Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO Visokošolski strokovni študij KEMIJSKA TEHNOLOGIJA
BIOLOŠKI PUFRI
DIPLOMSKO DELO
Avtorica: Zala Tavčer Mentorica: Barbara Hribar Lee
Ljubljana, avgust 2021
Zala Tavčer
Izjavljam, da sem avtorica predloženega diplomskega dela.
Spodaj podpisana Zala Tavčer,
sem avtorica diplomskega dela z naslovom:
Biološki pufri
S svojim podpisom zagotavljam, da:
- sem diplomsko delo izdelala samostojno pod mentorstvom - prof. dr. Barbara Hribar Lee.
- sem dosledno navedla vso uporabljeno strokovno literaturo.
- je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela
V Ljubljani, dne ________. 2021 Podpis avtorice: ______________
Zahvala
Za pomoč pri pripravi diplomskega dela se iskreno zahvaljujem mentorici prof.
dr. Barbari Hribar Lee.
Za pomoč in podporo pri študiju se iskreno zahvaljujem tutorici izr. prof. dr. Ireni Kralj Cigić, ki me je spodbujala vsa tri leta in mi pomagala v najtežjih trenutkih.
Hvala tudi zaposlenim v študentskem referatu za potrpežljivost in usmerjanje na pravo mesto.
Hvala celotnemu kolektivu fakultete, ki me je sprejelo, razumelo in podprlo na moji študijski poti. Uspelo mi je tudi zaradi odlične organiziranosti fakultete.
Zala Tavčer, 8.7.2021
POVZETEK
Delo opisuje, kaj so biološki pufri, kakšne lastnosti imajo, njihovo kemijsko sestavo, kako jih lahko pridobimo ter za katere pogoje so najprimernejši. Opisano je tudi, kako pufri in pH vplivajo na lastnosti proteinov ter kako vplivajo na rastlinske in živalske sisteme. Proteini se spreminjajo ali celo denaturirajo pri različnih pH; da bi jih ohranili pri pravem pH, lahko uporabimo pufre. Pufri so pomembni za pravilno delovanje skoraj vseh organizmov ter jih velikokrat uporabljamo v laboratorijih za ohranjanje pH pri želeni vrednosti.
ABSTRACT
This work describes what biological buffers are, what properties they have, their chemical structure, how we obtain them and under what type of conditions they work best. It also describes how buffers and pH affect protein properties and how they affect plant and animal systems. Proteins are altered or even denatured at different pH, buffers can be used to maintain them at the right pH. Buffers are important for the proper functioning of almost all organisms and are often used in laboratories to maintain the pH at the desired value.
Kazalo vsebine
1. UVOD ... 1
Pufri v živalskih sistemih ... 4
Pufri v rastlinskih sistemih ... 5
2. NAMEN DELA ... 6
3. METODE ... 6
3. 1. Merjenje pH ... 6
4. VLOGA PUFROV V FORMULACIJAH PROTEINOV ... 8
4. 1.Vpliv pufrov na fizično stabilnost proteinov ... 8
4. 2. Vpliv pufrov na kemično (ne)stabilnost proteinov ... 10
4. 3. Goodovi pufri ... 10
5. PUFRSKI SISTEMI V ŽIVIH ORGANIZMIH ... 14
5. 1. Vzdrževanje pH z dihalnim sistemom ... 14
5.1.1. Hemoglobin kot pufer ... 15
6. ZAKLJUČEK ... 17
7. LITERATURA ... 18
Kazalo slik:
Slika 1. Titracijska krivulja za ocetno kislino s pufrskim območjem………...2
Slika 2. pH lestvica ...………7
Slika 3. Molekulski zapis za MES ……….………...13
Slika 4. Molekulski zapis za BES………..13
Slika 5. Predstavitev 3D strukture proteina hemoglobina.………….…………...16
Kazalo tabel: Tabela 1. Primeri mešanic kemikalji za nastanek pufrov s specifičnim pH……...3
Tabela 2. Nekatere najpomembnejše zahtevane lastnosti bioloških pufrov…...11
Tabela 3. Imena in lastnosti nekaterih Goodovih pufrov………12
Seznam uporabljenih kratic:
- pH: negativni desetiški logaritem koncentracije oksonijevih ionov - MES: Je eden od Goodovih pufrov z formulo C6H13NO4S · x H2O - BES: Je bis (2-hidroksietil) amin. Je eden od goodovih pufrov.
- ADA: Je N- (2-acetamido) iminodiocetna kislina. Je eden od Goodovih pufrov - PIPES: Je pufer etansulfonske kisline, ki so ga razvili Good et al. v šestdesetih letih. Je Piperazin-1,4-bis (2-etansulfonska kislina)
- ACES: Je eden od Goodovih pufrov z imenom N- (2-acetamido) -2- aminoetansulfonska kislina
- TES: Je eden od Goodovih pufrov z imenom 2 - [(2-hidroksi-1,1-bis (hidroksimetil) etil) amino] etansulfonska kislina
- HEPES: Je N- (2-hidroksietil) piperazin-N '- (2-etan sulfonska kislina) - Tm: Temperatura denaturacije
1
1. UVOD
Po definiciji je pufer raztopina, ki se ji ob manjšem dodatku močne kisline ali močne baze pH ne spremeni bistveno 1. Pri laboratorijskem delu uporabljamo kot pufre zmes šibke kisline in njene konjugirane baze ali šibke baze in njene konjugirane kisline. Poznamo kisle in alkalne pufrske raztopine. Ker lahko pufri sproščajo protone in vežejo oksonijeve ione, lahko kljub dodatku močne kisline ali močne baze ohranjajo začetni pH zmesi. Delovanje pufra lahko pojasnimo na primeru acetatnega pufra, ki je mešanica šibke ocetne kisline in njene soli (konjugirana baza). Če takemu pufru dodamo raztopino kisline, poteče reakcija [1]:
𝐻3𝑂++ 𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂− ↔ 𝐻2𝑂 + 𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻 (1)
V primeru, da acetatnemu pufru dodamo raztopino baze, pa poteče reakcija:
𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝑂𝐻− ↔ 𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂−+ 𝐻2𝑂 (2)
Reakciji zagotavljata, da ima tudi precejšen dodatek oksonijevih oz. hidroksilnih ionov za posledico le majhno spremembo pH, kar kaže titracijska krivulja.
