U NIVERZA V L JUBLJANI
F AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
DIPLOMSKO DELO
Tim Nograšek
Ljubljana, 2021
U NIVERZA V L JUBLJANI
F AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE
BIOKEMIJA
Molekulsko kloniranje in filogenetske analize nekodirajočih vtRNA
DIPLOMSKO DELO
Tim Nograšek
MENTORICA: doc. dr. Vera Župunski
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega dela
Spodaj podpisani Tim Nograšek sem avtor diplomskega dela z naslovom: Molekulsko kloniranje in filogenetske analize nekodirajočih vtRNA
S svojim podpisom zagotavljam, da:
je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr. Vere Župunski;
sem poskrbel, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorskih in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. List RS, št. 16/2007);
sem poskrbel za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;
je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, september 2021 Podpis avtorja:
Zahvala
Najprej bi se rad posebno zahvalil svoji mentorici doc. dr. Veri Župunski za njeno prijaznost, odzivnost in številne napotke med nastajanjem diplomske naloge.
Zahvalil bi se rad tudi doc. dr. Gregorju Gunčarju za hiter pregled diplomskega dela.
Na koncu pa še zahvala celotni družini, ki so mi stali ob strani, me podpirali in pomagali tekom celotnega študija.
Molekulsko kloniranje in filogenetske analize nekodirajočih vtRNA Povzetek
˝Vault˝ RNA (vtRNA) je krajše, nekodirajoče zaporedje RNA, ki ga najdemo v kompleksih
˝vault˝, znotraj citoplazme evkariontskih celic. Sama vloga vtRNA zaenkrat še ni točno določena, prav tako ne vloga celotnega kompleksa. Ker se pogosto nahajajo v celicah, ki so v različnih bolezenskih stanjih, pa jih v zadnjem času vedno bolj raziskujejo. Pri človeku so bila identificirana štiri različna zaporedja vtRNA in sicer vtRNA1-1, vtRNA1-2, vtRNA1-3 in vtRNA2-1. Slednji se nahaja na drugem lokusu petega kromosoma kot ostali trije. Poleg teh štirih zaporedij sta v človeškem genomu prisotna dva psevdogena, poimenovana vtRNA2-2 in vtRNA3-1. Ta dva se nahajata na drugih kromosomih kot ostali štirje. V okviru diplomske naloge smo naredili filogenetsko analizo zaporedij vtRNA pri vretenčarjih. Ugotovili smo, da se razvoj različnih vrst vtRNA delno ujema s splošnim taksonomskim razvojem, hkrati pa je prisotnih tudi nekaj odstopanj. Pri nekaterih odstopanjih smo z podrobnim pregledom poravnav zaporedij pokazali njihov razlog. Največja ujemanja zaporedij vtRNA so bila na regulacijskih mestih, kjer so se ta skozi evolucijo najbolj ohranila. Pri laboratorijskem delu pa smo pripravili vektorje z različnimi človeškimi zaporedji vtRNA, da bi lahko izražali v sesalskih celicah. Na ta način bomo lahko določili njihove interakcijske partnerje in lokacijo v celici.
Ključne besede: vtRNA, filogenetska analiza, kloniranje IVA
Molecular cloning and phylogenetic analyzes of noncoding vtRNAs Abstract
Vault RNA (vtRNA) is a shorter, noncoding RNA sequence found in vault complexes in the cytoplasm of eukaryotic cells. The function of vtRNA is still not known, nor is the function of the complex, but because they are found in various unusual states of cells, there has been increased research recently. Four different vtRNA sequences have been identified in the human genome: vtRNA1-1, vtRNA1-2, vtRNA1-3 and vtRNA2-1. The last one is also the one found at different locus of chromosome number five than the other three. In addition to these four RNA molecules, there are also two pseudogenes in the human genome: vtRNA2-2 and vtRNA3-1. These two are located on different chromosomes than the other four vtRNAs. We performed a phylogenetic analysis of vtRNAs in vertebrates. We found that the development of different types of vtRNAs is consistent with the general taxonomic evolution, but at the same time there are some divergences. For some divergences we were able to explain them with a detailed review of sequence alignments, while for others the reason for their placement in the phylogenetic tree was different point mutations. In the laboratory part, we made vectors with different types of vtRNAs that can be expressed in mammalian cells. In this way, we enable further research on their interaction partners and cellular location.
Keywords: vtRNA, phylogenetic analysis, IVA cloning
Kazalo
1 UVOD ... 1
1.1 VAULT RNA ... 1
1.2 KOMPLEKS ˝VAULT˝ ... 1
1.3 PROTEINI V KOMPLEKSU ˝VAULT˝ ... 4
1.3.1 MVP ... 4
1.3.2 TEP1 ... 4
1.3.3 VPARP ... 5
1.4 GEN ZA vtRNA ... 5
1.4.1 Promotorsko mesto tipa 2 ... 6
1.4.2 Promotorsko mesto tipa 3 ... 6
1.5 vtRNA PRI ČLOVEKU ... 7
1.5.1 vtRNA 1 ... 7
1.5.2 vtRNA 2 ... 7
1.5.3 Sekundarna struktura vtRNA pri človeku ... 8
1.6 PSEVDOGENI ... 8
2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ... 9
3 MATERIALI IN METODE ... 11
3.1 MATERIALI - Laboratorijski del ... 11
3.1.1 Verižna reakcija s polimerazo ... 11
3.1.2 Agarozna gelska elektroforeza (AGE) ... 11
3.1.3 Transformacija bakterijskih celic E.coli, seva DH5α ... 12
3.1.4 Izolacija vektorske DNA ... 12
3.1.5 Vektorji ... 13
3.2 METODE – Laboratorijski del ... 14
3.2.1 Priprava začetnih nukleotidov ... 14
3.2.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR-reakcija) ... 15
3.2.3 Agarozna gelska elektroforeza (AGE) ... 16
3.2.4 Transformacija bakterijskih celic E.coli, seva DH5α ... 17
3.2.5 Verižna reakcija s polimerazo na osnovi kolonije (colony PCR) ... 17
3.2.6 Izolacija vektorske DNA ... 18
3.2.7 Določanje nukleotidnega zaporedja vektorske DNA ... 18
3.3 METODE - Teoretični del ... 19
3.3.1 Iskanje zaporedij vtRNA ... 19
3.3.2 Primerjava zaporedij ... 19
3.3.3 Izris filogenetskega drevesa ... 20
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 21
4.1 PRIPRAVA KONSTRUKTOV ZAPOREDIJ INSERTOV ČLOVEŠKIH vtRNA1 ... 21
4.1.1 Pomnoževanje vektorske DNA ... 21
4.1.2 Pomnoževanje insertov človeških vtRNA ... 22
4.1.3 Preverjanje novih konstruktov pcDNA-U6-vtRNA ... 23
4.1.4 Izolacija konstruktov ... 24
4.1.5 Sekvenciranje izoliranih vtRNA1-2 IN vtRNA1-3 ... 25
4.2 FILOGENETSKA ANALIZA vtRNA PRI VRETENČARJIH ... 27
4.2.1 Prisotnost vtRNA pri vretenčarjih in nevretenčarjih ... 27
4.2.2 Razvoj človeške vtRNA ... 32
4.2.3 Filogenetska analiza vtRNA1-1 ... 34
4.2.4 Filogenetska analiza vtRNA2-1 ... 39
4.2.5 Filogenetska analiza vtRNA1-2 in vtRNA1-3... 43
5 ZAKLJUČEK ... 45
6 LITERATURA IN VIRI... 47
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
dNTP deoksinukleozid trifosfat
DSE oddaljeno vezavno mesto (distal sequence element) IVA in-vivo združevanje (in-vivo assembly)
LINE1 dolgi razpršeni jedrni element 1 (long interspersed nuclear element) MVP glavni ˝vault˝ protein (major vault protein)
NPC kompleks jedrne pore (nuclear pore complex) PCR verižna reakcija s polimerazo
PSE bližnje vezavno mesto (proximal sequence element)
RNP ribonukleoprotein
snRNA mala jedrna RNA (small nucelar RNA)
TBE TATA vezavni element (TATA biding element) TBP TATA vezavni protein (TATA biding protein)
TEP1 protein povezan s telomerazo (telomerase-associated protein) VPARP ˝vault˝-poli (ADP-riboza) polimeraza (vault-poly (ADP-ribose)
polymerase) vtRNA ˝vault˝ RNA
1
1 UVOD
1.1 VAULT RNA
˝Vault˝ RNA (s kratico vtRNA) je krajše, nekodirajoče zaporedje RNA, ki ga lahko najdemo v kompleksih ˝vault˝ (angl. vault complex) znotraj citoplazme evkariontskih celic. Zaradi nahajanja molekul RNA v kompleksih ˝vault˝ in njene krožne sekundarne strukture, so bile tudi same poimenovane kot ˝vault˝ RNA. Omenjeni kompleksi so ribonukleoproteinski delci, v katerih ribonukleotidni del predstavlja manjšino, okoli 5 odstotkov mase kompleksa, in je vrinjen med proteine[1],[2]. Glede na nizek odstotek RNA v kompleksu ˝vault˝, ta nima pomembnejše strukturne vloge pri sestavi kompleksa. To je bilo tudi dokazano z razgradnjo verig RNA, kompleks pa je še vedno ohranil svojo strukturo. Molekula vtRNA ima tako verjetno funkcionalno vlogo v kompleksu, a ta zaenkrat še ni poznana, kot tudi vloga celotnega kompleksa[3]. Njena sekundarna struktura ji daje stabilnost tudi izven kompleksa, tako da obstoj molekul vtRNA ni vezan samo na komplekse ˝vault˝[3],[4]. Zaporedje vtRNA je bilo res identificirano prvič znotraj kompleksov ˝vault˝, a se večina molekul vtRNA, okoli 95 odstotkov, nahaja samostojno v citoplazmi. Tako predvidevajo, da imajo vtRNA tudi druge vloge pri celičnih procesih, ki niso povezane samo s kompleksi[5]. Molekula vtRNA je pogosto povezana tudi s skupino proteinov La, ki se vežejo na poli-U rep verig vtRNA. Na ta način jo dodatno stabilizirajo, delujejo kot šaperoni za pravilno sekundarno strukturo iz stebel in zank ter jih na koncu lahko transportirajo do kompleksov ¨vault˝[6]. Za sintezo molekul vtRNA je potreben encim RNA-polimeraza III. Znanih je več različnih tipov RNA-polimeraz III, v primeru nekodirajočih vtRNA pa celice uporabljajo tip 3. Tak tip polimeraze najdemo tudi pri translaciji nekodirajoče snRNA (angl. small nuclear RNA), kjer gre za podobno molekulo RNA kot pri vtRNA. Kodirajoče zaporedje za vtRNA vsebujejo tudi poli-T rep, ki deluje kot terminator transkripcije vtRNA[7],[8]. Kasneje lahko pride tudi do cepitve vtRNA na manjše svRNA (angl. small vault RNA). Nastanek teh je reguliran z metilacijo določenih nukleotidov s strani encima NSUN2 (RNA-citozin C5-metiltransferaza), cepitev vtRNA pa opravi endonukleaza DICER. Te svRNA delujejo podobno kot miRNA (angl. micro RNA) in na ta način vplivajo na različne celične procese[5].
