izpostavljene sušnim razmeram, saj je pri teh razmerah slabša sinteza in nalaganje škroba v endospermu zrna. Tiste vrste ječmena, ki pa so bile pred ţetvijo izpostavljena vlaţnim razmeram, imajo niţjo vsebnost β-glukanov (Brennan in Cleary, 2005).

Celotno zrno ječmena je sestavljeno iz 70 % škroba, 10-20 % proteinov, 5-10 % β- glukanov, 2-3 % maščob in 2,5 % mineralov. Zrno ječmena je pokrito in zraslo s plevami in se razlikuje od pšeničnega po velikosti in obliki. Od zunaj je obdano z zaščitno ovojnico. Ta je sestavljena iz zunanje ali plodnične (perikarp) in notranje ali semenske ovojnice (testa). Zunanja sloja, testa in perikarp, ščitita zrno pred mehanskimi poškodbami in napadi patogenov v času ţetve in kalivosti ter imata manjšo vsebnost prehranskih vlaknin (Hrovat, 2010)

Znotraj teste se nahaja endosperm, ki je sestavljen iz škrobnega endosperma in okoliške alevronske plasti. Škrobni endosperm predstavlja največji morfološki del zrna ječmena, ki vsebuje 75% svoje teţe. Škrobni endosperm sluţi kot hranilno tkivo za rast in razvoj zarodka med kalitvijo. Sestavljajo ga mrtve celice, ki nimajo jedra in vsebujejo vgrajene škrobne granule v matriki skladiščnih proteinov (Holopainen-Mantila, 2015).

Glavna sestavina notranjega dela celičnih sten škrobnega endosperma so (1→3),(1→4)-β- D-β-glukani (75%), z manjšo ne-škrobno komponento, identificirano kot arabinoksilani (20%) (Fox, 2010).

Alevronska plast v ječmenih zrnih je sestavljena iz dva do štirih vrst ţivih celic z debelimi, dvoslojnimi, celičnimi stenami, ki obdaja endosperm. Poleg zarodka je alevronski sloj edini del zrna, ki poleg embria vsebuje ţive celice. Celične stene alevrona vsebujejo fenolne kisline, ne-škrobne polisaharide, kot so β-glukani ter arabinoksilani. Alevronske celice so v primerjavi s celicami škrobnega endosperma izodiametrične. V alevronski plasti

(15)

5 se poleg ne-škrobnih polisaharidov nahajajo tudi pomembni elementi v sledovih, kot sta cink in ţelezo (Holopainen-Mantila, 2015).

Med alevronom in endospermom se nahaja plast celic, ki jo imenujemo subalevron, ki ščiti endosperm in zagotavlja potrebne encime za kalitev (Fox, 2010).

Slika 1: Zgradba ječmenovega zrna (prirejeno po Fox, 2010)

2.2 KAJ SO β-GLUKANI

Β-glukani so topni polisaharidi, ki so prisotni v vseh travah, najbolj pri ovsu in ječmenu, in jih uvrščamo med prehranske vlaknine. To so uţitni deli rastlin, ki so odporni na prebavo in absorpcijo v človeškem tankem črevesju s popolno ali delno fermentacijo v debelem črevesu. Če jih zauţijemo v zadostnih količinah lahko zniţajo nivo sladkorja v krvi, vplivajo na prebavo in zmanjšujejo apetit, s tem pa se zmanjša tveganje za kardiovaskularne bolezni in diabetes. Zaradi nekaterih lastnosti, kot so topnost, viskoznost ter sposobnost vezave vode, imajo prehranske vlaknine pozitivne učinke na zdravje.

Razgradnja β-glukanov poteka v debelem črevesu in to vpliva na rast bakterijskih sevov, ki so koristni za zdravje črevesja, saj se na njihov račun poveča volumen blata in pride do večje vezave vode, kar omogoča laţje odvajanje blata iz telesa (Jeršin, 2014).

Β-glukani se nahajajo v celični steni ţit, izolirali pa so jih tudi iz bakterij, plesni, kvasovk in nekaterih drugih uţitnih gob. Od skupnih ţit (pšenica, rţ, oves in ječmen) se največje (semenske) količine β-glukanov nahajajo v ječmenu (3-11%) in ovsu (3-7%), v ostalih ţitih (pšenica, rţ) pa so koncentracije β-glukanov zelo nizke (Johansson, 2006).

Alevronska plast

(16)

6 Zrno ječmena vsebuje 2-10% β-glukanov. Sedeminpetdeset procentov vseh polisaharidov v celicah endosperma ječmena predstavljajo β-glukani. Glavni nalogi β-glukanov sta stabilizacija rastlinske celične stene ter mobilizacija nastale energije pri njihovi hidrolizi (Wang in Ellis, 2014).

