DIPLOMSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Tjaša Stopar

Ljubljana, 2021

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJA

Metode za določanje sečnine

DIPLOMSKO DELO

Tjaša Stopar

M

ENTOR

ICA : doc. dr. Nataša Gros

Ljubljana, 2021

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Tjaša Stopar sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Metode za določanje sečnine.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr.

Nataše Gros;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

 je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 26. 8. 2021 Podpis avtorice:

(6)

(7)

(8)

(9)

ZAHVALA

Rada bi se zahvalila mentorici doc. dr. Nataši Gros za vse nasvete in pomoč pri pisanju tega dela.

Med drugim si zahvalo zaslužijo tudi starši in brat, ki so mi stali ob strani, me spodbujali in podali marsikater dober nasvet, ki mi je prišel prav tako pri samem študiju kot tudi pri življenju na sploh.

Zahvalila bi se tudi Tanji in Sari, ki sta, sicer dobre laboratorijske vaje, naredili ene izmed najlepših spominov na faks, da ne govorimo o druženju izven fakultetnih prostorov.

Spomini na smeh, ki smo si ga delile v času študija, me bodo opominjali, da je študij lahko tudi zabava in ne samo delo in učenje.

Posebna zahvala gre tudi Janu, ki mi je stal ob strani in mi pomagal, da sem ugotovila, da sem zmožna več kot sem si mislila na začetku. Skupno učenje, vsestransko spodbujanje in tako kemijski kot tudi nekemijski pogovori so mi spremenili pogled na življenje in na študij.

(10)

(11)

Metode za določanje sečnine

Povzetek: Metode za določanje sečnine v človeških vzorcih lahko razdelimo v tri različne skupine – biosenzorji, metode s spektrometrično detekcijo in pretočne metode. Večina metod za določanje sečnine uporablja encim ureazo, ki katalizira hidrolizo sečnine do amonijaka in ogljikovega dioksida. Ta encim predstavlja prvo stopnjo določitve sečnine v vzorcih, saj večina metod temelji na določanju enega ali obeh produktov reakcije hidrolize sečnine ali pa temelji na spremembi pH, do katere pride zaradi te iste reakcije.

Pomembni parametri pri izbiri metode za določanje sečnine so: kvadrat korelacijskega koeficienta (R²), širina linearnega območja, meja zaznave, obstojnost sistema, čas trajanja analize in selektivnost. Po primerjavi opisanih metod med seboj sem prišla do zaključka, da med obetavnejše metode za določitev sečnine sodijo: optični biosenzor s tankim slojem polianilina, elektrokemijska detekcija z uporabo kopolimerov iz zlatih nanodelcev, spektrometrična detekcija s srebrovimi nanodelci in avtomatizirana spektrometrična detekcija s plinsko segmentiranim analizatorjem.

Ključne besede: sečnina, ureaza, reakcija hidrolize sečnine

Methods for determination of urea

Abstract: Methods for determination of urea in human samples can be devided into three diferent groups – biosensors, methods with spectrometrical detection and flow-based methods. Most of them use enzyme urease, which catalyzes reaction of hydrolysis of urea.

Products of this reaction are ammonia and carbon dioxide. Even though hydrolysis is the first step for determination of urea, most methods for determination of urea use one or both products of catalyzed reaction of hydrolysis of urea or they detect change of pH in a sample solution. The important parameters in selection of a method for determination of urea are: coefficient of determination (R²), linear range of concentration, limit of detection, stability, duration of analysis and selectivity. After a comparison between the described methods, the more promising ones for determination of urea are: optical biosensors based on polyaniline thin films, electrochemical determination of urea using a gold nanoparticle-copolymer, a paper-based device for the colorimetric determination of urea using silver nanoparticles and automated spectrometric determination of urea by gas- segmented continous flow analysis.

Keywords: urea, urease, reaction of hydrolysis of urea

(12)

(13)

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Sečnina ... 1

1.2 Ureaza ... 2

2 Namen dela ... 5

3 Metode ... 7

4 Rezultati in razprava ... 9

4.1 Biosenzorji ... 9

4.1.1 Optični biosenzorji s tankim slojem iz polianilina ... 9

4.1.2 Biosenzorji z barvilom prusko modro ... 11

4.1.3 Določitev sečnine s tekočim kristalom ... 12

4.1.4 Piezouporovni hidrogelni biosenzor ... 14

4.1.5 Organski zeoliti z imobilizirano ureazo za detekcijo z biosenzorjem na optična vlakna ... 16

4.1.6 Elektrokemijska detekcija z uporabo kopolimerov iz zlatih nanodelcev ... 18

4.2 Metode s spektrometrično detekcijo ... 20

4.2.1 Spektrometrična detekcija s srebrovimi nanodelci ... 20

4.2.2 Avtomatizirana spektrometrična detekcija s plinsko segmentiranim analizatorjem neprekinjenega pretoka ... 22

4.2.3 Spektrometrična detekcija s peroksidazno aktivnostjo zlatih nanodelcev .. 24

4.3 Pretočne metode ... 26

4.3.1 FIA metode za detekcijo sečnine z uporabo brezstičnega konduktometričnega in spektrometričnega senzorja ... 27

4.3.2 Optični senzorji s sistemom pretočne analize... 28

5 Primerjava metod za določanje sečnine ... 31

5.1 Linearno območje in korelacijski koeficient (R²) ... 31

5.2 Meja zaznave ... 31

5.3 Obstojnost sistema ... 32

5.4 Čas trajanja analize ... 32

(14)

5.5 Pomembni posebni pogoji pri analizi ... 32

5.6 Selektivnost ... 33

6 Sklep ... 35

7 Literatura ... 37

8 Priloge ... 39

(15)

Kazalo tabel:

Tabela 1: Analizno obnašanje optičnega biosenzorja PANI/ureaza. ... 11

Tabela 2: Analizno obnašanje optičnega biosenzorja z barvilom prusko modro.^[1] ... 12

Tabela 3: Obnašanje metode detekcije s tekočim kristalom... 14

Tabela 4: Parametri obnašanja biosenzorja s hidrogelom. ... 16

Tabela 5: Analizno obnašanje biosenzorja na optična vlakna. ... 18

Tabela 6: Analizno obnašanje amperometričnega biosenzorja z zlatimi nanodelci. ... 19

Tabela 7: Parametri obnašanja kvantitativne analize sečnine s PAD. ... 22

Tabela 8: Analizno obnašanje avtomatizirane spektrometrične detekcije... 24

Tabela 9: Analizno obnašanje spektrometrične določitve sečnine s pomočjo zlatih nanodelcev. ... 26

Tabela 10: Parametri obnašanja v primeru določitve sečnine s C4D in LEDs... 28

Tabela 11: Analizno obnašanje obeh tehnik s sistemom pretočne analize. ... 30

Kazalo slik:

Slika 1: Strukturna formula sečnine. ... 1

Slika 2: Shema cikla sečnine. ... 2

Slika 3: Struktura ureaze – dimer heterotrimera, 6 podenot. ... 3

Slika 4: Struktura ureaze – vsaka podenota ima 1 Ni²⁺ ion (rdeča krogla) in 1 PO43- ion (5 zelenih krogel). ... 3

Slika 5: Nikljevi in fosfatni ioni so v ureazi razporejeni oktaedrično. ... 4

Slika 6: Kemijska reakcija hidrolize sečnine z ureazo. ... 4

Slika 7: Strukturna formula polianilina – a) popolnoma reducirana oblika; b) delno reducirana in delno oksidirana oblika; c) popolnoma oksidirana oblika. ... 10

Slika 8: Barvilo prusko modro – a) strukturna formula kompleksa [Fe(CN)6]^4-; b) 3D strukturna formula; c) barva barvila. ... 11

Slika 9: Reakcija redukcije prusko modro do prusko belo, pri kateri sodelujejo kalijevi ioni (K⁺) ^[15]. ... 12

Slika 10: Strukturna formula 4-ciano-4'-pentilbifenila. ... 13

Slika 11: Strukturna formula stearinske kisline z molekulsko formulo C17H35CO2H. ... 13

Slika 12: Prikaz vrste razporeditev molekul 4-ciano-4'-pentilbifenila – a) linerna razporeditev; b) homeotropska razporeditev. ... 14

Slika 13: a) Strukturna formula akrilne kisline; b) strukturna formula dimetilaminoetil metakrilata. ... 15

(16)