1.2 KOMPLEKS ˝VAULT˝
Odkritje same vtRNA je bilo povezano predvsem z odkritjem kompleksa ˝vault˝. Leta 1986 so pri raziskovanju lizosomskih encimov in endocitoze naključno odkrili tako imenovane komplekse ˝vault˝ v pljučnih celicah podgane. Odkriti delci so se po jajčasti obliki razlikovali od iskanih veziklov. Izstopali so predvsem po velikosti 35x65 nm, kar je skoraj enkrat daljše od dolžine ribosomov[4]. Ime izhaja iz morfološke zgradbe, saj spominja oblika na oboke v cerkvah, katerim se v angleščini reče ˝vault˝. Delci ˝vault˝ so z maso 13 MDa zaenkrat največji znani ribonukleoproteinski kompleksi[3],[4]. Poleg
2
vtRNA kompleks sestavljajo še trije različni proteini. Glavni identificiran protein je MVP (angl. major vault protein), ostala pomembna in pogosto prisotna proteina pa sta še TEP1 (angl. telomerase-associated protein) in VPARP (angl. vault-poly (ADP-ribose) polymerase). Samo strukturo kompleksa lahko razdelimo na podenote. Kompleks v obliki sodčka se lahko razdeli na dve simetrični podenoti, vsaka polovica od teh dveh pa še na 8 manjših delov (slika 1). Struktura kompleksov naj ne bi bila povsem fiksna, ampak se sestavi vsaka polovica sodčka po principu zaprte in odprte rože s po osmimi cvetnimi listi. Kasneje se lahko posamezne podenote kompleksa ločeno odprejo ali zaprejo. Sodček je znotraj votel[2],[3].
Slika 1: Skica strukture kompleksa in podenot vtRNA. V zgornji vrstici na levi je prikaz samega kompleksa s treh perspektiv, na desni pa kako naj bi se posamezni »cvetovi« kompleksa odpirali oziroma sploh sestavili v obliko sodčka.
V spodnji vrstici so prikazane skice, kako so po cepitvi samih kompleksov ˝vault˝ izgledali razprti pod mikroskopom, sestavljeni iz osmih podenot. Spodaj desno je še 3D model polovice sodčka[2].
Z ugotovitvijo te delitve in upoštevanjem masnega deleža vtRNA v kompleksu, so prišli do številke 16 vtRNA na kompleks. V posameznih podenotah so dokazali, da se nahaja po več polipeptidnih verig MVP. S krioelektronskim mikroskopom so uspeli pridobiti slike strukture kompleksov ˝vault˝ pri ločljivosti 3 Å. Našteli so 39 polipeptidnih verig v eni polovici, kar pomeni 78 enot MVP v posameznem kompleksu (slika 2)[2],[3]. Točno število posameznih verig ostalih dveh proteinov še ni bilo določeno, predvidevajo pa, da je TEP1 nekje med 2-4 kopije, VPARP pa med 4-16 kopij na kompleks[9]. Proteini VPARP vsebujejo regijo poimenovano INT, preko katere se vežejo na MVP proteine, po vsej verjetnosti znotraj sodčka. Drugi protein TEP1 pa je lociran na vrhovih kompleksov, kjer naj bi se nahajala tudi vtRNA, ki je vezana na te proteine preko RNA-vezavne domene[10],[11].
3
Slika 2: Model polovice kompleksa ˝vault˝, sestavljene s proteini MVP. Na levi je prikaz votle notranjosti, na desni pa stranski prikaz. Z zeleno barvo je označen en protein MVP, vse skupaj pa je vidnih 39 proteinov, ki sestavljajo polovico kompleksa. Ustvarjeno v programu Chimera (koda 4V60).
Funkcija kompleksa ˝vault˝ oziroma vtRNA zaenkrat še ni točno določena, pogosto pa se jih povezuje s procesi kot so transport snovi med jedrom in citoplazmo, celično signalizacijo, popravilo poškodovane DNA in odpornostjo na zdravila v rakavih celicah[5]. Kompleks ˝vault˝ ima podobno obliko kot osrednji del kompleksa jedrne pore (krajše NPC, angl. nuclear pore complex), katerega glavna vloga je prenos snovi v in izven jedra. Kljub podobnemu izgledu, pa si po samem zaporedju nista niti malo podobna.
Do te povezave so prišli zaradi pogostega nahajanja kompleksov ˝vault˝ v bližini teh por.
Ugotovili so celo, da obstajajo določene interakcije med njima. Domnevajo, da bi kompleks lahko deloval kot transporter zdravil iz jedra, zaradi povezave z jedrnimi porami in prisotnostjo v celicah, odpornih na zdravila. Predlagali so tudi, da bi lahko delovali kot prenašalci snovi oziroma zdravil ven iz celice, ne samo iz jedra, saj so kompleksi razpršeni po celotni citoplazmi. Potencial teh kompleksov je, da bi lahko v prihodnosti uporabljali kot markerji za celice, odporne na zdravila oziroma tumorske celice[2],[12]. Vedno bolj se razvija tudi biotehnologija, ki bi izkoriščala komplekse za prenašanje terapevtikov v svoji notranjosti v določene dele celic[11].
4
1.3 PROTEINI V KOMPLEKSU ˝VAULT˝
1.3.1 MVP
V kompleksu ˝vault˝ je v največji količini prisoten MVP (major ˝vault˝ protein), a sta bila poleg njega detektirana še dva proteini v manjšini. MVP je velik 99 kDa in predstavlja kar 70 odstotkov mase celotnega kompleksa. Neodvisno od raziskav o kompleksih ˝vault˝
so ga našli tudi v tumorskih celicah v precej velikih koncentracijah, le da je bil tam poimenovan kot LRP (angl. lung resistance-related protein), se pravi kot protein, ki omogoča rezistenco tumorskim celicam na razna zdravila. Tako je bil LRP protein, ki identificiran kot glavna komponenta kompleksov ˝vault˝, poimenovan MVP. S tem so hkrati pokazali, da se LRP ne nahaja samo v visokih koncentracijah v tumorskih celicah, ampak tudi v povsem normalnih celicah, le da v manjši količini[4],[13]. Posamezne podenote proteina se povežejo v kompleks, začetni in končni del proteina pa se razlikujeta po aminokislinski sestavi, kar se vidi tudi na izgledu celotnega kompleksa. C-konec je odgovoren za sestavo in zavitje zunanjih, ožjih delov kompleksa in je večinoma sestavljen iz α-heliksov. N-konec pa predstavlja širši del kompleksa, kjer pride do povezave obeh polovice, nekaj končnih aminokislinskih ostankov pa se nahaja znotraj delca[14].
1.3.2 TEP1
V kompleksu ˝vault˝ sta bila identificirana še dva proteina z večjo molsko maso, vendar v manjšem koncentracijskem razmerju kot MVP. TEP1 (angl. telomerase-associated component) je 240 kDa velik protein, ki ga poleg v kompleksih ˝vault˝, najdemo tudi kot komponento telomeraznega kompleksa v sesalskih celicah. Kljub temu pa kompleksi
˝vault˝ nimajo nikakršne telomerazne aktivnosti. Vloga proteina TEP1 v kompleksu
˝vault˝ zaenkrat še ni znana, nahajal pa naj bi se na kapi kompleksa. V tem primeru so domene v proteinu tiste, ki ga povezujejo s kompleksom in stehiometrijo. Ena izmed teh domen je RNA-vezavna domena, za katero je bilo dokazano, da se v telomeraznih kompleksih poveže z RNA. Do podobnega stika pride tudi pri vseh različnih tipih vtRNA, ki se vežejo v kompleks ˝vault˝ na to domeno[14]. Druga pomembnejša domena je WD40 domena. Izmenično je sestavljena iz triptofanov (kratica W) in asparaginskih kislin (kratica D) ter se v proteinu ponovi kar 16-krat, kar je v stehiometriji s samim 8- straničnim sodčkom. Ta zaporedja tvorijo 8-stranične beta propelerje, ki bi lahko služili kot osrednji element pri povezovanju vseh stranic. Protein TEP1 se nahaja v več ribonukleoproteinskih kompleksih, poleg kompleksa ˝vault˝ tudi v telomeraznem. Kljub temu pa zaenkrat še ni odkrito, v katerem se nahaja preferenčno. Telomerazni kompleksi se nahajajo v jedru, zato domnevajo, da bi bil kompleks ˝vault˝ lahko prenašalec proteina TEP1 do jedro za te komplekse[15],[16].