2 Slika 1. Titracijska krivulja za ocetno kislino s prikazanim pufrskim območjem [2]
Mnoge vrste pufrov imajo več kot eno ionizacijsko skupino, kar ima za posledico dve ali več različnih vrednosti pKa. To pomeni, da bodo imeli nekateri pufri občutno pufrsko zmogljivost v več kot enem pH območju [3].
Na stopnjo ionizacije (tj. pKa pufra) bo vplivala tudi prisotnost soli. Pokazalo se je, da dodajanje različnih soli ali elektrolitov lahko vpliva na pH pufra [3].
Vpliv temperature na pufer je tudi pomemben, saj se lahko stopnja ionizacije spreminja s temperaturo, kar pomeni, da se pH pufra spreminja, ko se vzorec
3 ohladi ali segreje. To pomeni, da pH snovi, ki je bil izmerjen pri sobni temperaturi, morda ne bo enak pri 2-8 °C [3].
pH pufra je določen z razmerjem med aktivnostjo ionov ali v spodnjem primeru koncentracije kisline in njene konjugirane baze in ga v območju pH v bližini pKa
kisline podaja Henderson – Hasselbalchova enačba [4]:
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎+ 𝑙𝑜𝑔[𝐴−]
[𝐻𝐴] (3) kjer je pKa negativni desetiški logaritem konstante kisline Ka, kvadratni oklepaji pa označujejo koncentracijo.
Za delovanje pufra je pomembno t. im. pufrsko območje, to je območje, v katerem lahko pufri kompenzirajo spremembe pH [5], ter njegova pufrska kapaciteta, 𝛽, ki nam pove, kolikšna je sposobnost pufra, da se upira spremembi pH [4] :
𝛽 = ∆𝑋
∆𝑝𝐻 (4) kjer je ∆x dodatek kisline ali baze na liter raztopine (v mol/L) in ∆pH je ustrezna sprememba pH.
Glede na območje, v katerem želimo vzdrževati konstanten pH, imamo na razpolago veliko število različnih pufrov. Nekateri značilni anorganski pufri, ki se uporabljajo v laboratorijih so prikazani v Tabeli 1.
Tabela 1. Primeri mešanic kemikalji za nastanek pufrov s specifičnim pH [6]
pH Kemikalije za pripravo pufrov 1,00 0,168 g Glicin (NH2CH2COOH)
0,132 g Natrijev klorid (NaCl) 4,456 g Klorovodikova kislina (HCl) 2,00 6,430 g Citronska kislina (C6H8O7*H2O)
2,448 g Natrijev hidroksid (NaOH) 2,530 g Klorovodikova kislina (HCl) 3,00 8,470 g Citronska kislina (C6H8O7*H2O)
3,224 g Natrijev hidroksid (NaOH) 2,176 g Klorovodikova kislina (HCl) 4,00 11,768 g Citronska kislina (C6H8O7 *H2O)
4 4,480 g Natrijev hidroksid (NaOH)
1,604 g Klorovodikova kislina (HCl) 5,00 20,256 g Citronska kislina (C6H8O7 *H2O)
7,840 g Klorovodikova kislina (HCl) 6,00 12,526 g Citronska kislina (C6H8O7 *H2O)
6,320 g Natrijev hidroksid (NaOH)
7,00 3,522 g Kalijev dihidrogenfosfat (KH2PO4)
7,265 g di-natrijev hidrogenfosfat (Na2HPO4 * H2O) 8,00 6,928 g Borova kislina (H3BO3)
2,234 g Natrijev hidroksid (NaOH) 1,610 g Klorovodikova kislina (HCl) 9,00 3,092 g Borova kislina (H3BO3)
3,728 g Klorovodikova kislina (HCl) 0,852 g Natrijev hidroksid (NaOH) 10,00 3,092 g Borova kislina (H3BO3)
3,728 g Kalijev klorid (KCl)
1,756 g Natrijev hidroksid (NaOH)
Pufri niso pomembni samo v laboratoriju, pač pa so ključnega pomena za žive sisteme, ker se mora večina metabolnih procesov odvijati pri točno določenem pH. V živalskih organizmih je funkcija proteinov odvisna od njihove strukture, njihova struktura pa je odvisna od pH, saj vsebujejo kislinske in bazične stranske skupine, ki lahko izmenjujejo protone z okolico. Le če je pH ustrezen in je posledično protein v pravi obliki, lahko poteče metabolni proces, drugače organizem odmre. To je povezano z delovanjem encimov, ki selektivno delujejo le na točno določeno obliko proteina. Če je protein spremenjen, encim nanj ne deluje in metabolizem ne poteka pravilno [7].