Slika 14: Shema kopolimera. ... 15

Slika 15: Kemijska strukturna formula imidazolata (Im), ki je del strukture zeolitnega imidazolata... 17

Slika 16: a) Struktura zeolitnega imidazolata; b) tetraedrična vezava imidazolatnih molekul na Zn(II); c) prikaz kanalov, po katerih potujejo analiti v zeolitni mreži. ... 17

Slika 17: Shema monomerne enote polipropilena. ... 18

Slika 18: a) Strukturna formula tiomalne kisline; b) strukturna formula maltola. ... 21

Slika 19: Primer PAD ploščice za detekcijo sečnine – a) primer razporeda razdelkov na PAD ploščici; b) obarvanje cone detekcije pred dodatkom vzorca, po dodatku samo NH3, po dodatku samo CO2 in po injiciranju vzorca sečnine. (prirejeno po ^[12]) ... 22

Slika 20: Strukturna formula diacetil monoksima (DAM). ... 23

Slika 21: Reakcijska shema reakcije med DAM in sečnino. ... 23

Slika 22: Molekulska formula 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin-a (TMB). ... 25

Slika 23: Reakcijska shema oksidacije TMB do 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin diimin-a. . 26

Slika 24: Strukturna formula salicilne kisline. ... 28

Slika 25: Reakcijska shema Barthelojeve metode za detekcijo sečnine. ... 29

Slika 26: Reakcijska shema – uporaba Ehrlichovega reagenta za določanje sečnine. ... 29

(17)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

AC izmenični tok

AgNPs srebrovi nanodelci (angl. silver nanoparticles) AuNPs zlati nanodelci (angl. gold nanoparticles)

C4D kapacitivno sklopljen brezstičen kapacitiven detektor (angl. capacitively coupled contacless conductivity detector)

DAM diacetil monoksim (angl. diacetyl monoxime)

DC enosmerni tok

dec dekada – enota na logaritemskem merilu

FIA pretočna injekcijska analiza (angl. flow injection analysis) LC tekoč kristal (angl. liquid crystal)

LoD meja zaznave (angl. limit of detection)

MAL maltol

MOFs organo-kovisko ogrodje (angl. metal organic frameworks) NPs nanodelci (angl. nanoparticles)

PANI polianilin

PDB baza podatkov o proteinih (angl. protein data base) PB prusko modro (angl. prussian blue)

TMA tiomalna kislina (angl. thiomalic acid)

WGM valovanje okoli konkavne površine (angl. whispering-gallery modes) ZIF-8 ogrodje zeolitnega imidazolata (angl. zeolitic imidazolate framework)

(18)

(19)

Tjaša Stopar Metode za določanje sečnine

1

1 Uvod

Določitev sečnine je dandanes zelo pomembna ne samo pri odkrivanju različnih zdravstvenih zapletov, ki so lahko posledica zvišane koncentracije sečnine v urinu, krvi ali slini, temveč tudi v okoljski in klinični analizi ter seveda pri analizi hrane. Kot primer bi lahko dala določitev koncentracije sečnine v mlečnih izdelkih, saj je previsoka koncentracija sečnine v tej hrani škodljiva za otroke in nosečnice ^[1].

Ob prebiranju člankov sem najpogosteje zaznala problematiko, kako na enostaven, hiter in cenovno ugoden način s čim večjo preciznostjo določiti koncentracijo sečnine v človeških vzorcih. Kot sem v prejšnjem odstavku nakazala, obstaja povezava med koncentracijo sečnine v človeških vzorcih in nepravilnim delovanjem ledvic in jeter. Na primer, znižana koncentracija sečnine v urinu je lahko pokazatelj ciroze jeter, odpovedi jeter, itd. ^[2]. Po drugi strani pa je lahko zvišana koncentracija sečnine v vzorcu posledica odpovedi ledvic, dehidracije, šoka, itd. ^[3]. Da bi lahko te zdravstvene zaplete čim prej prepoznali in jih posledično čim prej začeli tudi zdraviti, je pomembna točna in natančna določitev sečnine v človeških vzorcih, zaradi česar sem se odločila, da se bom v svojem diplomskem delu osredotočila predvsem na določitev sečnine v človeških vzorcih z različnimi tehnikami, ki bodo predstavljene in primerjane v nadaljevanju dela.

1.1 Sečnina

Sečnina je organska molekula s kemijsko formulo CO(NH2)2 (Slika 1) in sodi med amide ter hkrati tudi med ketone. Spojina je pri sobni temperaturi v trdnem stanju, je brez barve in brez vonja ter se dobro topi v vodi (545 g/L pri 25 °C). Prav tako ni posebej strupena (LD50 je za podgane, ki so sečnino zaužile oralno, 8500 mg/kg). Molska masa sečnine je 60,0556 g/mol ^[4].

Slika 1: Strukturna formula sečnine.

Sečnina, ki je v človeškem telesu eden izmed produktov cikla sečnine (Slika 2), nastane z oksidacijo aminokislin. V prej omenjenem ciklu je poleg sečnine produkt tudi fumarat, medtem ko so glavni intermediati tega cikla ornitin, citrulin, arginosukcinat in arginin.

Molekula sečnine vsebuje dva dušikova atoma, ki se morata v cikel sečnine uvesti

(20)

2

posamično. Prvi atom dušika vstopa v cikel v obliki karbamoil fosfata, medtem ko je drugi vir atoma dušika aminokislina aspartat ^[5].

Slika 2: Shema cikla sečnine.

V človeškem telesu je običajna koncentracija sečnine v urinu nekje med 155 mmol/L in 390 mmol/L ^[2], medtem ko je koncentracija sečnine v krvni plazmi nekje med 3,3 mmol/L in 6,7 mmol/L ^[6]. To pomeni, da moramo biti pazljivi, kakšno vrsto metode uporabimo pri določanju sečnine v vzorcu in hkrati točno vedeti, katera telesna tekočina predstavlja naš vzorec, da bomo pravilno redčili (naš vzorec mora biti primerne koncentracije glede na metodo določitve, ki smo jo izbrali). Najbolj optimalne so tiste metode, ki imajo dovolj široko linearno koncentracijsko območje.

1.2 Ureaza

Ureaza je encim, ki katalizira hidrolizo sečnine do amonijaka in ogljikovega dioksida.

Najdemo jo lahko v nekaterih rastlinah, glivah in tudi bakterijah. Gledano v splošnem jo lahko uvrščamo med amidohidrolaze in fosfotriesteraze ^[7],[8].

Poznamo veliko različnih ureaz, glede na to, ali so sintetizirane v rastlinski, glivni ali bakterijski celici. Rastlinska in bakterijska ureaza ima v osnovi trimerno strukturo, vendar je rastlinska ureaza najpogosteje dimer homotrimerov ([α3]2) za razliko od bakterijske, ki je najpogosteje heterotrimer ([αβγ]3). Glivna ureaza je navadno monomer, vendar tako

(21)

3

kot v primeru rastlinske in bakterijske ureaze, ta trditev ne velja za vse glivne ureaze. Kot primer lahko navedem ureazo, ki je bila izolirana iz rastline Canavalia ensiformis (vrsta fižola). Omenjena ureaza je za razliko od večine rastlinskih ureaz dimer heterotrimerov ([αβγ]2) ^[8].

V nadaljevanju bom za razlago strukture ureaze uporabila primer ureaze, izolirane iz rastilne Canavalia ensiformis, ki je prikazana na Slika 3 in ima 6 podenot. Oznaka omenjene ureaze je v banki podatkov o proteinih (angl. protein data bank) 7KNS. V vsako podenoto je vezan en nikljev(II) ion (Ni²⁺) in en fosfatni ion (PO43-). Nikljevi in fosfatni ioni pa so v encimu ureaze razporejeni oktaedrično, kot je prikazano na Slika 5.

Slika 3: Struktura ureaze – dimer heterotrimera, 6 podenot.

Slika 4: Struktura ureaze – vsaka podenota ima 1 Ni²⁺ ion (rdeča krogla) in 1 PO43- ion (5 zelenih krogel).

(22)

4

Slika 5: Nikljevi in fosfatni ioni so v ureazi razporejeni oktaedrično.