5 1.3.3 VPARP
Zadnji pomemben protein kompleksa ˝vault˝ je 193 kDa velik polipeptid, ki je podoben katalitični domeni encima poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP). VPARP (˝vault˝
PARP) ima enako katalitično aktivnost kot encim PARP, vendar imata aminokislinski zaporedji samo 28 odstotno podobnost, kar pomeni, da ima očitno ohranjene ključne dele zaporedja. Encim PARP deluje kot katalizator sinteze polimerne verige ADP-riboz.
Njegova naloga je prenos monomerne ADP-riboze iz substrata NAD+ nase. Tako ustvarja polimere ADP-riboz, preko katerih se odzove na poškodbe DNA, z vezavo teh polimerov na druge proteine, pa zraven vpokliče še druge encime iz DNA-popravljalnih sistemov[14]. V primerjavi s proteinom TEP1, pa VPARP ohrani encimsko delovanje tudi kot del kompleksa ˝vault˝. Ena pomembnejših domen, ki so bile identificirane znotraj proteina VPARP, je domena BRCT (angl. BRCA1 C-terminal), ki se nahaja na N-koncu proteina.
Znana je po vlogi regulacije proteinskih interakcij, je pa nekoliko oddaljena od same katalitične domene in bi lahko delovala kot regulator vezave proteina na sam kompleks oziroma monomere proteina MVP. Koncentracija kompleksov ˝vault˝ se pogosto poveča pri celicah odpornih na zdravila. Mnoga zdravila imajo za tarčo DNA, VPARP pa odpravlja poškodbe DNA. Zaradi več poškodovanih mest na DNA, se posledično poveča koncentracija VPARP v celici, kar domnevajo, da bi lahko vplivalo tudi na povečano sintezo kompleksov[17],[18].
1.4 GEN ZA vtRNA
Pri genu za vtRNA najdemo več različnih regulacijskih mest. Ta mesta pripadajo promotorskima mestoma tipa 2 in 3. Za vezavo encima RNA-polimeraze sta potrebni obe mesti, kar do sedaj še ni bilo najdeno pri nobenih drugih molekulah RNA. Glavne regije promotorskega mesta tipa 2 najdemo znotraj zaporedja vtRNA, medtem ko se te pri tipu 3 nahajajo zunaj kodirajočega zaporedja. Vezava transkripcijskih faktorjev se med obema tipoma razlikuje, obema pa je skupno da preko teh faktorjev aktivirajo RNA-polimerazo III za sintezo vtRNA (slika 3). Izvedena je bila tudi raziskava, kjer so ločeno mutirali obe promotorski mesti in na ta način dokazali, da ob prisotnosti samo enega ne pride do transkripcije. Predvidevajo, da naj bi proteini, vezani na zunanja regulatorna mesta, stabilizirali vezavo transkripcijskih faktorjev na notranja promotorska mesta[7],[12].
Slika 3: Skica gena za vtRNA s potrebnimi regulatornimi regijami tipa 2 in 3. Z odebeljeno sivo črto je označeno vtRNA zaporedje, s tanko pa zaporedje, ki se nahaja pred kodirajočim zaporedjem. Zunanji elementi pripadajo promotorskemu mest tipa 3, notranji pa promotorskemu mestu tipa 2. Zaporedje DSE je oddaljeno in PSE bližnje vezavno mesto za regulatorne molekule. Zaporedje TATA je promotorsko mesto tipa 3, zaporedje A (Box A) in B (Box B) pa sta promotorski mesti tipa 2. S kratico term. je označena terminalni konec zaporedij vtRNA.
6 1.4.1 Promotorsko mesto tipa 2
Pri promotorskem mestu tipa 2 ločimo dva dela, imenovana zaporedje A in B (Box A in Box B), ki pa sta med seboj ločeni zaporedji. Iniciacija transkripcije zahteva prisotnost transkripcijskih faktorjev TFIIIB in TFIIIC. Slednji se večinoma veže na mesto zaporedje B, v manjši meri pa tudi na zaporedje A. Vezava TFIIIC na kodirajočo DNA deluje kot sprožilec za vezavo TFIIIB, ta pa v nadaljevanju rekrutira RNA polimerazo III na mesto za prepis vtRNA[7].
Pri podganah so odkrili gen, kjer sta prisotni dve zaporedji B. Ugotovili so, da je za delovanje pomembna prisotnost vsaj ene izmed obeh. Ob odsotnosti obeh mest zaradi mutacij, ni prišlo do nastanka vtRNA, prav tako je bila transkripcija nekoliko oslabljena, če sta bili obe mesti normalno aktivni. Iz tega je razvidno, da imajo podgane rezervno kopijo, ki pa se skozi evolucijo pri večini organizmov ni ohranila[1],[7].
1.4.2 Promotorsko mesto tipa 3
Pred kodirajočim zaporedjem se nahaja PSE (angl. proximal sequence element), oddaljen nekaj 10 nukleotidov od začetnega mesta prepisovanja navzgor in zaporedje TATA (angl.
TATA box), ki se nahaja vmes med PSE in začetnim mestom prepisovanja. Obstaja tudi DSE (angl. distal sequence element), ki pa je oddaljen od začetnega mesta navzgor približno 300 baznih parov, pomaga pa pri sestavi transkripcijskega kompleksa[19]. Prvi transkripcijski faktor je PSE-vezavni faktor, imenovan tudi SNAPc (angl. snRNA activating protein complex), ki se veže na regulatorno mesto PSE, drugi pa je TBP (angl.
TATA box binding protein), ki se veže na promotorsko mesto TATA. Edina podobnost pri obeh tipih je TFIIIB, ki ga najdemo tudi pri tipu 3 in se veže na omenjena faktorja in rekrutira podobno kot pri tipu 2 RNA polimerazo III. Vloga zunanjih regulatornih in promotorskih mest ter nanje vezanih proteinov je stabilizacija vezave TFIIIC proteina na zaporedje B. Šele kasneje se veže TFIIIB na ta kompleks. Tip 3 naj bi zaenkrat odkrili samo pri vretenčarjih [7].
7
1.5 vtRNA PRI ČLOVEKU
Pri človeku so določili štiri zaporedja vtRNA, poimenovana vtRNA1-1, vtRNA1-2, vtRNA1-3 in vtRNA2-1. Med seboj se razlikujejo po dolžini, sekundarni strukturi in nahajanju na človeškem genomu, skupno vsem štiri pa je, da jih lahko najdemo v kompleksu ˝vault˝. Poleg omenjenih štirih zaporedij, so pri človeku odkrili še dve psevdogeni zaporedji, poimenovani vtRNA2-2 in vtRNA3-1[4].
1.5.1 vtRNA 1
Najprej so bila odkrita tri zaporedja vtRNA, ki so jih poimenovali vtRNA1-1, vtRNA1-2 in vtRNA1-3. Vsa tri zaporedja se nahajajo na petem kromosomu (5q31.3), kar predstavlja tudi številka ena v njihovih kraticah. Med seboj so oddaljena nekaj tisoč baznih parov, se pa vsa tri zaporedja nahajajo znotraj genov ZMAT2 (angl. Zinc Finger Matrin Type-2) in PCHDA1 (angl. Protocadherin alpha 1) [20]. Umeščenost v genom je povsem naključna in sama zaporedja vtRNA nimajo nobene povezave s sosednjimi geni.
Prvo izmed zaporedij, vtRNA1-1 je dolgo 98 nukleotidov. Na genomu mu sledita zaporedji vtRNA1-2 in vtRNA1-3, ki sta dolgi 88 nukleotidov in sta najkrajši zaporedji vtRNA pri človeku[21].
1.5.2 vtRNA 2
Zaporedje vtRNA2-1 se nahaja na istem kromosomu kot prvi trije, le da se ta nahaja na drugem lokusu (5q31.1), kar je v kratici označeno s številko 2. vtRNA2-1 je edino zaporedje na tem lokusu, na katerem ni prišlo do nobene duplikacije. Po sami dolžini je vtRNA 2-1 najdaljše zaporedje od vseh zaenkrat potrjenih vtRNA, saj je ima 108 baznih parov[21]. Na človeškem genomu se nahaja vmes med genoma SMAD5 in TGFB1. Gen SMAD5 spada v družino genov SMAD, ki zapisujejo istoimenske proteine in imajo vlogo pri prenosu signala za sintezo TGF-β receptorjev. Na drugi strani vtRNA 2-1 pa imamo gen TGFB1, ki pa vsebuje informacije za zapis TGF-β 1 (angl. Transforming Growth Beta Factor 1). Omenjeni faktor spada med citokine in ima pomembno vlogo pri nadzorovanju celične rasti, proliferaciji, diferenciaciji in na koncu apoptozi celice.
