MAGISTRSKO DELO

U

L

F

MAGISTRSKO DELO

David Ciriković

Ljubljana, 2021

U

L

F

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA

Modeliranje vezave antiretrovirusnih spojin s HIV-1 integrazo in reverzno transkriptazo

MAGISTRSKO DELO

David Ciriković

M

: izr. prof. dr. Miha Lukšič

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisani David Ciriković sem avtor magistrskega dela z naslovom Modeliranje vezave antiretrovirusnih spojin s HIV-1 integrazo in reverzno transkriptazo.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom izr. prof.

dr. Mihe Lukšiča.

 sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

 je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 28.09.2021 Podpis avtorja:

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemija. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Ljubljani.

Senat UL FKKT je za mentorja imenoval izr. prof. dr. Miho Lukšiča.

Recenzenti: predsednik komisije prof. dr. Iztok Turel in član komisije doc. dr. Črtomir Podlipnik

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije: prof. dr. Iztok Turel

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član: izr. prof. dr. Miha Lukšič

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član: doc. dr. Črtomir Podlipnik

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Iz srca se zahvaljujem mentorju izr. prof. dr. Mihu Lukšiču za vso predano znanje in nasvete med pisanjem magistrskega dela in na splošno tekom celotnega študija kemije.

Hvala tudi članu komisije doc. dr. Črtomirju Podlipniku in predsedniku komisije prof. dr.

Iztoku Turelu za temeljit pregled naloge in korektne komentarje.

Še posebej bi se rad zahvalil mami Suadi in bratu Benjaminu ob vseh letih podpore in spodbujanja v času študija.

Zadnji del zahvale pa pripada prijateljem in širši družini za vsa sproščena druženja skozi (na trenutke) turbulentno študijsko obdobje.

Modeliranje vezave antiretrovirusnih spojin s HIV-1 integrazo in reverzno transkriptazo

Povzetek:

Integraza in reverzna transkriptaza sta encima virusa HIV-1 in hkrati glavni tarči za proučevanje inhibicije razmoževanja virusa v gostiteljski celici. S pomočjo računalniških simulacij lahko predvidimo potencialne zdravilne učinkovine, ki bodo preprečile delovanje integraze in reverzne transkriptaze. V magistrskem delu sem se osredotočil na proučevanje vezave različnih inhibitorjev integraze in reverzne transkriptaze s pomočjo molekulskega sidranja in simulacij dinamike molekul. Pri molekulskem sidranju sem dobil informacijo o vezavnih mestih liganda s proteinom ter vezavnih energijah različnih antiretrovirusnih spojin. Med proučevanimi zaviralci integraze je imel najvišjo afiniteto vezave biktegravir. Preveril sem tudi, kakšen je vpliv prisotnosti magnezijevih ionov in DNK verige na jakost vezave inhibitorja v vezavnem mestu encima. Računalniško pridobljene vrednosti disociacijske konstante sem primerjal z eksperimentalno določenimi vrednostmi koncentracije polovičnega maksimalnega učinka inhibitorja, EC50. Izkazalo se je, da sta ti dve količini za izbrani set ligandov linearno korelirani.

Primerjal sem tudi vezavne energije različnih modifikacij biktegravirja, kjer je prvotna struktura ohranila najvišjo vrednost. Za primer biktegravirja (prvotni kompleks, kompleks brez magnezijevih ionov ter kompleks brez magnezijevih ionov in DNK) sem s pomočjo molekulske dinamike spremljal spremembo kontaktov in vrste interakcij med 50 ns dolgo simulacijo v eksplicitnem topilu. Pri tem sem spremljal spreminjanje položaja liganda v vezavnem mestu ter konformacijske spremembe kompleksa in proteina ob vezavi liganda. Enake parametre sem analiziral tudi v primeru delavirdina in rilpivirina, ki sta nenukleozidna inhibitorja reverzne transkriptaze. Rezultate obeh računalniških metod sem primerjal s podatki iz drugih študij in dobil primerljive rezultate glede kontaktov liganda z aminokislinskimi ostanki proteina ter prevladujočem tipu interakcij med njima.

Ključne besede: molekulsko sidranje, molekulska dinamika, integraza, reverzna transkriptaza, HIV-1

Modeling of antiretroviral compound binding by HIV-1 integrase and reverse transcriptase

Abstract:

Integrase and reverse transcriptase are enzymes of the HIV-1 virus and also main targets for studying the inhibition of virus replication in the host cell. With the help of computer simulations, we can predict potential active ingredients. In my master 's thesis, I focused on the study of the binding of integrase and reverse transcriptase inhibitors using computer simulations of molecular docking and molecular dynamics. In molecular docking simulation, I obtained information of the binding sites of the ligand with the protein and the binding energies of various antiretroviral compounds, where bictegravir had the highest binding affinity. I also examined the effect of magnesium ions and DNA strand on the binding strength of the inhibitor at the binding site. The computer - generated dissociation constant values were compared with the experimentally determined values of the concentration of half the maximum effect of the EC50 inhibitor.

I also compared the binding energies of different modifications of bictegravir, where the original structure retained the highest value. For the case of bictegravir (original complex, magnesium ion-free complex and magnesium ion-free complex and without DNA), I monitored the change in contacts and type of interactions during the 50 ns long simulation and the change in ligand position in the binding site, conformational changes of the complex and protein upon binding ligand. The same parameters were also analyzed in the case of delavirdine and rilpivirine, which are non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. I compared the results of both computer methods with data from other studies and obtained comparable results regarding ligand contacts with amino acid protein residues and the predominant type of interactions between them.

Keywords: molecular docking, molecular dynamics, integrase, reverse transcriptase, HIV-1

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 HIV-1 integraza ... 3

1.1.1 Zaviralci integraze HIV-1 ... 5

1.1.2 Mehanizem inhibicije HIV-1 integraze ... 7

1.2 HIV-1 proteaza ... 9

1.2.1 Zaviralci proteaze HIV-1 ... 9

1.2.2 Mehanizem inhibicije HIV-1 proteaze ... 10

1.3 HIV-1 reverzna transkriptaza ... 11

1.3.1 Zaviralci reverzne tranksriptaze HIV-1 ... 12

1.3.2 Mehanizem inhibicije HIV-1 reverzne transkriptaze z NRTI... 15

1.3.3 Mehanizem inhibicije HIV-1 reverzne transkriptaze z NNRTI ... 15

1.4 Računalniške metode ... 15

1.4.1 Molekulsko sidranje ... 16

1.4.2 Dinamika molekul ... 18

2 Namen dela ... 19

3 Eksperimentalni del ... 21

3.1 Molekulsko sidranje ... 21

3.2 Molekulska dinamika ... 22

3.3 Knjižnica zaviralcev integraze HIV-1 ... 23

3.4 Knjižnica zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 (NNRTI) ... 24

3.5 Knjižnica modificiranih struktur biktegravirja ... 26

4 Rezultati in razprava ... 31

4.1 Molekulsko sidranje zaviralcev integraze HIV-1 ... 31

4.1.1 Primerjava vpliva DNK in magnezijevih ionov na interakcijo biktegravirja z integrazo HIV-1 ... 33

4.1.2 Korelacija med izračunano disociacijsko konstanto, Kd, in vrednostjo EC50 pri zaviralcih integraze HIV-1 ... 34

4.1.3 Vpliv kemijske modifikacije biktegravirja na vezavno energijo ... 35

4.2 Molekulsko sidranje nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 ... 36

4.3 Molekulska dinamika ... 39

4.3.1 Kompleks integraza-biktegravir ... 40

4.3.2 Kompleks reverzna transkriptaza–delavirdin oz. rilpivirin ... 49

5 Zaključek ... 57

6 Literatura ... 59

Kazalo slik

Slika 1: Shematski prikaz reproduktivnega cikla virusa HIV-1. ... 4

Slika 2: Struktura integraze virusa HIV-1 (PDB ID: 5U1C_1). ... 5

Slika 3: INSTI spojine, ki so trenutno odobrene s strani FDA. ... 6

Slika 4: Predlagani mehanizem integracije virusne DNK (modra) v gostiteljsko DNK (bordo). ... 8

Slika 5: Struktura proteaze virusa HIV-1 (PDB ID: 1HPV). ... 9

Slika 6: Strukture devetih s strani FDA odobrenih zaviralcev proteaze... 10

Slika 7: Predlagani mehanizem katalitske aktivnosti HIV-1 proteaze. ... 11

Slika 8: Struktura reverzne transkriptaze virusa HIV-1 (PDB ID: 1T05). ... 12

Slika 9: Strukture osmih s strani FDA odobrenih nukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze (NRTI) virusa HIV-1. ... 13

Slika 10: Strukture petih s strani FDA odobrenih nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze (NNRTI) virusa HIV-1. ... 14

Slika 11: Prikaz delovanja inhibitorja zidovudina na reverzno transkriptazo. ... 15