Pufri v živalskih sistemih
Primer: Biološki procesi pri človeku potekajo ustrezno, če je pH krvi okoli 7,4, pH sline okoli 6,6 in pH v želodcu v območju 1,6 do 2,0. Vse te pogoje zagotavljajo
5 pufri [7]. Običajno biološki pufri vsebujejo organsko snov, ki nevtralizira učinek vodikovih ionov. Na ta način biološki pufer pomaga vzdrževati telo pri pravilnem pH, tako da biokemijski procesi še naprej potekajo optimalno [8].
Biološki pufri pomagajo preprečiti velike spremembe pH v celicah. Živalske celice vsebujejo lizosome. Te so središče za recikliranje v celici. Notranjost teh lizosomov je kisla, s pH 5 in vsebuje veliko encimov, ki prebavljajo proteine, maščobe, sladkorje in DNK. Kislo okolje znotraj lizosoma pomaga razgraditi molekule, če pa se eden ali več lizosomov po naključju odpre v celici, se kisla vsebina razlije v preostali del celice in celotno celico zakisa. Celica ima pufre, ki celico zaščitijo v primeru, da se ta razlitja zgodijo. Ker se pufri upirajo spremembi pH, se pH v celici ne bo preveč spremenil, če se nekaj lizosomov odpre [8].
Nevarnost spremembe pH v celici je, da pH močno vpliva na strukturo proteinov.
Celica je narejena iz številnih različnih vrst proteinov in vsak protein deluje le, če ima svojo pravilno tridimenzionalno obliko, ki je odvisna od pH okolice. Obliko proteina držijo notranje privlačne sile. Če se bo pH spremenil, bodo nekatere od teh sil zgubile svojo privlačno moč in ne bodo zadrževale proteina v osnovni obliki. Če torej notranjost celice postane preveč kisla ali preveč bazična, začnejo proteini izgubljati obliko in ne delujejo več. Pufri znotraj celice preprečijo, da bi se to zgodilo [8].
Pufri v rastlinskih sistemih
Podobno delujejo tudi pufrski sistemi v rastlinah. Na primer, v okolju, kjer je veliko onesnaženje in pada kisel dež, so zelo pomembni pufrski sistemi rastlinskih tkiv, ki obvladujejo pH spremembe. Pufrski sistemi odpovejo, če so spremembe pH prevelike, zato se v takšnih primerih rastlina posuši [7].
Biološki pufri so lahko pufrski sistemi, ki pomagajo vzdrževati enakomeren pH okoli fiziološkega pH. Pri izvajanju poskusov s posameznimi komponentami celic ali posameznimi proteini moramo poskuse izvajati pri pH, pri katerem se te komponente nahajajo v naravnem okolju. Če na primer delamo s proteini, ki delujejo v možganih pri pH 7,4, vendar uporabljamo pufer pH 8,0, potem protein ne bo deloval optimalno. Namesto tega bi morali preiti na pufer, ki je bližje pH, v katerem dejansko deluje protein [8].
Obstaja veliko različnih bioloških pufrov, ki se izdelujejo z izrecnim namenom ohranjanja fiziološkega pH. Zelo pogosto uporabljen biološki pufer je HEPES (4- (2-hidroksietil)-1-piperaz in etansulfonska kislina) [8]. Ta pufer zelo dobro vzdržuje enakomeren pH med 6,8 in 8,2. Za pravilno izbiro pufra moramo poznati pH, pri katerem želimo delovati [8].
6
2. NAMEN DELA
Namen diplomskega dela je s pomočjo pregleda literature raziskati vrste bioloških pufrov in njihove karakteristike. Za različne pufre, ki se uporabljajo za študij bioloških sistemov, sem pripravila pregled vplivov na rezultate eksperimentov, kot sem jih našla v literaturi.
3. METODE
Da bi okarakterizirali pufer, mu moramo določiti pufrsko območje in pufrsko kapaciteto. V obeh primerih merimo pH vzorca v odvisnosti od količine pufru dodane kisline oz. baze.
3. 1. Merjenje pH
pH je bil leta 1909 definiran, kot negativni desetiški logaritem molarne koncentracije oksonijevih ionov (H3O+) oziroma vodikovih ionov (H+)[4]. Kasneje so definicijo zaradi pomanjkljivosti spremenili tako, da so zamenjali koncentracijo z aktivnostjo vodikovih ionov (a(H+)) [4]:
pH= -log a(𝐻+) (5)
a(H+)
=
C((𝐻+))∗γ(𝐻+)Cθ (6) kjer je γ(𝐻+) aktivnostni koeficient vodikovih ionov, Cθ pa standardna koncentracija (1 mol/L).
Razpon pH lestvice je od 0 do 14, manjša kot je pH vrednost, bolj je snov kisla.
Npr. snov, ki ima pH enak 0, je zelo kisla, medtem ko je snov, ki ima pH enak 14 zelo bazična. V čisti vodi je aktivnost H+ ionov enaka 1 [4], ima tudi nevtralen pH enak 7, to pomeni, da je aktivnost vodikovih ionov (H+) enaka aktivnosti hidroksidnih ionov (OH-) [9]. Na sliki 2 je prikazana pH lestvica z barvnimi prehodi.
7 Slika 2. pH lestvica [10]
pH meter:
Za pH meter lahko rečemo, da je zelo občutljiv voltmeter. Ta meri razliko v potencialu med referenčno in merilno elektrodo. Potencial merilne elektrode opišemo z Nernstovo enačbo, potencial referenčne elektrode pa je konstanten [9]. Spodaj je navedena Nernstova enačba za boljše razumevanje, ta velja za elektrodo, občutljivo na H+ ione [9].