Lokacija v bližini gena SMAD5 ni zgolj naključje, ampak je vtRNA2-1 tudi funkcionalno povezana s TFG-β 1 signalizacijo. Ugotovili so, da je bilo vtRNA2-1 zaporedje povezano tudi z drugimi procesi, ne samo kompleksi ˝vault˝. Pod imenom nc886, ki velja za enako zaporedje kot vtRNA2-1, le da je to krajše za 1 nukleotid na 5´koncu in za 7 nukleotidov na 3´koncu, je bila vtRNA2-1 povezana z rakavimi celicami. TGF-β faktor, katerega kodirajoče zaporedje se nahaja na sosednjem genu, sproži sintezo nc886, ta pa se nato veže na encim DICER in prepreči zorenje miRNA. Nižje število miRNA v celice privede v pospešeno tumorogenezo[20],[22]. Deluje tudi kot inhibitor protein kinaze R (PKR) z vezavo nanj. Ta deluje kot proapoptotski faktor in v primeru, ko pride v rakavih celicah do hipermetilacije CpG otočkov ter posledično inhibicije transkripcije nc886, to privede do celične smrti[23].
8
1.5.3 Sekundarna struktura vtRNA pri človeku
Sekundarne strukture posameznih človeških vtRNA lahko vidimo na sliki 4. Obarvana so območja vtRNA, ki se najpogosteje ohranijo, potrebna pa so tudi za vezavo encima RNA- polimeraze. Z rumeno barvo je obarvano zaporedje, ki pripada mestu zaporedju A (Box A), z rdečo pa zaporedju B (Box B). Pri sekundarnih strukturah je poleg omenjenih zaporedij ohranjena tudi struktura spodnjega dela, kjer se stikata začetek in konec molekule vtRNA, ven iz strukture pa izstopa poli-U rep, sestavljen iz štirih uracilov.
Največje razlike se nahajajo v lasnicah osrednjega dela, kar je razvidno tudi iz samih poravnav zaporedij. Izjema je vtRNA2-1, ki ima za poli-U repom še šest nukleotidov, a ti enako kot poli-U rep visijo ven iz sekundarne strukture[1],[24].
Slika 4: Sekundarna struktura človeških vtRNA. Strukture izhajajo iz zaporedij vtRNA pridobljenimi v podatkovni bazi NCBI, izrisane pa v spletnem orodju RNAfold.
1.6 PSEVDOGENI
Predstavnika človeških psevdogenov sta vtRNA2-2 in vtRNA3-1. vtRNA2-2 se nahaja na drugem kromosomu (2p14) in je dolg 103 bazne pare, vtRNA3-1 pa na kromosomu X (Xp11.22) in je dolg 102 bazna para. Psevdogene je pogosto težko ločiti od samih kodirajočih zaporedij. Poznamo dve vrsti psevdogenov – procesirani in neprocesirani.
Neprocesirani psevdogeni nastanejo kot posledica duplikacija starševskega zaporedja.
Skozi čas pride do različnih insercij, delecij in mutacij, ki privedejo do zmanjšanja produktivnosti, izražanja in funkcije RNA, ohranijo pa se introni. Procesirani psevdogeni pa zaradi retrotranspozicije izgubijo 5´-promotorsko regijo in introne, medtem ko so zanje značilne terminalne ponovitve in poliadenilacijska oznaka[25],[26].
9
2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE
LINE1 (angl. long interspersed nuclear element) je avtonomni transpozicijski element iz skupine dolgih razpršenih jedrnih elementov. Za potek retrotranspozicije sta poleg LINE1 obvezna še proteina ORF1p in ORF2p. Protein ORF1p vsebuje domeno z motivom za prepoznavo RNA. Študije iCLIP so pokazale, da je ena izmed RNA, ki se vežejo na protein ORF1p tudi vtRNA1-1. V magisterski nalogi Valentine Novak so preučili, kakšen je dejanski vpliv vtRNA1-1 na retrotranspozicijo LINE1[27].
Namen laboratorijskega dela diplomske naloge je bil tako pripraviti vektorje s primernim promotorskim mestom za izražanje vseh treh človeških vtRNA1. Te vektorje smo pripravili z namenom nadaljnje študije vpliva in interakcij zaporedij vtRNA1-2 in vtRNA1-3 v sesalskih celicah. Posamezna človeška zaporedja vtRNA smo s tehniko IVA (in-vivo assembly) vstavili v vektor pcDNA-U6.
Namen teoretičnega dela diplomske naloge je bila analiza filogenetskih odnosov posameznih zaporedij vtRNA. Želeli smo odkriti, če se filogenetska drevesa, izrisana na osnovi vretenčarskih vtRNA, ujemajo s filogenetskim razvojem vrst. Pri določenih odstopanjih smo želeli utemeljiti le-ta z dodatnimi poravnavami zaporedij.
HIPOTEZE
Z metodo IVA bomo uspeli pripraviti vektorje pcDNA3.1-U6 z zapisi za človeške vtRNA1-1, vtRNA1-2 in vtRNA1-3.
Filogenetski odnosi vretenčarskih vtRNA se skladajo z evolucijskem razvojem vrst.
10
11
3 MATERIALI IN METODE
3.1
MATERIALI- Laboratorijski del
Materiali so razdeljeni glede na posamezne korake med izvajanjem poskusa
3.1.1 Verižna reakcija s polimerazo Aparatura:
PCR ABI Veriti 96 (Thermo Fisher Scientific, ZDA) – aparatura za izvedbo PCR- reakcije
Reagenti in pufri:
5× pufer Phusion High-Fidelity
mešanica vseh dNTP-jev
začetni smerni in protismerni oligonukleotidi:
5731IVAVTF; 31IVAVTR
31IVA12F; 31IVA12R
31IVA13F; 31IVA13R
31IVAPLF; 5731IVAPLR
matrice za pomnoževanje vtRNA:
pcDNA3_vaultRNA1-1+S1m;
pcDNA3_vaultRNA1-2+S1m;
pcDNA3_vaultRNA1-3+S1m;
pcDNA3.1-U6 – matrična DNA za pomnoževanje vektorjev
Phusion Hot Start II HF DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific, ZDA
restrikcijska endonukleaza DpnI (Thermo Fisher Scientific, ZDA)
3.1.2 Agarozna gelska elektroforeza (AGE) Aparatura:
kadička Owl (Thermo Fisher Scientific, ZDA) Reagenti in pufri
PCR SuperMix reagenti(Invitrogen, ZDA) – za izvedbo PCR na osnovi kolone
agar (Sigma-Aldrich, ZDA)
pufer TAE: 40 mM tris/HCl, 20 mM ocetna kislina, 1 mM EDTA, pH 8,0
6× nanašalni pufer: 10 mM tris/HCl, pH=7,6; 0,03-odstotni bromfenol modrega, 60-odstotni glicerol
Označevalci velikosti DNA
12
GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, ZDA) – za vektorsko DNA
GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, ZDA) – za inserte
QuickLoad Purple 1 kbp DNA Ladder (New England Biolabs, ZDA)
QuickLoad Purple 100 bp DNA Ladder (New England Biolabs, ZDA)
3.1.3 Transformacija bakterijskih celic E.coli, seva DH5α Aparature:
inkubator BD23 (Binder, Nemčija)
termoblok Mini Dry Bath (Starlab, Belgija) Reagenti in pufri:
bakterijski sev Escherichia coli DH5α
mešanica vektorja pcDNA3.1-U6 in posameznih insertov vtRNA pripravljenih s PCR-reakcijo
LB trdno gojišče: 1-odstotni pepton; 0,5-odstotni kvasni ekstrakt; 1-odstotni NaCl; 2-odstotni agar
Dodatek ampicilina (100 μg/mL)
3.1.4 Izolacija vektorske DNA Aparature:
stresalnik Sanyo orbital incubator (Panasonic, Japonska)
spektrofotometer NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, ZDA) Reagenti in pufri:
komplet za izolacijo plazmidne DNA GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, ZDA
13 3.1.5 Vektorji
Spodaj sta vektorski karti vektorjev, ki smo ju uporabili pri pripravi insertov vtRNA in vektorja pcDNA3.1-U6 za homologno rekombinacijo. Na sliki 5 je vektor pcDNA3.1- U6, ki že vsebuje promotor U6 in v katerega bomo za promotorskim mestom vstavljali inserte vtRNA. Na sliki 6 pa je prikazan vektor, iz katerega smo izolirali vtRNA1-3, a sta vektorja za ostali vtRNA enaka, razlikujeta se le po zaporedje vtRNA znotraj vektorja.
Slika 5: Vektorska karta pcDNA3.1-U6. Vektor je bil uporabljen za vstavljanje insertov vtRNA. Vektor smo pomnožili z začetnimi oligonukleotidi 31IVAPLF in 573IVAPLR in s tem pripravili vektor, ki je primeren za kasnejšo homologno rekombinacijo po postopku IVA. Karta je bila izdelana v programu SnapGene.
Slika 6: Vektorska karta pcDNA3_vaultRNA1-3+S1m. Predstavljen je vektor, iz katerega smo pomnožili inserte vtRNA1-3 za nadaljnje kloniranje. Z oranžno barvo je označeno mesto vtRNA1-3. Pri pomnoževanju ostalih dveh zaporedij vtRNA (vtRNA1-1 in vtRNA1-2), smo uporabili enak vektor z ustrezno vtRNA. Vektor smo pomnožili z začetnimi oligonukleotidi 31IVA13F in 31IVA13R. Karta je bila izdelana v programu SnapGene.
14
3.2 METODE – Laboratorijski del
Pri laboratorijskem delu diplomske naloge smo poskušali pripraviti primeren vektor, ki bi vseboval zaporedja posameznih vtRNA zaporedij in bi bil primeren tudi za kasnejše izražanje v sesalskih celicah. Pripravili smo ga po metodi sestavljanja in vivo (IVA).
Pri tej metodi gre za izvedbo homologne rekombinacije v bakterijskih celicah E.coli, deluje pa preko recA neodvisnega sistema. Omenjeni sistem se izkorišča pri kloniranju v določenih sevih E.coli, kot so DH5α, XL-10, TOP10. Pri tej homologni rekombinaciji lahko pride do združitve nekega inserta in vektorja, pri tem moramo predčasno dodati prekrivajoča zaporedja na obe zaporedji, ki so dolga nekje med 15 in 20 nukleotidi.