Slika 12: Primerjava vezavnih energij zaviralcev integraze HIV-1 (tabela 5), določena s pomočjo tarčnega sidranja. ... 32

Slika 13: Vpliv magnezijevih ionov in/ali DNK na vezavno energijo biktegravirja z integrazo HIV-1 (slepo in tarčno sidranje). ... 34

Slika 14: Odvisnost disociacijske konstante Kd od vrednosti EC50 za izbrane zaviralce integraze HIV-1. ... 35

Slika 15: Vezavne energije biktegravirja (B0) in njegovih analogov B1 – B15 pri tarčnem molekulskem sidranju (PDB ID tarče: 6PUW). ... 36

Slika 16: Primerjava vezavnih energij nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 (tabela 7), določena s pomočjo tarčnega sidranja. ... 37

Slika 17: Odvisnost disociacijske konstante Kd od vrednosti EC50 za izbrane zaviralce integraze HIV-1. ... 38

Slika 18: Začetni položaj liganda v kompleksu integraza-biktegravir (PDB ID: 6PUW). ... 40

Slika 19: Kontakti liganda biktegravirja z aminokislinskimi ostanki proteina (integraze HIV-1) v odvisnosti od dolžine simulacije pri 298 K in 1 bar. ... 41

Slika 20: Enako kot na sliki 19, le da za sistem brez magnezijevih ionov v aktivnem mestu encima. ... 42

Slika 21: Enako kot na sliki 19, le da za sistem brez magnezijevih ionov v aktivnem mestu encima in brez virusne DNK. ... 43

Slika 22: Kontakti biktegravirja z integrazo HIV-1 in DNK ... 44 Slika 23: Časovna odvisnost RMSD liganda (biktegravir) glede na začetno lego liganda tekom 50 ns dolge simulacije dinamike molekul v eksplicitni vodi pri 298 K in 1 bar.

(PDB ID: 6PUW) ... 45 Slika 24: Enako kot na sliki 23, le da za sistem brez magnezijevih ionov v aktivnem mestu encima. ... 45 Slika 25: Enako kot na sliki 23, le da za sistem brez magnezijevih ionov in brez DNK v aktivnem mestu encima. ... 46 Slika 26: Časovna odvisnost radija sukanja proteinske tarče (integraza HIV-1) tekom 50 ns dolge simulacije dinamike molekul v eksplicitni vodi pri 298 K in 1 bar. (PDB ID:

6PUW) ... 47 Slika 27: Enako kot na sliki 26, le da za sistem brez magnezijevih ionov v aktivnem mestu encima. ... 48 Slika 28: Enako kot na sliki 26, le da za sistem brez magnezijevih ionov in brez DNK v aktivnem mestu encima. ... 48 Slika 29: Začetni položaj liganda v kompleksu reverzna transkriptaza-delavirdin (PDB ID: 1KLM).. ... 49 Slika 30: Začetni položaj liganda v kompleksu reverzna transkriptaza-rilpivirin (PDB ID:

3BGR). ... 50 Slika 31: Kontakti liganda delavirdina z aminokislinskimi ostanki proteina (reverzna transkriptaza HIV-1) v odvisnosti od dolžine simulacije pri 298 K in 1 bar... 51 Slika 32: Enako kot na sliki 31 le da za ligand rilpivirin (PDB ID: 3BGR). ... 51 Slika 33: Diagram vezav različnih aminokislinskih ostankov z molekulo delavirdina. .... . ... 52 Slika 34: Kontakti rilpivirina z aminokislinskimi ostanki reverzne transkriptaze. ... 53 Slika 35: Časovna odvisnost RMSD liganda (delavirdina) glede na začetno lego liganda tekom 50 ns dolge simulacije dinamike molekul v eksplicitni vodi pri 298 K in 1 bar.

(PDB ID: 1KLM). ... 54 Slika 36: Enako kot na sliki 35, le da za rilpivirin. (PDB ID: 3BGR). ... 54 Slika 37: Časovna odvisnost radija sukanja proteinske tarče (reverzna transkriptaza HIV- 1) tekom 50 ns dolge simulacije dinamike molekul v eksplicitni vodi pri 298 K in 1 bar (kompleks z delavirdinom). (PDB ID: 1KLM). ... 55 Slika 38: Enako kot na sliki 37, le da za primer kompleksa z rilpivirinom... 55

Kazalo tabel

Tabela 1: PDB kode kompleksov, uporabljene pri molekulskem sidranju nenukleozidnih inhibitorjev reverzne transkriptaze. ... 21 Tabela 2: Knjižnica zaviralcev integraze virusa HIV-1, uporabljenih v tem delu.. ... 23 Tabela 3: Knjižnica nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 (NNRTI).

... 25 Tabela 4: Knjižnica modificiranih struktur biktegravirja (spojine B1 – B15). ... 26 Tabela 5: Rezultati molekulskega sidranja zaviralcev HIV-1 integraze (vezavna energija in RMSD) ter aminokislinski ostanki, ki tvorijo interakcijo z ligandom. ... 31 Tabela 6: Vpliv magnezijevih ionov in virusne DNK na vezavno energijo in RMSD pri interakciji biktegravirja z integrazo HIV-1.. ... 33 Tabela 7: Rezultati molekulskega sidranja nenukleozidnih zaviralcev HIV-1 reverzne transkriptaze (vezavna energija in RMSD) ter aminokislinski ostanki, ki tvorijo interakcijo z ligandom. ... 37

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

HIV virus humane imunske pomanjkljivosti (angl. Human Immunodeficiency Virus) AIDS sindrom pridobljene imunske pomanjkljivosti

(angl. Acquired ImmunoDeficiency Syndrome) ART antiretrovirusna terapija

(angl. AntiRetroviral Therapy) DNK deoksiribonukleinska kislina RNK ribonukleinska kislina

G, T, C, A gvanin, timin, citozin, adenin INSTI zaviralec integraze

(angl. INtegrase Strand Transfer Inhibitor) NRTI nukleozidni zaviralec reverzne transkriptaze

(angl. Nucleoside Reverse-Transcriptase Inhibitor) NNRTI nenukleozidni zaviralec reverzne transkriptaze

(angl. Non-Nucleoside Reverse-Transcriptase Inhibitor) FDA ameriška agencija za hrano in zdravila

(angl. Food and Drug Administration) dNTP deoksinukleotid trifosfat

PDB podatkovna baza proteinskih struktur (angl. Protein Data Bank)

RMSD koren povprečnega kvadrata razlike (angl. Root-Mean-Square Deviation) MD molekulska dinamika

(angl. Molecular Dynamics)

1

1 Uvod

V odsotnosti uspešnega cepiva proti okužbi virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV) je vzniknila pandemija, kjer je približno 33 milijonov ljudi aktivno okuženih z virusom HIV-1, 2,1 milijona pa jih letno umre zaradi posledic kasnejšega razvoja bolezni AIDS (sindrom pridobljene imunske pomanjkljivosti). Vsakoletno se na novo okuži do 2,5 milijona ljudi, zato je iskanje učinkovitih zdravil oziroma cepiv aktualna tema raziskovalnih skupin in inštitucij [1].

Leta 1987 je bilo prvič odobreno zdravilo azidotimidin (AZT), poznano tudi pod imenom zidovudin (ZDV), ki je bilo učinkovito proti delovanju HIV-1 in se ga je začelo uporabljati za zdravljenje okužbe z virusom (gre za nukleozidnega zaviralca reverzne transkriptaze). Danes se za zdravljenje okužbe s HIV-1 in za preprečevanje razvoja bolezenskih stanj oziroma za omejevanje posledic bolezni posega po t.i. antiretrovirusni terapiji (ART), kjer se uporablja kombinacija več zdravilnih učinkovin v eni dozi (angl.

fixed-dose combination). Takšno kombinirano zdravilo vsebuje dve ali več zdravilnih učinkovin, ki so združene v eno-odmerni farmacevtski obliki (običajno tableti).

Učinkovine imajo različne farmakološke načine delovanja, njihova kombinacija pa zmanjšuje tudi število tablet, ki jih mora zaužiti pacient. Kombinirana zdravila tudi zmanjšajo tveganje za pojav odpornosti povzročitelja na zdravilno učinkovino.

Sodobna antiretrovirusna kombinirana zdravila vsebujejo učinkovine, ki so zaviralci integraze (angl. integrase strand transfer inhibitor, INSTI) ter nukleozidni zaviralci reverzne transkriptaze (angl. nucleoside reverse-transcriptase inhibitor, NRTI). Eno izmed sodobnejših kombiniranih zdravil trenutno na tržišču se imenuje Biktarvy^®, ki vsebuje 50 mg biktergravirja (INSTI), 200 mg emtricitabina (NRTI) in 25 mg tenofovir alafenamida (NRTI) [2].

