Ljubljana, 2021 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
SVIT FERJANČIČ BENETIK
SINTEZA 4,5,6,7-TETRAHIDROBENZOTIAZOLNIH ALOSTERIČNIH ZAVIRALCEV PROTEINA
TOPLOTNEGA ŠOKA 90
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVIT MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA
Ljubljana, 2021 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO
SVIT FERJANČIČ BENETIK
SINTEZA 4,5,6,7-TETRAHIDROBENZOTIAZOLNIH ALOSTERIČNIH ZAVIRALCEV PROTEINA
TOPLOTNEGA ŠOKA 90
SYNTHESIS OF 4,5,6,7-TETRAHYDROBENZOTHIAZOLE DERIVATIVES AS ALLOSTERIC HEAT-SHOCK PROTEIN
90 INHIBITORS
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVIT MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA
Magistrsko nalogo sem opravljal na Univerzi v Ljubljani, Fakulteti za farmacijo, na Katedri za farmacevtsko kemijo pod mentorstvom izr. prof. dr. Tihomirja Tomašiča, mag. farm., in somentorstvom asist. Jake Dernovška, mag. farm.
Spektroskopske meritve in testiranja in vitro so opravili na Fakulteti za farmacijo Univerze v Ljubljani.
Zahvala
Zahvaljujem se svojemu mentorju, izr. prof. dr. Tihomirju Tomašiču, mag. farm., za ponujeno priložnost za delo, odzivnost, prijaznost in vse predano znanje pri izdelavi magistrske naloge. Prav tako velika hvala somentorju, asist. Jaki Dernovšku, mag. farm., za vso potrpežljivost, nesebično pomoč v laboratoriju in usmeritve pri pisanju naloge. Hvala tudi vsem ostalim iz laboratorija p47 s Katedre za farmacevtsko kemijo za prijazno pomoč.
Nazadnje bi se rad zahvalil svoji družini ter vsem prijateljicam in prijateljem za neizmerno podporo pri študiju in v življenju.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom izr. prof. dr.
Tihomirja Tomašiča, mag. farm., in somentorstvom asist. Jake Dernovška, mag. farm.
Svit Ferjančič Benetik
Predsednik komisije: prof. dr. Iztok Grabnar, mag. farm.
Član komisije: doc. dr. Urša Pečar Fonović, univ. dipl. biol.
I
Kazalo vsebine
Kazalo vsebine ... I Kazalo slik ... III Kazalo preglednic ... V Kazalo shem ... V Povzetek ... VI Abstract ... VIII Seznam uporabljenih okrajšav ... X
1. Uvod ... 1
1.1 Rak ... 1
1.1.1. Deset značilnosti raka... 2
1.1.2. Rak in proteostaza ... 3
1.2. Proteini toplotnega šoka ... 4
1.2.1. Osnove delovanja ... 4
1.3. Poddružina Hsp90 ... 5
1.3.1 Klasifikacija in struktura ... 5
1.3.2. Citoplazemski izoformi ... 6
1.4. Mehanizem delovanja ... 7
1.5. Vloga v rakavih obolenjih ... 7
1.5.1. Hsp90, evolucija tumorja in njegova heterogenost ... 8
1.5.2. Hsp90 in odpornost na kemoterapevtike ... 8
1.5.3. Vloga Hsp90 v odzivu na stres ... 8
1.6. Razvoj zaviralcev Hsp90 ... 9
1.6.1. N-končni zaviralci Hsp90... 9
1.6.2. C-končni zaviralci Hsp90 ... 11
2. Namen dela ... 16
II
3. Materiali in metode ... 19
3.1. Reagenti in topila ... 19
3.2. Kromatografske metode ... 19
3.2.1. Tankoplastna kromatografija (TLC) ... 19
3.2.2. Kolonska adsorpcijska kromatografija ... 19
3.2.3. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ... 19
3.3. Spektroskopske metode ... 20
3.3.1. Jedrska magnetna resonanca 1H- in 13C-NMR ... 20
3.3.2. Masna spektrometrija / visoke ločljivosti (MS / HRMS) ... 20
3.4. Biološka testiranja ... 20
3.5. Računalniška programska oprema ... 21
3.5.1. Chemdraw 18.1 ... 21
3.5.2. MestReC in MestReNova... 21
3.5.3. Programski paket OpenEye ... 21
4. Eksperimentalni del ... 23
4.1. Reakcijske sheme ... 23
4.2. Sintezni in analitski postopki: ... 26
5. Rezultati in razprava ... 42
5.1. Komentar sinteznih postopkov ... 42
5.1.1. Uvajanje zaščitne skupine Boc ... 42
5.1.2. Tvorba amidne vezi s pomočjo sklopitvenih reagentov ... 43
5.1.3. Odstranjevanje zaščitne skupine Boc ... 46
5.2. Rezultati in komentar bioloških testiranj ... 47
6. Sklep ... 51
7. Literatura ... 52
III
Kazalo slik
Slika 1: Stopnje v razvoju neoplastične celice, prirejeno po (3). ... 1 Slika 2: Deset značilnih znakov raka, prirejeno po (4). ... 3 Slika 3: Prikaz strukture in delovanja Hsp90 – leva slika ponazarja ravnotežje med odprto in zaprto konformacijo Hsp90. Z rdečo sta označeni C-končni, z rumeno srednji, svetlo modri sta N-končni domeni z zeleno pa je označen protein klient. Zdravilna učinkovina, označena z roza, lahko s tekmovanjem z ATP za vezavno mesto na NTD zavira delovanje samega Hsp90. AMPPNP na desni sliki je nehidrolizirajoči analog ATP, ki se veže v ATP-vezavno regijo NTD. Prirejeno po (5). ... 6 Slika 4: Mehanizem delovanja Hsp90. V stopnjah od I do VIII je prikazana pot proteina od napačnega zvitja do nativne konformacije z udeleženimi šaperoni in košaperoni. Prirejeno po (7). ... 7 Slika 5: N-končni zaviralci Hsp90. Z modro črtkano črto je označen benzokinonski
element, z rdečo resorcinolna skupina, z zeleno purinska skupina, vijolična črta pa obkroža benzamid. ... 10 Slika 6: Novobiocin z označenimi – rdečim kumarinskim skeletom, zelenim sladkorjem noviozo in modrim benzamidom ... 12 Slika 7: C-končni zaviralci Hsp90 KU-135, KU-32 in KU-174, razviti na osnovi
modifikacij novobiocina. ... 13 Slika 8: Bifenilni C-končni zaviralec, spojina A (levo) in njeno sidranje v alosterično vezavno mesto (desno). Vidne so ključne interakcije v malem žepu, predvsem z Glu584 in Lys615. Prirejeno po (35). ... 14 Slika 9: Stilbenska C-terminalna zaviralca – levo spojina B, desno pa njen analog z
izboljšano antiproliferativno aktivnostjo. Z rdečo sta označeni ključni spremembi (uvedba 2-(dimetilamino)etilne in triazolne skupine. Prirejeno po (42). ... 15 Slika 10: Spojina TMM-7b, ki bo osnova za raziskave odnosa med strukturo ligandov s 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazolnim skeletom in njihovim delovanjem na C-končno domeno Hsp90. ... 16 Slika 11: Prikaz vseh spojin knjižnice A - osnovno ogrodje je (S)-N-(2-amino-4,5,6,7- tetrahidrobenzo[d]tiazol-6-il)-3,4-diklorobenzamid, na katerega bomo pripeli osem različnih substituentov z alifatskim aminom. Po vrsti z leve proti desni si sledijo 4- aminobutanojska kislina, 3-aminocikloheksanojska kislina, (R)-3-amino-3-
IV
fenilpropanojska kislina, 3-aminociklopentanojska kislina, 2-amino-2-feniletanojska kislina, (R)-2-aminobutanojska kislina, (S)-piperidin-3-karboksilna kislina in (R)-piperidin- 3-karboksilna kislina. ... 17 Slika 12: Prikaz vseh spojin knjižnice B – osnovno ogrodje je 3-amino-N-(6-amino-
4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol-2-il)propanamid, na katerega bomo pripeli tri različne substituente na mestu 6 tetrahidrobenzotiazola. Od leve proti desni si sledijo benzojska kislina, cikloheksanojska kislina in 1-H-pirol-2-karboksilna kislina. ... 18 Slika 13: Računalniško sidrani spojini A) 7f in B) 7g v C-končno domeno tarčnega
proteina Hsp90. Aminokislinski ostanki v vezavnem mestu Hsp90 so označeni s sivo barvo, liganda pa z zeleno. ... 48 Slika 14: Sidranje novobiocina (a) in iz njega izpeljane spojine C (b) v alosterično vezavno mesto C-končne domene Hsp90β. Z rdečo je obkrožen Glu489B, ki tvori vodikovo vez z modro označenima NH v amidu na novobiocinu in NH v sečninski skupini spojine C.