Prej omenjena hidroliza sečnine (Slika 6) do amonijaka in ogljikovega dioksida, pri kateri sodeluje tudi voda, s pomočjo encima ureaze poteče 10¹⁴–krat hitreje kot nekatalizirana reakcija hidrolize sečnine. V vsakem primeru pa omenjena reakcija hidrolize povzroči znatno zvišanje pH kot posledico nastanka hidroksidnih ionov (OH^-), vendar pa je sprememba pH pogojena z začetnim pH raztopine pred reakcijo hidrolize, s koncentracijo sečnine ter seveda z aktivnostjo ureaze ^[9],[10].

Slika 6: Kemijska reakcija hidrolize sečnine z ureazo.

(23)

5

2 Namen dela

Zdrastveni delavci se vsakodnevno srečujejo z izzivom, kako na čim bolj enostaven, hiter in cenovno ugoden način čim bolj točno in natančno določiti koncentracijo sečnine v različnih človeških vzorcih.

Namen diplomskega dela je podati pregled nekaterih metod, s katerimi lahko z dovolj dobro točnostjo in natančnostjo določamo koncentracijo sečnine v človeških vzorcih ter primerjati te metode med seboj. Končni cilj tega diplomskega dela pa je ugotoviti, katera izmed opisanih metod je najbolj primerna za določitev sečnine v človeških vzorcih.

Metode sem razdelila v tri različne skupine – biosenzorji, metode s spektrometrično detekcijo in pretočne metode. Večina metod po karakteristikah sodi samo v eno izmed omenjenih skupin, vendar pa nekaj metod vključuje elemente več skupin metod. V takšnem primeru sem metodo razporedila v skupino metod, s katero si deli največ skupnih lastnosti. Za takšno delitev metod sem se odločila zaradi boljše preglednosti.

(24)

6

(25)

7

3 Metode

Dandanes se na internetu ter v različnih revijah najde veliko člankov, ki opisujejo metode za določanje sečnine, zaradi česar je izziv že zožiti izbor člankov. Večino uporabljenih člankov sem našla na spletnih portalih, kot je na primer Web of science, pri čemer sem kot ključne fraze uporabila: 'detection of urea', 'determination of urea with biosensors', 'determination of urea with urease' in druge. Pri izboru člankov, ki sem jih uporabila pri pisanju diplomskega dela, sem si pomagala z nekaterimi kriteriji:

 metoda za določanje sečnine ne sme biti povsem osnovna (primer: metoda, ki za določanje sečnine uporabi samo HPLC, ni prišla v zožen izbor člankov),

 članek, v katerem je opisana metoda, mora biti razumljiv in opisana metoda dobro razložena,

 članek z izbrano metodo mora vsebovati vsaj tri parametre, po katerih sem primerjala metode med seboj,

 metoda mora imeti zadovoljivo dobro analizno obnašanje (dobro občutljivost, široko linearno območje, visok korelacijski koeficient, nizko mejo zaznave, obstojnost v daljšem časovnem obdobju, čim krajši čas analize in/ali selektivnost metode za sečnino).

(26)

8

(27)

9

4 Rezultati in razprava

Konvencionalne metode, ki se navadno zelo pogosto uporabljajo v analizni kemiji, kot so na primer: kromatografija, spektrometrija, elektrokemija in fluorimetrična analiza, se v primeru določevanja sečnine v različnih vzorcih navadno ne obnesejo, vsaj ne v originalni izvedbi, saj so zelo dolgotrajne. Naslednja velika slabost večine teh naštetih metod je, da zahtevajo predhodno pripravo vzorcev zaradi prisotnosti motečih snovi, kot sta npr. CO2

in NH3, ki pa sta pri detekciji sečnine ključna. Zaradi tega so se razvile nove tehnike, kot je na primer detekcija z biosenzorji, in izboljšale nekatere stare, kot so na primer različne spektrometrične metode ^[11],[12].

V nadaljevanju bom opisala različne metode določanja sečnine z biosenzorji in različne izboljšave spektrometrijskih in pretočnih metod, ki se uporabljajo za določanje sečnine.

Večina teh tehnik je relativno novih, hkrati pa se opirajo na raziskave iz predhodnih izboljšav omenjenih metod, zaradi česar nekateri članki niso podali vseh ključnih informacij o analiznem obnašanju opisanih tehnik.

4.1 Biosenzorji

Ena izmed metod kvantitativne določitve sečnine je z biosenzorji, ki lahko delujejo po različnih principih, ki jih bom razložila v nadaljevanju. Vendar pa večina biosenzorjev, s katerimi določamo sečnino, za biološki receptor uporabi encim ureazo, ki je, kot sem napisala v uvodu (poglavje 1.2), biološki katalizator, ki katalizira reakcijo hidrolize sečnine, pri čemer pride do povišanja pH raztopine.

Biosenzorji so v principu zaznavalne naprave, pri katerih je primeren receptor navadno imobiliziran na medfazno matrico, in naj bi specifično detektiral biološke analite. V splošnem se lahko uporabljajo tako za kontrolo različnih okoljskih parametrov kot tudi za kvantitativne in kvalitativne določitve različnih bioloških molekul ^[13]. V nadaljevanju bom opisala različne biosenzorje, ki se najpogosteje uporabljajo za kvalitativno in kvantitativno določanje sečnine v človeških vzorcih.

4.1.1 Optični biosenzorji s tankim slojem iz polianilina

Pri encimskih biosenzorjih je ključnega pomena imobilizacija izbranega encima, v mojem primeru je ta encim ureaza, na površino biosenzorja, kamor se nato veže analit, v mojem primeru je to sečnina. Način, kako imobilizirati encim, je odvisen od tega, kaj predstavlja zaključni sloj biosenzorja ^[13].

Primer nekaterih načinov imobilizacije encima na površino biosenzorja:

(28)

10

 kovalentna vezava,

 zajetje encima na površino biosenzorja,

 afiniteta encima do biosenzorja,

 fizična adsorpcija encima na biosenzor, itd.

Pri tej vrsti biosenzorjev je zelo pomembna tudi izbira pravega polimera, ki bo predstavljal zaključni sloj biosenzorja, na katerega se bo vezal izbrani encim. Polimer mora biti kompatibilen s procesom suspendiranja ali raztapljanja analita na elektrodi, hkrati pa mora tvoriti dobro vezavo s prej izbranim encimom (encim mora biti dobro imobiliziran na polimernem sloju). Pri tej metodi je dobro izbrati polimer, ki sodi med prevodne polimere. Eden izmed takšnih polimerov, ki hkrati tvori dovolj močno interakcijo z encimom ureazo in se obnaša kot elektrokatalizator, je polianilin (PANI) (Slika 7) ^[13].

Slika 7: Strukturna formula polianilina – a) popolnoma reducirana oblika; b) delno reducirana in delno oksidirana oblika; c) popolnoma oksidirana oblika.

PANI je elektrokromen material¹, kar pomeni, da so njegove električne in optične spremembe povezane z oksidacijskim stanjem polimera, ki pa je odvisen od kemijskega okolja, v katerem se polimer nahaja. Omenjene spremembe imajo direkten vpliv na

1 Elektrokromizem je redek pojav, kjer se materialu zaradi spremembe napetosti spremeni barva ^[25].

(29)

11

občutljivost in linearnost (tu je mišljen kvadrat korelacijskega koeficienta) opisovanega biosenzorja. Kot tak je tanek sloj PANI na biosenzorju lahko dobra zamenjava za drugače bolj poznane in uporabljane spektrokemijske meritve. V primeru uporabe optičnih biosenzorjev lahko sloj PANI deluje kot optično-kemijski pretvornik, saj je bilo ugotovljeno, da sta odbojni in barvni spekter funkciji koncentracije analita, po tistem, ko je bil tanek sloj PANI pomočen v raztopino vzorca vsaj za 180 s ^[13].

Ko se na ureazo, ki je vezana na PANI sloj, veže sečnina, poteče reakcija hidrolize sečnine (Slika 6), pri kateri pride do povišanja pH raztopine. Sprememba pH povzroči, da se spremeni kemijsko okolje raztopine in posledično pride do sprememb v PANI (PANI se protonira) in dobimo optičen signal, ki je odvisen od koncentracije sečnine. Ugotovljeno je bilo, da večja kot je koncentracija sečnine, nižji je optični signal. Analizno obnašanje biosenzorja s slojem PANI, na katerega je vezana ureaza, je prikazano v Tabela 1 ^[13]. Tabela 1: Analizno obnašanje optičnega biosenzorja PANI/ureaza.

občutljivost [% dec^-1] 4,4 ± 0,3

R² [%] 97,4

linerno območje [mol/L] 10^-6 – 10^-1

LoD [µmol/L] 0,75

obstojnost sistema > 50 % [dni] 14

4.1.2 Biosenzorji z barvilom prusko modro

Na podoben način kot delujejo optični biosenzorji s slojem PANI, delujejo tudi biosenzorji z barvilom prusko modro (PB). V tem primeru je namesto polimera uporabljeno barvilo PB, s kemijskim imenom železov(III) heksacianoferat(II) in kemijsko formulo Fe4[Fe(CN)6]3 (Slika 8) ^[14].