Računalniško podprto načrtovanje novih zdravilnih učinkovin nam v veliki meri pomaga pridobiti informacije o interakcijah med aktivno spojino (ligandom) in njeno tarčo ter s tem omogoča proučevanje delovanja učinkovine na, v našem primeru, virus HIV-1. Pri tem se najpogosteje uporabljajo metode molekulskega sidranja, dinamike molekul (MD), kvantitativnega razmerja med strukturo in delovanjem (angl. Quantitative Structure- Activity Relationship, QSAR) ter metode za izračun proste energije [1]. V tej magistrski nalogi se bom posluževal molekulskega sidranja in simulacij dinamike molekul.

2

V nadaljevanju naloge sledi pregled literature s področja kombiniranih zdravil pri ART, ki že obstajajo na tržišču za zdravljenje okužbe z virusom HIV-1, ter klasifikacijo zdravilnih učinkovin, ki jih vsebujejo (zaviralci integraze, zaviralci proteaze ter (ne)nukleozidni zaviralci reverzne transkriptaze). Sledi opis uporabljenih računalniških metod za proučevanje knjižnice zaviralcev HIV-1 integraze in reverzne transkriptaze.

Glavnina naloge je posvečena predstavitvi in komentarju rezultatov.

3

1.1 HIV-1 integraza

Virus HIV-1 spada med retroviruse, za katere je značilno, da lahko reverzno prepišejo enojno vijačnico RNK genoma virusa v dvojno vijačnico DNK. Slika 1 prikazuje reproduktivni cikel virusa HIV-1, kjer v ospredju vidimo glavne tarče za vezavo zaviralcev: interakcija s (ko)receptorji, združitev virusa in gostiteljske celice, reverzna transkripcija (encim reverzna transkriptaza), integracija (encim integraza) in proteolitsko procesiranje (encim virusna proteaza) [3].

Virusna integraza vstavi virusno DNK v genom gostiteljske celice. Posledica tega je trajna okužba gostitelja s HIV-1.

Integracija, ki jo katalizira encim integraza, poteka v dveh korakih. V prvem koraku integraza cepi GT dinukleotid na obeh 3’ koncih dvojne vijačnice virusne DNK. Po cepitvi nastaneta še ohranjena CA sekvenca s prosto hidroksilno skupino na vsakem od obeh 3’ koncev in dinukleotidni ostanek na vsakem od 5’ koncev. Integraza nato v drugem koraku vstavi virusno DNK v gostiteljski genom tako, da s hidroksilno skupino na 3’

koncu napade fosfodiestersko hrbtenico genoma. Ta proces se imenuje prenos verige (angl. strand transfer, ST). Celični encimi nato zapolnijo vrzeli, nastale med tem procesom, in s tem omogočijo stabilno vezavo virusne DNK v genom okužene celice.

Slika 2 prikazuje strukturo HIV-1 integraze (PDB ID: 5U1C). Integraza je približno 32 kDa velik protein, sestavljen iz treh po funkcionalnosti različnih domen, ki so bile karakterizirane z biokemijsko in mutacijsko analizo: N-terminalna domena (sekvenca 1–

49, rumeno), na katero je vezan Zn²⁺ ion (sivo) in je odgovorna za multimerizacijo proteinov; C-terminalna domena (sekvenca 213–288, rdeče), ki stabilizira kompleks integraza-virusna DNK; in domena katalitskega jedra (sekvenca 50–212, modro), kjer je vezan ion Mg²⁺ (zeleno). Ta vsebuje vezavno mesto virusne DNK (vijolično) ter sodeluje pri prepoznavi substrata virusne DNK [1],[4],[5],[6].

4

Slika 1: Shematski prikaz reproduktivnega cikla virusa HIV-1. Prirejeno po [3].

5

Slika 2: Struktura integraze virusa HIV-1 (PDB ID: 5U1C_1).

1.1.1 Zaviralci integraze HIV-1

Pri antiretrovirusih je integracija ena izmed glavnih stopenj, s katero lahko vplivamo na reproduktivni cikel virusa. Trenutno klinično relevantni zaviralci integraze kažejo selektivnost za zaviranje procesa prenosa verige (ST) in le malo vplivajo na inhibicijo procesa 3’ cepitve GT nukleotida. Take spojine imenujemo INSTI (angl. integrase strand transfer inhibitors). [7] V nadaljevanju bom predstavil različne INSTI spojine in njihovo delovanje pri zaviranju procesa integracije virusa v gostiteljsko celico.

Prvi zaviralec integraze, ki je bil s strani FDA odobren leta 2007, je bil raltegravir (slika 3). Glavni del strukture molekule, ki je značilen za razred zaviralcev integraz, je beta- hidroksi ketonski del (R-C(OH)-CH2-C(=O)-R'). Ker se v gostiteljskih celicah aktivnost integraze ne izraža, raltegravir ne vpliva na aktivnost zdravih celic človeka [8].

Biktegravir je ena izmed novejših učinkovin, ki inhibira aktivnost virusne integraze in s tem zavira razmnoževanje virusa HIV-1 (slika 3). Farmakološki testi so pokazali, da je biktegravir manj občutljiv na mutacije virusa in njegovo odpornost proti učinkovini kot raltegravir. Ima tudi višjo antivirusno aktivnost kot vse ostale INSTI molekule. Kot omenjeno že v uvodu, se biktegravir uporablja v kombiniranem zdravilu Biktarvy^® skupaj z dvema zaviralcema reverzne transkriptaze (emtricitabin in tenofovir alafenamid) [2].

6

V klinični uporabi zasledimo kot INSTI tudi elvitegravir in dolutegravir (slika 3), ki imata podobno antivirusno aktivnost kot biktegravir.

Slika 3: INSTI spojine, ki so trenutno odobrene s strani FDA. Biktegravir je del kombiniranega zdravila Biktarvy^®, ostali pa se uporabljajo kot samostojni zaviralci [2], [5].

7

1.1.2 Mehanizem inhibicije HIV-1 integraze

V domeni katalitskega jedra HIV-1 integraze se na ostanke aminokislin asparaginske kisline (ASP 116, ASP 64) in glutaminske kisline (GLU 152) koordinirajo dvovalentni ioni magnezija (ali mangana). Raziskave kažejo, da lahko s spreminjanjem okolice aminokislin onemogočimo katalitsko aktivnost encima integraze. Čeprav vsebuje ta domena aktivno mesto, potrebujemo za katalitsko dejavnost encima tudi N- in C- terminalno domeno [6].

Na sliki 4 je prikazan predlagani mehanizem integracijskega procesa HIV-1 integraze. V prvih dveh stopnjah pride do napada vode na fosfodiestrsko vez in odcepitve terminalnega nukleotida, ki je posledica hidrolize. V tem koraku OH skupina 3' konca virusne DNK služi kot nukleofil za napad na fosfodiestrsko vez gostiteljske kromosomske celice, kjer nato nastane vez med 5' koncem zdrave DNK in 3' koncem virusne DNK (4. korak).

Združitev virusne in gostiteljske DNK lahko inhibiramo z vezavo zaviralca (INSTI) na kovinske ione, koordinirane na aktivno mesto encima integraze. Spojine s hidrofobnimi aromatskimi skupinami se izkažejo kot optimalne pri zaviranju procesa prenosa verige (ST) [6].

8

Slika 4: Predlagani mehanizem integracije virusne DNK (modra) v gostiteljsko DNK (bordo). Prirejeno po [6].

9

1.2 HIV-1 proteaza

Proteaza je odgovorna za cepitev virusne verige poliproteina v manjše, aktivnejše oblike proteinov. Z deaktivacijo proteaze tako preprečimo razmnoževanje virusa HIV-1 in je zaradi tega privlačna tarča za raziskovanje zaviralcev pri zdravljenju okužbe z virusom in napredovanja okužbe do bolezni AIDS [1], [9].

Na sliki 5 lahko vidimo strukturo HIV-1 proteaze (PDB ID: 1HPV), ki je sestavljena iz 99 aminokislin in spada v skupino asparaginskih proteaz. V aktivni obliki je homodimer s C2 simetrijo. Vsak monomer vsebuje podaljšano območje β-ploskve, bogate z glicinom, ki se imenuje zakrilce (angl. flap), na sliki označeno s svetlo modro in oranžno barvo.

Pod zakrilcema se nahajata dve esencialni asparaginski kislini (zelena), ASP 25 in ASP 25’, značilno za asparaginske proteaze. To je vezavno mesto za substrat ter omogoča interakcijo poliproteina z encimom [9], [10].

Slika 5: Struktura proteaze virusa HIV-1 (PDB ID: 1HPV).

1.2.1 Zaviralci proteaze HIV-1

Pred leti so poročali o strukturi kompleksa HIV-1 proteaze in učinkovine amprenavir (APV) [10]. Ta struktura zagotavlja bolj natančen vpogled v delovanje zaviralcev proteaz.