2.3 KEMIJKA STRUKTURA β-GLUKANOV V ŽITIH

Ţitni β-glukani, natančneje (1→3),(1→4)-β-D-β-glukani, so linearni polisaharidi, ki spadajo v skupino prehranskih vlaknin in so bistveni del človeške prehrane. Sestavljeni so D-glukopiranoznih enot, ki so med seboj povezane z β-(1-3) in β-(1-4) glikozidnimi vezmi.

(Wang in Ellis, 2014).

D-glukopiranozne enote so sestavni deli celične stene različnih vrst ţit kot so ječmen, oves, rţ in pšenica. Te so med seboj povezane v skupke z β-(1-4) vezmi. Posamezni skupki pa so med seboj ločeni z β-(1-3) vezmi. Pri hidrolizi s specifičnimi encimi nastane pribliţno 95%

trisahardnih in tetrasaharidnih podenot, 5% pa nastane daljših polimerov (Sullivan in sod., 2013). Razmerje med trisahardnimi in tetrasaharidnimi podenotami se med posameznimi vrstami ţit razlikuje, kar vpliva na fiziološke in kemijske lastnosti ţit. Pri ovsu je to razmerje 2:1, pri ječmenu 3:1 in pri pšenici 4:1, kar pomeni, da ima pšenica največji deleţ trisaharidov, medtem ko ima oves najmanjši deleţ trisaharidov. Poleg razmerja med oligosaharidnimi enotami na razlike v strukturi ţit vpliva tudi molska masa, viskoznost in topnost. Struktura β-glukanov ni pomembna samo za ugotavljanje razlik med vrstami glukanov, ampak vpliva tudi na številne fizikalne lastnosti β-glukanov. (Bacic in sod, 2009).

Slika 2: Osnovna struktura (1→3),(1→4)-β-D-β-glukanov iz ţit (Edgar181, 2008)

(17)

7 2.4 FLUORESCENČNA BARVILA

Kalkofluor beli (C40H42N12O10S2.2Na) in fluorescentni osvetljevalec 28 (C40H44N12O10S2), sta fluorescenčni selektivni barvili, ki se veţeta na β-1,3 in β-1,4 polisaharide in tako omogočata vizualizacijo celičnih sten zrn ovsa, ječmena in pšenice ter nekaterih gliv in bakterij. Ob vzbujanju z UV svetlobo (vzbujanje 365 nm in emisije 440 nm), barvili kalkofluor beli in fluorescentni osvetljevalec 28 fluorescirata z intenzivno modro barvo.

Škrob prav tako spada med polisaharide, vendar škrobna zrna ob zbujanju z UV svetlobo ne fluorescirajo. Ker se barvili selektivno veţeta tudi na celulozo, ju kot belilno sredstvo uporabljajo tudi v papirni industriji (Plasek in Hosková, 2009).

(18)

8 3 MATERIALI IN METODE

3.1 KEMIKALIJE

 Barvilo fluorescentni osvetljevalec 28 (FB28): Fluorescent Brightener 28 (C40H44N12O10S2), serijska številka: F3543-1G, Sigma-Aldrich, Nemčija

 Barvilo kalkofluor beli (CFW): Calcofluor White Stain (C₄₀H₄₂N₁₂O₁₀S₂.2Na), Serijska številka: 18909-100 mL-F, Sigma-Aldrich, Nemčija

 Kalijev hidroksid (KOH), serijska številka: 019-002-00-8, Merck KGaA, Nemčija

 Zamrzovalni medij: 25 ml Tissue Freezing Medium 14020108926, Leica Biosystems Richmond, Velika Britanija

 Bidestilirana voda

3.2 LABORATORIJSKA OPREMA 3.2.1 Drobni inventar

 Objektna in krovna stekla, (Thermo Thermo Scientific, VWR Chemicals Prolab, Anglija)

 Plastične pipete, Ratiolab GMBH, Nemčija

 Mikrocentrifugirke (1,5 mL in 2 mL iz polipropilena), Ratiolab GMBH, Nemčija

 Laboratorijska steklovina 3.2.2 Aparature

 Kriotom CM3050, Leica Biosystems, Nemčija

 Noţ iz nerjaveče kovine: High Profile Microtome Blades, Leica DB80 HS, Nemčija

 pH meter (HI 221, Hanna Instruments)

 Hladilnik (+ 4 °C) in zamrzovalnik (– 80 °C)

 mikroskop Axioskop 2 MOT (Carl Zeiss) z objektivi z 2.5, 10, 40, 63 in 100-kratno povečavo

 kamera AxioCam MRc (Carl Zeiss)

 programska oprema AxioVision 4.8 (Carl Zeiss).