Slika 8: Barvilo prusko modro – a) strukturna formula kompleksa [Fe(CN)6]^4-; b) 3D strukturna formula; c) barva barvila.

(30)

12

PB je tako kot PANI elektrokromen material in se zato lahko uporablja kot pretvornik signalov v optičnih biosenzorjih za sečnino. Ko PB interagira z NH4+ ioni, ki so nastali pri hidrolizi sečnine z ureazo, pri napetosti 0,2 V proti Ag | AgCl | KCl referenčni elektrodi, pride do optičnega odziva, saj na PB poteče reakcija redukcije do spojine prusko bele (PW) (Slika 9), ki pa je odvisna od koncentracije amonijevih ionov. Reakcija redukcije PB do PW je dejansko redukcija Fe(III) do Fe(II). Sprememba oksidacijskega stanja železovega iona je tista, ki onemogoči medvalenčni prehod elektronov (angl.

intervalence charge transfer) v koordinacijski spojini PB. Omenjeni pojav je razlog za modro barvo barvila PB in ko je ta pojav onemogočen zaradi redukcije, postane barvilo, ki ima sedaj ime PW, brezbarvno [1],[14],[15].

Slika 9: Reakcija redukcije prusko modro do prusko belo, pri kateri sodelujejo kalijevi ioni (K⁺) ^[15].

Rezultati meritev v članku so pokazali, da je opisan biosenzor z barvilom PB najbolj občutljiv pri koncentracijah med 7 mmol/L in 30 mmol/L, medtem ko očutljivost pri nižjih koncentracijah upada. V članku so določali samo koncentracije sečnine med 3 mmol/L in 30 mmol/L in v tistem območju je bila funkcija absorbance v odvisnosti od koncentracije sečnine linearna, vendar pa mi ti podatki niso povedali kaj več o resničnem linearnem območju metode. Prav tako se avtorji članka niso posvetili določitvi meje zaznave (LoD), tako da iz podatkov v članku ne morem narediti celovite analize te metode. Parametre obnašanja senzorja sem zapisala v Tabela 2 ^[1].

Tabela 2: Analizno obnašanje optičnega biosenzorja z barvilom prusko modro.^[1]

občutljivost = ∆A/c [L mol^-1] 4

R² [%] 99,5

linerno območje [mmol/L] 3 – 30

LoD /

obstojnost sistema > 50 % [dni] 41

4.1.3 Določitev sečnine s tekočim kristalom

Za kvantitativno sledenje reakcijskega procesa analita v realnem času se lahko uporabi posebno vrsto valovanja, ki potuje okoli konkavne površine (WGM), skupaj s kapljico tekočega kristala (LC). Omenjena LC kapljica je skoraj popolne sferične oblike z zelo gladko površino, zaradi česar je popolna za pridobivanje WGM. V principu se vzbujena svetloba iz pridobljenega središča LC kapljice znotraj optične votline, ki jo LC kapljica

(31)

13

ustvarja, odbija. Posledično se ta svetloba resonančno ojača zaradi konstruktivne interference odbojev svetlobe v LC kapljici. Frekvenca resonance je odvisna od odbojnega koeficienta, spremembo le-tega pa lahko zaznamo z WGM spektrom ^[2]. Nekatere izmed prednosti WGM laserja so:

 WGM laser lahko transformira biokemijski reakcijski proces v spektralni odziv na ta proces v realnem času (dobimo bolj natančne in kvantitativne informacije).

 Celotna postavitev LC molekul v mikrokapljici je zelo občutljiva za vrsto in moč vezi, s katerimi se molekule iz okolice pripnejo na LC kapljico. Posledično se tudi že najmanjše spremembe v LC molekulah, na katere se pripenjajo molekule iz okolice, odražajo na WGM resonančnem spektru v realnem času te spremembe.

 Veliko razmerje površina:volumen LC kapljice omogoča, da lahko celotna reakcija poteče na površini LC kapljice, kar posledično izboljša mejo zaznave.

V enem izmed primerov so kot tekoči kristal uporabili 4-ciano-4'-pentilbifenil (Slika 10), ki je pri temperaturi nižji od 24 °C v kristalinični obliki, pri 24 °C se pretvori iz kristalinične v mezomorfno obliko (tekoči kristal) ter se utekočini pri 35 °C ^[16].

Slika 10: Strukturna formula 4-ciano-4'-pentilbifenila.

Mehanizem določitve se začne s hidrolizo sečnine z encimom ureaza, pri čemer na vmesni stopnji nastane H2CO3, vendar se le-ta praktično takoj deprotonira. Ta reakcija povzroči, da se molekule 4-ciano-4'-pentilbifenila v kapljici, kjer so na omenjene molekule vezane molekule stearinske maščobne kisline (Slika 11), iz planarne oblike prerazporedijo v homeotropsko razporeditev molekul 4-ciano-4'-pentilbifenila, medtem ko se molekule stearinske kisline razporedijo po površini LC kapljice (Slika 12) ^[2].

Slika 11: Strukturna formula stearinske kisline z molekulsko formulo C17H35CO2H.

(32)

14

Slika 12: Prikaz vrste razporeditev molekul 4-ciano-4'-pentilbifenila – a) linerna razporeditev; b) homeotropska razporeditev.

Rezultati so pokazali, da je ta metoda, v primeru čistih vzorcev, specifična za sečnino ob uporabi ureaze kot katalizatorja, vendar pa pride pri analizi realnih bioloških vzorcev do napak zaradi interferenc. Prav tako so ugotovili, da je najbolj optimalen pH za to vrsto detekcije pH 9. Najnižji pH, da metoda še deluje v mejah dovoljenih napak, je pH 7,4. Pri pH 9 je gostota deprotoniranih molekul stearinske kisline ravno tolikšna, da lahko poteče spontana preureditev 4-ciano-4'-pentilbifenilnih molekul, pri nižjih in tudi pri višjih vrednostih pH gostota deprotoniranih molekul stearinske kisline ni optimalna. Drugi glavni parametri obnašanja metode so prikazani v Tabela 3.^[2]

Tabela 3: Obnašanje metode detekcije s tekočim kristalom.

občutljivost [nm L mmol^-1] 8,1

R² /

linearno območje /

LoD [mmol/L] 0,1

obstojnost sistema /

4.1.4 Piezouporovni hidrogelni biosenzor

Tako kot pri vseh do sedaj opisanih metodah za določitev sečnine v vzorcu se tudi tokrat določuje sečnino preko produktov hidrolizne reakcije (Slika 6), ki je katalizirana z encimom ureazo. V vsakem primeru pa je potreben pretvornik, ki bo pretvoril biološki signal, ustvarjen s hidrolizno reakcijo sečnine, v izhodni signal, ki ga bo mogoče meriti z običajnimi instrumenti. V tem primeru se za takšen pretvornik uporabi hidrogel, ki je osnovan na piezouporovnih tlačnih senzorjih (angl. piezoresistive pressure sensors).

Takšen gel, ki se v določenem okolju napihne, povzroči neko silo, ki pritisne na tlačno občutljiv senzor. Deformacija senzorja nato povzorči določeno upornost, ki jo lahko z

(33)

15

električnim vezjem, v katerem je Wheatstonov most, pretvorimo v napetost, ki pa jo lahko enostavno merimo ^[17].

Na splošno so hidrogelni senzorji lahko odvisni od pH vrednosti raztopine ali pa od temperature. Pri tej metodi so avtorji članka uporabili snov poli(akrilna kislina-co- dimetilaminoetil metakrilat) (Slika 13) kot hidrogel, ki se spreminja (širi ali krči) v odvisnosti od pH raztopine. Omenjeni polimer je kopolimer, kar pomeni, da je njegova monomerna enota sestavljena iz dveh različnih enot. V tem primeru to pomeni, da je monomoerna enota sestavljena iz akrilne kisline in dimetilaminoetil metakrilata (Slika 14).