Začetni zaviralci so posnemali kemijsko sestavo in vezavo substratov peptidov, kasnejši pa so imeli manj podobnosti z njimi in so vsebovali sulfonamidno skupino za večjo

10

topnost v vodi (primer amprenavira). S tem so povečali hidrofilne interakcije s skupinami aktivnega mesta encima.

FDA je do sedaj odobrila devet zaviralcev HIV-1 proteaze (slika 6), ki so esencialne komponente za visoko-aktivne ART. Najbolj potenten zaviralec proteaze je spojina darunavir [1],[11].

Slika 6: Strukture devetih s strani FDA odobrenih zaviralcev proteaze.

1.2.2 Mehanizem inhibicije HIV-1 proteaze

Na sliki 7 je prikazan predlagani mehanizem katalitske aktivnosti HIV-1 proteaze, ki temelji na kinetičnih in strukturnih podatkih [9]. V prvem koraku pride do nastanka kompleksa substrat-encim. Voda se nato s pomočjo aminokisline ASP 25’ polarizira in napade karbonilni ogljik na substratu, kjer pride do nastanka diola. Substrat nato sprejme proton z ASP 25’ konca in odda en proton aminokislinskemu ostanku ASP 25. V drugem koraku mehanizma pride do cepitve C-N vezi substrata, posledica pa je nastanek produktov (amida in karboksilne kisline). Ena izmed predlaganih poti je ta, da se negativni naboj na diolu prenese na dušikov atom, kot je prikazano na sliki 7 (4. struktura) [12].

11

Inhibitorjem proteaze HIV-1 je skupen nehidrolizirajoči hidroksietilenski oz.

hidroksietilaminski del strukture, saj posnema tetraedrično prehodno stanje proteolitske reakcije, in s tem zaustavi delovanje encima [9].

Slika 7: Predlagani mehanizem katalitske aktivnosti HIV-1 proteaze. Prirejeno po [12].

1.3 HIV-1 reverzna transkriptaza

HIV-1 spada v družino retrovirusov, pri katerih je encim reverzna transkriptaza (RT) ključen za njihovo delovanje. Reverzna transkriptaza namreč prepiše virusno RNK v DNK, ki se nato s pomočjo integraze vstavi v genom gostiteljske celice.

Struktura reverzne transkriptaze virusa HIV-1 je prikazana na sliki 8 (PDB ID: 1T05).

Sestavljena je iz dveh domen z oznakama p66 in p51 (temno modro), ki si delita enako sekvenco aminokislin, vendar različno terciarno strukturo. V domeni p66 se nahaja aktivno mesto polimeraze, ki spominja na obliko človeške dlani. Razdeljena je na tri domene: domena prstov (svetlo modro), dlani (roza) in palca (oranžno). V domeni p66 se

12

nahaja tudi aktivno mesto ribonukleaze H (predstavljena z rdečo barvo, aktivno mesto pa z zeleno) in aktivno mesto polimeraze v domeni dlani (označeno z zeleno barvo). Siva barva predstavlja povezovalno domeno. V domeni p51 ni C-terminalne ribonukleaze H, ostale domene pa so neaktivne [1], [13], [14], [15].

Slika 8: Struktura reverzne transkriptaze virusa HIV-1 (PDB ID: 1T05).

1.3.1 Zaviralci reverzne tranksriptaze HIV-1

Encim reverzne transkriptaze virusa HIV-1 je eden od ključnih tarč za anitretrovirusna zdravila. Do sedaj je odobrenih že 13 zaviralcev, med njimi tudi prvo zdravilo, uporabljeno za zdravljenje okužbe z virusom HIV-1 (učinkovina zidovudine, Retrovir^®), slika 9. Vsem zaviralcem je skupno to, da zavirajo delovanje polimeraze. Do sedaj še ni odobrene učinkovine, ki bi delovala na zaviranje ribonukleaze H.

Obstajata dve glavni skupini inhibitorjev reverzne transkriptaze: nukleozidni in nenukleozidni zaviralci. Nukleozidni zaviralci so sestavljeni iz modificiranih nukleozidov, ki posnemajo naravne in tekmujejo z njimi za vezavo in vključevanje v aktivno mesto polimeraze. Zaradi manjkajoče 3’ OH skupine na sladkornem ostanku

13

delujejo kot zaključevalci verige. NRTI (angl. nucleoside reverse transcriptase inhibitor) je za lažjo vstavitev v rastočo DNK verigo potrebno pretvoriti v 5’-trifosfatne nukleotide s pomočjo kinaze gostiteljske celice. Trenutno je sprejetih 8 nukleozidnih zaviralcev, ki so po strukturi podobni pirimidinskim in purinskim analogom (slika 9).

Nenuklozidni zaviralci so majhni, hidrofobni in alosterični zaviralci DNK polimerizacije.

Z vezavo NNRTI (angl. non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor) pride do odprte konformacije encima, ki preprečuje hiperekstenzijo domene palca in s tem ustavi polimerizacijo [13],[16],[17]. Trenutno je s strani FDA uradno odobrenih 5 nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze (slika 10).

Slika 9: Strukture osmih s strani FDA odobrenih nukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze (NRTI) virusa HIV-1.

14

Slika 10: Strukture petih s strani FDA odobrenih nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze (NNRTI) virusa HIV-1.

15

1.3.2 Mehanizem inhibicije HIV-1 reverzne transkriptaze z NRTI

Slika 11 prikazuje delovanje nukleozidnega zaviralca zidovudina (ZDV) na proces transkiripcije [3].

Po končni fosforilaciji do trifosfatne oblike, ZDV deluje kot alternativni substrat pri reakciji reverzne transkripcije in s tem zaustavi nadaljnje prepisovanje virusne RNK.

Slika 11: Prikaz delovanja inhibitorja zidovudina na reverzno transkriptazo. Prirejeno po [3].

1.3.3 Mehanizem inhibicije HIV-1 reverzne transkriptaze z NNRTI

NNRTI se na reverzno transkriptazo vežejo v hidrofobni žep, ki je približno 10 Å oddaljen od aktivnega mesta polimeraze (slika 8). So nekonkurenčni zaviralci in ne vplivajo na vezavo deoksinukleotid trifosfatov (dNTP). Molekularne podrobnosti vezave NNRTI še niso podrobno raziskane, različne študije kinetičnih analiz pa kažejo na to, da vezava teh inhibitorjev preprečuje transkripcijo virusne RNK [15],[18].

1.4 Računalniške metode

V današnjem času so se računalniške metode izkazale kot pomemben del v procesu iskanja zdravilnih učinkovin in načrtovanja zdravil. Nudijo podrobnejše informacije o interakcijah med učinkovinami in tarčami ter povečajo učinkovitost in zmanjšajo ceno raziskovanja v številnih stopnjah razvoja zdravil. Računanje konformacijskih, steričnih

16

in fizikalno-kemijskih lastnosti nam omogočajo izluščiti ključne karakteristike virusne tarče npr. pri prepoznavanju vezavnih žepov [13],[19].

Številne tehnike in silico nam omogočajo različne pristope pri odkrivanju zdravilnih učinkovin kot tudi pri optimizaciji delovanja le-teh. Orodja za odkrivanje novih učinkovin v glavnem temeljijo na grobem, visoko-prepustnem filtriranju in podatkovnem rudarjenju. Omogočajo nam, da iz velikega nabora spojin izberemo čim manjše število molekul za nadaljnje študije, ki so računsko zahtevnejše in s tem omogočajo natančnejšo analizo manjših setov aktivnih in neaktivnih spojin ter njihovih interakcij s tarčo.

Računalniške metode pri razvoju zdravil se delijo na dve večji veji: ligandne in strukturne tehnike. Pri iskanju ligandov se osredotočamo na fizikalno-kemijske lastnosti in biološko afiniteto že poznanih aktivnih komponent pri zaviranju ali pospeševanju delovanja encimov. Te imajo pomembno vlogo v začetnih fazah raziskovanja novih učinkovin, saj je razumevanje lastnosti (npr. rigidnost molekule, oblika, število vrtljivih vezi ipd.) ligandov ključnega pomena za nadaljevanje raziskav. Strukturno-odvisni pristopi nato uporabljajo 3D strukture bioloških molekul za podrobnejše napovedi interakcij ligandov s tarčo. Oba pristopa sta potrebna za čim bolj temeljito iskanje in študij novih zdravilnih učinkovin proti virusnim boleznim [19].