Primerne inserte in vektorje najlažje pridobimo preko PCR-reakcije, kjer so prekrivajoča zaporedja vezana na začetne oligonukleotide[28].
3.2.1 Priprava začetnih nukleotidov
Posamezno vtRNA smo pomnožili z ustreznim parom začetnih oligonukleotidov. Pri pomnoževanju vektorja smo potrebovali le en par začetnih oligonukleotidov, saj gre za enoten vektor pri vseh kasnejših homolognih rekombinacijah. Pri načrtovanju začetnih oligonukleotidov za inserte smo upoštevali zaporedja, ki se prilegajo vtRNA in dodatek potreben za homologno rekombinacijo (tabela 1).
Tabela 1: Tabela z uporabljenimi začetnimi oligonukleotidi pri pomnoževanju insertne vtRNA in osnovnega vektorja po metodi IVA. Pri smernih začetnih oligonukleotidih za inserte vtRNA, se del označen z rdečo ujema z protismernim začetnim oligonukleotidom vektorja pcDNA3.1-U6. Z modro je označen del protismernih začetnih oligonukleotidov za vtRNA, ki pa se prilegajo k smernemu začetnemu oligonukleotidu vektorja pcDNA3.1-U6. Ti deli so pomembni za homologno rekombinacijo, ostala črno obarvana zaporedja pa prileganju na zaporedja vtRNA.
Ime Oznaka Zaporedje
vtRNA1-1 forward
5731IVAVTF CTTGTGGAAAGGACGAAACACC
GGCTGGCTTTAGCTCAGC vtRNA1-1
reverse
31IVAVTR CTGGTTCTTTCCGCCTCAG AA
AAAAGGACTGGAGAGCGC vtRNA1-2
forward
31IVA12F CTTGTGGAAAGGACGAAACACC
GGCTGGCTTTAGCTCAGC vtRNA1-2
reverse
31IVA12R CTGGTTCTTTCCGCCTCAG AA
AAAAGAGCTGGAAAGCACC vtRNA1-3
forward
31IVA13F CTTGTGGAAAGGACGAAACACC
GGCTGGCTTTAGCTCAG vtRNA1-3
reverse
31IVA13R CTGGTTCTTTCCGCCTCAG AA
AAAAGAGGGCTGGAGAGC pcDNA3.1-U6 forward 31IVAPLF CTGAGGCGGAAAGAACCAG pcDNA3.1-U6 reverse 573IVAPLR GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG
15
3.2.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR-reakcija)
Ločeno smo pripravili PCR-reakcije za vektor in tri inserte (vtRNA1-1, vtRNA1-2 in vtRNA1-3). V posamezne centrifugirke smo po protokolih pripravili mešanice za PCR- reakcije. Za pripravo vektorja smo vzeli vektor pcDNA3.1-U6 (slika 5), za pripravo insertov vtRNA pa vektor pcDNA3_vtRNA+S1m (slika 6).
Tabela 2: Sestava mešanice za pomnožitev posameznih insertov vtRNA s PCR-reakcijo.
komponenta Volumen [μL] Končna količina
5× pufer Phusion HF 4,0
10mM dNTP 0,4 Vsak 200 μM
smerni zač. oligo. 31IVA (VTF; 12F;
13F;) (10 μM)
0,2 0,1 μM
protismerni zač. oligo. 31IVA (VTR;
12R; 13R) (10 μM)
0,2 0,1μM
matrična DNA: (2,55 ng/μL) pcDNA3_˝vault˝RNA1-1+S1m;
pcDNA3_˝vault˝RNA1-2+S1m;
pcDNA3_˝vault˝RNA1-3+S1m;
0,4 1 ng
DNA-polimeraza Phusion Hot Start II (2 U/ μL)
0,2 0,4 U
MQ voda 14,8
skupaj 20
Tabela 3: Sestava mešanice za pomnožitev vektorjev s PCR-reakcijo.
komponenta Volumen
[μL]
Končna količina
5× pufer Phusion HF 4,0
10mM dNTP 0,4 Vsak 200 μM
smerni zač. oligo. 31IVAPLF (10 μM) 0,2 0,1 μM protismerni zač. oligo. 31IVAPLF (10 μM) 0,2 0,1μM matrična DNA pcDNA3.1-U6 (2,92 ng/μL) 0,3 0,9 ng DNA-polimeraza Phusion Hot Start II (2 U/
μL)
0,2 0,4 U
MQ voda 14,7
skupaj 20
16
Tabela 4: Program za PCR pomnožitev posameznih vtRNA. Zaradi različnih začetnih oligonukleotidov, ima vsaka posamezna vtRNA svojo temperaturo za prileganje in pomnoževanje.
Temperatura [°C] Časovni interval [s] Število ciklov
98 30 1
98 10
60,2 (vtRNA1-1) 59,1 (vtRNA1-2) 57,8 (vtRNA1-3)
30 18
72 3
72 600 1
Tabela 5: Programa za PCR pomnožitev vektorske pcDNA3.1-U6.
Temperatura [°C] Časovni interval [s] Število ciklov
98 30 1
98 10
61 30 18
72 140
72 600 1
Po izvedenem pomnoževanju s PCR-reakcijo, smo odvzeli po 5 μL mešanice za nanos na agarozni gel in dodali še po 1 μL 6× nanašalnega pufra. Ostalim 15 μL mešanice smo dodali 0,5 μL restriktaze Dnp I (10 U/μL), ki razgradi metilirano DNA, v tem primeru matrico DNA. Na ta način dobimo samo pomnožena zaporedja in pričakujemo na agaroznem gelu samo eno liso. Poleg encima smo dodali še 1,15 μL 10× pufra Tango.
3.2.3 Agarozna gelska elektroforeza (AGE)
Za ugotavljanje prisotnosti posameznih zaporedij smo uporabljali agarozni gel različne zamreženosti. Pri daljših vektorskih zaporedjih smo uporabili 1-odstotni, pri insertih pa 2-odstotni agarozni gel. Agarozo smo raztopili v pufru TAE. Po ohlajanju agaroznega gela smo dodali etidijev bromid s končno koncentracijo 5 μg/mL. Agarozni gel smo nato prelili v kadičke, kjer se je strdil. Izbor velikosti kadičke je bil glede na število vzorcev, s tem povezana pa je bila tudi uporabljena konstantna napetost (10 V/cm gela). Pred nanosom vzorcev smo jim dodali primerno količino 6× nanašalnega pufra. Poleg vzorcev se doda še standard velikosti.
17
3.2.4 Transformacija bakterijskih celic E.coli, seva DH5α
Za transformacijo smo uporabili kompetentni sev DH5α bakterijskih celic E.coli. Vzeli smo 100 μL celic, jih odtalili na ledu, k njim pa dodali še med 50-100 ng insertov in vektorske DNA. DNA insertov in vektorjev še ni bila povezana in smo ju ločeno tudi dodali k bakterijskim celicam, kjer je potekla homologna rekombinacija po recA neodvisnem sistemu. Mešanico celic in DNA smo inkubirali na ledu 15 minut, nato pa izvedli toplotni šok 45 sekund pri 42 °C . Celice smo dali za kratek čas nazaj na led, nato pa dodali še gojišče LB in inkubirali pri 37 °C, da so si celice opomogle od toplotnega šoka. Po inkubaciji in stresanju smo nanesli 50 μL na trdno gojišče LBA in inkubirali preko noči, tako da so zrastle samo uspešno transformirane kolonije.
3.2.5 Verižna reakcija s polimerazo na osnovi kolonije (colony PCR)
Namen ponovne verižne reakcije s polimerazo na osnovi kolonije je, da preverimo uspešnost homologne rekombinacije in če sta se izbrani insert in vektor povezala v skupen vektor, ki se je podvojeval v bakterijskih celicah. Z nastavkom smo prenesli kolonijo s trdnega gojišča v mikrocentrifugirko, kjer smo predhodno že povsod dodali reagente za PCR-reakcijo.
Tabela 6: Sestava mešanice za pomnoževanje dela rekombinantnega vektorja na osnovi kolonije. PCR supermix je sestavljen iz vseh štirih dNTP-jev in Taq polimeraze.
komponenta Volumen [μL] Končna količina
PCR supermix 22,5 1×
smerni zač. oligo. 31IVAPLF (10 μM)
0,5 0,2 μM
protismerni zač. oligo.
31IVAPLF (10 μM)
0,5 0,2 μM
MQ voda 1,5
skupaj 25
18
Tabela 7: Program za PCR pomnoževanje rekombinantnega vektorja.
Temperatura [°C] Časovni interval [s] Število ciklov
94 300 1
94 15
53 30 35
72 7
72 600 1
Nastale produkte pri PCR na osnovi kolonije smo preverili na agaroznem gelu, ki smo ga pripravili po istem postopku in količinah, kot so opisane v poglavju 3.2.3.
3.2.6 Izolacija vektorske DNA
Pripravili smo prekonočno kulturo bakterijskih celic s koncentracijo 1 kolonija /5 μL gojišča LBA. Za izolacijo vektorske DNA smo uporabili komplet za izoliranje plazmidov DNA GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Po izvedeni izolaciji smo preverili še koncentracijo in čistost same vektorske DNA na spektrofotometru NanoDrop.