Slika 13: a) Strukturna formula akrilne kisline; b) strukturna formula dimetilaminoetil metakrilata.

Slika 14: Shema kopolimera.

Kot je bilo do sedaj že nekajkrat omenjeno, je pH raztopine odvisen od koncentracije sečnine v tej raztopini. Višja koncentracija sečnine vodi do višjega pH raztopine, kar povzroči nabrekanje pH-občutljivega hidrogela, ki je zelo občutljiv do 20 mmol/L koncentracije sečnine v raztopini. Celotna meritev pa ima dokaj veliko negotovost, ki je posledica razlik med posameznimi hidrogeli. Pri kopolimerih lahko pride do velikih razlik v strukturi, posledično pa takšni kopolimeri nimajo enakih lastnosti, kar privede tudi do razlik v občutljivosti med posameznimi hidrogeli ^[17].

Za razliko od kar nekaj drugih biosenzorjev pa so ti biosenzorji s hidrogelom zelo stabilni.

Sicer potrebujejo kar nekaj časa, da popolnoma nabreknejo (v tem primeru hidrogel, ki je pomočen v raztopino sečnine s koncentracijo 20 mmol/L, potrebuje približno 24 h, da popolnoma nabrekne) in še več, da se ponovno skrčijo (proces, ko se hidrogel krči na prvotno velikost, lahko traja tudi 2 tedna), vendar pa se ti biosenzorji lahko uporabijo več kot samo enkrat. Prav tako so zelo selektivni za sečnino. Parametri obnašanja metode so prikazani v Tabela 4 ^[17].

(34)

16

Tabela 4: Parametri obnašanja biosenzorja s hidrogelom.

občutljivost /

R² /

linearno območje /

LoD [mmol/L] 1

obstojnost sistema > 95% [dni] 56

4.1.5 Organski zeoliti z imobilizirano ureazo za detekcijo z biosenzorjem na optična vlakna

Biosenzorji na optična vlakna lahko merijo temperaturo, tlak in tudi lomni količnik.

Večkrat se uporabljajo predvsem zaradi svoje cenovne ugodnosti in dovolj enostavne obdelave podatkov. Takšni biosenzorji vsebujejo selektivno zaznavno plast, ki lahko vsebuje različne encime, protitelesa in tudi molekule DNA, v katero se ujamejo analiti. V primeru te metode je zaznavna plast sestavljena iz organskih zeolitov, na katere je vezana ureaza ^[18].

Za organski zeolit, kamor je vezana ureaza, so izbrali ogrodje zeolitnega imidazolata (ZIF-8) s kemijsko formulo [Zn(II)[Im]4]^2- (Slika 16), ki sodi med organo-kovinska ogrodja (MOFs) zaradi vsebnosti cinkovih(II) ionov (Zn²⁺). Struktura imidazolata pa je predstavljena na Slika 15. MOFs so navadno kristalinični materiali z veliko aktivno površino in ravno prav velikimi kanali, da se lahko uporabijo kot tuneli za analite. Ti kanali omogočajo selektivno interakcijo med biomolekulami in analiti, prav tako pa je v njih olajšana kemijska reakcija med encimom in analitom. Hkrati pa imajo MOFs tudi visoko afiniteto do specifičnih analitov. Navadno se nanje ujamejo bioaktivne molekule, na ta način pa se tvori občutljiv bioprepoznavni film. Dobra lastnost MOFs je tudi varovanje biomolekul pred previsoko temepraturo in močnimi organskimi topili, vendar pa se kar nekaj MOFs še vedno sintetizira v organskih topilih in pri visoki temperaturi, zaradi česar se encimi denaturirajo, še preden bi jih lahko uporabili. Za razliko od teh MOFs pa ima ZIF-8 enostavno sintezo, ki poteka pri blagih pogojih, prav tako pa je enostavno spremljati morfologijo ZIF-8 med samo sintezo in tudi po njej. Ta zeolit je zelo stabilen in biokompatibilen ^[18].

(35)

17

Slika 15: Kemijska strukturna formula imidazolata (Im), ki je del strukture zeolitnega imidazolata.

Medtem ko se pri tej metodi ZIF-8 uporabi za prepoznavanje sečnine, se za zaznavo spremembe lomnega količnika uporabijo optična vlakna s tehniko 'single-mode coreless single-mode' (SCS). V primeru, ko je ureaza vezana na ZIF-8 (ZIF-8/ureaza) in ni samo v prosti obliki, poteče vezava sečnine na ureazo bolj kontrolirano, hkrati pa nastajajo kristali ZIF-8/ureaze, saj ZIF-8 spodbuja nukleacijo ureaze. Posledično so zaradi kristalinične oblike ZIF-8/ureaze lažje in hitreje opazne spremembe v spektru transmitance v odvisnosti od valovne dolžine za določitev sečnine, kar pomeni, da se izboljša občutljivost metode ^[18].

Slika 16: a) Struktura zeolitnega imidazolata; b) tetraedrična vezava imidazolatnih molekul na Zn(II); c) prikaz kanalov, po katerih potujejo analiti v zeolitni mreži.

(36)

18

Pri valovni dolžini, kjer se pojavi resonanca (1525 nm – 1590 nm), je odvisnost spremembe valovne dolžine od koncentracije sečnine linerana. Prav tako je metoda zelo občutljiva, vendar pa se občutljivost metode poveča v primeru manjšega premera optičnega vlakna, ki pa pri zelo majhnih premerih postane bolj lomljivo, kar znanstvenikom na tem področju trenutno predstavlja izziv. Opisovana metoda ima mejo zaznave pri 0,1 mmol/L, prav tako pa ima relativno ozko območje zaznave, ki sovpada z lineranim območjem te metode (Tabela 5).

Tabela 5: Analizno obnašanje biosenzorja na optična vlakna.

občutljivost [nm L mmol^-1] 0,8

R² /

linerno območje [mmol/L] 1 – 10

LoD [mmol/L] 0,1

obstojnost sistema /

4.1.6 Elektrokemijska detekcija z uporabo kopolimerov iz zlatih nanodelcev

Med različnimi snovmi, ki se jih lahko uporabi kot dodatek k biosenzorjem za boljšo elektrokemijsko senzoriko, se pogosto uporablja zlate nanodelce (AuNPs), ki omogočijo prehajanje elektronov med encimom in elektrodo. Hkrati pa lahko AuNPs-ji imobilizirajo encim ureazo preko kemijske adsorpcije in na takšen način ustvarijo stabilno površino za imobilizacijo encimov, kjer ne bo prišlo do poslabšanja biološke aktivnosti teh encimov.

Da bi se še dodatno izboljšalo prehajanje elektronov med encimom in elektrodo na biosenzorju, se na le-tega nanese plast polipropilena (Slika 17), morda celo plast poli(propilen-co-imidazol)-a (Slika 15), ki je dodatno prevlečen s plastjo AuNPs-jev ^[11].

Slika 17: Shema monomerne enote polipropilena.

V tem primeru so za biosenzor vzeli amperometrični biosenzor, ki je zelo občutljiv za določitev sečnine v vzorcu, zaradi česar so določanje sečnine izvajali z diferenčno pulzno

(37)

19

voltametrično tehniko². Pri takšnih biosenzorjih je odziv instrumenta direktno povezan s hidrolizo sečnine, pri čemer na elektrodi poteče elektrooksidacija amonijevih ionov (NH4+). Vendar nastane težava, saj ima takšen sistem biosenzorja slabo električno aktivnost za NH4+ ione, kar pa lahko popravimo z dodatnim encimom, ki je namenjen samo oksidaciji NH4+ ionov, ali pa takšna oksidacija poteče na elektrodi, ki je prevlečena z različnimi kovinskimi katalizatorji. V primeru sekundarnega encima imamo lahko problem z usklajevanjem pogojev, ki bi morali biti primerni za oba encima, zaradi česar je mogoče boljša izbira dodatek kovinskih katalizatorjev, ki so bili v tem primeru AuNPs- ji ^[11].

V celotnem procesu detekcije je potrebno paziti tudi na pH raztopine, saj imamo prisoten encim, ki ima neko optimalno območje delovanja, hkrati pa v isti raztopini poteka še reakcija oksidacije NH4+ ionov. Na srečo oba procesa potekata v rahlo bazičnih pogojih, kar je avtorjem članka precej olajšalo delo. Ugotovili so, da je optimalnen pH za to metodo določanja sečnine pri pH 8, kar je zelo blizu optimalnemu pH območju proste ureaze.