E=E°+2,303 (𝑅𝑇
𝐹)*(Log a(H+) ) (7)
kjer je a(H+) = aktivnost H+ ionov, E = električni potencial elektrode, E°=
standardni potencial elektrode, R = plinska konstanta, T = temperatura [K] in F
= Faradayeva konstanta (96485.33212 C/ mol) .
Posamezni tipi pH metrov se po izvedbi med seboj zelo razlikujejo, zato ni mogoče podati splošnega navodila uporabe za vse. Vseeno pa velja nekaj skupnih dejavnikov: pH-meter na začetku umerimo z eno izmed standardnih pufrskih raztopin, nato pa izmerimo pH vzorca. Manjša ko je razlika med vrednostma pH vzorca in pH pufrske raztopine, s katero je pH-meter umerjen, tem bolj pravilna je meritev pH [4]. ʺČe je ta razlika znatna, potem je treba ponoviti umeritev pH-metra s pufrom, ki je bližje izmerjeni vrednosti pH, nato pa meritev ponovitiʺ [4]. pH meritve so pravilnejše, če pH-meter umerimo z dvema pufroma oz. v dveh točkah. To je namenjeno korigiranju izmerjene napetosti tako, da odčitek pH ustreza dejanskemu pH prvega pufra pri teoretični strmini elektrode pri temperaturi merjenja. Z umerjanjem z drugim pufrom pa inštrument dobi dovolj podatkov, da korigira tudi strmino elektrode in jo prilagodi dejanski strmini steklene elektrode [4].
8
4. VLOGA PUFROV V FORMULACIJAH PROTEINOV
Proteini so pogosto nestabilni in denaturirajo, kadar niso v originalnem okolju.
Večina teh procesov denaturacije je posledica delovanja med-molekulskih interakcij, kot so vodikova vez, elektrostatske interakcije in hidrofobne interakcije [11]. Za poliprotske spojine, kot so proteini, se vrednosti pKa lahko razlikujejo, odvisno od lokalnega okolja v ionizabilni skupini. Kljub temu je povprečna vrednost blizu prave vrednosti za posamezne aminokisline. Zaradi velike količine ionizabilnih skupin imajo proteini tudi sposobnost delovanja kot pufri npr.
hemoglobin, ki se lahko veže na majhne količine kisline v krvi, kar pomaga odstraniti to kislino, preden ta preveč spremeni pH krvi [3].
pH je najvplivnejši faktor pri vzdrževanju stabilnosti proteinov, zato proteinov skoraj nikoli ne damo v raztopine brez pufra [11].
Pufri so namenjeni predvsem nadziranju pH. Primarni razlog za uporabo pufrskega sistema v farmacevtskem izdelku je tako omejitev sprememb pH med skladiščenjem in ravnanjem [3]. Pufri imajo tudi druge pomembne lastnosti, ki lahko preko različnih mehanizmov znatno prispevajo k splošni stabilnosti proteinskega izdelka. Dodajanje pufrov lahko povzroči povečano konformacijsko stabilnost proteinov, bodisi z vezanjem ligandov ali z izključenim mehanizmom topljenca. Poleg tega lahko spremenijo koloidno stabilnost proteinov in modulirajo medfazne poškodbe. Pufri lahko vodijo tudi do destabilizacije proteinov [3].
4. 1.Vpliv pufrov na fizično stabilnost proteinov
Na fizično stabilnost kateregakoli proteina najbolj vplivata dva vidika:
konformacijski in koloidni. Oba sta medsebojno povezana; sestavine formulacije (ti. pomožne snovi) pogosto vplivajo na več kot en vidik stabilnosti proteinov [3].
Konformacijska stabilnost
Vezava ligandov je prevladujoči mehanizem konformacijske stabilizacije proteinov [3]. Pri pufrih je ta mehanizem verjetno eden od najpogostejših, ki povzroči povečanje termodinamske stabilnosti proteina. Številne študije ne obravnavajo natančnega mehanizma stabilizacije, ampak samo poročajo o opažanjih. Kljub temu pa so učinki vidni in vredni pozornosti, tudi če ni mehanistične razlage [3].
9 Na splošno bo povečanje konformacijske stabilnosti zmanjšalo delež komponent, ki v raztopini agregirajo in s tem upočasnilo stopnjo agregacije. Predpostavlja se, da se pufer (ligand) preferenčno veže na osnovno stanje proteina, s čimer ga stabilizira, medtem ko skoraj nima vpliva na denaturirano oziroma razvito stanje.
[3].
Učinek pufrov na konformacijsko stabilnost je najbolj opisan vidik stabilizacije proteinov. To se po navadi odraža s povečanjem navidezne vrednosti temperature denaturacije (Tm) proteina v prisotnosti določenih vrst pufrov. Poleg tega so nekatere študije opisale izboljšano stabilnost med dolgotrajnim skladiščenjem, kar je verjetno posledica povečanja termodinamične stabilizacije globularne strukture.
Za citrat in fosfat je bilo ugotovljeno, da ščitita zeleni fluorescenčni protein (GFP) pred aktivacijo pri povišani temperaturi, predvidoma s povečanjem konformacijske stabilnosti. Ko je bilo dodanih več teh pufrov, se je aktivacijska energija za inaktivacijo znatno povečala. Podobno poročajo, da ta ista pufra povzročata povečanje Tm za 5 do 7 °C za ovotransferin [3].