1.4.1 Molekulsko sidranje

Molekulsko sidranje (angl. molecular docking) je metoda molekulskega modeliranja, ki je namenjena napovedovanju orientacije liganda napram receptorju (tarča) ter računanju jakosti interakcij v kompleksu ligand-receptor. Uporaba molekulskega sidranja je ključnega pomena pri reševanju problemov strukturne molekularne biologije in v računalniško podprtih iskanjih potencialnih zdravilnih učinkovin. Metoda molekulskega sidranja uporablja algoritme, ki poskušajo predvideti vezavo biološko aktivne molekule na tarčo (konformacijo kompleksa in jakost interakcije). Računalniški proces v prvi stopnji oceni položaj liganda v vezavnem mestu receptorja. Položaj liganda glede na receptor opišejo različne spremenljivke: prostorske lege atomov (koordinate x, y in z), orientacijo atomov liganda (koti) in v primeru fleksibilnih ligandov tudi konformacijske spremenljivke (torzijski koti). S povečevanjem števila spremenljivk posledično podaljšamo računski čas. Po končanih izračunih lege liganda glede na receptor, program oceni afiniteto molekule do proteina. Enotnega algoritma, ki bi za vse vrste receptorjev enako dobro ocenil končno pozicijo liganda, še niso razvili. Posledica je v velikem številu računalniških programov za sidranje, kjer vsak uporablja različne algoritme (npr.

genetski algoritmi, Monte Carlo, sistematično iskanje ipd.) [19],[20],[21].

17

Fleksibilnost vezavnega mesta na receptorju (običajno protein) je pomembna, vendar pogosto zapostavljena lastnost pri molekulskem sidranju. Pri vezavi liganda na receptor lahko pride do konformacijskih sprememb tako liganda kot receptorja [21].

V večini primerov so konformacijske spremembe receptorja zanemarljive in algoritem upošteva zgolj fleksibilnost liganda.

1.4.1.1 Cenilna funkcija

Namen cenilne funkcije (angl. scoring function) pri molekulskem sidranju je oceniti vezavno afiniteto med ligandom in receptorjem v kompleksu ligand-receptor za dani vezavni način (tj. orientacijo liganda relativno glede na receptor ter glede na konformacijo liganda in receptorja v kompleksu). Cenilne funkcije so običajno parametrizirane glede na eksperimentalne vrednosti vezavnih afinitet določenega seta molekul. Poznamo tri skupine t.i. klasičnih cenilnih funkcij:

- osnovane na polju sil

- empirično osnovane funkcije

- osnovane na »znanju« (angl. knowledge-based)

V magistrski nalogi bom za sidranje ligandov na protein uporabljal program YASARA, ki sidranje izvaja s pomočjo AutoDock Vina (cenilna funkcija je osnovana na polju sil) [22].

Cenilne funkcije, osnovane na polju sil, vezavno energijo ligand-receptor izračunajo iz vsote različnih prispevkov. Elektrostatske interakcije so določene s pomočjo Coulombovega zakona (uporabimo dielektrično konstanto medija, ki se spreminja z razdaljo), Van der Walsove interakcije pa opišemo z Lennard-Jonesovim 6-12 potencialom. AutoDock za boljši opis neveznih interakcij uporablja tudi funkcije, ki upoštevajo vpliv vodikovih vezi (10-12 Lennard-Jonesov potencial), solvatacijo in entropijske prispevke.

18

Spodnja enačba prikazuje vsoto vseh prispevkov neveznih interakcij, ki nastopajo v cenilni funkciji V [23],[24],[25]:

𝑉 = 𝑊 𝐴

𝑟 −𝐵

, 𝑟

+ 𝑊 𝐸_{( )} 𝐶

𝑟 −𝐷

, 𝑟

+ 𝑊 𝑞 𝑞

𝜀(𝑟 )𝑟

,

+ 𝑊 𝑆 𝑉 + 𝑆 𝑉

,

𝑒

Prvi člen predstavlja Van der Waalsov prispevek, drugi prispevek vodikovih vezi, tretji elektrostatske interakcije zadnji pa (de)solvatacijski prispevek. rij je razdalja med atomoma i in j, Wi pa so uteži posameznih prispevkov. Ostali členi so opisani v referenci [26].

1.4.2 Dinamika molekul

Metoda računalniške simulacije dinamike molekul (angl. molecular dynamics, MD) temelji na principu reševanja Newtonovih enačb gibanja. Rezultat simulacije je trajektorija, ki vsebuje informacijo o legi in hitrosti vseh delcev sistema v odvisnosti od časa simulacije. Na začetku simulacije določimo časovni korak za integracijo enačb gibanja ter izberemo statistični ansambel. Pogosto simulacije izvajamo pri konstantni temperaturi in tlaku (izbrati moramo ustrezen termostat in barostat) [27]. Na ta način se najbolje približamo sistemu, ki ga navadno obravnavamo eksperimentalno.

Sile, ki delujejo na sistem, so določene z molekulskimi interakcijskimi potenciali, s t.i.

poljem sil, ki so parametrizirani s kvanto-kemijskimi izračuni ali eksperimentalnimi meritvami. V molekulski dinamiki najpogosteje uporabljamo AMBER, CHARMM in GROMOS polja sil. Pri svojem delu sem uporabljal polje sil AMBER14 [28]:

𝑉 = 𝑘 𝑙 − 𝑙

∈

+ 𝑘 𝜃 − 𝜃

∈

+ 1

2𝑉 [1 + 𝑐𝑜𝑠(𝑛𝜔 − 𝛾 )]

∈

+ 𝑓 𝜀 𝑟

𝑟 − 2 𝑟

𝑟 + 𝑞 𝑞

𝜀 𝑟

Prvi člen opisuje harmonsko nihanje vezi okoli referenčne dolžine l⁰ (kb je konstanta sile), drugi člen na podoben način opisuje valenčne kote, tretji pa opisuje rotacijo okoli vezi (torzijski koti). Zadnja dva člena sta nekoliko modificiran 6-12 Lennard-Jonesov potencial in Coulombski potencial.

19

2 Namen dela

Namen magistrskega dela je uporaba računalniške metode molekulskega sidranja in molekulske dinamike za proučevanje interakcije nekaterih zaviralcev HIV-1 integraze in reverzne transkriptaze z ustrezno proteinsko tarčo. Kot inhibitorje integraze bom proučeval vrsto s strani FDA odobrenih spojin ter spojin, ki so še v fazi kliničnih testiranj.

Podrobneje se bom osredotočil na učinkovino zdravila Biktarvy^®, in sicer biktegravir in njegove kemijsko modificirane analoge. Od spojin, ki inhibirajo delovanje encima reverzne transkriptaze, se bom osredotočil na t.i. nenukleozidne inhibitorje.

Eksperimentalno določene strukture kompleksov proteinov z izbranimi zdravilnimi učinkovinami bom skušal poiskati zlasti v PDB podatkovni bazi. Rezultate molekulskega sidranja bom ovrednotil glede na eksperimentalno strukturo. Vezavne načine bom ovrednotil tudi glede na posamezne interakcijske prispevke. Raziskal bom tudi, kakšen vpliv ima nepopolna struktura kompleksa (npr. brez prisotnosti virusne DNK ali magnezijevih ionov) na rezultat sidranja. S pomočjo simulacij dinamike molekul bom za izbrane komplekse spremljal časovni potek stabilnosti kompleksov ter potencialne konformacijske spremembe. Rezultate sidranja in simulacijo dinamike molekul bom primerjal med seboj ter tudi s podatki že objavljenih študij.

21

3 Eksperimentalni del

Za proučevanje interakcije ligandov (zaviralci integraze, zaviralci reverzne transkriptaze) s proteinsko tarčo (encima HIV-1 integraze in reverzne transkriptaze) sem se posluževal dveh metod molekulskega modeliranja: molekulskega sidranja (angl. molecular docking) in simulacij dinamike molekule (angl. molecular dynamics simulation). Za oboje sem uporabljal računalniški program YASARA Structure (Yet Another Scientific Artificial Reality Application) [29], v nadaljevanju YASARA.

3.1 Molekulsko sidranje

Za molekulsko sidranje zaviralcev integraze in reverzne transkriptaze virusa HIV-1 sem uporabil strukture kompleksov ligand-protein, ki sem jih pridobil v podatkovni bazi PDB.

Pri sidranju zaviralcev HIV-1 integraze in modifikacij biktegravirja sem izhajal iz rentgenske strukture kompleksa s PDB kodo 6PUW. Pri sidranju nenukleozidnih inhibitorjev reverzne transkriptaze pa sem uporabil več različnih struktur iz podatkovne baze PDB, ki so navedene v Tabeli 1.

Tabela 1: PDB kode kompleksov, uporabljene pri molekulskem sidranju nenukleozidnih inhibitorjev reverzne transkriptaze.