(19)

9 4 METODE DELA

4.1 PRIPRAVA VZORCEV

Za pripravo vzorcev smo izbrali semena štirih različnih kultivarjev ječmena, ki so bila ţe predhodno označena s številkami 10 (cv. Pirona Danska), 42, 38 (München) in 614 (KM 2454-46-S, n, wax, dobro razraščen). Za vsak vzorec smo vzeli po dve semeni, katerima smo odrezali vrh, iz katerega izraščajo krovne pleve. V predhodno označene čaše s številkami 10, 38, 42, 614 smo nalili enako količino bidestilirane vode ter v njej imbibirali semena. Imbibicija je trajala pribliţno 24 ur v hladilniku pri 4 ˚C. Po 24 urah smo bidestilirano vodo s semeni odcedili ter semena rahlo osušili na sobni temperaturi.

4.2 PRIPRAVA VODNIH RAZTOPIN BARVIL ZA IZVEDBO POSKUSA

Za histokemijsko lokalizacijo β-glukanov v ječmenovih zrnih smo uporabili fluorescentni barvili, ki sta topni v vodi in se selektivno veţeta s polisaharidi v celični steni in alevronski plasti, vendar se razlikujeta glede na specifičnost in obstojnost. Uporabili smo kalkofluor beli in fluorescentni osvetljevalec 28.

Za barvanje rezin smo pripravili dve vodni raztopini, dveh različnih barvil. Za pripravo 0,01% raztopine kalkofluor beli smo zatehtali 10 mg kalkofluor belega ter ga raztopili v 100 mL bidestilirane vode. Ker se kalkofluor beli v vodi ne raztaplja dobro, smo raztopini dodali 1 kapljico 1 M KOH. Vrednost pH raztopine je bila med 10 in 11. Za pripravo 0,01% raztopine fluorescentnega osvetljevalca 28 smo zatehtali 10 mg fluorescentnega osvetljevalca 28 ter ga raztopili v 100 mL bidestilirane vode. Dodali smo kapljico KOH, izmerili pH vrednost. Ta je bila 10. Mikrocentrifugirke s pripravljenimi raztopinami barvil smo zavili v aluminijasto folijo, saj so barvila občutljiva na svetlobo. Do končne uporabe smo jih shranili v zamrzovalniku pri -80 ˚C.

(20)

10 4.3 REZANJE VZORCEV

Osušena semena smo dali v banjice iz trde aluminijaste folije, jih označili ter zalili z zamrzovalnim medijem (angl. tissue-freezing medium, Leica). Tako pripravljene banjice smo vsako posebej zmrznili v propanu hlajenem s tekočim dušikom. Zmrznjene banjice s semeni smo nato shranili v zamrzovalniku pri – 80 °C še 24 ur (Singh, S. P. in sod., 2014).

Zamrznjena semena smo rezali v kriomikrotomu (Leica CM3050). Zamrznjeno seme smo s pomočjo zamrzovalnega medija pritrdili na kovinski nosilec, ga obrezali in namestili na rezilno glavo kriomikrotoma. Temperatura komore med rezanjem je bila med -25 ˚C in -30

˚C, temperatura rezilne glave pa -25 ˚C. Pri rezanju smo uporabili noţ iz nerjaveče kovine (High Profile Microtome Blades, Leica DB8 0 HS). Rezali smo serijske rezine.

Debelina prečno rezanih rezin je bila 10 µm. Rezine smo s pomočjo pincete prenesli na dve predhodno ohlajeni objektni stekli, ki sta bili označeni s številkama vzorca. Za vsak vzorec smo narezali pribliţno dvajset rezin. Vsako objektno steklo z rezinami posameznega vzorca smo pogledali pri 2,5-kratni povečavi pod vidno svetlobo ter nato še pod UV osvetlitvijo.

4.4 BARVANJE REZIN

Objektna stekla z rezinami vzorcev smo nekaj minut pustili na sobni temperaturi, da so se vzorci stalili (angl. freeze-thaw tehnika). Na objektna stekla z rezinami vzorcev smo s kapalko nakapali bodisi raztopino barvila kalkoflour beli, bodisi raztopino barvila fluorescentni osvetljevalec 28 in počakali eno minuto. Odvečno raztopino barvila smo po 1 minuti odlili in rezine sprali z bidestilirano vodo.

4.5 POSTOPEK ZAJEMA SLIK

Za določevanje celičnih struktur v zrnih ţit se uporablja optična mikroskopija. Poznamo več načinov določanja celičnih struktur. Kateri način izberemo, pa je seveda odvisno od kemijske sestave celične strukture, ki jo ţelimo identificirati. Za pregled pobarvanih mikroskopskih preparatov smo uporabili optični mikroskop Axioskop 2 MOT (Carl Zeiss) z objektivi z 2.5, 10, 40, 63 in 100-kratno povečavo. Za zajem celotnega prečnega prereza zrna smo uporabili 2.5-kratno povečavo pri fluorescenčni (valovna dolţina UV ekscitacije je bila 365 nm in emisije 397 nm naprej) in presevni osvetlitvi. Pri 2.5-kratni povečavi smo

(21)

11 preparate pri presevni osvetlitvi slikali časom ekspozicije (exposure) 200 ms. Pri fluorescentni osvetlitvi pa pri času ekspozicije 450 ms.