Celoten proces določanja sečnine z uporabo kopolimera in AuNPs-jev ima visoko točnost (88,3 %) in je tudi zelo stabilen. Avtorji članka so ugotovili, da je odziv biosenzorja po 75 dneh, kjer so merili amperometrični odziv biosenzorja na 5 mmol/L raztopino sečnine, ohranil kar 97 % začetnega odziva. Prav tako so ugotovili, da je metoda linearna in ima nizko mejo zaznave. (Tabela 6) Tudi ko so analizirali realne vzorce, so prišli do ugotovitve, da askorbinska kislina in glukoza ne predstavljata interferenc pri določanju sečnine in tudi Na⁺ in Cl^- nista pomembnejši interferenci pri določanju sečnine.

Tabela 6: Analizno obnašanje amperometričnega biosenzorja z zlatimi nanodelci.

občutljivost /

R² [%] 99

linerno območje [mmol/L] 0,1 – 30

LoD [µmol/L] 36

obstojnost sistema > 97 %

začetnega odziva senzorja [dni] 75

2 Diferenčno pulzna voltametrija uporablja potencialne impulze, pri čemer se zvišuje amplituda. Medtem se tok skozi raztopino postopoma znižuje. Posledično lahko s to tehniko določamo nizke koncentracije molekul, ki so vezane na površino ^[11].

(38)

20

4.2 Metode s spektrometrično detekcijo

Med pogoste metode določitve sečnine v vzorcih sodijo tudi metode s spektrometrično detekcijo, med katerimi pa je najbolj pogosta metoda, ki temelji na različnih principih z nanodelci (NPs).

Nanodelci so kot taki biokompatibilni in stabilni, prav tako pa je z njimi mogoče zaznati sledove analitov. Narejeni so iz kovinskega jedra, ki je prekrito s stabilizatorji, ki imajo lahko različne kemijske strukture, zaradi česar lahko NPs-ji specifično interagirajo na določen analit. Prav tako lahko NPs-ji tvorijo različne interacije z analiti – Coulombove sile, kovalentne in vodikove vezi in celo elektrofilne ali nukleofilne interakcije. Katera koli od teh interakcij lahko povzroči agregacijo NPs, kar se potem zazna ^[12].

Problem metod, ki ne vključujejo biosenzorjev za detekcijo, je analiza z njimi, ki je sicer natančna ter tudi točna, a tudi precej zamudna, hkrati pa dostikrat potrebuje tudi predhodno obdelavo vzorcev. Med take metode sodijo različne kromatografske, spektroskopske in tudi elektrokemijske tehnike. Vendar pa se zadnjih nekaj let dela na izboljšavah teh tehnik. Ena izmed takih izboljšav je uporaba encimov v sami analizni metodi, saj dodatek encimov naredi metodo bolj praktično, izboljša njeno selektivnost in zmanjša čas trajanja analize ^[12].

Seveda se tudi v primeru metod s spektrometrično detekcijo za kvantitativno in kvalitativno določanje sečnine v različnih vzorcih za encim uporabi ureazo, ki je, kot že večkrat omenjeno, encim, ki specifično katalizira reakcijo hidrolize sečnine do CO2 in NH3 (Slika 6). Problem pri omenjenih metodah pa lahko nastane zaradi prevelike količine CO2 v raztopini, kjer se meritev izvaja, saj prisotnost CO2 moti detekcijo. Kar pomeni, da je potrebno pred izvedbo metode CO2 nekako odstraniti iz preiskovane raztopine ^[12].

4.2.1 Spektrometrična detekcija s srebrovimi nanodelci

Za določanje sečnine se v primeru metod s spektrometrično detekcijo z nanodelci lahko uporabi srebrove nanodelce, ki so bili pridobljeni s pomočjo tiomalne kisline (TMA) in so selektivni za zaznavo NH3, in srebrove delce, ki so bili pripravljeni z maltolom (MAL) in so zaradi tega selektivni za CO2 (Slika 18). Srebrovi nanodelci so lahko sintetizirani na enostaven in cenovno ugoden način, prav tako pa lahko delujejo kot dobri katalizatorji.

Dobra stran teh nanodelcev pa je tudi v tem, da ni potrebna predpriprava vzorca, saj odstranitev CO2 iz vzorca ni potrebna. Srebrovi nanodelci tako ob prisotnosti NH3 in CO2

spremenijo barvo in delujejo kot senzorji ^[12].

(39)

21

Slika 18: a) Strukturna formula tiomalne kisline; b) strukturna formula maltola.

V primeru encimske reakcije v raztopini je potrebna velika količina reagentov, steklovine in drugih materialov, kar podraži celoten proces, ki je hkrati še nepraktičen. Da bi se temu izognili, so v tem primeru izdelali 'laboratorij na papirju', kar pomeni, da je njihov analizni proces potekal na papirnati analizni napravi (PAD), ki je preprosta, biokompatibilna, fleksibilna, cenovno ugodna in vsestranska. Poleg vsega tega pa analizni proces lahko poteče v relativno kratkem času v primerjavi s kakimi drugimi metodami s spektrometrtično detekcijo ^[12].

V tem primeru ima PAD tri razdelke – cona injiciranja, encimska cona in cona detekcije.

V coni injiciranja se vzorec sečnine injicira na PAD, nato se ta vzorec prenese na encimsko cono, na katero je fiksiran encim ureaza. Da encim ne bi kontaminiral drugih dveh predelkov na PAD, mora biti encim na papirnato površino pritrjen s pomočjo polimernih reagentov. Na encimski coni poteče reakcija hidrolize sečnine (Slika 6), nato pa sta produkta te reakcije (NH3 in CO2) prenesena še na zadnji razdelek PAD, torej na cono detekcije. Na tem zadnjem razdelkuomenjena produkta hidrolize interagirata s prej omenjenima dvema različnima vrstama NPs. Srebrovi NPs-ji (AgNPs), ki so bili pridobljeni s pomočjo TMA, so selektivni za detekcijo NH3 in ob interakciji z NH3

omenjeni NPs-ji spremenijo barvo iz svetlo rumene v temno rjavo. Za razliko od prej omenjenih NPs-jev pa s tistimi srebrovimi NPs-ji, ki so bili sintetizirani s pomočjo maltola, kvalitativno (s spremembo barve) in tudi kvantitativno (intenzivnost spremenjene barve) določamo CO2. V tem primeru pa pride do spremembe barve iz rumene v rdečo (Slika 19) ^[12].

V primeru prisotnosti NH3 (možno tudi v obliki NH4+) v coni detekcije pride do elektrostatske interakcije med karboksilno skupino v molekuli TMA in amonijevimi kationi. Prav tako lahko nastane vodikova vez med atomom dušika v amonijevih ionih in protonom v hidroksilni skupini v molekuli TMA. Tako kot NH3 tudi CO2 lahko tvori vodikovo vez z molekulo MAL, hkrati pa je v tem primeru mogoča tudi nukleofilna interakcija med molekulo CO2 in molekulo MAL ^[12].

(40)

22

Slika 19: Primer PAD ploščice za detekcijo sečnine – a) primer razporeda razdelkov na PAD ploščici; b) obarvanje cone detekcije pred dodatkom vzorca, po dodatku samo NH3, po dodatku samo CO2 in po injiciranju vzorca sečnine. (prirejeno po ^[12])

S poskusi so prišli do ugotovitev, da je pri tej metodi najbolj optimalen volumen vzorca 2,0 µL, ter da je najbolj optimalna koncentracija ureaze 0,15 mg/mL. Prav tako so ugotovili, da je metoda selektivna za sečnino. Ostali pomembni parametri obnašanja metode so prikazane v Tabela 7.