Ime zaviralca PDB ID Rilpivirin 3BG3

Etravirin 3MEC

Efavirenz 4B3O

Nevirapin 3V81 Delavirdin 1KLM

Uporabljal sem program YASARA, ki za molekulsko sidranje uporablja AutoDock VINA [30]. Kompleks sem najprej uvozil s pomočjo PDB kode v program ter ga pred samim sidranjem ustrezno pripravil: najprej sem odstranil ione ali molekule, ki niso vplivali na rezultate sidranja, ter vse molekule vod. Nato sem kompleks ligand-protein, ki je lahko vseboval tudi DNK ter magnezijeve ione v aktivnem mestu, energijsko minimiziral v eksplicitni vodi (model vode TIP3P), pri čemer sem uporabil polje sil AMBER14. Ker ima voda v realnosti zaradi svojih lastnosti velik vpliv na rezultat računalniških izračunov, uporabljamo različne modele, ki opišejo obnašanje vode v sistemu. Implicitni modeli pogosto vodo opišejo preprosto kot tekoči medij z dielektrično konstanto, eksplicitni pa upoštevajo še ostale fizikalne lastnosti vode kot so dipolni moment, velikost

22

molekule, dihedralne kote ipd. [31] TIP3P model vode za opis uporablja Lennard- Jonesova parametra atoma kisika (σ in ε), razdaljo med kisikovim in vodikovim atomom, kot med OH vezema ter naboja na vodikovem in kisikovem atomu. [27]

Po energijski minimizaciji sem odstranil vse molekule vode, ki jih je program YASARA dodal tekom postopka minimizacije.

Za slepo sidranje (angl. blind docking) sem ohranil prvotno simulacijsko celico, ki je bila oddaljena od vseh atomov v strukturi za vsaj 5 Å. Pri tarčnem sidranju (angl. target docking) pa sem simulacijsko celico omejil na 5 Å okoli atomov liganda.

Molekule ligandov, ki niso bili del eksperimentalnih kompleksov, pridobljenih v bazi PDB (npr. kemijsko modificirane molekule biktegravirja), sem izrisal s pomočjo programa ChemDraw, ki mi je omogočil izvoz molekule v formatu SMILES. Format SMILES je nedvoumen način zapisa molekulske strukture, ki uporablja nize ASCII znakov in je zapisan v eni vrstici. Po uvozu molekule liganda v formatu SMILES v program YASARA sem ligand najprej energijsko minimiziral (polje sil AMBER14, TIP3P voda) in ga šele nato uporabil pri sidranju.

3.2 Molekulska dinamika

Z računalniško simulacijo molekulske dinamike (MD) sem proučeval zlasti strukturne spremembe obravnavanih kompleksov ter časovno dinamiko interakcije liganda s proteinsko tarčo. Uporabljal sem program YASARA, in sicer skripto md_run.mcr. Vse simulacije sem izvajal v kubični simulacijski celici v eksplicitni vodi (TIP3P, gostota 0,997 g/mL) in poljem sil AMBER14. Temperaturo sem vzdrževal pri 298 K, tlak pa pri 1 bar. Upošteval sem periodične robne pogoje, elektrostatske interakcije pa sem ovrednotil s pomočjo metode PME (angl. particle-mesh Ewald). Protonacijsko stanje proteina je bilo določeno pri pH = 7,4. Elektronevtralnost sistema je bila zagotovljena z dodatkom ustreznega števila natrijevih oziroma kloridnih ionov (koncentracija dodanega NaCl je bila 0,9 %). Korak za integracijo enačb gibanja je bil 2,5 fs. Vse simulacije so bile dolge 50 nm, podatke pa sem shranjeval na vsakih 100 ps. Rezultat simulacije (trajektorijo) sem analiziral s pomočjo skripte md_analyze.mcr

Simulacije dinamike molekul sem izvedel za kompleks biktegravirja z integrazo HIV-1 (PDB ID: 6PUW). Pri tem je simulacijska celica poleg eksplicitne vode in dodanega NaCl vsebovala: (i) protein, ligand, Mg²⁺ ione in DNK, (ii) protein, ligand in Mg²⁺ ione ter (iii) samo protein in ligand (brez Mg²⁺ ionov v aktivnem centru ter brez DNK). Simulacije dinamike molekul sem izvedel tudi z dvema nenukleozidnima zaviralcema reverzne

23

transkriptaze: liganda rilpivirin (PDB ID: 3BGR) ter delavirdin (PDB ID: 1KLM).

Strukture sem uvozil v program YASARA ter jih pred začetkom simulacij (kot pri molekulskem sidranju) ustrezno pripravil (tj. odstranil molekule vode ter ostale molekule, ki niso del obravnavanega kompleksa).

3.3 Knjižnica zaviralcev integraze HIV-1

V tabeli 2 so prikazane strukture nekaterih s strani FDA odobrenih zaviralcev integraze ter dveh zaviralcev integraze, ki sta še v fazah kliničnih testiranj (4d, in MK-2048). Z modro barvo je označen kelatni del molekule, ki se v aktivnem mestu veže na magnezijev ion, z rdečo barvo pa hidrofobni del molekule, ki interagira s tarčo preko π-π interakcij.

Tabela 2: Knjižnica zaviralcev integraze virusa HIV-1, uporabljenih v tem delu. Poleg imena liganda je njegova koda SMILES ter strukturna formula. Modra barva označuje del molekule, ki tvori koordinacijsko vez z Mg²⁺-ioni, z rdečo pa hidrofobni del molekule.

Ime spojine SMILES 2D struktura

raltegravir CC1=NN=C(O1)C(=O)NC(C)(C)C2=NC(=C (C(=O)N2C)O)C(=O)NCC3=CC=C(C=C3)F

elvitegravir CC(C)C(CO)N1C=C(C(=O)C2=C1C=C(C(=

C2)CC3=C(C(=CC=C3)Cl)F)OC)C(=O)O

24

biktegravir C1CC2CC1N3C(O2)CN4C=C(C(=O)C(=C4 C3=O)O)C(=O)NCC5=C(C=C(C=C5F)F)F

dolutegravir CC1CCOC2N1C(=O)C3=C(C(=O)C(=CN3C 2)C(=O)NCC4=C(C=C(C=C4)F)F)O

kabotegravir [H][C]12CN3C=C(C(NCC4=CC=C(C=C4F) F)=O)C(C(O)=C3C(N1[CH](C)CO2)=O)=O

4d [32] ON(C1=NC=C(CCCCCCO)C=C1C(N)=C2C (NCC3=CC=C(F)C=C3F)=O)C2=O

MK-2048 [33]

CCN1C[CH](C)N2C3=C(C(N(N=C3C(NC)=

O)CC(C=C4)=CC(Cl)=C4F)=O)C(O)=C2C1

=O

3.4 Knjižnica zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 (NNRTI)

V tabeli 3 so prikazane strukture nekaterih nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze virusa HIV-1 (NNRTI). Zaradi kompleksnega delovanja nukleozidnih zaviralcev (interakcija z DNK) le-teh pri svojem delu nisem obravnaval.

25

Tabela 3: Knjižnica nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 (NNRTI).

Ime SMILES 2D struktura

efavirenz O=C1NC2=CC=C(Cl)C=C2C(C(

F)(F)F)(C#CC3CC3)O1

nevirapin CC1=C2NC(C3=C(N(C2=NC=C 1)C4CC4)N=CC=C3)=O

delavirdin CC(NC1=C(N2CCN(C(C3=CC4

=C(C=CC(NS(C)(=O)=O)=C4)N 3)=O)CC2)N=CC=C1)C

etravirin

CC1=CC(=CC(=C1OC2=NC(=N C(=C2Br)N)NC3=CC=C(C=C3) C#N)C)C#N

rilpivirin

CC1=CC(=CC(=C1NC2=NC(=N C=C2)NC3=CC=C(C=C3)C#N) C)C=CC#N

26

3.5 Knjižnica modificiranih struktur biktegravirja

V tabeli 4 je navedenih petnajst kemijsko modificiranih struktur (B1 – B15) biktegravirja, katerih interakcijo z encimom integraze HIV-1 sem študiral s pomočjo molekulskega sidranja.

Tabela 4: Knjižnica modificiranih struktur biktegravirja (spojine B1 – B15).

Ime SMILES 2D struktura

Biktegravir

C1CC2CC1N3C(O2)CN4C=C(C(=O) C(=C4C3=O)O)C(=O)NCC5=C(C=C(

C=C5F)F)F

B1

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C([H])C=

C(F)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

B2

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C([H])C=

C([H])C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

B3

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C([H])C=

C([H])C=C4[H])=O)C2=C(O)C3=O

27 B4

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(F)C=C ([H])C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

B5

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(Cl)C=

C(F)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

B6

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(Cl)C=

C(Cl)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

B7

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(Cl)C=

C(Cl)C=C4Cl)=O)C2=C(O)C3=O

B8

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(Cl)C=

C(F)C=C4Cl)=O)C2=C(O)C3=O

28 B9

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(F)C=C (Cl)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

B10

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(F)C=C (F)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=N

B11

N=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(F)C=C (F)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=N

B12

N=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(F)C=C (F)C=C4F)=O)C2=C(O)C3=O

29 B13

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C(F)C=C (F)C=C4F)=O)C2=C(N)C3=O

B14

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C([H])C=

C(O)C=C4[H])=O)C2=C(O)C3=O

B15

O=C(N[C@](CC1)([H])C[C@]1([H]) OC([H])CN2C=C3C(NCC4=C([H])C=

C([H])C=C4O)=O)C2=C(O)C3=O

31

4 Rezultati in razprava

Najprej bom predstavil in komentiral rezultate molekulskega sidranja zaviralcev integraze in nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze virusa HIV-1, nato pa bodo sledili še rezultate in komentar simulacij dinamike molekul.