Povzeto po (36). ... 49
V
Kazalo preglednic
Preglednica I: Rezultati biološkega testiranja za pet končni spojin in spojino TMM-7b. 47 Preglednica II: Ostali sintetizirani alosterični zaviralci Hsp90. ... 49
Kazalo shem
Shema 1: Redukcija ob prisotnosti metabolno aktivnih celic. ... 21 Shema 2: Sinteza ligandov iz knjižnice A – 1. stopnja. Reagenti in pogoji: (a) Boc,
H2O/1,4-dioksan/1 M NaOH, sobna T, 3 h – 18 h. ... 23 Shema 3: Sinteza ligandov iz knjižnice A. Reagenti in pogoji: (b) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 3,4-diklorobenzojska kislina, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18-20 h; (c) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18h – 20 h; (d) 4 M HCl v 1,4-dioksanu, 1,4-dioksan, sobna T, 24 h. ... 24 Shema 4: Sinteza ligandov 12a-c iz knjižnice B. Reagenti in pogoji: (b) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18-20 h; (c) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18h – 20 h; (d) 4 M HCl v 1,4-dioksanu, 1,4-dioksan, sobna T, 24 h. ... 25 Shema 5: Mehanizem zaščite amino skupine z Boc2O, prirejeno po (51). ... 42 Shema 6: Mehanizem tvorbe amidne vezi s pomočjo sklopitvenih reagentov EDC in HOBt. Prirejeno po (53). ... 44 Shema 7: Prikaz mehanizma racemizacije po aktivaciji karboksilne skupine, prirejeno po (51) ... 45 Shema 8: Mehanizem odstranitve Boc-skupine z acidolizo, pri kateri smo uporabili HCl v 1,4-dioksanu. ... 46
VI
Povzetek
Proteini toplotnega šoka so ubikvitarne molekule v celici. Njihovo izražanje se poveča, ko je celica izpostavljena povišani temperaturi ali oksidativnemu stresu, ki ga povzročajo reaktivne kisikove zvrsti. Osnovna naloga teh proteinov, predvsem poddružine proteinov toplotnega šoka 90 (Hsp90), je vzdrževanje nativne konformacije celičnih proteinov. Še bolj kot zdrave delovanje Hsp90 izkoriščajo rakave celice, ki imajo zaradi spremenjenega genoma več konformacijsko nestabilnih proteinov, ključnih za ohranjanje malignosti. Zato so zaviralci Hsp90 potencialne protitumorne učinkovine, pri čemer se raziskave vse bolj usmerjajo na modulacijo delovanja tega proteina preko vezave v njegovo C-končno regijo.
V sklopu magistrske naloge smo sintetizirali in optimizirali serijo C-končnih zaviralcev Hsp90 s 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazolnim skeletom. Načrtovali smo knjižnici spojin A in B za proučevanje odnosa med strukturo ligandov in njihovim delovanjem (SAR) na rakavih celičnih linijah. Pri knjižnici A smo se osredotočili na optimizacijo substituenta na mestu 2 osnovnega 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazolnega skeleta. S spremembami dolžine distančnika in uvedbo kiralnih centrov smo želeli ugotoviti predvsem, kateri položaj kationskega centra je za delovanje najugodnejši. Namen knjižnice B pa je bil primerjati različne aromatske sisteme na mestu 6 osnovnega skeleta z vidika velikosti in tvorbe dodatnih interakcij z vezavnim mestom.
Na osnovi rezultatov testiranja antiproliferativnega delovanja petih končnih spojin na celični liniji raka dojke MCF-7 smo iz primerjave IC50 spojin 12c in 12a ugotovili, da je na mestu 6 aromatski sistem nujen za aktivnost spojine. Rezultati aktivnosti spojine 12b so pokazali, da je v vezavnem mestu verjetno še dodatna možnost tvorbe vodikove vezi, na vezavo pa pomembno vpliva tudi dodatna substitucija aromatskega obroča. Na mestu 2 je poleg velikosti substituenta z amino skupino pomembna tudi njegova prostorska orientacija.
Od vseh testiranih spojin je imela spojina 7f najnižjo vrednost IC50 = 17 μM, kar je še vedno previsoko za potencialno zdravilno učinkovino. Vrednotenje antiproliferativnega delovanja preostalih šestih sintetiziranih spojin (spojine 7a-e, 7h) bo pomagalo razjasniti vpliv dodatnega aromata na mestu 2 in določiti ustrezno razdaljo med osnovnim skeletom in aminsko funkcionalno skupino. S temi ugotovitvami bi rezultati magistrske naloge podali še več ključnih informacij glede odnosa med strukturo liganda in delovanjem 4,5,6,7- tetrahidrobenzotiazolnih modulatorjev C-končne domene Hsp90.
VII
Ključne besede: Hsp90; 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazol; C-končna domena; SAR; rak
VIII
Abstract
Heat-shock proteins (Hsp) are ubiquitous molecules in the cell which increases their expression when exposed to elevated temperature or oxidative stress by reactive oxygen species. The main role of these proteins, particularly of the heat shock protein 90 (Hsp90) family is to maintain the native conformation of proteins in the cell. Since cancer cells possess many conformationally unstable proteins that are critical for their survival and malignancy, they tend to utilize the chaperone function of Hsp90 even more than healthy cells. For this reason, Hsp90 inhibitors represent potential antitumor drugs with researchers increasingly focusing on modulating protein function by interacting with the C-terminal domain of Hsp90. Therefore, the aim of this Master's thesis was to synthesize and optimize Hsp90 C-terminal inhibitors bearing the 2,6-diamino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazole core.
Two libraries of compounds (A and B) were designed with the aim of investigating the structure-activity relationships (SAR) of these ligands. Library A focused primarily on optimizing the amine-bearing moiety attached to position C-2 of the tetrahydrobenzothiazole scaffold. By changing the length of the spacer and introducing chiral centers to the central scaffold we aimed primarily to determine which position of the cationic center will give the strongest inhibitory activity. In library B, on the other hand, the introduction of different aromatic systems to position C-6 of the 4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazole moiety was to be compared in order to obtain information on the size of the most potent substituents and to allow additional interactions with the residues of the binding site.
Five final compounds were evaluated for their antiproliferative activity in MCF-7 breast cancer cell lines. Comparison of the IC50 values of compounds 12c and 12a confirmed that the aromatic system at position C-6 is a mandatory requirement for activity. Compound 12b showed that there is an additional possibility to form hydrogen bonds in the active site.
Again, the bonding is significantly affected when the aromatic ring is substituted. At the C- 2 position of the tetrahydrobenzothiazole ring, both the size and spatial orientation of the amine moiety must be considered.
Of all the compounds tested, compound 7f showed the lowest IC50 value of 17 μM, which is still too high for a potential antitumor agent. The cytotoxic evaluation of the remaining six synthesized compounds 7a-e and 7h would help to clarify the effects of adding an aromatic ring to the amine moiety bound at position C-2 and give a rough estimate of the optimal
IX
length of the spacer between the amine of interest and the tetrahydrobenzothiazole scaffold.
With these results this Master's thesis could provide even more key information on the structure-activity relationship of 4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazole Hsp90 C-terminal domain modulators.
Keywords: Hsp90; 4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazole; C-terminal domain; SAR; cancer
X
Seznam uporabljenih okrajšav
Okrajšava Pomen
1H-NMR protonski spekter jedrske magnetne resonance AMPPNP adenilil-imidodifosfat
Btz benzotiazol
CDK od ciklina odvisna kinaza (angl. cyclin-dependent kinase) CIP s CDK interagirajoči protein (angl. CDK interacting protein) CTD C-končna domena
DIPEA N,N-diizopropiletilamin DKM diklorometan
DMF N,N-dimetilformamid DMSO-d6 devteriran dimetil sulfoksid DNAJ bakterijski Hsp40
DNAK bakterijski Hsp70
EDC 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid
EGFR receptor za epidermalni rastni dejavnik (angl. epidermal growth factor receptor)
ESI ionizacija z razprševanjem v električnem polju (angl. electrospray ionization)
EtOAc etil acetat
GHKL družina strukturno podobnih ATP-aznih domen, ki jih najdemo v girazi (G), Hsp90 (H), histidin-kinazi (K) in proteinih MutL (L) GRP94 z glukozo reguliran protein 94 (angl. glucose-regulated protein 94) GroEL različica Hsp60 v bakteriji Escherichia coli
GroES različica Hsp10 v bakteriji Escherichia coli
HER-2 receptor 2 za človeški epidermalni rastni dejavnik (angl. human epidermal growth factor receptor 2)
HIF1α s hipoksijo induciran dejavnik 1α (angl. hypoxia-inducible factor 1- alpha)
XI HIP Htt interagirajoči protein HOBt hidroksibenzotriazol
HOP Hsp70-Hsp90 organizirajoči protein (angl. Hsp70-Hsp90 organizing protein)
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. high performance liquid chromatography)
HRMS masna spektrometrija visoke ločljivosti (angl. high resolution mass spectrometry)
Hsp protein toplotnega šoka (angl. heat-shock protein)
IC50 koncentracija zaviralca, ki zavre metabolno aktivnost celic za 50%
MCF-7 celična linija raka dojke (angl. Michigan cancer foundation-7) MD srednja domena
MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4- sulfofenil)-2H-tetrazolij)
MeOH metanol
NAC z nastajajočim polipeptidom povezan kompleks (angl. nascent polypeptide associated complex)
NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfat NMM N-metilmorfolin
NTD N-končna domena
ROS reaktivne kisikove zvrsti (angl. reactive oxygen species) SAR odnos med strukturo in delovanjem (angl. structure-activity relationship)
SkBr3 celična linija raka dojke, izolirana v Sloan-Kettering centru leta 1970
TLC tankoplastna kromatografija (angl. thin-layer chromatography) TRAP1 z receptorjem TNF povezani protein 1 (angl. TNF receptor associated protein 1)
VEGF vaskularni endotelni rastni dejavnik (angl. vascular endothelial growth factor)
ZU zdravilna učinkovina
XII d dublet
dd dublet dubleta dq dublet kvarteta m- meta-
p- para- s singlet t triplet
td triplet dubleta
1
1. Uvod 1.1 Rak
Rak je eden vodilnih razlogov za obolevnost, smrt in ekonomske izgube. Leta 2040 se pričakuje 26,5 milijona novoodkritih primerov raka in kar 18,6 milijona smrti, številke pa naraščajo predvsem v razvitem svetu (1). V zdravem telesu celice rastejo in se delijo nadzorovano. Ko se tkivo stara ali poškoduje, le-te zamenjajo nove. Včasih pa se ta sistem poruši in nenormalne ali poškodovane celice ne odmrejo, temveč se delijo naprej. Takšno nenormalno maso tkiva imenujemo novotvorba oz. tumor. Kadar raste počasi in ni agresivna, je benigna, če pa raste pospešeno in se lahko širi po celem telesu, je maligna. Razvoju raka botrujejo spremembe v genomu celic, ki vodijo v okvaro dednega zapisa. Razlogi za tovrstne spremembe so lahko notranji dejavniki, kot so spol, starost in prirojene okvare (npr.