Pobarvane mikroskopske preparate smo fotografirali s kamero AxioCam MRc (Carl Zeiss) ter slike zajemali s programsko opremo AxioVision 4.8 (Carl Zeiss). Za analizo in merjenje intenzitete signala smo slike obdelali s programom ImageJ, 64 bit (http://imagej.nih.gov/ij/). Podatke, ki smo jih dobili s programom ImageJ, smo obdelali v programu Microsoft Office Excel.

(22)

12 4.6 OPIS VREDNOTENJA INTENZITETE FLUORESCENCE

Meritve intenzitete fluorescence smo izvedli s programom ImageJ. S tem programom smo slike prečnih prerezov znr ječmena (vzorec 10, 38, 42, 614), pobarvanih z barvilom fluorescentni osvetljevalec 28, bodisi z barvilom kalkoflour beli, posnete z UV ekscitacijo, razstavili na tri osnovne barvne kanale (moder, zelen, rdeč).

Slika 3 prikazuje serijo štirih fotografij vzorca 10, pobarvanega z barvilom CFW.

Fotografija A prikazuje vzorec 10, posnetega pri UV svetlobi. Fotografija B prikazuje vzorec 10 pri modrem kanalu. Fotografija C prikazuje vzorec pri zelenem kanalu.

Fotografija D prikazuje vzorec 10 pri rdečem kanalu.

Slika 4 prikazuje serijo štirih fotografij vzorca 10, pobarvanega z barvilom FB28.

Fotografija A prikazuje vzorec 10, posnetega pri UV svetlobi. Fotografija B prikazuje vzorec 10 pri modrem kanalu. Fotografija C prikazuje vzorec pri zelenem kanalu.

Fotografija D prikazuje vzorec 10 pri rdečem kanalu.

Slika 3: Fotografije prečnega prereza ječmena (vzorec 10), pobarvanega z barvilom CFW. Fotografija A je barvna slika fluorescence prečnega prereza ječmena. Fotografija B je prečni prerez ječmena na modrem kanalu. Fotografija C je prečni prerez ječmena na zelenem kanalu. Fotografija C je prečni prerez ječmena na rdečem kanalu.

Slika 4: Fotografije prečnega prereza ječmena (vzorec 10), pobarvanega z barvilom FB28. Fotografija A je barvna slika fluorescence prečnega prereza ječmena. Fotografija B je prečni prerez ječmena na modrem kanalu. Fotografija C je prečni prerez ječmena na zelenem kanalu. Fotografija C je prečni prerez ječmena na rdečem kanalu.

(23)

13 Opravili smo meritve intenzitete fluorescence na modrem kanalu (fotografiji B), saj je bila jakost svetlobe največja. Za merjene intenzitet fluorescence smo vzeli samo tisto polovico vzorca, kjer je bila osvetljenost največja, in ne celega vzorca.

Izmerili smo povprečno intenziteto v izbranem območju preparata, tako da smo obkroţili območje z orodjem Freehand selection in izmerili.

Slika 5: Fotografije postopka merjenja intenzitete fluorescence pri prečnem prerezu zrna ječmena, pobarvanega z barvilom FB28 pri 2,5-kratni povečavi. Prva fotografija (iz leve proti desni) je barva slika fluorescence prečnega prereza zrna ječmena. Druga fotografija je polovica celotnega prečnega prereza zrna ječmena. Tretja fotografija je polovica celotnega prečnega prereza zrna ječmena na modrem kanalu. Četrta fotografija je območje merjenja intenzitete fluorescence.

Zgoraj opisan postopek merjenja intenzitete fluorescence smo na enak način izvedli tudi za vzorce številka 42, 38 in 614 pobarvane tako z CFW kot tudi za vzorce številka 10, 42, 38 in 614 pobarvane s FB28.

(24)

14 4.7 STATISTIČNA ANALIZA

Rezultate intenzitete fluorescence, pomerjene na polovicah rezin vzorcev smo statistično ovrednotili tako, da smo izračunali povprečno vrednost intenzitete za posamezen vzorec, določili R-kvadrat vrednosti, standardni odmik ter standardno napako.

Intenzitete fluorescence za isti kultivar ječmena, vendar barvan z različnima barviloma, smo ovrednotili s Studentovim t-testom. Analize smo opravili s pomočjo programske opreme Excel.