3.2.7 Določanje nukleotidnega zaporedja vektorske DNA
Nukleotidno zaporedje so določili v podjetju Eurofins Genomics, kjer uporabljajo metodo sekvenciranja po Sangerju. Pripravili smo 1 μL raztopine, ki je vsebovala med 400 in 500 ng vektorske DNA, zraven pa dodali še 2,5 μL začetnih oligonukleotidov s koncentracijo 10 μM. Uporabili smo začetne oligonukleotide za promotorsko mesto U6.
Na koncu smo dodali še dH2O do 10 μL in vzorce poslali na sekvenciranje.
19
3.3 METODE - Teoretični del
3.3.1 Iskanje zaporedij vtRNA
Iskanja zaporedij smo se lotili na podlagi človeških vtRNA, ki so od vseh najbolj raziskana in imajo točno določeno, katera zaporedja so psevdogeni. Za nadaljnja iskanja drugih ortologov, pa smo uporabili različna spletna bioinformatska orodja.
Točna nukleotidna zaporedja za človeške vtRNA smo našli v zbirki podatkov NCBI pod kategorijo Gene. Večina ortologov je bilo poiskanih preko spletnega mesta Ensembl pod kategorijo Orthologues, do katerega smo dostopali preko direktne povezave iz zbirke podatkov NCBI[21],[29]. Zaporedja so imeli različne odstotke prekrivanja s človeškimi vtRNA, uporabili pa smo vsa zaporedja, tudi tista z nekoliko nižjim prekrivanjem.
Najnižji organizmi so imeli okoli 40 odstotno prekrivanje, a ker smo izrisali filogenetsko drevo vseh vretenčarjev, so tudi ta prišla v poštev. Dodatna iskanja smo izvedli še preko programa BlastN, kjer smo preko človeških zaporedij iskali podobna zaporedja na genomih drugih živali[30]. Tukaj smo za mejo postavili vrednost E in vzeli predstavnike, ki so imeli višjo vrednost od 0 in niso bili še najdenih preko orodja Ensembl. Večina zadetkov, ki smo jih uporabili pri nadaljnjih analizah, smo dobili s programom Ensembl, le par predstavnikov pa tudi preko BlastN.
Na koncu smo zbrali 57 zaporedij vtRNA1-1 in 54 zaporedij vtRNA2-1. Pri vtRNA1-2 in vtRNA1-3 smo našli manj ortologov in naredili kar skupno drevo, glede na visoko podobnost zaporedij. Pri nekaterih organizmih je prišlo tudi do več zadetkov, upoštevali pa smo tistega, ki je imel najvišjo podobnost s človeškim zaporedjem vtRNA.
3.3.2 Primerjava zaporedij
Zbrane podatke vseh vtRNA smo zbrali v Excell datoteki in jih uredili glede na njihove lastnosti. Zbrane podatke smo pripravili v FASTA formatu, saj smo lahko edino na ta način izvedli poravnavo. Za poravnavo zaporedij smo uporabljali program Clustal Omega. Pri poravnavi smo uporabili že pripravljene nastavitve, brez spreminjanja parametrov. Clustal Omega nam je poleg same poravnave nukleotidnih zaporedij podal tudi filogenetsko drevo[31]. Pri določenih zaporedjih, kjer smo rabili same nukleotide obarvane zaradi lažje razlage, pa smo uporabili kar orodje MUSCLE, ki že privzeto obarva zaporedja glede na stopnjo poravnanosti. Tudi pri tem smo uporabili že nastavljene parametre[32].
20
3.3.3
Izris filogenetskega drevesaZa izris filogenetskega drevesa za diplomsko nalogo smo uporabili dve različni orodji.
Najprej smo to naredili na spletni strani Phylogeny.fr, kjer smo uporabljali program One click, ki izvede vse od začetka, se pravi poravna zaporedja med seboj in do konca, ko izriše drevo[33]. Vsi parametri so že samodejno določeni in jih nismo spreminjali. Pri tej možnosti One click pride v prvem koraku do poravnave v spletnem programu MUSCLE[32]. Ta program deluje na principu hitrega iskanja podobnih krajših zaporedij (angl. k-tuple) znotraj celotnih zaporedij, brez da bi zaporedja poravnal med seboj. Ta tehnika je zelo hitro, vendar manj natančna kot pri ostalih orodjih. Po poravnavi vseh zaporedij drugi program, imenovan Gblocks[34], preveri učinkovitost poravnave več zaporedij. V tretjem koraku program PhyML[35] sestavi filogenetsko drevo in poda osnovne podatke o filogenetskem drevesu. Program temelji na algoritmu ML (angl.
Maximum likelihood) in primerja poravnana zaporedja z vzorci evolucijskega razvoja, ki se najbolj približajo tem zaporedjem in na podlagi tega zgradi filogenetsko drevo. V zadnjem koraku se izriše končno filogenetsko drevo s programom TreeDyn[36]. Omenjeni program nam poda tudi sorodnosti posameznih zaporedij med seboj. Zaradi samega kasnejšega urejanja filogenetskega drevesa smo podatke iz dobljenega filogenetskega drevesa v obliki Netwick prenesli in odprli v programu iTOL[37]. Ta nam je omogočil barvanje posameznih predelov drevesa, hkrati pa je bilo na voljo tudi več dodatnih možnosti za urejanje filogenetskega drevesa. Pri drugem načinu smo začetno poravnavo zaporedij izvedli kar v orodju Clustal Omega, s privzetimi nastavitvami[31]. Ta program nam omogoči izpis podatkov v formatu, primernem za nadaljnje oblikovanje v programu iTOL. Orodje Clustal Omega uporablja za sestavo filogenetskega orodja, metodo NJ (angl. neighbour - joining), kjer najprej zaporedja združi v pare zaporedij, ki so si med seboj najbolj podobni, potem pa naprej te pare primerja med seboj. Ta metoda je načeloma slabša za sestavo filogenetskih dreves v primerjavi z PhyML. Vseeno smo večinoma smo izhajali iz dreves, narejenih v programu Clustal Omega.
21
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 PRIPRAVA KONSTRUKTOV ZAPOREDIJ INSERTOV ČLOVEŠKIH vtRNA1
Konstrukte smo pripravili s kloniranjem IVA. Ločeno smo pomnožili zaporedje vektorja pcDNA-U6 in zapise za posamezne človeške vtRNA1 (1-1,1-2 in 1-3). Pomnožene DNA smo vnesli v bakterijske celice E.coli DH5α, kjer je potekla rekombinacija, da se je zapis za vtRNA vnesel v vektor.
4.1.1 Pomnoževanje vektorske DNA
Uspešnost pomnoževanja vektorske DNA smo preverili z AGE. Pri vektorjih smo izvedli tri PCR-reakcije za vzorec, da bi dobili dovolj izoliranega vektorja z dodatnimi prekrivajočimi nukleotidi za nadaljnjo homologno rekombinacijo. Na sliki 7 je razvidno, da smo uspeli pomnožiti vektor v vseh treh vzorcih, saj imamo v vsakem stolpcu le po eno liso, ki se nahaja nekje pri 4500 baznih parih. Točna velikost vektorja pcDNA3.1-U6 je 4653 baznih parov. Ker gre za precej dolga zaporedja, so lahko odstopanja večja, saj so lise standarda velikosti pri večjih vrednostih bolj skupaj. V tem primeru lahko vseeno trdimo, da imamo na gelu samo vektorsko DNA, brez dodatnih motečih molekul. Liso so strnjene, kar pomeni da ni prišlo do nobenih dodatno zvitih struktur po pomnoževanju s PCR-reakcijo.
Slika 7: PCR pomnoževanje vektorja pcDNA3.1-U6 za kloniranje s tehniko IVA. Prikazana je pomnožitev vektorjev pcDNA3.1-U6 (plU6), ki je bila izvedena v treh vzporednih vzorcih. AGE je bila izvedena v 1-odstotnem agaroznem gelu. Bp je kratica za bazni par, ST za standard velikosti.
22 4.1.2 Pomnoževanje insertov človeških vtRNA
Namnožili smo tudi zaporedja za posamezne inserte vtRNA (vtRNA1-1, vtRNA1-2 in vtRNA1-3). Poleg samih produktov PCR smo dodali še slepi vzorec, ki ne vsebuje zaporedij vtRNA in produkt PCR ne bi smel nastati. Pozitivne rezultate smo dobili pri vzorcih vtRNA1-2 in pri vtRNA1-3, medtem ko lise ni bilo vidne pri vtRNA1-1 (slika 8).
Od vseh treh zaporedij, so bili ti postopki že izvedeni za vtRNA1-1, zato smo bili edino za to zaporedje sigurni, da se začetni oligonukleotidi vežejo nanj in bi morala nastati lisa.
Zaradi istega razloga poskusa nismo ponavljali, saj smo že imeli pripravljen vektor.
Izkazalo se je, da je moralo priti do napake med samim postopkom priprave mešanice za PCR-reakcijo. Lise se tokrat nahajajo pri krajših dolžinah baznih parov pri dolžini okoli 150 baznih parov. Podatki o dolžinah vtRNA s spleto so, da imata vtRNA1-2 in vtRNA1- 3 po 88 baznih parov, vtRNA1-1 pa 98 baznih parov. Upoštevati je potrebno še dodatek na začetnih oligonukleotidih zaradi kasnejše homologne rekombinacije. Pri vseh treh zaporedjih vtRNA je bilo dodano isto število nukleotidov, saj vse vstavljamo v isti vektor.
Na smerne začetne oligonukleotidu smo dodali po 22 nukleotidov, na protismernem pa 21, kar skupaj nanese dodatnih 43 nukleotidov k samim zaporedjim vtRNA. Tako dobimo dolžino 131 baznih parov pri vtRNA1-2 in vtRNA1-3 in 141 baznih parov pri vtRNA1- 1. Tako lahko za obe zaporedji s pozitivnima rezultatoma trdimo, da imamo prisotno vtRNA na agaroznem gelu.