Vezava ligandov je lahko primarna razlaga, zakaj se zdi, da je veliko citratnih formulacij precej stabilnih, tudi če se uporabljajo pri pH vrednostih, kjer ima citrat omejeno pufrsko kapaciteto. Poročali so o stabilizaciji s citratom za protitelesa in za malat dehidrogenazo, kar je verjetno posledica vezave liganda pufrskih vrst na izvorno stanje proteinov, kar ima za posledico neto stabilizacijo [3].
Koloidna stabilnost
Drugi pomemben vidik stabilizacije proteinov je koloidna stabilnost.
Koloidna stabilnost se nanaša na interakcije med samimi proteini, kjer se makromolekule, kot so proteini, lahko obnašajo kot klasični koloidi, ki imajo privlačno ali odbojno silo med posameznimi molekulami. Konformacijska stabilnost in koloidna stabilnost lahko vplivata na nagnjenost k združevanju proteinov, kar se vedno bolj opaža v zadnjih letih [3]. Določeni pufri, na primer citrat, se s porastom pH večkrat nabijejo, kar ima za posledico učinkovitejše senčenje naboja, in s tem zmanjšanje elektrostatičnega odbijanja, kar lahko privede do slabše koloidne stabilnosti [3]. Ker lahko citratne vrste nosijo precejšnji negativni naboj, lahko povzročijo inverzijo naboja na mestu vezave in s tem spremenijo profil koloidne stabilnosti proteina [3]. Zdi se, da to prednostno kopičenje citrata na površini proteinov vodi do večje zaščite pred naboji in slabše koloidne stabilnosti, kar ima za posledico povečano agregacijo. Npr. koloidna stabilnost monoklonskega protitelesa IgG1 je bila nižja ob prisotnosti visokih ravni
10 citratnega pufra, kar kaže na nekoliko povečano stopnjo agregacije pri povišani temperaturi. Tako se zdi, da se na površini proteina nabira citrat, kar vodi k zmanjšanju koloidne stabilnosti [3].
4. 2. Vpliv pufrov na kemično (ne)stabilnost proteinov
Kemična nestabilnost je sposobnost snovi, da reagira in se razgradi. V tehničnem smislu kemična nestabilnost pomeni termodinamično nestabilnost kemičnega sistema. Kemično nestabilne spojine ali zmesi pogosto imenujemo labilne [12].
Obstaja več poročil o pufru histidina (His), ki vpliva na kemično stabilnost proteinov. Na primer, poročano je bilo, da je hitrost hidrolize fleksibilne regije v težkih verigah protiteles nižja pri uporabi His kot pufra v primerjavi s fosfatom pri enakih pH in ionskih jakostih. Verjetno se to zgodi, ker je His boljše kelatno sredstvo kot fosfat, saj naj bi bila ta reakcija katalizirana s kovino. Obstajajo poročila o vezavi histidina na različne kovine in o sposobnosti histidina, da veže baker ter povzroči hidrolitično cepitev DNK [3]. Ta sposobnost nekaterih pufrov, da se vežejo na kovine, lahko povzroči povečanje reaktivnosti kovine, namesto da bi jo zmanjšali, kot se zgodi pri večini kelatnih sredstev [3].
Isti pufri lahko bodisi stabilizirajo ali destabilizirajo različne proteine. Določen pufer se lahko selektivno veže na nativni protein in s tem bi se povečala stabilnost proteinov [10].
4. 3. Goodovi pufri
Kot sem že omenila v uvodu, so biološki pufri tisti pufri, ki jih izdelujejo z namenom ohranjanja pH v bližini biološkega pH. Vendar pa ustrezno pH območje ni dovolj, da bi bil določen pufer uporaben za študij biokemijskih procesov.
Zahteve za biološke pufre so zbrane v Tabeli 2 [13].
11 Tabela 2. Nekatere najpomembnejše zahtevane lastnosti bioloških pufrov [13,14].
Št. Najpomembnejše zahtevane lastnosti bioloških pufrov
1 Ne smejo nastopati kot substrati ali inhibitorji v študiranih procesih.
2 Njihov pH sme biti le malo odvisen od temperature.
3 Molekule pufra ne smejo prehajati preko bioloških membran.
4 Pufer ima maksimalno pufrsko kapaciteto v območju, kjer je protein najbolj stabilen.
5 Niso toksični.
6 Imajo pKa v območju med 6 in 8, v katerem poteka večina bioloških procesov.
7 Morajo biti dobro topni v vodi in slabo topni v drugih topilih.
8 Morajo biti čim manj občutljivi na dodatek soli.
9 Kompleksi s kationi morajo biti topni v vodi, poznana mora biti konstanta kompleksacije.
10 Morajo biti odporni na encimsko in neencimsko degradacijo.
11 Ne smejo absorbirati svetlobo v vidnem in UV delu spektra.
12 Proces njihove priprave in čiščenja mora biti enostaven.
Good in sodelavci so predlagali 12 različnih pufrov, ki se jih danes standardno uporablja pri študiju bioloških raztopin in procesov. Njihova priprava in fizikalno- kemijske lastnosti so predstavljene spodaj [14].
Goodovi pufri imajo sposobnost odstranjevanja prostih radikalov in kelatnih snovi, zaradi česar so koristni primeri, kako lahko pufri z različnimi mehanizmi vplivajo na stabilnost [3].
Goodovi pufri so skupaj s pKa vrednostjo pri temperaturi 20oC navedeni v tabeli 3 [14].