4.1 Molekulsko sidranje zaviralcev integraze HIV-1

V tabeli 5 so zbrani rezultati molekulskega sidranja sedmih ligandov, ki delujejo kot zaviralci integraze HIV-1 (INSTI; tabela 2). Podane so vrednosti vezavne energije (v kcal/mol), koren povprečnega kvadrata razlike (RMSD) glede na eksperimentalno določeno strukturo kompleksa (v Å; PDB kode so podane v tabeli 2) ter aminokisline proteinske tarče, ki so udeležene pri interakciji ligand-protein.

Tabela 5: Rezultati molekulskega sidranja zaviralcev HIV-1 integraze (vezavna energija in RMSD) ter aminokislinski ostanki, ki tvorijo interakcijo z ligandom.

INSTI

Vezavna energija [kcal mol^-1]

RMSD

[Å] Vezavna mesta

Raltegravir - 7,94 6,86

ASP 64 CYS 65 HIS 67 GLU 92 ASP 116 ASN 117 GLY 118 SER 119 ASN 120 ILE 141 PRO 142 TYR 143 ASN 144 PRO 145 GLN 148 GLU 152 DC 20 DA 21 MG 301 MG 302

Kabotegravir - 8,31 7,80 ASP 64 CYS 65 HIS 67 GLU 92 ASP 116 ASN 117 PRO 142 TYR 143 ASN 144 PRO 145 GLN 148 GLU 152 ARG 231 DA 21 MG 301 MG 302 Biktegravir - 10,13 6,76 CYS A 65 GLU A 92 ASP A 116 ASN A 117 GLY

A 118 SER A 119 TYR A 143 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 DA F 21 MG A 301 MG A 302 Elvitegravir - 9,31 6,26

ASP A 64 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 GLY A 140 ILE A 141 PRO A 142 TYR A 143 ASN A 144 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 ARG D 231 DG E 18 DC F 20 DA F 21 MG A 301 MG A 302

Dolutegravir - 9,84 7,39

ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 SER A 119 PRO A 142 TYR A 143 ASN A 144 PRO A 145 GLN A 146 GLN A 148 GLY A 149 GLU A 152 DG E 18 DC F 20 DA F 21 MG A 302

4d - 8,15 7,48

ASP A 64 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 SER A 119 ILE A 141 PRO A 142 TYR A 143 ASN A 144 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 DC F 20 DA F 21 MG A 301 MG A 302

MK-2048 - 9,30 7,47 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 TYR A 143 PRO A 145 GLN A 146 GLU A 152 ARG D 231 DG E 18 DC F 20 DA F 21 MG A 301 MG A 302

32

Na spodnji sliki 12 so prikazane vrednosti vezavne energije zaviralcev HIV-1 integraze (tabela 5), ki sem jih dobil s tarčnim sidranjem s programom YASARA. Ligandi so razvrščeni po naraščajoči vrednosti vezavne energije. Energija vezave nam nudi informacijo o tem, kako močno bo ligand interagiral z encimom (večja vrednost energije vezave pomeni boljšo vezavo). Od proučevanih ligandov ima raltegravir najnižjo vrednost vezavne energije (7,94 kcal mol^-1), biktegravir pa najvišjo (10,13 kcal mol^-1).

Dolutegravir, ki ima tudi visoko vezavno energijo glede na ostale testirane INSTI, se podobno kot biktegravir že uporablja v odobrenem zdravilu Triumeq^®.

Slika 12: Primerjava vezavnih energij zaviralcev integraze HIV-1 (tabela 5), določena s pomočjo tarčnega sidranja.

Opozoriti velja, da so vrednosti RMSD (tabela 5) precej visoke, kar pomeni, da v našem primeru molekulsko sidranje ni najbolje napovedalo konformacije liganda v vezavnem mestu v primerjavi z eksperimentalno strukturo. Navadno za dobro oceno velja RMSD, ki je vsaj pod 2,5 Å. Razlog za to bi lahko bil ta, da ligand interagira z aktivnim mestom encima zgolj na določenem mestu molekule. Poleg tega je sistem precej kompleksen, saj pri vezavi pride tudi do interakcije z ioni, ki se nahajajo v vezavnem mestu kot tudi z molekulo DNK. Zaradi tega sem na primeru biktegravirja tudi preveril, kakšen je vpliv magnezijevih ionov in DNK na interakcijo z encimom.

33

4.1.1 Primerjava vpliva DNK in magnezijevih ionov na interakcijo biktegravirja z integrazo HIV-1

Zapis PDB ID: 6PUW vsebuje intasom (nukleoproteinski kompleks virusne integraze, vezane na konec virusne DNK), zaviralec integraze biktegravir ter dva magnezijeva iona v aktivnem mestu encima. S pomočjo molekulskega sidranja sem preveril, kakšen je vpliv prisotnosti magnezijevih ionov in/ali virusne DNK na vezavno energijo in RMSD liganda v kompleksu s proteinom. Preveril sem tudi ali slepo sidranje pravilno napove vezavno mesto ter rezultat primerjal s tarčnim sidranjem. Rezultati so zbrani v tabeli 6.

Tabela 6: Vpliv magnezijevih ionov in virusne DNK na vezavno energijo in RMSD pri interakciji biktegravirja z integrazo HIV-1. Slepo sidranje je označeno s »S«, tarčno sidranje pa s »T«. Prisotnost Mg²⁺ ali DNK označuje +, odsotnost le-teh pa –.

Podani so: vezavna energija, aminokislinski ostanki, ki tvorijo interakcijo z ligandom, ter RMSD.

Način sidranja/

prisotnost Mg²⁺ in DNK

Vezavna energija [kcal/mol]

RMSD [Å] Vezavna mesta

S

+ Mg²⁺ + DNK - 7,96 9,19

ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 THR A 122 GLY A 140 ILE A 141 PRO A 142 TYR A 143 ASN A 144 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 DA F 21 MG A 301 MG A 302

S

+ Mg²⁺ – DNK - 6,82 8,65 ASP A 64 CYS A 65 THR A 66 HIS A 67 TYR A 143 GLU A 152 ASN A 155 LYS A 156 LYS A 159 MG A 301 MG A 302

S

– Mg²⁺ + DNK - 7,47 8,77 GLU A 92 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 SER A 119 ASN A 120 TYR A 143 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 DA F 21

S

– Mg²⁺ – DNK - 7,27 8,97

ASP A 64 ASP A 116 ASN A 117 TYR A 143 ASN A 144 PRO A 145 GLN A 146 GLN A 148 GLY A 149 GLU A 152 SER A 153 LYS A 156

T

+ Mg²⁺ + DNK - 10,13 6,76 CYS A 65 GLU A 92 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 SER A 119 TYR A 143 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 DA F 21 MG A 301 MG A 302 T

+ Mg²⁺ – DNK - 7,82 7,90 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 SER A 119 ILE A 141 PRO A 142 TYR A 143 ASN A 144 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 MG A 301 MG A 302 T

– Mg²⁺ + DNK - 7,80 8,25 ASP A 64 GLU A 92 ASP A 116 ASN A 117 GLY A 118 SER A 119 TYR A 143 PRO A 145 GLN A 148 GLU A 152 ARG D 231 DA F 21

Pri vizualni primerjavi rezultatov slepega sidranja z eksperimentalno določeno strukturo (PDB ID: 6PUW) sem ugotovil, da slepo sidranje pravilno napove vezavno mesto na proteinski tarči (top-1 rezultat). Kljub temu so vezavne energije v primeru slepega sidranja nekoliko nižje od vezavnih energij pri tarčnem sidranju. Prav tako je RMSD

34

nekoliko slabši v primeru slepega sidranja. V primerjavi s tarčnim sidranjem, je slepo sidranje računsko bolj potraten proces, saj moramo preveriti interakcijo liganda s proteinom preko večje površine tarče.

Vpliv prisotnosti magnezijevih ionov in/ali DNK je prikazan tudi na sliki 13. Opazimo lahko, da je vezavna energija močno odvisna od tega, ali je prisotna veriga DNK in magnezijeva iona. Vezavna energija se zmanjša, če DNK in/ali Mg²⁺ niso prisotni. To je posledica dodatnih interakcij liganda (biktegravir) z aminokislinskimi ostanki na verigi in koordinacijske vezi na kovinske ione. Magnezijevi ioni imajo skoraj enako pomemben vpliv na vezavo inhibitorja kot DNK, kar lahko vidimo v majhni spremembi vrednosti vezavne energije na sliki, kadar pri sidranju ne sodeluje DNK veriga.