(25)

15 5 REZULTATI Z RAZPRAVO

Pri preliminarnem rezanju in barvanju smo ţeleli ugotoviti, katera koncentracija barvila CFW in FB28 je optimalna za histokemijsko določitev β-glukanov. Izvedli smo poskusne serije barvanja rezin zrna ječmena (kultivarja Hordeum vulgare Lyseval in Hordeum vulgare Reni) s tremi različnimi koncentracijami raztopin barvila fluorescentni osvetljevalec 28 in kalkofluor beli. Začetne koncentracije raztopin so bile 0,01%, 0,1% in 0,35%. Po pregledu vseh pobarvanih rezin z različnimi koncentracijami ter pregledu objav smo ocenili, da je najbolj optimalna koncentracija za barvilo kalkofluor beli 0,01% (w/v) in za fluorescentni osvetljevalec 28 0,01% (w/v) (Sikora in sod., 2013).

Slika 6: Prečni prerez zrna ječmena (Hordeum vulgare Lyseval), pobarvanega z 0,01% raztopino barvila FB28 pri 2,5 kratni povečavi in UV svetlobi.

Slika 7: Prečni prerez zrna ječmena (Hordeum vulgare Lyseval), pobarvanega z 0,1% raztopino barvila FB28 pri 2,5- kratni povečavi in UV svetlobi.

Slika 8: Prečni prerez zrna ječmena (Hordeum vulgare Lyseval), pobarvanega z 0,35% raztopino barvila FB28 pri 2,5- kratni UV svetlobi.

(26)

16 Intenziteto fluorescence smo merili sprva na območju celotnega vzorca. Z dobljenimi rezultati nismo bili zadovoljni, saj je bila osvetlitev vidnega polja neenakomerna in tako niso bili vsi deli vzorca enako osvetljeni. Na podlagi tega smo se odločili, da bomo za merjenje intenzitete vzeli samo tisto polovico vzorca, kjer je bila osvetljenost največja.

Slika 9: Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev, pobarvanih z barvilom CFW, posnete na modrem kanalu pri 2,5-kratni povečavi. Fotografija A – vzorec 10. Fotografija B – vzorec 38.

Fotografija C – vzorec 42. Fotografija D – vzorec 614.

Slika 10: Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev, pobarvanih z barvilom FB28, posnete na modrem kanalu pri 2,5-kratni povečavi. Fotografija A – vzorec 10. Fotografija B – vzorec 38.

Fotografija C – vzorec 42. Fotografija D – vzorec 614.

Slika 11: Fotografije območja merjenja intenzitete fluorescence prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev na modrem kanalu, pobarvanih z barvilom CFW, pri 2,5 kratni povečavi. Fotografija A – vzorec 10. Fotografija B – vzorec 38. Fotografija C – vzorec 42. Fotografija D – vzorec 614.

(27)

17

Slika 12: Fotografije območja merjenja intenzitete fluorescence prečnih prerezov zrna ječmena štirih različnih kultivarjev na modrem kanalu, pobarvanih z barvilom FB28, pri 2,5 kratni povečavi. Fotografija A – vzorec 10. Fotografija B – vzorec 38. Fotografija C – vzorec 42. Fotografija D – vzorec 614.

(28)

18 5.1 STATISTIČNA OBDELAVA VREDNOSTI INTENZITETE

FLUORESCENCE

Rezultate vseh meritev intenzitet smo obdelali tako, da smo jih razdelili glede na vrsto barvila, s katerim so bili vzorci pobarvani. Za vsak vzorec smo iz nabora meritev določili povprečno vrednost intenzitete fluorescence. Izračunali smo standardni odklon (SD) ter standardno napako (SE).

Na podlagi povprečne stopnje fluorescence, pridobljene z Image J programom ter znanih vsebnosti β-glukanov v vzorcih 10, 38 in 614, smo izdelali umeritveno krivuljo, s pomočjo katere smo določili neznano vsebnost β-glukanov ječmenovih zrn vzorca 42. Predvidevali smo, da bodo imele rezine z večjo vsebnostjo β-glukanov, večjo intenziteto fluorescence od tistih z manjšo vsebnostjo β-glukanov, zato smo umeritveno krivuljo izdelali samo za vzorce, pobarvane z barvilom FB28, kjer je fluorescenca naraščala z koncentracijo β- glukanov. Izdelali smo tudi umeritveno krivuljo s podatki povprečnih vrednosti intenzitet fluorescence vzorcev pobarvanih z barvilom CFW, vendar pa ta umeritvena krivulja ni bila uporabna in zanesljiva, saj fluorescenca ne narašča z koncentracijo β-glukanov.