12 Tabela 3. Imena in lastnosti nekaterih Goodovih pufrov [15-25, 34, 35].
Št. Ime pKa pri 25°C
Molska masa Učinkovito pH
območje
Topnost v vodi
1 MES 6,10 206,73 g/mol 5,5-6,7 10 g/100 ml 2 Maleate
(pK2)
6,24 358,34 g/mol 5,5-7,2 Je zelo dobro topen v vodi
3 ADA 6,59 190,15 g/mol 6,0-7,2 Je slabo topen v vodi, vendar je zelo topen v obliki mononatrijeve soli.
4 PIPES 6,76 302,4 g/mol 6,1-7,5 Ni dobro topen v vodi.
Topen postane, ko postane pH višji od 7 (in se pretvori v obliko soli).
5 Phosphate (pK2)
7,20 411,04 g/mol 5,8-8,0 Je dobro topen v vodi
6 ACES 6,78 182,2 g/mol 6,1-7,5 5 g/100 ml 7 BES 7,09 213,24 g/mol 6,4-7,8 10 g/100 ml 8 TES 7,40 229,25 g/mol 6,8-8,2 5 g/100 ml 9 HEPES 7,48 238,30 g/mol 6,8-8,2 70,36 g/100 ml 10 Tricine 8,05 179,17 g/mol 7,4-8,8 1,8 g/100 ml
Goodovi pufri so si precej podobni po učinkovitem pH območju a se bistveno razlikujejo v topnosti in molekulski masi. Kot je razvidno iz tabele 3, se pKa Goodovih pufrov nahaja približno med 6,10 in 8,05 pri 25°C.
4. 3. 1. Podrobnejši opis nekaterih bioloških pufrov
Kot je že na začetku napisano: pri laboratorijskem delu uporabljamo kot pufre zmes šibke kisline in njene konjugirane baze ali šibke baze in njene konjugirane kisline.
13 MES
Je 2-(N-morfolino) etansulfonska kislina. MES je eden od Good-ovih, najpogosteje uporabljenih, bioloških pufrov. MES je zwitterionska N-substituirana aminosulfonska kislina z morfolinskim obročkom. Ne tvori kompleksov z večino kovin, ki se uporabljajo v okoljskih in bioloških študijah. Je lahko topen v vodi in ima minimalno topnost v lipidih, zaradi česar je nepropusten za lipidne membrane [28].
MES hidrat je bil uporabljen v gojiščih MS (Murashige in Skoog) za rast sadik Arabidopsis [28].
Slika 3. Molekulska formula za MES [29]
Pufer z uporabo MES lahko pripravimo s titriranjem z NaOH do želenega pH.
Alternativno lahko zmešamo osnovne raztopine MES in MES natrijeve soli, da dosežemo želeni pH. Uporabno pH območje za MES je med 5,5 in 6,7 [28].
BES
Je bis (2-hidroksietil) amin. Pufer BES se uporablja v raziskavah biokemije in molekularne biologije. BES je bil uporabljen za proučevanje vsestranskih predhodnih sestavin katalizatorjev za blago hidrokarboksilacijo alkanov v karboksilne kisline [30].
Slika 4. Molekulska formula za BES [30].
14 5. PUFRSKI SISTEMI V ŽIVIH ORGANIZMIH
Večina proteinov delujejo kot pufri in privzamejo to vlogo v živih organizmih.
Proteini so namreč sestavljeni iz aminokislin, ki vsebujejo pozitivno nabite aminske skupine in negativno nabite karboksilne skupine. Nabita območja teh molekul lahko vežejo vodikove in hidroksilne ione in tako delujejo kot pufri [31].
Pufrski sistemi v človeškem telesu so izjemno učinkoviti in različni sistemi delujejo različno hitro. Potrebne so le sekunde, da kemični pufri v krvi prilagodijo pH.
Dihala lahko v nekaj minutah z izdihom CO2 iz telesa prilagodijo pH krvi navzgor.
Ledvični sistem lahko prilagodi pH krvi tudi z izločanjem vodikovih ionov (H+) in ohranjanjem bikarbonata, vendar ta postopek traja ure ali dni [31].
Pufrski sistemi, ki delujejo v krvni plazmi, vključujejo plazemske proteine, fosfate ter pufre bikarbonata in ogljikove kisline. Ledvice pomagajo nadzirati kislinsko- bazično ravnovesje z izločanjem vodikovih ionov in tvorbo bikarbonata, ki pomaga vzdrževati pH krvne plazme v normalnem območju. Proteinski pufrski sistemi delujejo pretežno znotraj celic [31].
5. 1. Vzdrževanje pH z dihalnim sistemom
V dihalnem sistemu telo uravnava raven ogljikove kisline. CO2 v krvi zlahka reagira z vodo in tvori ogljikovo kislino, ravni CO2 in ogljikove kisline v krvi pa so v ravnovesju. Ko se raven CO2 v krvi dvigne (tako kot pri zadrževanju diha), odvečni CO2 reagira z vodo in tvori dodatno ogljikovo kislino, kar zniža pH krvi.
Če se poveča hitrost in / ali globina dihanja, lahko izdihnete več CO2. Izguba CO2
iz telesa zmanjša raven ogljikove kisline v krvi in s tem prilagodi pH navzgor, na normalno raven. Ta postopek deluje tudi v nasprotni smeri. Prekomerno globoko in hitro dihanje (kot pri hiperventilaciji) odstrani CO2 iz krvi in zmanjša količino ogljikove kisline, zaradi česar je kri preveč alkalna. Ta kratka alkaloza se lahko odpravi z vdihavanjem že izdihanega zraka, ki vsebuje več CO2. Vdihavanje izdihanega zraka bo hitro znižalo pH krvi na normalno [31].