mutacije v zapisih za protoonkogene, tumorje zavirajoče gene, gene, ki uravnavajo apoptozo, gene, ki sodelujejo pri popravljanju neletalnih poškodb molekule DNA), ali pa zunanji, ki so lahko kemični (npr. kovine, arzen, alkilirajoča sredstva), biološki (DNA in RNA virusi) in fizikalni (UV, X in gama žarki) (2). Ključ za razvoj malignega tumorja (neoplazme) je aktivacija enega onkogena, ki poveča verjetnost za dodatne okvare genoma. Posebni geni, imenovani protoonkogeni, nosijo zapis za proteine, ki sodelujejo pri celičnem razmnoževanju. V vseh celicah pri delitvi pride do mutacij, ki jih potem popravljalni mehanizmi popravijo. Težava nastane, ko se z mutacijami aktivirajo protoonkogeni in se spremenijo v onkogene, ki nosijo zapis za onkoproteine (Slika 1). Ti imajo povečano aktivnost, kar pospeši celično delitev in rast – iniciacija kancerogeneze (3). Obrambni mehanizem telesa proti temu predstavljajo tumorje zavirajoči geni oz. antionkogeni. Ribosomi njihov zapis prevedejo v proteine, ki zavirajo Slika 1: Stopnje v razvoju neoplastične celice, prirejeno
po (3).
2
celično razmnoževanje in medsebojni prenos signalov, preprečujejo adhezijo na drugo celico, uravnavajo celični cikel in spodbujajo apoptozo pri poškodbah DNA. Če sta mutirana tudi oba alela za posamezen antionkogen, maligni proces lahko napreduje in aktivirajo se še dodatni onkogeni. Poleg zgoraj opisanih dejavnikov so za to pomembni še promotorji, kot so hormoni. Ti spodbudijo procese, ki vodijo v klonalnost celic – vse imajo istega predhodnika in vsebujejo genetsko ali epigenetsko anomalijo. Te celice se lahko potem nekontrolirano delijo in takrat govorimo o progresivni neoplaziji (2).
1.1.1. Deset značilnosti raka
Lokalizirano nebrzdano razmnoževanje celic imenujemo tumor, ko pa ta začne metastazirati, bolezen imenujemo rak. Rakavo spremenjene celice tekom genetskih sprememb pridobijo deset značilnih lastnosti (Slika 2). Proces se začne z genomsko nestabilnostjo z veliko mutacijami. Temu sledi tumorsko spodbujeno vnetje, ki s signalnimi molekulami in encimi olajša metastaziranje in angiogenezo. Da preživi, se tumorska celica zna izogniti apoptotskim mehanizmom in zaviralcem rasti, obenem pa neprestano oddaja signale za proliferacijo. Morda najpomembnejši zaščitni znak tumorske celice je neskončna možnost replikacije, saj se telomeraze v rakavi celici ne krajšajo in s tem celici omogočajo nesmrtnost.
Poleg nesmrtnosti se lahko tumorsko spremenjene celice uspešno izogibajo zaviralcem rasti, kar omogoča, da število celic na določenem mestu močno naraste. S tem pride do zmanjšanja perfuzije, zato je za preživetje tumorja ključna lastnost spodbujanje angiogeneze, kar pa še ne zadostuje za preživetje. Celice zato preklopijo metabolizem na aerobno glikolizo. Ko se celice na mestu rasti preveč skoncentrirajo, začnejo metastazirati, ob tem pa razvijejo še sposobnost izogibanja imunskemu sistemu (2,4).
3
Slika 2: Deset značilnih znakov raka, prirejeno po (4).
1.1.2. Rak in proteostaza
Glede na to, da razvoj raka vodijo spremembe genoma, je ključnega pomena genotip. Ker pa so vsi zaščitni znaki rakavega obolenja izrazito fenotipski, se znanost vse bolj fokusira na mehanizme, kako se fenotip izrazi iz genotipa. Osrednji mehanizem tega procesa tvori proteostaza (homeostaza proteinov). Njeni sestavni deli so sinteza, pravilno zvijanje in razgradnja proteinov. Vsak protein tvori 3D nativno konformacijo tako, da najde stanje z minimalno Gibbsovo prosto energijo. Ob tem igrajo vodilno vlogo hidrofobne interakcije, ki jih tvorijo predvsem aminokisline Ala, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr in Trp, in jih le dopolnjujejo vodikove vezi (5). In vitro to poteka avtomatsko, in sicer velja teorija, da se protein na različnih koncih začne naenkrat zvijati v veliko različnih konformacij, pri čemer potem sproti prevladajo energijsko vedno bolj ugodne, dokler ne dobimo nativne konformacije (5).
In vivo, kjer je koncentracija makromolekul kar med 200 in 400 mg/mL, je prostora bistveno manj in le 10% proteinov se zvije spontano. Prisotne so mnoge intermolekularne interakcije
4
z ostalimi gradniki celice, ki bi lahko motile zvijanje. Prav tako je lahko del proteina že v neki 3D konformaciji, ko se drugi še sestavlja v ribosomih (6). V teh primerih pri zvijanju proteinov ključno vlogo opravljajo šaperoni, med katerimi imajo pomembno vlogo proteini toplotnega šoka (7).
1.2. Proteini toplotnega šoka
Proteini toplotnega šoka so ubikvitarne molekule (prisotni v pro- in evkariontih) in predstavljajo do 2% skupne mase proteinov v zdravi evkariontski celici. Poimenovani so po svoji vlogi v celici, saj se njihovo izražanje poveča, ko je celica izpostavljena stresorjem, kot sta povišana temperatura in oksidativni stres, ter približni molekulski masi v kDa, določeni z denaturacijo pri gelski elektroforezi. Hsp90 ima na primer molsko maso 90 kDa. Obstaja več poddružin proteinov toplotnega šoka, in sicer manjši Hsp (veliki okoli 15-30 kDa), Hsp40/DNAJ, Hsp70/DNAK, Hsp100/CIP in Hsp90. Poleg delovanja v zdravi in rakavi celici imajo posamezni predstavniki vlogo tudi pri nevrodegenerativnih, virusnih in parazitskih boleznih (7).
1.2.1. Osnove delovanja
Predstavniki prvih štirih poddružin skrbijo za razbitje proteinskih agregatov in vzpostavitev nativne konformacije vsakega proteina. Njihovo delovanje lahko razdelimo v tri faze:
1) Ko se novonastali protein sprosti z ribosomov, se Hsp70 in Hsp40 združita z nastajajočim peptidom povezanim kompleksom NAC in pomagata vzdrževati približno nativno 3D konformacijo novega proteina. Ta korak je nujen, ker je hitrost zvitja proteinov kar tisočkrat večja od hitrosti sinteze v ribosomih.
2) Sledi vstop proteina v kompleks TriC/CCT (oz. GroES/GroEL v bakterijah), v katerem je zaščiten pred interakcijami z okoliškimi (makro)molekulami in se lahko dokončno pravilno zvije. Alternativna pot poteka preko Hsp90, ki je odgovoren tudi za prehod nekaterih proteinov skozi membrane in pravilno zvitje mnogih transmembranskih receptorjev (8).
3) Proteini družine Hsp100/CIP delujejo kot molekulski odpirači, ki razvijejo napačno zvite molekule in razstavijo morebitne proteinske agregate. Po vezavi napačno zvitih proteinov Hsp104 ob porabi ATP spremeni konformacijo, kar loči agregate na posamezne sestavne dele. Ti so nato takoj zaščiteni s Hsp70 in Hsp40. Hsp70
5
sodeluje tudi pri deagregaciji, saj se veže na srednjo domeno Hsp104 in ga pomaga usmeriti proti proteinom (9).
Poddružina Hsp90 pa ima drugačno vlogo – podpira namreč stabilnost konformacijsko labilnih proteinov, ko so ti zaključili zgoraj opisani fazi 2) in 3) (5).
1.3. Poddružina Hsp90
Glavni izziv za preživetje rakave celice je, kako se spopasti z napačno zvitimi lastnimi proteini, saj so ti napram proteinom ostalih celic konformacijsko zelo nestabilni. Hsp90 s stabilizacijo nativne strukture pomaga ohranjati naravno prisotne fenotipske variante proteinov rakavih celic in s tem tudi njihovo malignost. Tako ni presenetljivo, da je med vsemi proteini toplotnega šoka prav poddružina Hsp90 najbolj raziskana v protitumorni terapiji (10).
1.3.1 Klasifikacija in struktura
Poddružino Hsp90 lahko delimo na več načinov. Nove smernice nomenklature jo delijo na pet proteinov: Hsp90AA1, Hsp90AA2, Hsp90AB1, Hsp90B1 in Hsp90L. Pogostejša in bolj praktična je klasifikacija glede na lokacijo v celici. Tako imamo v citoplazmi Hsp90α, Hsp90α2 in Hsp90β, v endoplazemskem retikulumu Grp94 in v mitohondrijih TRAP1.