Preglednica 1: Rezultati povprečnih vrednosti intenzitet fluorescence prečnih prerezov treh kultivarjev ječmena (10, 38, 614), pobarvanih z barvilom FB28, standardni odklon in standardna napaka

Preglednica 2: Rezultati povprečnih vrednosti intenzitet fluorescence prečnih prerezov treh kultivarjev ječmena (10, 38, 614), pobarvanih z barvilom CFW, standardni odklon in standardna napaka

vzorec Povprečna vrednost intenzitete fluorescence

Količina β-glukanov

Standardni odklon (SD)

Standardna napaka (SE)

FB28_10 83,7 3,81 11,53 1,28

FB28_38 78,7 2,91 7,00 0,54

FB28_42 87,1 neznana 9,86 1,10

FB28_614 86,5 5,8 6,75 0,75

vzorec Povprečna vrednost intenzitete fluorescence

Količina β-glukanov

Standardni odklon (SD)

Standardna napaka (SE)

CFW_10 117,5 3,81 7,96 1,33

CFW_38 98,3 2,91 19,77 2,47

CFW_42 101,7 nenzana 34,43 4,30

CFW_614 80,6 5,8 11,88 1,49

(29)

19

Slika 13: Umeritvena krivulja za določitev neznane količine β-glukanov v vzorcu 42

S preoblikovanjem enačbe (1) umeritvene krivulje ter z znano povprečno intenziteto fluorescence, smo izračunali neznano količino β-glukanov za vzorec 42. Dobljena količina je znašala 5,8.

Tako smo semi-kvantitativno ovrednotili količine β-glukanov v zrnih ječmena. Na podlagi semi-kvantitativne analize lahko vzorce 10, 38, 42 in 614 razdelimo v tri velikostne razrede glede na njihovo količino β-glukanov v zrnu (Sikora in sod., 2013). Vzorec 38 spada v razred z majhno količino β-glukanov, vzorec 10 v razred s srednjo količino, vzorca 42 in 614 pa v razred z višjo količino β-glukanov.

…(1)

(30)

20 5. 2 STATISTIČNA PRIMERJAVA BARVANJA Z BARVILOMA FB28 IN CFW Za preverjanje druge hipoteze (intenzitete fluorescence prečnega prereza zrna ječmena bodo ob uporabi različnih barvil a isti koncentraciji barvila, različne) smo izvedli Studentov t-test za vzorce 10, 38, 42, 614 pri merjenju intenzitete fluorescence barvila FB28 in CFW v celotnem prečnem preseku polovice zrna ječmena. Pri vzorcu 614 je bila p vrednost, ki smo jo dobili po opravljenem Studentovem t-testu, večja od 0,05. Lahko rečemo, da razlike med povprečno intenziteto pri barvanju s CFW in FB28 ni. To pomeni, da sta povprečni intenziteti podobni.

Pri vzorih 10, 38 in 42 je bila p vrednost, ki smo jo dobili po opravljenem Studentovem t- testu manjša od 0,05. Lahko rečemo, da je razlika med povprečno intenziteto pri barvanju s CFW in FB28 statistično značilno različna.

preglednica 3: p vrednosti Studentovega T-testa

Ime vzorca p vrednost

10 38 42 614

0,00013 0,03508 0,00126 0,41131

(31)

21 ZAKLJUČEK

Namen diplomskega dela je bila histokemijska določitev lokalizacije β-glukanov v zrnu ječmena z uporabo dveh barvil: CFW in FB28. Obe omenjeni barvili sta specifični barvili za vezavo na β-1,3 in β-1,4 polisaharide in ob UV svetlobi fluorescirata modro. Ta lastnost nam je omogočila, da smo lahko po barvanju rezin štirih različnih kultivarjev ječmena ovrednotili tudi intenziteto fluorescence prečnega prereza zrna ječmena in jo primerjali z eksperimentalno določenimi količinami β-glukanov (Kreft, neobjavljeno). Na podlagi izmerjenih intenzitet fluorescence smo izdelali umeritveno krivuljo. S preoblikovanjem enačbe umeritvene krivulje smo določili tudi neznano količino β-glukanov v zrnu kultivarja ječmena 42. Ta je bila 5,8.

Izmerjene intenzitete fluorescence pri vzorcih, pobarvanih z FB28, smo primerjali z ţe znanimi izmerjenimi količinami β-glukanov. Na podlagi umeritvene krivulje, ki smo jo izdelali s pomočjo izmerjenih intenzitet fluorescence, smo ugotovili, da so imela tista zrna ječmena z višjo količino β-glukanov, višjo intenziteto fluorescence, zato lahko vrste ječmena grupiramo v razrede z niţjo, srednjo in višjo vsebnostjo β-glukanov v zrnu. S tem smo potrdili našo tretjo hipotezo.