Slika 8: PCR pomnoževanje treh različnih vrst človeških vtRNA zaporedij (vtRNA1-1, vtRNA1-2 in vtRNA1-3).
Pripravili smo 2-odstoten agarozni gel. Dobili smo lise pri vtRNA1-2 in vtRNA1-3 pri okoli 150 baznih parih. Pri vtRNA1-1 lisa ni vidna, torej same vtRNA ni bilo prisotne v tem vzorcu, tako kot pri slepem vzorcu.
23
4.1.3 Preverjanje novih konstruktov pcDNA-U6-vtRNA
S postopkom IVA smo pripravili nove konstrukte vektorja pcDNA-U6 tako, da smo pomnožen vektor in zapise za vtRNA1-2 ter vtRNA1-3 vnesli v celice E.coli DH5α.
Zaradi enakih ustreznih koncev je v celici potekla homologna rekombinacija in nastal je vektor z zapisom za posamezno vtRNA. Uspešnost same rekombinacije smo po transformaciji preverili na agaroznem gelu s PCR na osnovi kolonije (slika 9). Pri začetni PCR-reakciji nam ni uspelo dobiti pozitivnih rezultatov za vtRNA1-1, zato smo v nadaljevanju uporabljali samo vtRNA1-2 in vtRNA1-3. Vzporedno smo nanesli dva vzorca posamezne vtRNA na agarozni gel (VZ1 in VZ2). Za PCR-reakcijo na osnovi kolonije smo uporabili iste začetne nukleotide kot pri začetni pomnožitvi zaporedij vtRNA. Ta niso bila najbolj primerna, saj se lahko vežejo tudi na inserte vtRNA, ki niso še vključeni v vektor znotraj bakterijskih celic in ne na sam rekombinanten vektor. Tako lahko pride do lažne pozitivnosti, a žal drugih nismo imeli na voljo.
Slika 9: PCR na osnovi kolonije za konstrukta pcDNAU6-vtRNA1-2 in vtRNA1-3. V obeh primerih smo preverili po 2 koloniji: VZ1 in VZ2. Pozitivna kontrola je pcDNA3.1-vtRNA1-2+S1m za vtRNA1-2 in pcDNA3.1-vtRNA1- 3+S1m za vtRNA1-3. Oba vektorja smo v začetnem koraku uporabili pri pomnožitvi zaporedij vtRNA. Negativna kontrola je prazen vektor pcDNA3.1-U6.
Pri vtRNA1-3 smo dobili take rezultate, kot smo pričakovali (slika 9). Pri vtRNA1-2 pa so bila odstopanja pri pozitivni kontroli. Za pozitivno kontrolo smo uporabili vektorje, iz katerih smo na začetku pomnožili zaporedja vtRNA, tako da smo pričakovali liso vzporedno z vzorci. Poskus z vtRNA1-2 smo zato še enkrat ponovili (slika 10). Tokrat smo dobili pričakovan rezultat. Lise vzorcev se nahajajo pri dolžini 150 baznih parov, kar se precej ujema z dolžino vtRNA skupaj z dodatki na začetnih nukleotidih, ki ima 131 baznih parov.
24
Slika 10: PCR pomnoževanje na osnovi kolonije za vektor pcDNA3.1-U6_vtRNA1-2. S ponovitvijo smo dokazali, da je reakcija pravilno potekla, ker je bila lisa tudi pri pozitivni kontroli.
Za pozitivno kontrolo smo vzeli vektorja pcDNA3.1-vtRNA1-2+S1m za vtRNA1-2 in pcDNA3.1-vtRNA1-3+S1m za vtRNA1-3. Oba vektorja smo uporabili že na samem začetku za pomnožitev zaporedij vtRNA in se začetni oligonukleotidi preverjeno vežejo nanju. Za negativno kontrolo smo vzeli prazen pcDNA3.1-U6 vektor in načeloma ne bi smelo biti nič, vendar vidimo liso pri vrednostih blizu 100 baznih parov. Možna razlaga je nastanek dimerov med začetnimi oligonukleotidi. Ostale lise pri vzorcih in pozitivnih kontrolah so ustrezne.
4.1.4 Izolacija konstruktov
Pri preverjanju uspešnosti rekombinacije s pomočjo PCR na osnovi kolonije, smo isto kolonijo razmazali na trdo gojišče LBA. Naslednji dan smo pripravili 5 ml prekonočne kulture izbrane kolonije in iz nje izolirali vektorsko DNA. Koncentracije vzorcev so zbrane v tabeli 8. Izolirali smo dovolj velike količine vektorske DNA. Vrednost A260/A280 nam pove, da je sama DNA precej čista, očitno pa so v vzorcih še vseeno prisotne molekule RNA. Vrednost A260/A230 pa še dodatno opredeli čistost vzorca.
Pove nam, če so prisotne še druge nečistoče, kot npr. organska topila, ki bi lahko negativno vplivale na nadaljnje korake. Pri tem je najbolj optimalna vrednost okoli 2,2, čemur smo se zelo približali tudi z našimi rezultati.
Tabela 8: Koncentracije konstruktov pcDNA3.1-U6_vtRNA1-3 in pcDNA3.1-U6_vtRNA1-3.
Koncentracija [ng/mL] A260/A280 A260/A230
vtRNA1-2 419,7 1,88 2,20
vtRNA1-3 417,8 1,88 2,22
25
4.1.5 Sekvenciranje izoliranih vtRNA1-2 IN vtRNA1-3
Spodaj so predstavljeni rezultati sekvenciranja posameznih zaporedij vtRNA (slika 11).
Za sekvenciranje smo poleg rekombinantnih vektorjev zraven dodali še smerni začetni oligonukleotid 57U6BamHIF, ki se veže na začetek promotorskega mesta U6. V obeh primerih vtRNA je bilo popolno ujemanje, primerjavo pa smo naredili z orodjem Clustal Omega. Primerjali smo z zaporedji, pridobljenimi na spletu iz baze podatkov NCBI (referenčna sekvenca: >NR_026704.1 (vtRNA1-2) in >NR_026705.1 (vtRNA1-3))[21]. S tem smo dokazali, da je homologna rekombinacija potekla uspešno in da vmes med samimi postopki ni prišlo do neželjenih napak oziroma mutacij na preiskovanem zaporedju vtRNA. Edina razlika je v dveh timinih na terminalnem zaporedja vtRNA. Tu sta bila dodana pri samem začetnem oligonukleotidu, medtem ko določena človeška zaporedja vtRNA teh dveh nimajo in zato pride do odstopanja. Razlog za dodajanje teh dveh timinov je v promotorskem mestu U6, saj encim RNA-polimeraza III tipa 3 potrebuje vsaj 6 oziroma več timinov na repu za terminacijo transkripcije. vtRNA v naravi pa nima tega tipa promotorja, kar pomeni da ji zadostujejo le štirje timina[38].
Slika 11: Poravnava zaporedij človeških vtRNA pridobljenih iz baze podatkov NCBI (insilico) in sekvenciranega zaporedja vtRNA1-2 (CFZ145) in vtRNA1-3 (CFZ146). Oznaka CFZ145 predstavlja vektor pcDNA3.1- U6_vtRNA1-2, druga oznaka CFZ146 pa vektor pcDNA3.1-U6_vtRNA1-3.
26
27
4.2 FILOGENETSKA ANALIZA vtRNA PRI VRETENČARJIH
4.2.1 Prisotnost vtRNA pri vretenčarjih in nevretenčarjih
Pri analizi filogenetskega drevesa primerjamo njegov razvoj s splošnim filogenetskim razvojem vrst. Izris filogenetskih dreves v našem primeru temelji samo na podlagi vtRNA, pri splošnem drevesu vrst pa je upoštevan razvoj več različnih molekul in morfoloških značilnosti. Najbolj relevantno filogenetsko drevo bi bilo, če bi lahko primerjali in poravnali vse genome organizmov, vendar ti pogosto niso na voljo[39]. Zaporedja vtRNA smo iskali v programu Ensembl. Za osnovo smo vzeli človeška zaporedja vtRNA in nato iskali ortologe pri predstavnikih drugih vrst živali.
Večinoma organizmi s prisotno vtRNA spadajo v poddeblo vretenčarjev, razen dveh izjem. V bazi podatkov smo našli zaporedja pri dveh predstavnikih nevretenčarjev. Ciona intestialis in Ciona savignyi spadata v poddeblo Tunicata, ki je sestrsko poddeblu vretenčarjev (Vertebrata). V njem se nahajajo predvsem morski nevretenčarji, znotraj poddebla pa imamo razred morskih brizg (Ascidiadea), kamor spadata naša predstavnika in za katere ja značilen način prehranjevanja s filtriranjem vode. Iz tega lahko vidimo, da so bila vtRNA zaporedja prisotna že zelo zgodaj v filogenetskem razvoju vrst[40]. Našli smo le zaporedja vtRNA2-1.
Delitev vretenčarjev s prisotnimi vtRNA je na tri razrede. Razred dvoživk (Amphibia) je prvi, ki se odcepi. Znotraj njega smo našli zgolj nekaj predstavnikov reda žab (Anura), še ti pa so imeli samo zaporedji vtRNA1-1 in vtRNA2-1. Njihova posebnost je, da potrebujejo vodo oziroma vlažno okolje za preživetje[41],[42]. Po odcepitvi dvoživk smo našli predstavnike z vtRNA v dveh sestrskih razredih, plazilcih (Sauropsida) in sesalcih (Mammalia). Pri plazilcih smo našli predstavnike z vtRNA1-1 in vtRNA2-1, medtem ko pri sesalcih najdemo živali z vsemi štirimi zaporedji vtRNA.