Osnovna molekulska struktura vseh homologov zajema N-končno domeno (NTD), C- končno domeno (CTD) in srednjo domeno (MD) (Slika 3). Poseben vmesnik povezuje NTD in MD. Sestavljen je iz aminokislin s funkcionalnimi skupinami, ki so pri fiziološkem pH nabite. Tako neposredno narekuje stopnjo, do katere bo Hsp spremenil konformacijo po vezavi ATP v NTD, s tem pa tudi samo delovanje šaperona (11). Naloga NTD je vezava molekule ATP, CTD je odgovorna za dimerizacijo proteina, MD pa nekovalentno veže protein, ki se mora pravilno zviti (t.i. klient) (7).
6
Slika 3: Prikaz strukture in delovanja Hsp90 – leva slika ponazarja ravnotežje med odprto in zaprto konformacijo Hsp90. Z rdečo sta označeni C-končni, z rumeno srednji, svetlo modri sta N-končni domeni z zeleno pa je označen protein klient. Zdravilna učinkovina, označena z roza, lahko s tekmovanjem z ATP za vezavno mesto na NTD zavira delovanje samega Hsp90. AMPPNP na desni sliki je nehidrolizirajoči analog ATP, ki se veže v ATP-vezavno regijo NTD. Prirejeno po (5).
1.3.2. Citoplazemski izoformi
Najbolj zastopani izoformi Hsp90 sta inducibilna izoforma Hsp90α in konstitutivna izoforma Hsp90β, ki se nahajata v citoplazmi. Ker imata v 85-odstotkih identično aminokislinsko zaporedje in se tudi funkcionalno bistveno ne razlikujeta, se ju pogosto imenuje kar s skupnim imenom Hsp90. Gre za hidrofoben šaperon, ki obstaja kot fosforiliran dimer z 2 do 3 kovalentno vezanimi fosfati. V NTD ima vezavno mesto za ATP, podobno tistim v naddružini GHKL (12). Vmesnik med NTD in MD poveča fleksibilnost proteina, MD pa z vezavo γ-fosfata v ATP modulira njegovo aktivnost. CTD ima štiri ključna mesta.
Mesto vezave kalmodulina, motiv petih aminokislin MEEVD za vezavo košaperonov, ki pomagajo pri zvitju proteinov, mesto za homodimerizacijo samega Hsp90 in alosterični regulator ATP-azne aktivnosti v NTD. Slednji se aktivira, ko je ATP že vezana v NTD in tako odpira nove možnosti za modulacijo delovanja Hsp90 (7,13). Citoplazemski protein toplotnega šoka 90 je s svojim delovanjem med drugim vključen v signalne poti receptorjev za steroidne hormone, zaščito proteinskih kinaz pred agregacijo, transport le-teh v jedro, premreženje aktinskih filamentov in zamenjavo starih molekul miozina z novimi. Če se v stresnih situacijah izloči iz celice, promovira celjenje ran in celično gibljivost (7,14–16).
7
1.4. Mehanizem delovanja
Izoforme Hsp90 se sicer nahajajo v različnih predelih celice, a je šaperonski cikel pri vseh zelo podoben. Vezava ATP v NTD sproži serijo konformacijskih sprememb, ki vodijo v medsebojno povezavo obeh NTD homodimera. Tvori se dimer v zaprti konformaciji (Slika 4), ki se po hidrolizi ATP vrne v odprto konformacijo. V tem stanju se Hsp90 približa protein klient, ki je stabiliziran s kompleksom Hsp70/Hsp40/HIP (Slika 4, stopnje I-III). Za interakcijo med Hsp90 in Hsp70 je potrebna še adapterska molekula HOP, košaperon Cdc37 pa poskrbi za vezavo klienta na MD Hsp90 (Slika 4, stopnja IV). V naslednji stopnji se Hsp70, HIP in HOP sprostijo (Slika 4, stopnja V), ATP pa se veže na NTD Hsp90, ki s tem preide v zaprto konformacijo (Slika 4, stopnja VI). Tu se pridružita še košaperona p23 in Aha1 (Slika 4, stopnja VII), ki spodbudita hidrolizo ATP, pri čemer se s ponovno spremembo konformacije šaperona (16,17) klient zvije v nativno konformacijo (Slika 4, stopnja VIII) (17,18).
Slika 4: Mehanizem delovanja Hsp90. V stopnjah od I do VIII je prikazana pot proteina od napačnega zvitja do nativne konformacije z udeleženimi šaperoni in košaperoni. Prirejeno po (7).
1.5. Vloga v rakavih obolenjih
Več kot 400 znanih regulatorjev celičnega signaliziranja v rakavih celicah je tudi proteinov klientov Hsp90. Med njimi je mnogo proteinskih kinaz, transkripcijskih dejavnikov in
8
molekul, ki sodelujejo pri mobilizaciji in restrukturiranju nukleosomov. Maligne celice imajo zaradi večje količine proteinov povečano potrebo po Hsp90. Obenem je znano, da mutacije tega šaperona niso pogoste, a je v patogenezo rakavih obolenj vseeno močno vpleten preko vpliva na svoje onkogene kliente, ki so udeleženi v vseh desetih značilnostih raka (19).
1.5.1. Hsp90, evolucija tumorja in njegova heterogenost
Hsp90 preko stabilizacije proteinov, katerih genski zapis ima veliko mutacij/polimorfizmov, pomaga ohraniti določene genetske variante celic, ki se razkrijejo šele pod stresnimi pogoji (hipoksija, pomanjkanje hranil, pritisk, kemoterapevtiki idr.) V normalnih okoliščinah bi imele negativen vpliv na stabilnost celic, v stanju stresa pa jim pomagajo preživeti in s tem se rakavo obolenje razvija naprej. Primer tega je konformacijsko izredno nestabilen onkoprotein nereceptorska tirozin kinaza v-Src, ki zaradi Hsp90 uspe prenašati signale med rakavimi celicami (18–20).
1.5.2. Hsp90 in odpornost na kemoterapevtike
Zgoraj omenjene mutirane proteine skušamo pri zdravljenju raka zavirati s kemoterapevtiki.
Med zdravljenjem se pogosto pojavijo dodatne mutacije, ki naredijo protein odporen na zdravilno učinkovino, a hkrati zaradi naraščajoče konformacijske labilnosti vse bolj odvisen od stabilizacije s Hsp90. Takšen primer je onkoprotein receptor za epidermalni rastni dejavnik (EGFR), ki je tarča kinaznih zaviralcev gefitiniba in erlotiniba. Ko se z mutacijami EGFR dovolj spremeni njegovo aminokislinsko zaporedje in s tem konformacija, ta postane odporen na terapijo. Dodatek vorinostata sproži nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti, ki prekinejo vez med aminokislinami na N-končni domeni Hsp90, kar vodi v razgradnjo tega proteina (21). Mutirani EGFR potem razpade, kar jasno kaže na njegovo neposredno odvisnost od Hsp90. V hormonski terapiji ER+ raka dojke pa so ugotovili, da je postal odporen proti tamoksifenu zaradi spremembe v signalnih poteh različnih kinaz. Dodatek zaviralca Hsp90 je tu značilno podaljšal čas do nastopa odpornosti proti tamoksifenu, iz česar sklepajo na nestabilnost kinaz, ko teh ne ščiti Hsp90 (7,22,23).
1.5.3. Vloga Hsp90 v odzivu na stres
S povečevanjem tumorske mase vse tumorske celice niso več enakomerno preskrbljene s kisikom, zato se v hipoksičnih celicah aktivira s hipoksijo induciran faktor 1α (HIF1α). Ta poveča izražanje vaskularnega endotelnega rastnega dejavnika (VEGF), ki spodbudi
9
angiogenezo. Za stabilizacijo HIF1α je prav tako ključen Hsp90. Razraščanje tumorja pomeni tudi povečano potrebo po hranilih in s tem njihovo pomanjkanje, zaradi česar mora celica spremeniti proces biosinteze purinov, metabolizem aminokislin z razvejano verigo in glutamata. Mnogi encimi teh metabolnih poti so prav tako klienti Hsp90. Če rakava celica kljub temu preživi, bo sčasoma postala tako neoplastična, da jo bo imunski sistem prepoznal kot organizmu tujo celico. Hsp90 ima pomembno vlogo tudi pri preživetju tumorskih celic, saj vpliva na izražanje imunskih kontrolnih točk PD1 in CTLA4, ki izpostavljeni na celični membrani preprečujeta vezavo T-celic na tumorsko celico in s tem preprečita njeno uničenje (19). Ravno vsesplošna vpletenost v rakava obolenja je Hsp90 izpostavila kot obetavno tarčo za razvoj novih protirakavih zdravil.
1.6. Razvoj zaviralcev Hsp90
Preko zaviranja Hsp90 lahko občutno zmanjšamo delovanje proteinov, ki so za pridobitev nativne konformacije odvisni od tega šaperona. Ti proteini so, kadar je Hsp90 zavrt, zaradi nestabilnosti podvrženi razgradnji z ubikvitin-proteasomskim sistemom. To posebej občutijo rakave celice, pri katerih šaperoni ščitijo maligni fenotip in hkrati stabilizirajo močno mutirane onkoproteine, kot so vSRC, HER2 in B-raf. Prav zmanjšana aktivnost onkoproteinov je bila prvi znak, da določena spojina vpliva na delovanje Hsp90. Razvoj zaviralcev Hsp90 se je tako začel leta 1994 z odkrijem antiproliferativnih lastnosti geldanamicina (Slika 5). Ta je z vezavo na NTD Hsp90 zmanjšal aktivnost tirozin kinaz in povzročil celično smrt. Večina kliničnih kandidatov je delovala preko zaviranja vezave ATP v NTD Hsp90, zaradi nekaterih slabosti pa je sledil razvoj zaviralcev z alternativnimi mehanizmi delovanja, kot je alosterična modulacija Hsp90 preko vezave zaviralcev v CTD (13,24).