Ugotovili smo, da je optimalna koncentracija barvil za histokemijsko barvanje prečnih prerezov zrn ječmena 0,01% (w/v) za barvilo FB28 ter prav tako 0,01% (w/v) za barvilo CFW. Na rezinah vzorcev 10, 42, 38 in 614 lahko vidimo intenzivnejšo modro obarvanost v predelu sten v notranjosti endosperma ter alevronske in subalevronske plasti. S tem lahko potrdimo našo hipotezo, da so β-glukani lokalizirani v celični steni endosperma in v alevronskih celicah, zato se te deli po barvanju in ob vzbujanju z UV svetlobo obarvajo modro, s čimer smo potrdili našo prvo hipotezo.

Za analizo statistično značilne razlike v intenziteti fluorescence pri barvanju z dvema različnima barviloma CFW in FB28 smo uporabili Studentov t-test za neodvisne vzorce.

Primerjava intenzitet fluorescence pri posameznih kultivarjih ječmena je pokazala, da se intenziteta razlikuje pri uporabi različnih barvil (CFW in FB28) istih koncentracij, razen pri vzorcu 614, kjer razlike med povprečno intenziteto pri barvanju s CFW in FB28 ni. S tem smo potrdili tudi našo drugo hipotezo.

Z raziskavo smo pokazali, da bi količino β-glukanov v zrnu ječmena in posledično tudi v drugih vrstah ţit, lahko ovrednotili s histokemijskim barvanjem, in sicer z uporabo 0,01%

(32)

22 raztopine barvila FB28 ter primerjavo fluorescence z vzorci z znano vsebnostjo β- glukanov.

(33)

23 VIRI

Bacic, A. F. (2009). Chemistry, Biochemistry, and Biology of 1-3 Beta Glucans and Related Polysaccharides, 1st Edition. Academic Press 2009.

Betts, N. W. (2017). Morphology, Carbohydrate Distribution, Gene Expression, and Enzymatic Activities Related to Cell wall Hydrolysis in Four Barley Varieties during Simulated Malting. Plant Science.

Brennan, C. S. (2005). The potential use of cereal (1-3, 1-4)-β-D-glucans as functional food igredients. Journal of Cereal Science, 42: 1-13.

Edgar181. (November 2008). Oat β-glucan repeat structure, chemical structure of Beta-1,3- 1,4-glucan (lichenin, lichenan, moss starch). Prevzeto Februar 2019 iz Wikipedia:

https://en.wikipedia.org/wiki/Oat_beta-glucan#/media/File:Beta-1,3-1,4-glucan.png

EFSA. (2010). Scientific opinion on the substantiation of a health claim related to oat beta - glucan and lowering blood cholesterol and reduced risk of (coronary) heart disease pursuant to Article 14 of Regulation (EC). EFSA Journal, 8, 12, 15.

EFSA. (EFSA Journal). Scientific opinion on the substantiation of health claims related to beta-glucans from oats and barley and maintenance of normal blood LDL- cholesterol concentrations. 2011, 21.

Fox, G. (2010). Researchgate. Prevzeto avgust 2018 iz Chemical Composition in Barley Grains and Malt Quality:

https://www.researchgate.net/publication/227235861/download

Havrlentová, M. K. (2006). Content of β-D-glucan in cereal grains. Journal Of Food And Nutrition Research, 97-103.

(34)

24 Holopainen-Mantila, U. (2015). Composition and structure of barley (Hordeum vulgare L.) grain in relation to end uses. Academic dissertation . Helsinki: VTT Technological Research Centre of Finland.

Hrovat, M. (2010). Mlinarstvo. Prevzeto December 2018 iz Ministerstvo za šolstvo in šport:

http://www.mizs.gov.si/fileadmin/mizs.gov.si/pageuploads/podrocje/ss/Gradiva_ES S/Biotehniska_podrocja__sole_za_zivljenje_in_razvoj/BT_PODROCJA_104ZIVI LSTVO_Mlinarstvo_Hrovat.pdf

Jääskeläinen, A.-S. &. (2013). Endosperm and aleurone cell structure in barley and wheat as studied by optical and Raman microscopy. Journal of Cereal Science, 543-55.

Jeršin, S. (2014). Izloacija in karakterizacija beta-glukanov iz ječmenove moke.

Magistersko delo. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta.

Johansson, L. (2006). Structural analyses of (1→3),(1→)-β-D-glucan of oats and barley.

Doctoral dissertation. Department of Applied Chemistry and Microbiology, Helsinki. Prevzeto avgust 2018 iz

http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/maa/skemi/vk/johansson/structur.pdf

Patterson, C. (avgust 2008). Agriculture and Agri-Food Canada. Prevzeto avgust 2018 iz

Oat and Barley ß-Glucans. Unique soluble fibres:

http://www5.agr.gc.ca/resources/prod/doc/misb/fb-ba/nutra/pdf/B-Glucans_Eng.pdf

Plasek, J. H. (2009). Solvatochromic Effect in the Optical Spectra of Calcofluor and its Relation to Fluorescent Staining of Yeast Cell Walls. Journal of fluorescence, 342- 352.