Kemične reakcije, ki uravnavajo nivo CO2 in ogljikove kisline, se pojavijo v pljučih, ko kri potuje skozi pljučne kapilare. Manjše prilagoditve dihanja običajno zadoščajo za uravnavanje pH krvi s spreminjanjem količine izdihanega CO2. Dejansko bi podvojitev hitrosti dihanja za manj kot 1 minuto in odstranjevanje
"odvečnega" CO2 povečala pH krvi za približno 0,2. Da bi uravnotežili povečano
15 proizvodnjo kisline, se stopnja dihanja poveča, da se odstrani CO2. To pomaga preprečiti razvoj acidoze [31].
Telo uravnava hitrost dihanja z uporabo kemičnih receptorjev, ki kot signal uporabljajo predvsem CO2. Senzorji periferne krvi so v stenah aorte in karotidnih arterijah. Ti senzorji signalizirajo možganom, da nemudoma prilagodijo hitrost dihanja, če se raven CO2 dvigne ali pade. Pa vendar se v možganih najdejo tudi drugi senzorji. Spremembe pH v cerebrospinalni tekočini vplivajo na dihalni center v možganskem deblu, ki lahko neposredno prilagaja hitrost dihanja, da pH povrne v normalno območje [31].
5.1.1. Hemoglobin kot pufer
Hemoglobin je glavni protein v rdečih krvnih celicah in predstavlja eno tretjino mase celice [31]. Hemoglobin je sestavljen iz proteina (globin), na katero so vezane štiri molekule hema, na vsaki molekuli globina je vezan en atom železa (Fe), na katerega se veže molekula kisika. Ko se kisik veže na hemoglobin, nastane oksihemoglobin (Hb4O8), hemoglobin, na katerega ni vezan kisik, imenujemo deoksihemoglobin. 100 ml krvi lahko prenese približno 20 ml kisika, kadar je popolnoma oksigenirana. »Številni faktorji, kot na primer temperatura ali pH, lahko vplivajo na nasičenost hemoglobina« [32]. Vezava kisika na hemoglobin je odvisna od parcialnega tlaka kisika v krvi ter afinitete hemoglobina za kisik. Z znižanjem pH krvi se znižuje tudi nasičenost hemoglobina pri istem parcialnem tlaku kisika. V pljučih, kjer je pH navadno višji in temperatura nižja, hemoglobin močneje veže nase kisik in ga oddaja tam, kjer je pH nižji in temperatura višja, npr. v aktivnih mišicah [32].
Ko ogljikov dioksid preide v kri, takoj reagira z vodo in tvori ogljikovo kislino, ker pa je ta nestabilna, takoj po nastanku s pomočjo encima karboanhidraza disociira na vodikov ion (H+ ) in bikarbonatni ion (HCO3-). Vodikov ion se nato veže na hemoglobin, in tako pospeši oddajanje kisika ter osvobaja hemoglobin. Ker hemoglobin nase veže prosti vodikov ion, ta deluje kot pufer, saj tako prepreči večje zmanjšanje pH krvi. S tem mehanizmom telo vzdržuje normalen pH [32].
Ko kri teče skozi pljučne kapilare, kjer je parcialni tlak kisika nižji, se H+ in HCO3-
združita in tvorita ogljikovo kislino, ki nato disociira na ogljikov dioksid in vodo.
Ogljikov dioksid difundira v alveolo in se nato z izdihom odstrani iz telesa [32].
16 Slika 5. Predstavitev 3D strukture proteina hemoglobina [33].
17
6. ZAKLJUČEK
Obnašanje pufrnih raztopin raziskujejo že desetletja, že skoraj stoletje pa je poznana njihova sposobnost, da uravnavajo pH. Poleg tega, da vplivajo na pH, imajo pufri tudi pomemben vpliv na stabilnost proteinov. To je lahko posledica povečane konformacijske stabilnosti zaradi vezave ligandov, pufer pa lahko tudi izboljša koloidno stabilnost proteina. V nekaterih primerih pa lahko vpliv pufra zmanjša stabilnost proteina. Pufri lahko katalizirajo hidrolitično reakcijo, na primer deamidacijo. Lahko se vežejo na kovine, ki so potrebne za stabilnost in/ali aktivnost proteinov. Lahko celo povečajo agregacijo z vezanjem na delno odvito obliko proteina.
Pri izbiri pufrov za delo s proteini moramo biti previdni in upoštevati, da na strukturo proteinov vpliva več različnih parametrov, kot so npr. sprememba temperature, pH, hidrofobnost, kovinski ioni in mehanske sile.
V raziskavi za diplomsko delo sem ugotovila, da so biološki pufri pomembni tako v živalskih kot rastlinskih sistemih. Pufri so ključnega pomena za žive sisteme, ker se večina metabolnih procesov odvija pri točno določenem pH . V organizmih je delovanje proteinov odvisno od njihove strukture, ta pa je odvisna od pH, saj vsebuje kislinske in bazične stranske skupine, ki izmenjujejo protone z okolico.
Metabolni proces lahko poteče le, če je pH ustrezen in je posledično protein v pravi obliki. To je povezano z delovanjem encimov, ki selektivno delujejo samo na točno določeno obliko proteina. Na spremenjen protein encim ne deluje in metabolizem ne poteka pravilno [7].