1.6.1. N-končni zaviralci Hsp90
Kmalu po odkritju geldanamicina so enak učinek dokazali tudi za naravno spojino radicikol (Slika 5). Obe spojini delujeta kot kompetitivna zaviralca Hsp90, ki z lastno vezavo preprečita vezavo in hidrolizo ATP v NTD. Od tu naprej je bil osnovni cilj izboljšati farmakokinetiko in farmakodinamiko obeh spojin. Tako so najprej razvili analoge geldanamicina, ki so ohranili benzokinonski skelet (Slika 5, označen z modro barvo) – alvespimicin, tanespimicin in retanespimicin. Vzporedno so na podlagi nekonvencionalne konformacije ATP v vezavnem mestu sintetizirali purinske analoge, kot je PU-H71 (Slika
10
5). Težava predvsem benzokinonskih derivatov je bila hepatotoksičnost, kar so skušali preprečiti z zamenjavo benzokinona za resorcinolno skupino iz radicikola (Slika 5, označena z rdečo barvo) in za benzamidno skupino. Tako so razvili onalespib, luminespib in ganetespib ter benzamida XL888 in Tas-116 (25,26).
Slika 5:N-končni zaviralci Hsp90. Z modro črtkano črto je označen benzokinonski element, z rdečo resorcinolna skupina, z zeleno purinska skupina, vijolična črta pa obkroža benzamid.
Do zdaj v razvoju N-končnih zaviralcev Hsp90 raziskovalci niso prišli dlje kot do faze III kliničnih testiranj, za kar obstajajo trije glavni razlogi:
1) Močno zaviranje Hsp90 je lahko smrtonosno tudi za zdrave celice. Da bi dosegli zadostno stopnjo zavrtja kinaz v rakavih celicah, bi morali aplicirati za človeka že toksičen odmerek zaviralca Hsp90, če bi tega aplicirali samostojno. V kliničnih študijah geldanamicina se je to kazalo kot okularna, gastrointestinalna toksičnost in hepatotoksičnost (27). Pri ostalih N-končnih zaviralcih je bila toksičnost sprejemljiva, če so bili uporabljeni v kombinaciji z učinkovino, ki deluje na drugo tarčo, npr. tanespimicin s trastuzumabom (28).
11
2) Pri tem odmerku se močno aktivira odziv toplotnega šoka (angl. Heat-Shock Response ali HSR). Veliko število nepravilno zvitih proteinov predstavlja stresno stanje za celico. HSF-1 se zato sprosti iz kompleksa s Hsp90 in poveča translacijo Hsp70, Hsp40 in Hsp27. Ti potem nasprotujejo delovanju zaviralcev Hsp90, saj pomagajo ohranjati nativno konformacijo onkoproteinov. Ugotovili so tudi, da HSF- 1 v rakavih celicah sproži drugačen odziv kot v zdravih, saj je usmerjen le v ohranjanje proteinov, ki so ključni za malignost celice (29).
3) Ko je dendritična celica izpostavljena N-končnemu zaviralcu Hsp90, izloča manj IL- 12, prav tako pa se zmanjša njen učinek na proliferacijo limfocitov T (30). Zaviranje Hsp90 tako deluje imunosupresivno, kar pri protirakavi terapiji ni zaželeno (19).
1.6.2. C-končni zaviralci Hsp90
Leta 2000 so odkrili, da kumarinska zaviralca bakterijske DNA-giraze novobiocin in kumermicin A1 zavirata delovanje Hsp90 z vezavo v vezavno mesto, ki ni del NTD. Pri tem ne izzoveta HSR, ki je bil glavna težava pri vseh znanih N-končnih zaviralcih. Neckers je s sodelavci odkril, da se novobiocin veže v vezavno mesto proksimalno dimerizacijski regiji na C-končni domeni in s tem tudi prepreči asociacijo Hsp90 s Hsp70, p23 in košaperoni.
CTD ima namreč še eno vezavno regijo za nukleotide, ki ima večjo afiniteto za ATP od NTD, a se ATP lahko veže, šele ko je vezavno mesto za ATP v NTD že zasedeno. Vezava alosteričnega modulatorja v C-končno vezavno mesto signifikantno spremeni konformacijo proteina, kar sproži sprostitev proteinov klientov in ločitev dimera, hkrati pa je še vedno favorizirana vezava na HSF-1, kar prepreči pojavljanje HSR (31). Novobiocinu so s testom na celični liniji raka dojke SKBr3 določili IC50 približno 700 μM, kar ni ustrezno za potencialen prehod v terapijo (32). Zato so se lotili obsežnih strukturnih modifikacij z namenom izboljšanja učinkovitosti in priprave alosteričnega modulatorja Hsp90 z večjim terapevtskim potencialom. C-končni zaviralci Hsp90 so s terapevtskega vidika zanimivi predvsem iz treh razlogov:
- S ciljanjem na alosterično vezavno mesto lahko dosežemo selektivnost zaviralca za le določene izoforme Hsp90 (13,33)
- Vpliv alosteričnega zaviranja na dinamiko proteina je večji.
- Vezava C-končnega zaviralca spremeni strukturo proteina na mestu, kjer interagira z ostalimi košaperoni, in s tem prepreči interakcijo z njimi (34).
12
Modifikacije novobiocina so izvajali na treh mestih – na benzamidni stranski verigi, osrednjem kumarinskem skeletu in sladkorju noviozi (Slika 6) (34). Težavo pri optimizaciji spojine še vedno predstavlja dejstvo, da kristalna struktura CTD Hsp90 z vezanim C-
končnim zaviralcem do danes še ni bila razrešena. Sidranje do zdaj znanih zaviralcev v predvideno mesto vezave v CTD (35) je pokazalo, da to tolerira spremembe na mestu 3 na kumarinskem skeletu, sama zamenjava skeleta pa z izjemo nekaterih alternativ (bifenilni in stilbenski) vodi v izgubo aktivnosti zaviralca. Ključne interakcije z vezavnim mestom, ki jih omogoča novobiocin, so vodikova vez z Lys615 in predvsem prileganje novioznega dela v majhen žep, v katerem pride do interakcije z Glu584 in Lys581. Zamenjava novioznega dela za različne amine je pokazala, da je za delovanje na tem mestu potreben alifatski amin. Blizu tega bazičnega centra se lahko nahaja aromatska funkcionalna skupina, aromatski amini pa niso učinkoviti. Preko amida je lahko na mesto 3 kumarinskega obroča pripet večji substituent. Z molekulskim modeliranjem na osnovi strukture in ligandov so Tomašič in sodelavci (36) podali tri ključne farmakoforne elemente, ki se ujemajo z zgoraj navedenimi značilnostmi. Potrdili so relevantnost donorja H-vezi, aromatskega obroča in bazične funkcionalne skupine v molekuli liganda na ustrezni razdalji. Prav to so bile tudi vpeljane spremembe v strukturi novobiocina skozi različne študije SAR (37). Blaggova raziskovalna skupina je že leta 2008 pokazala, da sta novioza na mestu 7 in amidna vez na mestu 3 kumarinskega skeleta novobiocina ključni za delovanje zaviralcev tega tipa (34). Dodatna zamenjava novioznega sladkorja za substituente, ki lahko tvorijo vodikove in ionske vezi, je pokazala, da imajo derivati piperidina najmočnejše antiproliferativno delovanje. Velikost substituenta, ki je z amidno vezjo povezan z mestom 3 kumarinskega ogrodja, narekuje mehanizem delovanja modulatorja Hsp90 – ali je spojina nevroprotektivna ali protitumorna (38,39). Če vsebuje substituent pet ali več C-atomov, potem prekine povezavo med Hsp90 in Aha1, kar vodi v protitumorno delovanje. Pri krajših substituentih se ta povezava ohrani, kar spodbudi odziv toplotnega šoka, ki deluje nevroprotektivno, npr. pri periferni diabetični nevropatiji (40). Od vseh substituentov se je najbolj izkazal bifenilni. Spojina KU-135 je pri zaviranju Slika 6: Novobiocin z označenimi – rdečim
kumarinskim skeletom, zelenim sladkorjem noviozo in modrim benzamidom
13
proliferacije celic T-limfoblastoidne levkemije dosegla vrednost IC50 416 nM, na celični liniji raka dojke SkBr3 pa 14 μM (Slika 7) (34).
Slika 7: C-končni zaviralci Hsp90 KU-135, KU-32 in KU-174, razviti na osnovi modifikacij novobiocina.
Izkazalo se je, da je za aktivnost nujna ustrezna razdalja med piperidinskim in bifenilnim substituentom. Največja antiproliferativno delovanje in zaviranje Hsp90 je pri zaviralcih, pri katerih je ta razdalja med 7,7 in 12,1 Å in kot med njima približno 180° (41–44).