Razred plazilcev (Sauropsida) se razdeli v tri skupine organizmov. Najprej se odcepi veja s skupino želv (Testudines), kjer smo našli nekaj predstavnikov z vtRNA1-1 in vtRNA2- 1. Pri filogenetskem drevesu za vtRNA1-1 smo jih postavili celo v korenino drevesa, saj je njihovo zaporedje vtRNA1-1 najbolj izstopalo iz drevesa[43]. Želvam sledi nadred ptic (Aves), kjer smo našli le predstavnike z vtRNA2-1. Ptice se delijo v skupinsko morskih ptic (Ansedriformes), kjer smo našli samo primerek race, in kopenskih ptic (Galliformes), ki jih zastopata piščanec in puran[44],[45]. Zadnji red znotraj plazilcev z zaporedji vtRNA1- 1 in vtRNA2-1 so luskarji (Squamata). Red se razdeli na skupino kuščarjev, kjer imamo organizme iz družin iguan (Iguanidae), stenskih kuščarjev (Lacertidae) in anolov (Dactyloidae). Ti se med seboj razlikujejo predvsem po velikosti in življenjskem prostoru. Druga skupina, ki se od kuščarji loči po tem, da nimajo pravih nog, pa so kače (Serpentes), kjer sta edina predstavnika kač oba iz skupine strupenih kač[46]. Kljub temu, da samih predstavnikov iz reda luskarjev ni bilo veliko, smo pa pri vseh našli veliko število posameznih zaporedij vtRNA. To velja za vse predstavnike, kasneje pri izdelavi filogenetskih dreves pa smo uporabili le eno zaporedje. Najverjetnejša razlaga je ta, da
28
imajo luskarji prisotno veliko število psevdogenov, ki pa zaradi slabše preučenosti še niso bili določeni. Do podobnih ugotovitev so prišli tudi pri raziskovanju genomov luskarjev, kjer so ugotovili, da število ponovitev zaporedij zelo niha v primerjavi z ostalimi organizmi in bi bil lahko tudi to razlog za tako veliko število zaporedij vtRNA[47]. Sesalci (lat. Mammalia) se prvotno delijo v tri skupine, ki se razlikujejo glede na način razmnoževanja. Najprej se odcepi skupina sesalcev, ki se razmnožujejo z jajci. Ta skupina organizmov je precej majhna, glavni red znotraj pa so stokovci (Monotremata). Iz te skupine smo našli le najznačilnejšega predstavnika kljunaša, ki je vseboval zaporedji vtRNA1-1 in vtRNA2-1[48].
Sledita dve sestrski skupini sesalcev. Na eni strani imamo skupino živali, ki ob razvijanju zarodka že ima zametke placente, vendar sam razvoj mladičev ne poteče popolnoma znotraj matere. Zaključna stopnja razvoja poteče zunaj telesa v kožni vreči. Iz tega izhaja tudi ime za red vrečarjev (Marsupialia), kjer najdemo predstavnike z vsemi štirimi zaporedji vtRNA[49].
Najbolj preiskana in najštevilčnejša pa je zadnja skupina višjih oziroma placentalnih sesalcev (Eutheria). Razvoj pri placentalnih sesalcih popolnoma poteče v maternici, razvije pa se tudi že prava posteljica oziroma placenta[39],[50]. Zaradi obsežnosti skupine višjih sesalcev, se ti delijo naprej na štiri nadrede. Sama razvrstitev, kako so se razvili nadredi še ni točno določena. Najprej naj bi se odcepila nadreda Xenarthra in Afrotheria v dveh korakih, na koncu pa imamo sestrska nadreda Laurasiatheria in Euarchontoglires[51].
Nadredi znotraj skupine višjih sesalcev, pri katerih smo našli vtRNA:
Xenarthra – znotraj placentalnih sesalcev najmanjši nadred. Od vseh predstavnikov smo našli samo enega predstavnika iz reda lenivcev (Pilosa), ki je vseboval le zaporedje vtRNA1-1[52].
Afrotheria - nadred, znotraj katerega smo našli vtRNA1-1 in vtRNA2-1 zaporedja v dveh manjših redih. Te sta vsebovala slon, kot edini predstavnik trobčarjev (Proboscidea) in lamantin, kot edini predstavnik reda morskih krav (Sirenia) [53].
Laurasiatheria – nadred sestavljen iz šestih redov, vtRNA1-1 in vtRNA2- 1 pa sta bili prisotni le pri predstavnikih petih redov. Sama razporeditev med redovi se razlikuje od vira do vira in zaenkrat ni nobena razvrstitev dokončno potrjena. Redovi, ki se nahajajo znotraj omenjenega nadrazreda, so žužkojedi (Eulipotyphla: rovka, jež…), netopirji (Chiroptera: mali rjavi netopir, leteči pes…), lihoprsti kopitarji (Perissodactyla: konj, nosorog…), zveri (Carnivora: mačka, pes, lev…) in sodoprsti kopitarji (Cetartiodactyla: prašič, krava, delfin, kit…). Zaradi prisotnosti velikega števila predstavnikov slednjega reda, se ti razdelijo še na prašiče in sorodstvo (Suina), prežvekovalce (Ruminantia) in kite (Cetacea)[54].
29
Euarchontoglires – V zadnji nadred spadajo še sesalci, ki niso bili razvrščeni v ostale nadrede. Najpomembnejši in najbolj raziskani pa so sigurno prvaki, kamor spada tudi človek. Pri Euarchontoglires je v precej virih napisana kar enotna razdelitev, kjer se v prvem koraku razdelijo na dva dela. Prva veja se nato še naprej razdeli na dva sestrska rodova - zajcev (Lagomorpha) in glodalcev (Rodentia). Predstavnika lagomorfov smo našli le pri iskanju ortologov vtRNA1-1, medtem ko smo vsa štiri zaporedja vtRNA našli pri glodalcih. Ker gre za precej obširno skupino, se znotraj nje razdeli še na tri skupine, kjer se loči na mišim sorodne glodalce, vevericam sorodne glodalce in ostale glodalce (Ctenohystrica)[55],[56]. Druga večja veja se razdeli še na ostale redove, kot so tupaje (Scandentia) in prvaki (Primates). Edini predstavnik tupaj je imel le zaporedje vtRNA1- 1. Prvaki pa so imeli pri vseh tipih vtRNA največ predstavnikov, kar kaže na dobro preučenost in visoko podobnost s človekom. Prvaki so red, v katerem se nahaja veliko različnih vrst opic, ki se zaradi boljše preglednosti delijo še naprej na opice novega sveta, opice starega sveta in človeku podobne opice[57].
30
Slika 12: Splošen filogenetski razvoj vrst (se nadaljuje na naslednji strani).
31
32 4.2.2 Razvoj človeške vtRNA
Pri človeku so bila odkrita in potrjena štiri zaporedja vtRNA. Njihov filogenetski razvoj je prikazan na sliki 13. Zaporedja vtRNA1 se razvijejo ločeno od vtRNA2-1, kar je v skladu z nahajanjem posameznih vtRNA na človeškem genomu. Pri zaporedjih, ki se nahajajo na istem lokusu je večja verjetnost, da je prišlo do medsebojne duplikacije in so si evolucijsko bolj sorodne. Filogenetska razporeditev nam da največjo sorodnost med vtRNA1-3 in vtRNA1-1 (slika 13), medtem ko sta si glede na poravnavo zaporedij, veliko bolj podobni vtRNA1-2 in vtRNA1-3 (slika 15).
Slika 13: Evolucijski razvoj različnih vrst človeških vtRNA. Zaporedja vtRNA so bila pridobljena iz zbirke zaporedij NCBI, poravnana je bila izdelana z spletnim orodjem Clustal Omega, filogenetsko drevo pa z orodjem iTOL.
Domnevamo, da je prišlo do prikazanega razvoja človeških vtRNA, kar pa pomeni, da je kasneje v razvoju prišlo do insercije določenega zaporedja v osrednjem delu vtRNA1-1.
Razlika v osrednjem delu je razvidna tudi iz poravnave vseh človeških zaporedij vtRNA (slika 14). Poravnava nam je pokazala, da se vtRNA1-1 razlikuje v osrednjem delu po 10 nukleotidov dolgem zaporedju, ki manjka pri vtRNA1-2 in vtRNA1-3 (označeno z modro puščico na sliki 14). Drugačno zaporedje pa je pri vtRNA2-1.
Ni pa ta vrzel edina posebnost, ki se je spremenila skozi evolucijo. Sama zaporedja se tudi na drugih mestih ne ujemajo, saj so se nakopičile različne mutacije. Določena regulatorna mesta, pomembna za sintezo vtRNA, pa so bolje ohranjena. Na sliki 14 sta taki še posebno ohranjeni dve mesti med 19. in 27. nukleotidom ter med 70. in 85. mestom glede na človeško zaporedje vtRNA2-1 (obe mesti sta označeni z oranžnima puščicama).
Razvidno iz znanih podatkov gre za regulatorni zaporedji A in B (Box A in Box B).
Očitna razlika je tudi pri terminalnem delu vtRNA2-1. Ta ima poleg poli-U repa na koncu še 6 dodatnih nukleotidov. Samo zaporedje vtRNA2-1 se pogosto uporablja tudi kot krajše 101 nukleotid dolgo zaporedje, ki se konča s poli-U repom. Krajše zaporedje je znano pod različnimi imeni od vtRNA2-1, nc886 pa tudi CBL3. Različne vloge vtRNA2- 1 se tako večinoma povezujejo s tem krajšim zaporedjem vtRNA2-1[21].