Sigma-Aldrich. (2013). Acid Fuchsin. Prevzeto avgust 2018 iz Sigma-Aldrich:

https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/f8129?lang=en&region=SI

(35)

25 Sikora, P. T. (2013). Indentificytion of high beta-glucan oat lines and localization and chemical cheracterization of their seed karnel neta-glucans. Food Chemistry, 83-91.

Singh, S. V.-M. (2014). Spatial X-ray fluorescence micro-imaging of minerals in grain tissuesof wheat and related genotypes. Planta.

Sullivan, P. A. (2013). The increasing use of barley and barley by-products in the production of healthier baked goods. Trends in Food Science & Tecnology, 124- 134.

Wang, Q. E. (2014). Oat β-glucan: physico-chemical characteristics in relation to its blood- glucose and cholesterol-lowering properties. British Journal Of Nutrition. British Journal Of Nutrition, 112S4.

Wrigley, C. B. (2017). Cereal Grains: Assessing and Managing Quality (Woodhead Publishing Series in Food Science, Technology and Nutrition), 2nd Edition.

Woodhead Publishing.

(36)

26 ZAHVALA

Zahvaljujem se mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš ter recenzentu dr. Alešu Kladniku za vodenje in predloge pri pisanju naloge.

Zahvaljujem se tudi sodelavcem v laboratoriju, še posebej mladi raziskovalki Anji Kavčič za vso pomoč in nasvete tako pri eksperimentalnem delu kot tudi pri pisanju diplomske naloge.

Za podporo se iskreno zahvaljujem tudi staršem in sestri, ki so mi omogočili študij, ter prijateljem za podporo in razumevanje v teţkih trenutkih.

(37)

27 PRILOGE

PRILOGA A

Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena z barvilom FB28, vzorec številka 10, pri 2,5-kratni povečavi, pri UV svetlobi.

(38)

28

Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena z barvilom FB28, vzorec številka 38, pri 2,5-kratni povečavi, pri UV svetlobi

(39)

29

Fotografije prečnih prerezov ječmena z barvilom FB28, vzorec številka 42, pri 2,5-kratni povečavi, pri UV svetlobi.

(40)

30

Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena z barvilom FB28, vzorec številka 614, pri 2,5-kratni povečavi, pri UV svetlobi.

(41)

31 PRILOGA B

Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena z barvilom CFW, vzorec številka 10, pri 2,5-kratni povečavi, pri UV svetlobi.

(42)

32

(43)

33

(44)

34

Fotografije prečnih prerezov zrna ječmena z barvilom CFW, vzorec številka 614, pri 2,5-kratni povečavi, pri UV svetlobi

(45)

35 PRILOGA C

Preglednica 4: Vrednosti intenzitete fluorescence rezin vzorca 10, pobarvanega z barvilom CFW

Ime vzorca Intenziteta fluorescence

CFW_10_1 CFW_10_2 CFW_10_3 CFW_10_4 CFW_10_5 CFW_10_6 CFW_10_7 CFW_10_8

118.484 106.526 99.951 121.202 128.752 109.465 127.468 121.677

CFW_38_1 CFW_38_2 CFW_38_3 CFW_38_4 CFW_38_5 CFW_38_6 CFW_38_7 CFW_38_8 CFW_38_9 CFW_38_10

70.006 79.321 118.723 134.595 98.283 93.040 96.054 138.017 92.228 74.388

88.291 104.279 109.664 111.417 103.287 96.865 102.072 103.755 105.320 82.091

(46)

36

66.022 69.130 88.003 71.324 69.349 101.699 101.829 81.399 90.323 73.614

Preglednica 5: Vrednosti intenzitete fluorescence rezin vzorca 10, pobarvanega z barvilom FB28

FB28_10_1 FB28_10_2 FB28_10_3 FB28_10_4 FB28_10_5 FB28_10_6 FB28_10_7 FB28_10_8 FB28_10_9

75.661 65.300 92.485 86.378 95.373 67.951 93.910 93.057 83.039

FB28_38_1 FB28_38_2 FB28_38_3 FB28_38_4 FB28_38_5 FB28_38_6 FB28_38_7 FB28_38_8 FB28_38_9 FB28_38_10 FB28_38_11 FB28_38_12

69.457 81.770 83.647 81.675 74.300 76.986 85.865 71.008 82.960 86.153 88.894 69.714

(47)

37

107.034 95.728 83.601 91.162 80.822 79.510 74.072 84.113 88.183

73.169 88.935 88.058 86.270 88.914 90.838 88.615 78.239 95.518