1.6.2.1 Alkilamino bifenilni C-končni zaviralci
Spojine, pri katerih so kumarinski osnovni skelet zamenjali z bifenilom, so v testih antiproliferativnega delovanja imele vrednosti IC50 med 0,5 in 5 μM (testirano na celičnih linijah SKBr3 in MCF-7). Alkilamino substituenti na mestu 3 obroča B (Slika 8) so izboljšali antiproliferativno delovanje napram nesubstituiranim obročem, če substituent ni vseboval več kot treh C-atomov. Še močneje so delovali tisti analogi, ki so imeli dodatno substituirano tudi mesto 3 na obroču A. Izkazalo se je, da je za aktivnost nujna ustrezna razdalja med piperidinskim in bifenilnim substituentom.
14
Slika 8: Bifenilni C-končni zaviralec, spojina A (levo) in njeno sidranje v alosterično vezavno mesto (desno). Vidne so ključne interakcije v malem žepu, predvsem z Glu584 in Lys615. Prirejeno po (35).
1.6.2.2. Stilbenski C-končni zaviralci
Blaggova raziskovalna skupina je med raziskavami o ustrezni razdalji med piperidinskim in bifenilnim substituentom sintetizirala stilbenski C-končni zaviralec B (Slika 9 levo) (45–
47). To spojino so nato skušali optimizirati z uvedbo štirih sklopov sprememb:
A) Restrikcija rotacije v stilbenskem jedru z zamenjavo le-tega za 6-fenil-7,8- dihidronaftalenski skelet je pomenila izgubo učinka, kar kaže na to, da dodatek dveh ogljikovih atomov v središče stilbenske funkcionalne skupine že pomeni preveliko sterično oviro za dobro prileganje v vezavno mesto Hsp90 oz. da razdalja med aminom in aromatom ni prava.
B) Dodatek spojine s šibkim pozitivnim mezomernim učinkom (Cl) na o- ali m- mesto na amidni benzenov obroč v stilbenu je zmanjšal aktivnost spojine.
C) Uvedba nasičenih sistemov med oba benzena v stilbenu je na celični liniji MCF-7 dala podobne rezultate kot so bili tisti za spojino B.
D) Zamenjava dimetoksi bifenilne skupine za triazol je pri testiranju antiproliferativne aktivnosti na celični liniji MCF-7 znižala IC50 vrednost z 0,82 μM na 0,09 μM. Podobno velja za zamenjavo N-metilpiperidina za 2-(dimetilamino)etilno skupino ob sočasni uvedbi triazola – v tem primeru se je IC50 znižala iz 0,82 μM na 0,23 μM (42).
15
Slika 9: Stilbenska C-terminalna zaviralca – levo spojina B, desno pa njen analog z izboljšano antiproliferativno aktivnostjo. Z rdečo sta označeni ključni spremembi (uvedba 2-(dimetilamino)etilne in triazolne skupine. Prirejeno po (42).
1.6.2.3. Benzotiazolni C-končni zaviralci
Benzotiazolni osnovni skelet se je sprva pogosto uporabljal kot osnovni skelet za zaviralce DNA-giraze B za zdravljenje bakterijskih infekcij kot je okužba s Staphylococcus aureus (48). DNA-giraza B, histidin-kinaza, proteini MutL proteini in Hsp90 imajo vsi enako strukturo ATP-vezavnega mesta – t. i. Bergeratovo zvitje (12), ki ga sestavljajo štiri α- vijačnice in ena β-ravnina. V zankah, ki povezujejo te elemente, pa so AK ostanki, ki se vežejo z ligandom. Ta povezava med DNA-girazo B in Hsp90 je vodila v uspešno načrtovanje in vrednotenje benzotiazolnih zaviralcev Hsp90 sprva kot antivirotikov proti virusoma influence A in B ter nato še kot protirakavih spojin (44,49,50). Načrtovanje benzotiazolnih zaviralcev Hsp90 je sledilo vsem že znanim ugotovitvam o ključnih strukturnih elementih potrebnih za vezavo v Hsp90 CTD. Zato smo se pri magistrskem delu odločili za optimizacijo benzotiazolom analognih zaviralcev Hsp90 s 4,5,6,7- tetrahidrobenzotiazolnim osnovnim skeletom.
16
2. Namen dela
Pri eksperimentalnem delu magistrske naloge bomo sintetizirali in ovrednotili nove alosterične modulatorje C-končne domene Hsp90. Izhajali bomo iz na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo Univerze v Ljubljani že sintetizirane in ovrednotene spojine TMM-7b (Slika 10) z osnovnim skeletom (S)-4,5,6,7- tetrahidrobenzo[d]tiazol-2,6-diaminom. Spojina je na testu antiproliferativnega delovanja izkazala vrednost IC50 24 μM (celična linija MCF-7), zato je primerna za nadaljnjo optimizacijo. Na ta način bomo dodatno razjasnili odnos med strukturo ligandov s tem osnovnim skeletom in njihovim antiproliferativnim delovanjem. Substituente na tetrahidrobenzotiazol bomo uvajali na mestih 2 in 6.
Slika 10: Spojina TMM-7b, ki bo osnova za raziskave odnosa med strukturo ligandov s 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazolnim skeletom in njihovim delovanjem na C-končno domeno Hsp90.
Na podlagi sidranja znanih zaviralcev v predvidena mesta vezave na CTD Hsp90 in na osnovi raziskave odnosa med strukturo in delovanjem (SAR) alosteričnih modulatorjev Hsp90, ki je bila izvedena na Fakulteti za farmacijo z metodami molekulskega modeliranja (36) je za aktivnost ključno, da na osnovni skelet uvedemo aromatsko skupino na eni in bazični center na drugi strani molekule. Na mestu 2 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazolnega obroča bomo tako preko amidne vezi in distančnika uvedli bazično aminsko skupino, ki bo omogočala interakcijo z Glu489B v vezavnem mestu. Na mesto 6 pa bomo uvedli različne aromatske in alifatske substituente, ki bodo omogočali tvorbo hidrofobnih interakcij z odprtim delom apo žepa, predvsem z Ile605B, Leu664A in Leu670B.
Tako bomo za raziskavo odnosa med strukturo in delovanjem sintetizirali knjižnici spojin A in B. Knjižnica A bo vsebovala derivate 3,4-diklorobenzamida na mestu 6 4,5,6,7- tetrahidrobenzotiazolnega obroča, spreminjali pa bomo substituente na mestu 2 (Slika 11).
Pri knjižnici B bomo na mestu 2 uvedli β-alanin, spremembe pa bomo izvajali na mestu 6 (Slika 12). S prvim sklopom spojin A bomo iskali optimalno velikost in prostorsko
17
usmerjenost substituenta z amino skupino za prileganje v vezavno mesto. Na takšen način želimo določiti optimalno razdaljo med 4,5,6,7-tetrahidrobenzotiazolom in bazičnim centrom. Usmerjenost bazičnega centra v vezavnem mestu bomo proučevali z uporabo enantiomerov (R)-1-Boc-piperidin-3-karboksilne kisline in (S)-1-Boc-piperidin-3- karboksilne kisline. Ob ohranjeni S-konfiguraciji na kiralnem centru izhodnega 4,5,6,7- tetrahidrobenzotiazola bomo na takšen način pripravili diastereomerni končni spojini (S,S) in (S,R). Pri raziskovanju optimalne velikosti substituenta z aminom bomo z uvajanjem aromatskih nenaravnih aminokislin proučevali možnost dodatnih interakcij aromata z aminokislinskimi ostanki v delu vezavnega mesta, kamor se veže aminska skupina.
Slika 11: Prikaz vseh spojin knjižnice A - osnovno ogrodje je (S)-N-(2-amino-4,5,6,7- tetrahidrobenzo[d]tiazol-6-il)-3,4-diklorobenzamid, na katerega bomo pripeli osem različnih substituentov z alifatskim aminom. Po vrsti z leve proti desni si sledijo 4-aminobutanojska kislina, 3-aminocikloheksanojska kislina, (R)-3-amino-3-fenilpropanojska kislina, 3- aminociklopentanojska kislina, 2-amino-2-feniletanojska kislina, (R)-2-aminobutanojska kislina, (S)-piperidin-3-karboksilna kislina in (R)-piperidin-3-karboksilna kislina.
S knjižnico B želimo preveriti predvsem vlogo aromatskega obroča, kar bomo storili z uvedbo cikloheksana na mesto 6 in ga primerjali s spojino, ki ima na tem mestu uveden nesubstituiran benzenov obroč. Poleg tega nas zanima tudi vpliv uvedbe dodatnega donorja vodikovih vezi znotraj aromatskega sistema na delovanje spojin. To bomo preverili z uvedbo pirolnega obroča. Vrednotenje končnih spojin bo potekalo na človeški celični liniji raka dojke MCF-7 s pomočjo metode MTS.
18
Slika 12:Prikaz vseh spojin knjižnice B – osnovno ogrodje je 3-amino-N-(6-amino-4,5,6,7- tetrahidrobenzo[d]tiazol-2-il)propanamid, na katerega bomo pripeli tri različne substituente na mestu 6 tetrahidrobenzotiazola. Od leve proti desni si sledijo benzojska kislina, cikloheksanojska kislina in 1-H-pirol-2-karboksilna kislina.
19
3. Materiali in metode 3.1. Reagenti in topila
Pri sintezi spojin smo uporabljali reagente in topila proizvajalcev Merck, TCI, Sigma- Aldrich, Acros Organics, Enamine in Fluka.
3.2. Kromatografske metode
3.2.1. Tankoplastna kromatografija (TLC)
Za sprotno spremljanje poteka kemijskih reakcij smo uporabljali kromatograme TLC, na katerih smo opazovali ločbo reaktantov in produktov na osnovi njihove polarnosti. Nanašali smo jih na ploščice proizvajalca Merck (TLC Silica Gel F254) z 0,2 mm debelo plastjo silikagela na aluminijastem nosilcu. Kot mobilno fazo smo uporabljali mešanice diklorometana in metanola v različnih razmerjih. Lise analitov smo detektirali z UV- svetlobo (λ = 254 nm) in jih nato oroševali z ninhidrinom.