Tabela 7: Parametri obnašanja kvantitativne analize sečnine s PAD.

občutljivost [mg/L] 0,073

R² [%] 99,5

linerno območje [mg/L] 0,05 – 20,00

LoD [mg/L] 0,018

obstojnost sistema (relativna

napaka ni signifikantna) [dni] 28

4.2.2 Avtomatizirana spektrometrična detekcija s plinsko segmentiranim analizatorjem neprekinjenega pretoka

Pri spektrometrični detekciji se lahko namesto ureaze v primeru sečnine uporabi diacetil monoksim (DAM) (Slika 20), ki se je v preteklosti dostikrat uporabljal ravno za detekcijo sečnine v človeških vzorcih. Med DAM in sečnino poteče specifična kemijska reakcija, katere produkt je 4,5-dimetil-2H-imidazol-2-on, ki je pri sobnih pogojih v trdnem

(41)

23

agregatnem stanju in je rumene barve. Nekateri izmed razlogov, zakaj je uporaba ureaze slabša kot uporaba DAM za kvantitativno določitev sečnine:

 ureazna metoda je odvisna od pH,

 možna inhibicija ureaze z ioni kovin (Ca²⁺, Mg²⁺, težke kovine, ...),

 nepopolna hidroliza sečnine z ureazo, ^[19],^[20]…

Slika 20: Strukturna formula diacetil monoksima (DAM).

Ne glede na to, ali je spektrometrična zaznava avtomatizirana ali ne, je potrebno za kvantitativno določitev sečnine v vzorcih v primeru uporabe DAM, izvesti spektrometrične meritve, saj je absorbanca 4,5-dimetil-2H-imidazol-2-on–a linearno odvisna od koncentracije sečnine v vzorcu. 4,5-dimetil-2H-imidazol-2-on je, kot že omenjeno, spojina, ki nastaja pri reakciji med DAM in sečnino. Omenjena spojina je rumene barve, intenziteta te barve pa je odvisna od množine sečnine, ki je reagirala z DAM. Celotna reakcija med DAM in sečnino poteče v kislih pogojih, pri tem pa kot intermediat nastane biacetil (Slika 21) ^[21].

Slika 21: Reakcijska shema reakcije med DAM in sečnino.

(42)

24

Pri avtomatizirani spektrometrični detekciji sečnine z DAM je pomembna uporaba površinsko aktivne snovi, ki omogoči konstanten pretok in stabilno bazno linijo (angl.

baseline). Vsaka površinsko aktivna snov ima svojo značilno molarno absorptivnost.

Dodatne prednosti avtomatizirane analize, ki uporablja plinsko segmentiran analizator neprekinjenega pretoka (angl. gas-segmented continuous flow analyzer) so:

 konstantni reakcijski pogoji (čas analize, reagenti, volumen vzorca, ...),

 dobra ponovljivost analiznih rezultatov,

 konstanten pretok,

 meja zaznave in celotna analiza lahko poteka pri zelo nizkih koncentracijah analita (nivo 10^-9 mol/L),

 visok korelacijski koeficient med 0 nmol/L – 1000 nmol/L,

 zelo kratek čas analize (približno 3 min),

 uporaba za analizo sečnine v morjih in oceanih (koncentracije sečnine je med 45 nmol/L – 152 nmol/L), ^[19]…

Podatki o analiznem obnašanju metode so zbrani v Tabela 8.

Tabela 8: Analizno obnašanje avtomatizirane spektrometrične detekcije.

občutljivost /

R² [%] 99,9

linerno območje [nmol/L] 1 – 1000

LoD [nmol/L] 5

obstojnost sistema [dni] /

4.2.3 Spektrometrična detekcija s peroksidazno aktivnostjo zlatih nanodelcev

Zlati nanodelci (AuNPs) lahko delujejo kot katalizatorji redoks reakcije med substratom 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin-om (TMB) (Slika 22) in vodikovim peroksidom (H2O2), pri čemer nastane rumeno obarvan produkt. Barvno spremembo iz brezbarvne v rumeno lahko zaznamo s spektrofotometrom, nastavljenim na λ 450 nm ^[22].

TMB je kromogen substrat za peroksidazo, kar pomeni, da se TMB obnaša kot donor protonov, pri čemer poteče redukcija H2O2 do H2O z encimom peroksidazo. TMB je v

(43)

25

osnovi pri sobnih pogojih v trdnem agregatnem stanju v obliki (umazano) belega prahu

[23].

Slika 22: Molekulska formula 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin-a (TMB).

V primeru določanja sečnine z AuNPs-ji se lahko le-te uporabi za razcep O – O vezi v H2O2, da nastaneta dva hidroksilna radikala (HO∙), ki v nadaljevanju reagirata s TMB, pri čemer nastane 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin diimin, ki je rumeno obarvan. Redoks reakcija (Slika 23), ki poteče, da iz TMB s pomočjo H2O2 nastane tako obarvan produkt, vsebuje intermediat, ki pa je modro obarvan. Da se olajša okidacija TMB-ja do končnega rumeno obarvanega produkta, se navadno doda kislino (npr. H2SO4). V primeru prisotnosti NH3, ki je v primeru določanja sečnine prišel iz reakcije hidrolize sečnine z encimom ureazo, poteče reakcija nevtralizacije H2SO4 z NH3. Posledično skoraj ne pride do rumenega obarvanja raztopine (raztopina se zaradi prisotnosti tako intermediata – modra barva, kot tudi prisotnosti končnega produkta – rumena barva, obarva zeleno), vendar pa absorbanca takšne raztopine pri λ 450 nm pada linearno z naraščanjem koncentracije sečnine v raztopini ^[22],[23].

Katalizna aktivnost AuNPs-jev je močno odvisna od pH v raztopini. Ko ima raztopina nizek pH, poteče oksidacija TMB s H2O2 v prisotnosti AuNPs-jev dosti hitreje kot v primeru bolj bazične raztopine. Avtorji članka so ugotovili, da pride do linearne odvisnosti med koncentracijo sečnine in absorbanco pri λ 450 nm v primeru, ko je pH raztopine med 6,40 – 6,60. Pri tem so ugotovili, da je občutljivost takšnega pH senzorja

∆pH ≤ 0,2 ^[22].

Tudi pri tej metodi so možnosti interferenc, zaradi česar so avtorji članka te interference preverili in ugotovili, da med enajstimi različnimi organskimi molekulami, ki bi lahko povzročale interference, samo sečnina znatno zmanjša absorbanco pri λ 450 nm, kar pomeni, da je metoda selektivna za sečnino, kar je večinoma posledica visoke specifičnosti ureaze. Prav tako so določili, pri katerih koncentracijah sečnine pride do linearnega odnosa med absorbanco in koncentracijo sečnine (Tabela 9).

(44)

26

Slika 23: Reakcijska shema oksidacije TMB do 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin diimin-a.

Tabela 9: Analizno obnašanje spektrometrične določitve sečnine s pomočjo zlatih nanodelcev.

občutljivost [∆pH] ≤ 0,2

R² [%] 99,84

linerno območje [mmol/L] 0,02 – 0,4

LoD [µmol/L] 5

4.3 Pretočne metode

Malo manj pogoste metode določitve sečnine v človeških vzorcih so pretočne metode, vendar pa se tudi te postopoma modernizirajo in izboljšujejo. Ene izmed takšnih primerov izboljšav so pretočne tehnike, kamor sodi tudi pretočna injekcijska analiza (angl. flow injection analysis) (FIA).

(45)

27

4.3.1 FIA metode za detekcijo sečnine z uporabo brezstičnega konduktometričnega in spektrometričnega senzorja

Pri tej metodi so za določanje sečnine uporabili pretočno analizo – FIA analizo, ki je enostavna, predpriprava vzorca ni potrebna, hkrati pa je metoda tudi zelo precizna. Kot senzor pa so uporabili kapacitivno sklopljen brezstični konduktivni senzor (angl.

capacitively coupled contacless conductivity detector) (C4D). C4D je konduktometrična tehnika, ki vsebuje dve elektrodi, kjer elektrodi nista v direktnem stiku z merjeno raztopino. Prva elektroda je priključena na izmenično (AC) napetost, medtem ko se na drugi elektrodi spremlja spreminjanje AC toka. V nadaljevanju je AC tok z druge elektrode ojačan in s pomočjo različnih pretvornikov pretvorjen v enosmerni (DC) tok.

Vendar pa C4D detektor ne more delovati kot tak, temveč potrebuje za svoje delovanje še nek vir svetlobe, zaradi česar je C4D sklopljen še s fotometrično napravo, ki vsebuje diode, ki oddajajo svetlobo (angl. light-emitting diodes) (LEDs). Ker je pas valovnih dolžin svetlobe, ki jo LEDs oddajajo, razmeroma ozek (40 nm), v tem primeru ni potrebe po monokromatorju, ki v primeru svetlobe s širšim pasom valovnih dolžin 'zoži' pas valovnih dolžin omenjene svetlobe ^[3].