V laboratorijih se za študij biokemijskih procesov ustvarijo pufri, ki ohranjajo pH v bližini biološkega. Najbolj znani in uporabljani so Goodovi pufri. V nalogi je predstavljena priprava in fizikalno-kemijske lastnosti dvanajstih različnih Goodovih pufrov. Podrobneje sta opisana MES in BES.
V nalogi je predstavljen pomen pufrov, pufrska kapaciteta, način merjenja pH, vpliv pufrov na fizično in kemično stabilnost proteinov. Podrobneje sta predstavljena dva primera, in sicer vpliv pufrov pri dihanju človeka in hemoglobin kot biološki pufer v krvi.
18
7. LITERATURA
[1] F. Lazarini, J. Brenčič, Splošna in anorganska kemija, DZS, Ljubljana 1989, str. 223-224.
[2] https://socratic.org/questions/a-student-found-that-53-2-ml-of-a-0-232m- solution-of-naoh-was-required-to-titrat 20.4.2020
[3] T. J. Zbacnik, R. E. Holcomb, D.S. Katayama, B. M. Murphy, R. W. Payne, R. C. Coccaro, G. J. Evans, J. E. Matsuura, C. S. Henry, M. C. Manning, Role of Buffers in Protein Formulations. J Pharm Sci., 2017;106: 713-733.
[4] M. Bončina, J. Cerar, A. Godec, B. Hribar-Lee, A. Jamnik, J. Lah, A Lajovic, M. Lukšič, Č. Podlipnik, I. Prislan, J. Reščič, B. Šarac, M. Tomšič, G. Vesnaver:
fizikalna kemija – Praktikum; Ljubljana; Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo; 2011.
[5] https://si.openprof.com/wb/hidroliza_soli_in_pufri?ch=645#Pufri, dostopano 14.3. 2020.
[6] Prodajni karalog MERCK Laborprodukte letnik 2005 16.6.2021 [7] https://dijaski.net/gradivo/kem_sno_pufri_01 18.4.2020
[8] https://sciencing.com/biological-buffers-8350868.html dostopano 23.3.2020.
[9] http://lrtme.fe.uni-
lj.si/lrtme/slo/UNIVSS/meri_pret/seminar%202011/Primoz_Toplikar_Seminar.pd f 20.4.2020
[10] https://si.openprof.com/wb/ph_izra%C4%8Duni_in_ph_indikatorji?ch=642 22.4.2020
[11] M. Taha, B. S. Gupta, I. Khoiroh, M.-J. Lee, Interactions of Biological Buffers with Macromolecules: The Ubiquitous “Smart” Polymer PNIPAM and the Biological Buffers MES, MOPS, and MOPSO. Macromolecules, 2011; 44:8575- 8589.
[12]https://www.corrosionpedia.com/definition/1519/chemical-
instability#:~:text=Chemical%20instability%20is%20the%20reactive,unstable%2 0are%20often%20called%20labile. 27.8.2020
19 [13] S. O. Ugwu, S. P. Apte, The effect of buffers on protein conformational stability, Pharmaceutical Technology, 2004; 28: 86-108.
[14] N. E. Good, G. D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Izawa, R. M. M.
Sing, Hydrogen Ion Buffers for Bifological Research. Biochemistry, 1966; 5:467- 477. 22.4.2020
[15] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Tricine 30.8.2020 [16] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Glycinamide 30.8.2020 [17] https://en.wikipedia.org/wiki/HEPES 30.8.2020
[18]
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1375?lang=en®ion=SI 30.8.2020
[19]
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b9879?lang=en®ion=S I#:~:text=2%2Daminoethanesulfonic%20acid-
,N%2CN%2DBis(2%2Dhydroxyethyl)%2D2%2D,molar%20mass%20213.24%2 0g%2Fmol. 30.8.2020
[20] https://en.wikipedia.org/wiki/Cholamine_chloride_hydrochloride 30.8.2020 [21]
.https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9758?lang=en®ion=
SI 30.8.2020
[22] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Phosphate-Buffered-Saline 30.8.2020
[23] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Pipes 30.8.2020 [24]
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/00307?lang=en®ion=SI 30.8.2020
[25] https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6450418 30.8.2020 [26]
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=MES+buffer&interface=All&
N=0&mode=partialmax&lang=en®ion=SI&focus=product 30.8.2020 [27] http://staff.ustc.edu.cn/~liuyz/methods/buffer.htm 4.9.2020
20 [28]
https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8250?lang=en®ion=
SI&gclid=EAIaIQobChMI8Y25tJ6E6QIVFKmaCh3PEQlWEAAYASAAEgKmbfD _BwE (8.7.2020)
[29] https://en.wikipedia.org/wiki/MES_(buffer) (19.5.2020)(slika 4)
[30] https://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological- buffers/bes-specification.html 18.11.2020
[31] https://opentextbc.ca/anatomyandphysiology/chapter/26-4-acid-base- balance/#:~:text=Several%20substances%20serve%20as%20buffers,in%20tiss ues%20throughout%20the%20body 12.9.2020
[32] https://www.fsp.uni-
lj.si/COBISS/Diplome/Diploma2204891CetrcicPrimoz.pdf 7.11.2020 [33]
https://sl.wikipedia.org/wiki/Hemoglobin#/media/Slika:1GZX_Haemoglobin.png 8.7.2020
[34] (https://www.hopaxfc.com/en/blog/biological-buffers-solubility-in-water) 9.6.2021
[35] (https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and- recipes/phosphate-buffer-ph-5-8-to-7-4) 10.6.2021