Slika 13: Vpliv magnezijevih ionov in/ali DNK na vezavno energijo biktegravirja z integrazo HIV-1 (slepo in tarčno sidranje).

4.1.2 Korelacija med izračunano disociacijsko konstanto, Kd, in vrednostjo EC50 pri zaviralcih integraze HIV-1

Slika 14 prikazuje korelacijo med izračunano disociacijsko konstanto, Kd, (določeno iz vezavne energije pri tarčnem sidranju, Δ𝐺 = −𝑅𝑇ln𝐾 , pri čemer je R plinska konstanta, T pa temperatura; v našem primeru 298 K) in koncentracijo polovičnega maksimalnega učinka inhibitorja, EC50. Vrednosti EC50 za biktegravir, elvitegravir in dolutegravir so bili pridobljeni iz [34], za raltegravir iz [35] in kabotegravir iz [36]. Višja ko je disociacijska konstanta, nižja je vezavna energija in s tem posledično slabši učinek inhibitorja pri zaviranju delovanja encima (tabela 5). Nižja vrednost EC50 pomeni močnejšo inhibicijo pri manjši količini zaviralca.

35

Slika 14: Odvisnost disociacijske konstante Kd od vrednosti EC50 za izbrane zaviralce integraze HIV-1. Enačba premice je: Kd = 1,2047 * EC50 - 0,019.

Na sliki 14 vidimo, da je korelacije med Kd in EC50 relativno dobro linearna (vrednost korelacijskega koeficienta znaša R² = 0,959). V tem primeru lahko metodo molekulskega sidranja uporabimo za napoved vrednosti EC50 za ligande, katerih eksperimentalna vrednost še ni določena. Iz podatkov v tabeli 5 in linearne zveze, prikazane na sliki 14 sem za zaviralca 4d in MK-2048, ki sta še v fazi kliničnih testiranj, določil sledeči vrednosti EC50: 0,897 nM (4d) in 0,144 nM (MK-2048).

4.1.3 Vpliv kemijske modifikacije biktegravirja na vezavno energijo

Od preiskovanih zaviralcev integraze HIV-1 (tabela 2) se je biktegravir izkazal za najboljšega (tabela 5, slika 12). Zanimalo me je, ali lahko s pomočjo kemijske modifikacije molekule biktegravirja najdemo analog, ki se bo v smislu vezave odrezal bolje. V ta namen sem pripravil petnajst spojin (tabela 4), kjer sem modificiral hidrofobni del molekule ali pa beta-hidroksi ketonski del molekule. Za vse molekule sem potem izvedel tarčno sidranje na proteinsko strukturo PDB ID: 6PUW, ki je vsebovala tako magnezijeva iona kot virusno DNK. Rezultati vezavnih energij so prikazani na sliki 15.

S kockastim vzorcem je označen biktegravir, s pikčastim vzorcem pa modifikacije te strukture (tabela 4). Pri vseh modificiranih strukturah opazimo nižje vrednosti vezavnih energij kot pri biktegravirju, kar nakazuje na slabšo vezavo analogov in s tem slabše delovanje zaviralca integraze HIV-1. Najbolj ugodno vezavno opazimo pri modifikaciji

36

B12 kjer sem karbonilno (C=O) skupino v kelatnem delu biktegravirja zamenjal z iminsko (C=NH). Iz teh podatkov tudi lahko zaključim, da je molekula biktegravirja že optimizirana, kot inhibitor z najbolj učinkovitim delovanjem.

Slika 15: Vezavne energije biktegravirja (B0) in njegovih analogov B1 – B15 pri tarčnem molekulskem sidranju (PDB ID tarče: 6PUW).

4.2 Molekulsko sidranje nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1

V tabeli 7 so zbrani rezultati tarčnega molekulskega sidranja petih ligandov, ki delujejo kot nenukleozidni zaviralci reverzne transkriptaze HIV-1 (NNRTI; tabela 3). Podane so vrednosti vezavne energije (v kcal mol^-1), koren povprečnega kvadrata razlike (RMSD) glede na eksperimentalno določeno strukturo kompleksa (v Å) ter aminokisline proteinske tarče, ki so udeležene pri interakciji ligand-protein. Rezultati za vezavne energije so prikazani tudi na sliki 16. Najvišjo vezavno energijo ima delavirdin, najnižjo pa rilpivirin. Tako kot v primeru zaviralcev integraze (tabela 5), so tudi v primeru NNRTI vrednosti RMSD precej visoke.

37

Tabela 7: Rezultati molekulskega sidranja nenukleozidnih zaviralcev HIV-1 reverzne transkriptaze (vezavna energija in RMSD) ter aminokislinski ostanki, ki tvorijo interakcijo z ligandom.

NNRTI Vezavna

energija [kcal mol^-1]

RMSD

[Å] Vezavna mesta

Rilpivirin - 6,65 6,46 PRO 95 LEU 100 LYS 101 ASN 103 VAL 179 CYS 181 TYR183 TYR 188 GLY 190 PHE 227 LEU 228 TRP 229 LEU 234

Etravirin - 8,20 4,24

PRO 95 LEU 100 LYS 101 LYS 103 VAL 106 VAL 108 PRO 176 VAL 179 TYR 181 TYR 188 VAL189 GLY 190 PHE 227 LEU 234 TYR 318

Nevirapin - 9,96 4,12

PRO 95 LEU 100 LYS 101 LYS 102 LYS 103 VAL 106 VAL 179 ILE 180 TYR 181 TYR 188 VAL 189 GLY 190 PHE 227 TRP 229 LEU 234 HIS 235 PRO 236 TYR 318

Efavirenz - 11,14 3,78

PRO 95 PRO 97 LEU 100 LYS 101 LYS 102 LYS 103 VAL 106 VAL 179 TYR 181 TYR 188 VAL 189 GLY 190 PHE 227 TRP 229 LEU 234 HIS 235 PRO 236 TYR 318

Delavirdin - 11,86 7,74

PRO 95 LEU 100 LYS 101 LYS 102 LYS 103 LYS 104 SER 105 VAL 106 VAL 179 ILE 180 TYR 181 TYR 188 VAL 189 GLY 190 GLU 224 PRO 226 PHE 227 TRP 229 LEU 234 HIS 235 PRO 236 TYR 318

Slika 16: Primerjava vezavnih energij nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze HIV-1 (tabela 7), določena s pomočjo tarčnega sidranja.

38

Slika 17: Odvisnost disociacijske konstante Kd od vrednosti EC50 za izbrane zaviralce integraze HIV-1.

Na sliki 17 vidimo, da je odvisnost konstante disociacije od eksperimentalne vrednosti EC50 slabša kot v primeru zaviralcev integraze, saj ima premica manjši R² (0,7557).

Teoretični rezultati Kd treh najmočneje vezanih NNRTI delavirdina, nevirapina in efavirenza se kljub temu izkažejo za dober približek eksperimentalnim vrednostim EC50.

39

4.3 Molekulska dinamika

V naslednjih razdelkih bom opisal rezultate, ki sem jih dobil s 50 ns dolgimi simulacijami dinamike molekul v eksplicitni vodi, in sicer za sledeče komplekse protein-ligand:

- biktegravir – integraza HIV-1: prisotna tako DNK kot magnezijevi ioni (PDB ID: 6PUW)

- biktegravir – integraza HIV-1: prisotna DNK, brez magnezijevih ionov (PDB ID: 6PUW)

- biktegravir – integraza HIV-1: brez DNK in brez magnezijevih ionov (PDB ID: 6PUW)

- rilpivirin – reverzna transkriptaza HIV-1 (PDB ID: 3BGR) - delavirdin – reverzna transkriptaza HIV-1 (PDB ID: 1KLM)

Najprej bom opisal rezultate za kompleks biktegravir–integraza. Zanimale me bodo spremembe, ki so posledica odstranitve magnezijevih ionov iz aktivnega mesta encima ter odstranitve DNK verige iz nukleoproteinskega kompleksa. Primerjal bom razlike v številu kontaktov z aminokislinskimi ostanki proteina in naravo interakcij, gibanje liganda znotraj vezavnega mesta, spremembe v radiju sukanja proteina ter ali pride do konformacijskih sprememb proteina oziroma liganda. Kontakte ligand-tarča bom primerjal z rezultati molekulskega sidranja.

Nato bom predstavil rezultate simulacij dveh nenukleozidnih zaviralcev reverzne transkriptaze. Zanimale me bodo razlike med inhibitorjem delavirdinom, ki je imel pri molekulskem sidranju najvišjo vezavno energijo ter inhibitorjem rilpivirinom, ki je imel najnižjo.