Nekatere prednosti C4D so:

 ni kontaminacije zaradi elektrod (elektrode niso v stiku s preiskovano raztopino),

 nizka cena detektorja,

 enostavna postavitev,

 detektor je univerzalen, ^[3]...

Ugotovljeno je bilo, da pri frekvenci med 40 – 100 kHz občutljivost določanja sečnine upada z naraščanjem vhodne frekvence v C4D detektor, medtem ko občutljivost narašča z naraščanjem napetosti, pri čemer se je spremljalo maksimalno napetost (Umax), ki ni smela biti večja od 10 V. Glede na podatke so ugotovili, da je določanje sečnine najbolje izvajati pri ν 40 kHz in Umax 15 V.

Avtorji članka so preverili tudi možne interference, ki bi jih lahko povzročile snovi, poleg sečnine prisotne v urinu: sečna kislina, K⁺, Na⁺, Mg²⁺, Cl^- in SO42-. Ugotovili so, da omenjene molekule in ioni ne predstavljajo vira napak pri določanju sečnine v človeškem vzorcu in lahko posledično odziv za te molekule/ione zanemarimo pri merjenju odziva za molekulo sečnine. Prav tako so prišli do ugotovitve, da je predlagana metoda hitra (analiza vzorca za določanje sečnine poteče v 1,93 min), linearna (gledan je kvadrat korelacijskega koeficienta) v relativno širokem območju in ima relativno nizko mejo zaznave glede na ugotovljeno linearno območje zaznave (Tabela 10).

(46)

28

Tabela 10: Parametri obnašanja v primeru določitve sečnine s C4D in LEDs.

občutljivost /

R² [%] 99,38

linerno območje [mmol/L] 0,5 – 4

LoD [µmol/L] 0,15

4.3.2 Optični senzorji s sistemom pretočne analize

V primeru optičnega senzorja in s sistemom pretočne analize je možnih več različnih tehnik detekcije sečnine, sama sem našla opis dveh takšnih tehnik. Ena izmed njih je pretočna analiza, ki temelji na bioreaktorju z imobilizirano ureazo. Pri pretočni analizi je možna uporaba pufra, v katerem je Nesslerjev reagent. Takšna tehnika je enostavna, saj vsebuje samo en reagent, segrevanje pa ni potrebno. Hkrati je takšna tehnika tudi hitra in cenovno ugodna, vendar ima en izredno ključen problem v današnjih časih: Nesslerjev reagent je toksičen in nevaren tako za okolje kot tudi za človeka, saj vsebuje živo srebro.

Zaradi tega so se avtorji članka odločili in namesto Nesslerjeve metode uporabili raje okolju prijazno Berthelojevo metodo, pri kateri sta potrebna dva reagenta – hipokloritni ioni (ClO^-) in salicilna kislina (Slika 24). V tem primeru je produkt zeleno obarvan derivat salicilne kisline, ki absorbira svetlobo pri λ 630 nm. V primeru uporabe Berthelojeve metode potečeta dve kaskadni reakciji, ki sta prikazani na spodnji reakcijski shemi (Slika 25) ^[24].

Slika 24: Strukturna formula salicilne kisline.

(47)

29

Slika 25: Reakcijska shema Barthelojeve metode za detekcijo sečnine.

Druga tehnika, ki prav tako za določanje sečnine uporabi optični senzor ter sistem pretočne analize, za svoje delovanje ne potrebuje encima ureaze. Namesto tega uporabi modificiran Ehrlichov reagent, pri čemer poteče reakcija (Slika 26), pri kateri nastane rumeno obarvan produkt, ki močno absorbira svetlobo pri valovnih dolžinah med λ 420 nm in λ 435 nm. Ta metoda je hitra in zato primerna za klinično določanje sečnine tako v krvi kot tudi v urinu. Vendar pa ima ta metoda slabost zaradi mehurčkov plina, ki se pojavijo v sistemu pretočne analize. Reakcija sečnine z Ehrilchovim reagentom poteče ob prisotnosti klorovodikove kisline (HCl), ki s karbonatnim pufrom, ki je v pretočnem sistemu, tvori mehurčke ogljikovega dioksida (CO2), ta pa povzroča napake pri spektrometričnih meritvah. Da bi problem preprečili, so avtorji članka že v naprej znižali pH v pretočnem sistemu in nato nastale mehurčke CO2 odstranili s pomočjo membrane in z zvišanjem tlaka v sistemu ^[24].

Slika 26: Reakcijska shema – uporaba Ehrlichovega reagenta za določanje sečnine.

Avtorji članka so mnenja, da je boljša izmed dveh predstavljenih tehnik druga tehnika, saj je bolj stabilna in te tehnike ni potrebno tako pogosto kalibrirati kot prve, prav tako

(48)

30

pa je druga tehnika bolj odporna na zunanje dejavnike. Vendar če primerjamo analizno obnašanje teh dveh tehnik, lahko opazimo, da ima prva širše linearno območje in nižjo mejo zaznave ter mejo kvantifikacije, prav tako je prva tehnika bolj občutljiva, vendar pa ima druga tehnika boljši korelacijski koeficient (Tabela 11) ^[24].

Tabela 11: Analizno obnašanje obeh tehnik s sistemom pretočne analize.

bioreaktor z imobilizirano

ureazo ne-encimatska tehnika občutljivost [V L mol^-1] 28,1 ± 0,2 80,9 ± 7,7

R² [%] 92 93

linerno območje [mmol/L] 0,2 – 5 0,7 – 5

LoD [mmol/L] 0,1 0,3

obstojnost sistema [dni] ≤ 7 /

(49)

31

5 Primerjava metod za določanje sečnine

Da bi lahko izbrali metodo določitve sečnine, je potrebno med seboj primerjati opisane metode. Tega sem se lotila tako, da sem metode primerjala glede na njihovo linearno območje in korelacijski koeficient, mejo zaznave, obstojnost sistema in nato tudi po času trajanja analize, po potrebi analize po posebnih pogojih ter po občutljivosti. Pri opisu posameznih metod sem navedla tudi občutljivost, vendar je ne morem navesti kot parameter obnašanja metode za primerjavo, saj je pri vsaki metodi drugačna enota, glede na kaj se občutljivost opazuje, kar pomeni, da številke ne bi pomenile veliko pri primerjavi, tako da sem občutljivost izpustila iz primerjave.

Za kar nekaj metod nisem našla vseh primerjanih parametrov obnašanja, zaradi česar bodo moja nadaljnja predvidevanja in primerjanja opisanih metod omejena le na parametre, ki sem jih uspela pridobiti. Omenjeno lahko v določeni meri vpliva na moja predvidevanja.

Tabela s primerjanimi analiznimi vrednostmi je navedena v Prilogi 1.

5.1 Linearno območje in korelacijski koeficient (R

²

)

Metodi z najboljšim korealcijskim koeficientom sodita med metodi s spektrometrično detekcijo in sicer sta to avtomatizirana spektrometrična detekcija s plinsko segmentiranim analizatorjem neprekinjenega pretoka ter spektrometrična detekcija s peroksidazno aktivnostjo zlatih nanodelcev. Prav tako ima prva metoda zelo široko linearno območje, ki se razteza kar čez štiri velikostne rede, kar ji omogoči določitev sečnine v vzorcu v širokem koncentracijskem območju. Edina metoda, ki ima širše linearno območje kot prej omenjena avtomatizirana spektrometrična detekcija s plinsko segmentiranim analizatorjem neprekinjenega pretoka, je metoda, ki za določanje sečnine v človeških vzorcih uporablja optični biosenzor s tankim slojem polianilina. Ta metoda ima linerano območje, ki se razteza čez šest velikostnih redov (od 10^-6 mol/L do 10^-1 mol/L).

S primerjavo med posameznimi metodami sem ugotovila, da imajo metode s spektrometrično detekcijo najvišji kvadrat korelacijskega koeficienta, medtem ko imajo metode pretočne analize dokaj ozko linearno območje koncentracij za določanje sečnine.

5.2 Meja zaznave

Večina opisanih metod ima mejo zaznave koncentracije sečnine za en velikostni red nižje, kot je linearno območje za določanje koncentracije sečnine v vzorcu. Kot pričakovano glede na linearno območje, ima najnižjo mejo zaznave avtomatizirana spektrometrična detekcija s plinsko segmentiranim analizatorjem neprekinjenega pretoka, ki ima tudi