3.2.2. Kolonska adsorpcijska kromatografija
Po koncu sinteznega postopka C smo za čiščenje produktov uporabljali steklene kolone različnih velikosti. Pri tem smo količino uporabljenega silikagela (Merck, Silica Gel 60 F254; velikost delcev: 0,040-0,063 mm) prilagajali količini vzorca po ekstrakciji. Kot mobilno fazo smo uporabili mešanico diklorometana in metanola v različnih razmerjih.
Elucijo spojin smo pospeševali z uporabo nadtlaka.
3.2.3. Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)
Analize HPLC končnih in vmesnih produktov smo izvedli na Fakulteti za Farmacijo na instrumentu 260 Infinity II LC (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, ZDA), ki je bil sklopljen z detektorjem UV-VIS. Uporabljali smo kolono Waters XBridge C18 (3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm) in mobilno fazo z mešanico acetonitrila (topilo A) in 0,1% mravljične kisline v 1% acetonitrilu v visoko prečiščeni vodi (topilo B). Gradient topila A je bil: 0-1,0 min, 25%; 1,0-6,0 min, 25%-98%; 6,0-6,5 min, 98%; 6,5-7,5 min, 98%-25%; 7,5-10,5 min, 25%.
Ultračisto vodo smo pridobili s sistemom Millipore Advantage A10. Kromatografijo smo izvajali pri pretoku mobilne faze 1,5 mL/min. Injicirali smo 10 μL raztopine vzorca.
Detekcija je potekala pri 254 nm.
20
3.3. Spektroskopske metode
3.3.1. Jedrska magnetna resonanca 1H- in 13C-NMR
Identiteto vseh produktov smo potrjevali s snemanjem in vrednotenjem spektrov 1H-NMR, za končne spojine pa smo posneli tudi spektre 13C-NMR. Spektri so bili posneti na Fakulteti za farmacijo z NMR-spektrometrom Bruker Advance DPX400 v devteriranih topilih CDCl3
in DMSO-d6 s tetrametilsilanom kot internim standardom.
3.3.2. Masna spektrometrija / visoke ločljivosti (MS / HRMS)
Masne spektre smo posneli na Fakulteti za farmacijo s spektrometrom ADVION expression CMCL (Advion Inc., Ithaca, ZDA) z metodo razprševanja v električnem polju (ESI). Masni spektri visoke ločljivosti so bili prav tako posneti na Fakulteti za farmacijo s spektrometrom Exactive Plus Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA).
3.4. Biološka testiranja
Antiproliferativno delovanje končnih spojin smo določevali z ugotavljanjem deleža viabilih celic s testom MTS. Tu se v gojišče s celicami doda reagenta MTS / PMS in potencialni zaviralc Hsp90. Metabolno aktivne celice reducirajo reagent PMS, ki nato izstopi iz celic in v gojišču reducira tetrazolno spojino MTS v derivat formazana, ki se ga lahko kvantificira z meritvijo absorbance pri λ = 490-500 nm. Če celice odmrejo zaradi citotoksičnega delovanja spojin, obarvan derivat ne nastane. Z meritvijo koncentracije formazana lahko tako ocenimo delež viabilnih celic (Shema 1). Test je izvedla Živa Zajec, mag. farm. na človeški celični liniji raka dojke MCF-7. Rezultati so podani z vrednostmi IC50, ki pomenijo koncentracijo zaviralca, ki zmanjša delež viabilnih celic na polovico.
21
Shema 1: Redukcija ob prisotnosti metabolno aktivnih celic.
3.5. Računalniška programska oprema
3.5.1. Chemdraw 18.1
S programom podjetja CambridgeSoft – ChemDraw 18.1 smo risali strukturne formule spojin, reakcijske sheme, mehanizme reakcij in spojine poimenovali po IUPAC nomenklaturi.
3.5.2. MestReC in MestReNova
Programa MestReC in MestReNova proizvajalca Mestrelab Research smo uporabili pri obdelavi in interpretaciji spektrov NMR.
3.5.3. Programski paket OpenEye
Pri delu smo uporabljali računalnik s štirijedrnim procesorjem Intel® Core™, s 16 GB fizičnega pomnilnika (RAM), 128 GB SSD in 1 TB velikim vrtljivim trdim diskom. Pri molekulskem sidranju ligandov smo si najprej s pomočjo ChemDraw18.1 pripravili liganda za sidranje, ki smo ju izbrali na podlagi rezultatov biološkega testiranja končnih spojin. Nato smo zapis struktur spojin shranili v formatu SMILES in ga s programom OMEGA pretvorili v knjižnico konformerov posamezne spojine, ki smo jo potem uporabili za delo s programom za sidranje ligandov. Iz proteinske podatkovne baze (www.rcsb.org) smo prenesli zapis strukture Hsp90. S programom MAKE RECEPTOR 3.3.0.3 smo nato pripravili alosterično vezavno mesto za sidranje spojin. Uporabili smo privzete nastavitve
22
za sidranje in pripravo vezavnega mesta. S kontrolno ploščo programskega paketa OpenEye smo nato sidrali oba liganda v pripravljeno vezavno mesto in dobljene rezultate interpretirali ter vizualizirali s programom VIDA 4.4.0.4. Na Sliki 13 sta prikazani vezavni konformaciji, ki ju je program na podlagi cenilne funkcije Chemgauss4 ocenil kot najbolj ugodni.
23
4. Eksperimentalni del 4.1. Reakcijske sheme
Na Shemah 2 in 3 je prikazana sinteza ligandov iz knjižnice A. V prvi stopnji smo z uvajanjem Boc-anhidrida v zmesi 1,4-dioksana, vode in 1 M natrijevega hidroksida zaščitili aminsko skupino na nenaravnih aminokislinah (spojine 1a-h) in dobili produkte 2a-h.
Izjema je bila spojina 2b, ki je bila že sintetizirana. Nato smo izvedli amidno sklopitev na (S)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol-2,6-diamin (4) s sklopitvenim reagentom 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)karbodiimidom (EDC) ob prisotnosti hidroksibenzotriazola (HOBt) in N,N-diizopropilamida (DIPEA) v N,N-dimetilformamidu (DMF) pripeli 3,4- diklorobenzojsko kislino (3a). V naslednjem koraku smo s sklapljanjem spojine 5 in zaščitenih aminokislin 2a-h dobili produkte 6a-h. Tem smo nato v brezvodnem 1,4-dioksanu dodali prebitek 4 M klorovodikove kisline v 1,4-dioksanu, s katero smo odstranili zaščito Boc in dobili osem končnih produktov v obliki soli na aminu (spojine 7a-h).
Shema 2: Sinteza ligandov iz knjižnice A – 1. stopnja. Reagenti in pogoji: (a) Boc, H2O/1,4- dioksan/1 M NaOH, sobna T, 3 h – 18 h.
24
Shema 3: Sinteza ligandov iz knjižnice A. Reagenti in pogoji: (b) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, 3,4-diklorobenzojska kislina, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18-20 h; (c) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18h – 20 h; (d) 4 M HCl v 1,4-dioksanu, 1,4-dioksan, sobna T, 24 h.
25
Shema 4 prikazuje sintezo ligandov iz knjižnice B. Prva stopnja je analogna tisti iz knjižnice A, le da smo na (S)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol-2,6-diamin (4) namesto 3,4- dikolrobenzojske kisline (3a) uvedli benzojsko kislino (8a), 1H-pirol-2-karboksilno kislino (8b) in cikloheksanojsko kislino (8c), da smo dobili spojine 9a-c. Zatem smo izvedli sklopitveno reakcijo z vnaprej pripravljenim Boc-zaščitenim β-alaninom, s katerim smo sintetizirali 2,6-diamide 11a-c. V zadnji stopnji smo z acidolizo, pri kateri smo uporabili 4 M klorovodikovo kislino v 1,4-dioksanu, odstranili zaščito Boc in tako pripravili spojine 12a-c.
Shema 4: Sinteza ligandov 12a-c iz knjižnice B. Reagenti in pogoji: (b) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18-20 h; (c) EDC, HOBt, DIPEA, DMF, ledena kopel prvih 15 min, nato sobna T, 18h – 20 h; (d) 4 M HCl v 1,4-dioksanu, 1,4-dioksan, sobna T, 24 h.
26
4.2. Sintezni in analitski postopki:
Splošni postopek A. Sinteza spojin 2a-h: Ustrezno aminokislino (1 ekv.) smo raztopili v zmesi voda/1 M NaOH/1,4-dioksan = 5 mL/5 mL/5 mL na ledeni kopeli. Raztopini smo dodali Boc-anhidrid (1,2 ekv.), ki smo ga predhodno raztopili v 5 mL dioksana. Reakcijo smo nato spremljali s TLC. Ko je potekla do konca, smo uparili 1,4-dioksan, zaostanek dopolnili z vodo do 20 mL in v liju ločniku ekstrahirali z 2 × 20 mL dietilnega etra. Vodno fazo smo nato nakisali z 2 M klorovodikovo kislino do pH približno 2 in ekstrahirali s 3 × 20 mL etil acetata. Združene organske faze smo še sušili nad Na2SO4, filtrirali in topilo uparili pod znižanim tlakom.
(R)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)butanojska kislina (2a): Reakcijo smo izvedli po splošnem postopku A iz (R)-2-amino butanojske kisline (1a) (500 mg, 4,85 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (1,27 g, 5,82 mmol, 1,2 ekv.). Izkoristek reakcije: 70%; prozorna oljnata snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1) = 0,17; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NH-Boc), 4,33 – 4,18 (m, 1H, CH-NH-Boc), 1,92 (m, 1H, CH2-HA), 1,80 – 1,68 (m, 1H, CH2-HB), 1,45 (s, 9H, C(CH3)3), 0,99 (t, J = 7,5 Hz, 3H,CH3,) ppm; Signal za COOH ni viden. MS (ESI-) C9H17NO4S m/z: 202,0 [M-H]-.
3-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-fenilpropanojska kislina (2c): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku A iz 3-amino-3-fenil propanojske kisline (1c) (500 mg, 3,03 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (793 mg, 3,63 mmol, 1,2 ekv.). Izkoristek reakcije:
74%; bela trdna snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1) = 0,23; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,21 (s, 1H, CH2-COOH), 7,45 (d, J = 8,8 Hz, 1H, NH-Boc), 7,30 (m, 4H, 4 × Ar-H), 7,22 (dt, J1 = 8,6 Hz, J2 = 4,0 Hz, 1H, Ar-H), 4,89 (q, J = 8,2 Hz, 1H, CH-NH-Boc), 2,62 (m, 2H, CH2-COOH), 1,35 (s, 9H, C(CH3)3) ppm; MS (ESI+) C14H20NO4 m/z: 264,6 [M-H]+. 3-((terc-butoksikarbonil)amino)cikloheksan-1-karboksilna kislina (2d): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku A iz 3-aminocikloheksan-1-karboksilne kisline (1d) (500 mg, 3,49 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (915 mg, 4,19 mmol, 1,2 ekv.). Izkoristek reakcije:
73%; bela trdna snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1) = 0,24; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,09 (s, 1H, CH-COOH), 6,78 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH-Boc), 3,57 – 3,52 (m, 0,5H, CH-NH- Boc (R,S)), 3,24 – 3,19 (m, 0,5H, CH-NH-Boc (R,S)), 2,65 – 2,57 (m, 0,6H, CH-COOH (R,S)), 2,23 (tt, J1 = 12,22 Hz, J2 = 3,54 Hz, 0,4H, CH-COOH (R,S)), 1,83 – 1,67 (m, 2H,
27
CH2), 1,64 – 1,46 (m, 3H, CH2, CH2-HA), 1,38 (d, J = 1,6 Hz, 9H, C(CH3)3), 1,33 – 0,98 (m, 3H, CH2 in CH2-HB) ppm; MS (ESI-) C12H21NO4S m/z: 242,1 [M-H]-.
3-((terc-butoksikarbonil)amino)ciklopentan-1-karboksilna kislina (2e): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku A iz 3-aminociklopentan-1-karboksilne kisline (1e) (500 mg, 3,87 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (1,01 g, 4,64 mmol, 1,2 ekv.). Izkoristek reakcije:
35%; bela trdna snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1) = 0,26; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 12,06 (s, 1H, CH-COOH), 6,84 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH-Boc), 3,80 – 3,68 (m, 1H, CH), 2,71 – 2,60 (m, 1H, CH), 2,06 (dt, J1 = 12,6 Hz, J2 = 7,5 Hz, 1H, CH2-HA), 1,83 – 1,71 (m, 3H, CH2 in CH2-HB), 1,54 (dt, J1 = 12,6 Hz, J2 = 9,3 Hz, 1H, CH2-HC), 1,48 – 1,40 (m, 1H, CH2- HD), 1,38 (s, 9H, C(CH3)3) ppm; MS (ESI+) C11H20NO4 m/z: 228,1 [M-H]+.
(R)-1-(terc-butoksikarbonil) piperidin-3-karboksilna kislina (2f): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku A iz (R)-piperidin-3-karboksilne kisline (1f) (500 mg, 3,87 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (1,01 g, 4,64 mmol, 1,2 ekv.). Pri izolaciji je del produkta ostal v etru, zato smo ga dodatno sprali z 2 × 25 mL 1 M NaOH, nakisali združeni vodni fazi do pH = 2 in znova ekstrahirali s 3 × 20 mL EtOAc. Obe frakciji EtOAc smo potem združili in uparili. Izkoristek reakcije: 62%; bela trdna snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1)
= 0,30; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,38 (s, 1H, CH-COOH), 3,91 (s, 1H, CH- COOH), 3,75 – 3,64 (m, 1H, CH2-HA), 2,83 (ddd, J1 = 13,5 Hz, J2 = 10,8 Hz, J3 = 3,1 Hz, 1H, CH2-HB), 2,33 – 2,28 (m, 1H, CH2-HC), 1,95 – 1,85 (m, 1H, CH2-HD), 1,61 – 1,58 (m, 1H, CH2-HE), 1,55 – 1,47 (m, 1H, CH2-HF), 1,39 – 1,28 (m, 10H, C(CH3)3 in CH2-HG) ppm;
MS (ESI+) C11H20NO4 m/z: 228,1 [M-H]+.
(S)-1-(terc-butoksikarbonil) piperidin-3-karboksilna kislina (2g): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku A iz (S)-piperidin-3-karboksilne kisline (1g) (500 mg, 3,87 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (1,01 g, 4,64 mmol, 1,2 ekv.). Pri izolaciji je del produkta ostal v etru, zato smo ga dodatno sprali z 2 × 25 mL 1 M NaOH, nakisali združeni vodni fazi do pH = 2 in znova ekstrahirali s 3 × 20 mL EtOAc. Obe frakciji EtOAc smo potem združili in uparili. Izkoristek reakcije: 41%; bela trdna snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1)
= 0,31; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,37 (s, 1H, CH-COOH), 3,89 (s, 1H, CH- COOH), 3,73 – 3,64 (m, 1H, CH2-HA), 2,82 (ddd, J1 = 13,6 Hz, J2 = 10,8 Hz, J3 = 3,1 Hz, 1H, CH2-HB), 2,33 – 2,26 (m, 1H, CH2-HC), 1,94 – 1,83 (m, 1H, CH2-HD), 1,64 – 1,59 (m,
28
1H, CH2-HE), 1,56 – 1,46 (m, 1H, CH2-HF), 1,42 – 1,27 (m, 10H, C(CH3)3 in CH2-HG) ppm;
MS (ESI+) C11H20NO4 m/z: 228,1 [M-H]+.
4-((terc-butoksikarbonil)amino)butanojska kislina (2h): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku A iz 4-aminobutanojske kisline (1h) (500 mg, 4,85 mmol, 1 ekv.) in Boc-anhidrida (1,27 g, 5,82 mmol, 1,2 ekv.). Izkoristek reakcije: 66%; bela trdna snov; Rf
(DKM:MeOH = 9:1) = 0,23; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,68 (s, 1H, NH-Boc), 3,26 – 3,11 (m, 2H, CH2-NH-Boc), 2,40 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2-COOH), 1,83 (p, J = 7,0 Hz, 2H, NH-CH2-CH2), 1,44 (s, 9H, C(CH3)3) ppm; Signal za COOH ni viden. MS (ESI-) C9H16NO4
m/z: 202,1[M-H]-.
Splošni postopek B. Sinteza spojin 5, 9a-c: Reakcijo sklopitve do amidne vezi smo izvajali v argonovi atmosferi. Kislino (1 ekv.) smo raztopili v 10 mL DMF in na ledeni kopeli dodali EDC (1,2 ekv.). Dodali smo še HOBt (1,3 ekv.) in NMM (2 ekv.). Po približno 20 minutah smo v bučko dodali še (S)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol-2,6-diamin (4) (1 ekv.) in jo odstavili z ledene kopeli. Reakcijo smo pustili potekati čez noč v argonovi atmosferi in potek spremljali z LC-MS in TLC. Topilo smo uparili pod znižanim tlakom, zaostanek raztopili v približno 50 mL etil acetata in ekstrahirali z 2 × 25 mL nasičene raztopine natrijevega hidrogenkarbonata, 2 × 25 mL 1% raztopine citronske kisline in 25 mL nasičene raztopine natrijevega klorida. Organsko fazo smo še sušili nad Na2SO4, filtriraliin topilo uparili pod znižanim tlakom.
(S)-N-(2-amino-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol-6-il)-3,4-diklorobenzamid (5): Spojino smo sintetizirali po splošnem postopku B iz 3,4-diklorobenzojske kisline (3a) (3,39g, 17,8 mmol, 1 ekv.) in (S)-4,5,6,7-tetrahidrobenzo[d]tiazol-2,6-diamina (4) (3,00 g, 17,8 mmol, 1ekv.). Pri ekstrakciji se je tvorila oborina, ki je bila 85% čista, zato smo ekstrakcijo ponovili s 70 mL etilacetata in natrijevega hidrogenkarbonata ter tako dobili 93% čist produkt, s katerim smo nadaljevali sintezo, saj je v naslednji stopnji sledilo čiščenje s kolonsko adsorpcijsko kromatografijo. Izkoristek reakcije: 53%; bela trdna snov; Rf (DKM:MeOH = 9:1) = 0,27; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,64 (d, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-CO-NH-Btz), 8,10 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,84 (dd, J1 = 8,4 Hz, J2 = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,76 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar-H), 6,68 (s, 2H, Btz-NH2) 4,24 – 4,10 (m, 1H, Ar-CO-NH-CH), 2,81 (dd, J1 = 14,9 Hz, J2 = 5,4 Hz, 1H, CH2-HA), 2,00 – 1,90 (m, 1H, CH2-HB), 1,85 – 1,73 (m, 1H, CH2-
